DE2713536C2 - Verfahren zur Isolierung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids - Google Patents

Verfahren zur Isolierung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids

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Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Patentansprüche 2 bis 5 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.
Es ist bekannt, daß man ein Polysaccharid mit Antitumorwlrkung durch mehrstufige Reinigung eines Extraktes gewinnen kann, der mit einem wäßrigen Lösungsmittel aus Pilzen der Klasse Basldiomyceten. Familie Polyporaceae, einschließlich solchen der Gattung Coriolus erhalten wurde, vgl. die GB-PS 13 31 513. Auch nach der US-PS 37 59 896 werden Pilze zur Gewinnung eines Wirkstoffes mit Wasser oder wäßrigen alkalischen Lösungen extrahiert. Das Extraktionsverfahren wird dort jedoch an anderen Pilzen durchgeführt und dementsprechend werden auch andere Wirkstoffe erhalten, die keinen Stickstoff enthalten, sondern aus /M l,3)-verbundenen Glucoseresten bestehen.
Die bekannten Extraktionsverfahren haben den Nachteil, daß die Effizienz der Extraktion in bezug auf die aktive Komponente gering Ist, was einen erheblichen Verlust an wertvoller Antitumorsubstanz bedeutet. Ihre praktische Anwendbarkelt Ist daher gering.
Es wurde nun gefunden, daß man ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit Anutumorwlrkung und anderen pharmaküdynamischen Eigenschaften In hoher Ausbeule erhalt, wenn man einen Pilz der Familie Polyporaceae der Galtung Coriolus In der Im Anspruch 1 gekennzeichneten Welse zuerst mit Wasser oder einer verdünnten wäßrigen alkalischen Lösung und dann In weiteren Extraktionsstufen mit wäßrigen alkalischen Lösungen allmäh-Hch zunehmender Konzentration extrahiert.
Die erfindungsgemäß verwendeten Pilze der Gattung Coriolus gehören zur Familie Polyporaceae. die wiederum der Klasse der Basldiomyceten angehört. Spezielle Arten der Gattung Coriolus sind Coriolus versicolor (Fr.) Quel.. Coriolus hlrsutus (Fr.) Quel., Coriolus consors (Berk.I Imaz., Coriolus conchlfer iSchw.) Pal., Coriolus pubescens (Fr.) Quel.. Coriolus pargamenus (Fr.) Pal.
und CorirJus biformis (Klotz.) Pal., vgl. »Colored Illustrations of Fungi of Japan« von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, Band I, 1974, und Band II, 1975. Coriolus versicc'or (Fr.) Quel. (ATCC 20 545), Coriolus consors (Berk.) Imaz. (ATCC 20 565), Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. (ATCC 20 561) und Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (ATCC 20 562) sind unter den angegebenen Hinterlegungsnummern bei The American Type Culture Collection hinterlegt. Unter der Bezeichnung »zur Gattung
ίο Coriolus gehörender Pilz« werden auch die Sporen und/oder die Mycele der oben genannten Pilzarten verstanden. Bevorzugt für das erfindungsgemäße Verfahren werden die aus gezüchteten Kulturen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. erhaltenen Mycele. Um das gewünschte stickstoffhaltige Polysaccharid aus den Pilzen der Gattung Coriolus bzw. deren Sporen und/oder Mycelen zu extrahieren, wird das Ausgangsmaierial einer mehrfachen Extraktion unterworfen, d. h. das Ausgangsmaterial wird zuerst mit Wasser oder einer verdünnten wäßrigen alkaline sehen Lösung exirahien und dann in weiteren Stufen ml! wäßrigen alkalischen Lösungen allmählich ansteigender Konzentration. Während dieses Extraktlonsverfahrcns ist es möglich, eine Extraktionsstufe unter Verwendung einer Extraktionslösung gleicher Konzentration zu wle-
-r> derholen.
Die wäßrigen alkalischen Lösungen mit allmählich ansteigender Konzentration werden vorzugsweise so eingestellt, daß die maximale Konzentration 2n beträgt. Der Grund hierfür Hegt üarln, daß bei höheren Konzentratlo-
'<> nen eine Zersetzung der aktiven Komponente eintreten kann. Bezogen auf das Trockengewicht des Ausgangsmaterials wird das wäßrige Lösungsmittel In einem 5- bis 200fachen Gewichtsüberschuß verwendet; gewöhnlich erfolgt die Extraktion Innerhalb von 1 bis 20 Stunden bei
'■' 50 bis 100° C. Eine Extraktionstemperatur von unter 50° C ist nicht geeignet, da die Extraktlonswlikung zu gering ist, während Extraktionstemperaturen von über 100° C eine Zersetzung des Endproduktes bewirken. Die Anzahl der Extraktionen beträgt gewöhnlich 2 bis 10 und vorteilhaft 3 bis 8. Vorzugswelse beträgt die Zelt der Erwärmung auf die oben angegebenen Temperaturen unabhängig von der Anzahl der Extraktionen weniger als 20 Stunden, um eine Zersetzung der aktiven Komponente zu vermelden. Für das erfindungsgemäße Verfah-
4S ren geeignete alkalische Verbindungen sind u. a. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid oder Ammoniak. Die Verwendung von Natriumhydroxid 1st am üblichsten.
Die mehrstufige Extraktion mit wäßrigen alkalischen Lösungen allmählich ansteigender Konzentration ergibt höhere Ausbeuten an Endprodukt, als sie mit den bekannten Verfahren erhalten werden und Ist daher von großer Bedeutung für die industrielle Anwendung. Mit anderen Worten, die erfindungsgemäße Mehrstufenextraktlon mit wäßrigen alkalischen Lösungen ansteigender Konzentration führt Im Vergleich zur wiederholten Extraktion unter Verwendung reinen Wassers oder einer wäßrigen alkalischen Lösung gleichbleibender Konzentration zu unerwartet hohen Ausbeuten, wie später
b0 anhand von Vergleichsversuchen gezeigt wird.
Der Mechanismus, der diese hohe Extraktionseffektivität bewirkt. Ist nlchl genau bekannt. Man nimmt jedoch an, daß das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren nicht nur die Herauslösung der löslichen Komponen-
" ten aus den Pilzen, sondern auch eine geringe Zersetzung der Pilze herbeiführt und so die lösliche aktive Komponente freisetzt.
Wenn andererseits die Extraktion zu Beginn unter
Verwendung einer hochkonzentrierten wäßrigen alkalischen Lösung ohne vorherige Extraktion mit Wasser durchgeführt wird, ist die Ausbeute in der ersten Extraktionsstufe zwar verhältnismäßig hoch, fällt aber in der zweiten und den folgenden Extraktionsstufen scharf ab. Als Grund hierfür wird angenommen, daß sich die gewünschte Fraktion oder Komponente, die normalerweise mit heißem Wasser oder einer verdünnten alkalischen wäßrigen Lösung extrahiert wird, unter den scharfen Bedingungen übermäßig zersetzt und das erwünschte hochmolekulare Polysaccharid in eine niedermolekulare Substanz mit einem Molekulargewicht von unter 5000 übergeht.
Der erfindungsgemäß erhaltene Extrakt wird mit einer Mineralsäure, wie verdünnter Salzsäure, neutralisiert und dann einem Reinigungsverfahren unterwerfen. Dabei können die In jeder Extraktfonsstufe erhaltenen Lösungen für sich oder die vereinigten Lösungen der Exlraktionsstufen gemeinsam gereinigt werden.
Die Reinigung kann nach verschiedenen Verfahren, z. B. durch Ultrafiltration, Hyperfiltration, Gelfiltration, Aussalzen und Ausfällen unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels erfolgen. Diese Verfahren können allein oder in Kombination angewandt werden. Die Anwendung einer solchen Reinigung ermöglicht die Gewinnung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids mit Anlitumoraktivilät. Die Elementaranalyse des erfindungsgemäß erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharids zeigt, daß es hauptsächlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff besteht. Der Stickstoffgehalt schwankt je nach dem Stickstoffgehalt des Ausgangsmaterials, jedoch wurde festgestellt, daß das Produkt gewöhnlich mehr als 2 Gew.-% und In den meisten Fällen 3 bis 5 Gew.-1A, Stickstoff enthält.
Mit der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz durchgeführte Farbreaktionen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1
Farbe
Ergebnisse
α-Naphthol- purpur Saccharide +
Schwefelsäure
Reaktion (Molish-
Reaktion)
Indol-Schwefel- braun Saccharide +
säure-Reaktion
(Disch-Reaktion)
Anthron-Schwefel- grünlich- Saccharide +
säure-Reaktion blau
Phenol-Schwefel- braun Saccharide +
säure-Reaktion
Tryptophan- purpur- Saccharide +
Schwefelsäure- braun
Reaktion
Lowry-Folin- blau Peptid- +
Verfahren bindungen
Ninhydrin-Reaktion purpur- a-Amino- +
nach Hydrolyse blau säuren
mit Salzsäure
Die Farbreaktionen neigen an, daß das mit dem crflndungsgemälJen Verfahren erhaltene Endprodukt ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit hauptsächlich peptidgebundenem Stickstoff ist.
Durch Säulenchromatographie wurde festgestellt, daß das Molekulargewicht der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz im Bereich von etwa 5000 bis 300 000 liegt und das mittlere Molekulargewicht, gemessen durch Ultrazentrifugation, im Bereich von 10 000 bis 100 000. Die niedermolekularen Fraktionen mit Molekulargewichten von weniger als 5000, die bei der oben genannten Reini-
lu gungsbehandlung entfernt werden, haben nahezu keine Inhibitorwirkung gegen feste Sarcoma-180-Tumore bei Mäusen nach intraperitonealer Verabreichung, schmekken außerdem bitter, riechen unangenehm und zeigen Nebenwirkungen. Sie tragen daher nicht zu den pharmakodynamischen Wirkungen des stickstoffhaltigen Polysaccharids bei, sondern haben eher eine nachteilige Wirkung.
Das erfindungsgemäß erhaltene stickstoffhaltige Polysaccharid zeigte nicht nur nach intraperitonealer Verabreichung an Mäuse starke Hemmwirkung gegen feste Sarcoma-180-Tumore, sondern erwies sich auch bei oraler Verabreichung als wirksam, eignet sich also als orales Antitumormittel. Die erfindungsgemäß erhaltene Substanz v.irkt Nebenwirkungen bei der Chemotherapie von
ir< Krebs, einer erhöhten Empfindlichkeit während der Radiotherapie sowie einer Verringerung dei Immunität und der physischen Widerstandsfähigkeit UeI Patienten nach einer Operation oder einer Bluttransfusion entgegen und kann zur Vorsorge oder zum Schutz gegen Infek-
i" tionskrankheiten durch Viren oder Bakterien aufgrund herabgesetzter Immunität oder physischer Widerstandskraft eingesetzt werden. Die orale Verabreichung der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz ergab außerdem eine ausgezeichnete Wirkung hinsichtlich einer Verbes-
'"■ serung Leberfunktion, einer Zunahme des Appetits, der Beseitigung von Darmstörungen und der Förderung der Harnabgabe. Die erfindungsgemäß erhaltene Substanz eignet sich auch für die Behandlung von Lepra.
,,, Beispiel 1
200 g trockenes Mycel mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 9,9'.v, von Corlolus versicoior (Fr.) Quel. (ATCC 20 545) aus einer gezüchteten Kultur und 3 Liter Wasser wurden in einen mit Rührer ausgerüsteten 5-Llter-Kolben gegeben. Die Mischung wurde in einem siedenden Wasserbad gerührt und drei Stunden unter diesen Bedingungen bei einer Innentemperatur von 95 ± T C gehalten. Dann wurde sie gekühlt und in einem Büchner-Trichter abgenutscht, um den Pilz und die Extraktlösung
'" zu trennen. Das zurückgebliebene Mycel wurde mit etwa 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Extraktlösung vereinigt. Die vereinigten Lösungen ergaben etwa 3,5 Liter. Der pH-Wert der Extraktlösung betrug 5,8. Das zurückgebliebene Mycel wurde nochmals
" mit 2 Liter Wasser vermischt und dann erneut zwei Stunden extrahiert. Das zurückgebliebene Mycel wurde wieder mil I Liter Wasser gewaschen, so daß 3 Liter Extraktlösung erhalten wurden. Der Mycelrückstand wurde darauf mit 2 Liter 0,1 η Natriumhydroxidlösung vermischt und bei 95 ± T C 2 Stunden extrahiert. Anschließend wurde gekühlt, mit 2n-Salzsäure neutralisiert und abgenutscht, um die Extraktlösung vom Mycel zu trennen. Nach erfolgter Trennung wurde der Rückstand mit etwa 500 ecm Wasser gewaschen und das
h1 Waschwasser mit der Extraktlösung vereinigt, worauf man 2,5 Liter Lösung erhielt. Der Mycelrückstand wurde dann noch mit jeweils 2 Liter 0,2n-. 0.3n- und 0.4n-Natriumhydroxldlösungen extrahiert, wobei jeweils mit
0,5 1 Wasser gewaschen wurde, so daß jeweils 2,5 Liier Extraktlösung erhalten wurden. Die sechs erhaltenen Extraktlösungen (insgesamt 16,5 Liter) wurden vereinigt und im Vakuum auf einem Rotationsverdampfer bei 60° C auf 700 ecm eingeengt. Dann wurde die Lösung in einem Zelluloseschlauch bei 5° C 72 Stunden lang dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde weiter konzentriert und dann gefriergetrocknet. Man erhielt 60 g eines leberbraunen Pulvers mit einem Feuchtigkeitsgehalt vor 7%; Ausbeute: 31,1%. Die Elementaranalyse ergab: C 40,3%; H 6,2%; N 2,9%; O 50,6%. Das durch Säuienchromatographie bestimmte Molekulargewicht betrug etwa 10 000 bis 250 000 und das mittlere, durch Ultrazentrifugation unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel bestimmte Molekulargewicht 94 000. (Der oben angegebene Sauerstoffgehalt wurde durch Ergänzung auf 100% erhalten.)
Verschiedene nach Auflösen des Pulvers in Wasser durchgeführte Farbreaktionen führten zu den in der Tabelle 1 angegebenen Ergebnissen. Damit ist bestätigt, daß es sich bei der pulvrigen Substanz um ein stickstoffhaltiges Polysaccharid handelt. Die Hemmwirkung dieser Substanz gegen feste Sarcoma-180-Tumore bei Mäusen betrug 90% bei intraperitonealer Verabreichung und 70% bei oraler Verabreichung. Die Antitumorwirkung dieser Substanz wurde nach einem herkömmlichen Verfahren bestimmt, das nachfolgend kurz beschrieben ist
Sarcoma-180-Tumorzellen wurden In die Bauchhöhlen von Mäusen transplantiert. Nachdem die Zellen sieben Tage ausreichend gewachsen waren, wurden 106 dieser Zellen zur Bildung fester Tumore unter die Haut rier Achselhöhle anderer Mäuse transplantiert. Die Verabreichung der zu testenden Substanz begann 24 Stunden nach der Transplantation. Bei intraperitonealer Verabreichung wurden 20 Tage lang jeden zweiten Tag 10 mg/kg, entsprechend einer jeweiligen Gesamtdosis von 0,2 mg in 0,2 ml bei einer 20 g schweren Maus, verabreicht. Bei oraler Verabreichung wurde das erhaltene Produkt 20 Tage lang täglich in Dosen von 1000 mg/kg verabreicht, was einer jeweiligen Gesamtdosis von 20 mg in 0,2 ml bei einer 20 g schweren Maus entsprach. Am 25. Tag nach der Transplantation wurden die Tumore herausgenommen und die Hemmung des Tumorwachstums wurde aus dem mittleren Tumorgewicht der behandelten Mäuse und dem mittleren Tumorgewicht der nicht behandelten Kontrollmäuse ermittelt.
Das vorstehend beschriebene Extraktionsverfahren wurde wiederholt, jedoch ausschließlich mK Wasser unter Durchführung aller Extraktions- und Waschstufen in den angegebenen Mengen. Jede erhaltene Extraktlösung (gemischt mit Waschwasser) wurde Im Vakuum eingeengt, dialyslert, gekühlt und getrocknet, um die Ausbeute jeder Extraktionsstufe zu bestimmen. Die Ergebnisse sind In der Tabelle 2 wiedergegeben. Danoch fällt die Ausbeute nach der zweiten Extraktionsstufe scharf ab. und es 1st nicht möglich, die gewünschte Substanz durch wiederholte Extraktion mit Wasser In hoher Ausbeute zu gewinnen.
Tabelle 2
ixtraklions- Extraklions- Waschlijfe lösung. lösung.
Liier Liier
Fortsetzung
Extraktions
stufe
5		 Extraktions
lösung,
Liter		 Wasch
lösung,
Liter		 Ausbeute an
trockenem
Pulver, Gew.-%
3 2 0,5 0,8
4 2 0,5 0,3
ίο 5 2 0,5 0,1
6 2 0,5 0,1
Summe
13
3,5
10,4
Anmerkung:Ausgangsmaterial: 200 g Mycel
Exlraklionslemperatur: 95 ± 2° C.
Die weitere Wiederholung des Extraktionsverfahrens
2b mit In- und O,4n-Natriumhydroxidlösungen ergab die in der Tabelle 3 wiedergegebenen Werte. Sie zeigen, daß die Ausbeute bei Wiederholung der Extraktion mit einer Lösung gleicher Alkalikonzentration stark abnimmt und es nicht möglich ist, eine so hohe Ausbeute wie mit dem erfindungsgemäf3en Extraktionsverfahren zu erreichen.
Tabelle 3
Extraktionsstufe Ausbeute bei der Ausbeute bei der
Extraktion mit Extraktion mit
I π NaOH, Gew.-% 0,4 η NaOH, Gew.-%
Summe
10,5 13,8
2,4 2,9
1,1 2,0
0,5 1,5
14,5
20,2
Ferner wurden 200 g trockenes Mycel von Corlolus verslcolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 545) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% jeweils 2 Siunden bei 90 bis 95° C
4S mit jeweils 2 Liter 0,05n-, 0,ln-, ( 2n- und nochmals mit O.ln-Natrlumhydroxldlösung extrahiert, wobei nach jeder Extraktion gekühlt, mit 2n-Chlorwasserstofflösung neutralisiert, zur Trennung des Mycels vom Extrakt abge: nutscht, der Myceirückstand jeweils mit 500 ml Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Extrakt vereinigt wurde. Die Extraktlösung jeder Stufe wurde im Vakuum konzentriert, dlalysiert, weiter konzentriert und gefriergetrocknet, worauf man ein leberbraunes Pulver erhielt. Die erhaltenen Werte sind In der nachfolgenden
d5 Tabelle 4 zusammengestellt.
0.5
Tabelle 4 Konzentration
der NaOH		 pH während
der		 Ausbeute an
trockenem
60 Extraktions
stufe		 Lösung Extraktion Pulver, Gew.-%
Ausbeute an 0,05 π 9.0 10,1
trockenem
Pulver, Gew.-"..		 1 0,1 η
0.2 η
0.1 η 		11,5
12,5
11.5		 6,8
η
7.0
2.1		 2
3
4
27
Sie zeigen, daß In jeder Extrakilonsslufe die mü dem jeweils verwendeten Extraktlonsmittel extrahlerbaren Substanzen vollständig herausgelöst werden. Mit anderen Worten, in der 2. Stufe wurden die mit der O,ln-Natrlumhydroxldlösung extrahierbaren Substanzen vollständig entfernt, so daß bei erneuter !Extraktion mit O.ln-Natrlumhydroxidlösung nach der Extraktion mit O,2n-Natrlumhydroxldlösung die Ausbeute 0 betrug.
Führt man die Extraktion mit den wäßrig alkalischen Lösungen steigender Konzentration bei Raumtemperatur durch, so sind die Ergebnisse aufgrund einer geringeren Extraktionseffizienz weniger günstig und fallen noch welter ab, wenn mit Lösungen gleichbleibender Konzentration extrahiert wird, wie die Tabellen 5 und 6 zeigen.
Tabelle 5
13 536
Tabelle 7
Extraktions- Extraktionsbedingungen Ausbeute,
stufc Gew.-%
1 0,1 η NaOH, 2 Std. bei 1,0
Raumtemperatur
2 1,0 rtNaOH, 2 Std. bei 1,1
Raumtemperatur
3 2,OnNaOH, 2 Std. bei 1,2
Raumtemperatur
Tabelle 6
Extraktions Extraklionsbedingungen Aubeute,
sl ufe Gew.-%
1 2 η NaOH, 2 Std. bei 1,2
Raumtemperatur
2 2 η NaOH, 2 Std. bei 0,4
Raumtemperatur
3 2 η NaOH, 2 Std. bei 0,2
Raumtemperatur
.Ausgangsmaterial für beide Versuchsreihen jeweils 200 g getrocknetes Mycel von Corlolus verslcolor (Fr.) Quel.
Beispiel 2
Unter Verwendung der gleichen Vorrichtung wie in Beispiel 1 wurden 200 g trockenes Mycel von Corlolus verslcolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 545) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% mit jeweils 2 Liter 0,05n-, 0,ln-, 0,2n- und O,4n-Natr!umhydroxidlösung extrahiert. Die Extraktionstemperatur betrug 90 bis 95° C und die Extraktionszelt in jeder Extraktionsstufe 2 Stunden. Nach jeder Extraktionsstufe wurde die Mischung gekühlt, mit 2n-Salzsäure neutraHslert und dann abgenutscht, um das Mycel von der Extraktlösung zu trennen. Der Rückstand wurde jeweils mit 500 ecm Wasser gewaschen und die Waschlösung mit der entsprechenden Extraktlösung vereint.
Die Extraktlösungen jeder Extraktionsstufe wurden wie in Beispiel 1 im Vakuum konzentriert, dialyslert, weiter konzentriert und gefriergetrocknet. Man erhielt ein leberbraunes Pulver.
Die Ergebnisse der einzelnen Extraktionsstufen sind in der Tabelle 7 wiedergegeben.
Extraktions- Natrium- pH während Ausbeute an
st'Ie hydroxid- der trockenem
konzentration Extraktion Pulver. Gcw.-%
1 0,05 η 9.0 10,1
2 0,1 η 11,5 3,5
3 0,2 η 12,5 6,8
4 0,4 η 13,0 6,6
Die Gesamtausbeute betrug 27%, die Elementaranalyse ergab C 41.0%: H 6,3*; N 3,7%: O 49,0%
Wie In Beispiel 1 stellte man fest, daß das erhaltene Pulver aus einem stickstoffhaltigen Polysaccharld mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 250 000 und einem mittleren Molekulargewicht von 100 000 bestand. Die Hemmwirkung gegen feste Sarcoma-180-Tumore bei Mäusen betrug 93% bei intraperitonealer Verabreichung und 73% bei oraler Verabreichung.
Beispiel 3
Unter Verwendung der gleichen Vorrichtung wie In Beispiel 1 wurden 200 g trockenes Mycel von Corlolus verslcolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 545) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 9,9% zuerst bei 95 ± 2° C 3 Stunden mit 3 Liter Wasser extrahiert. Nach dem Kühlen und dem Abtrennen des Mycels durch Abnutschen wurde das Mycel mit 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Extrakllösung vereinigt, so daß 3,5 Liter Extraktlösung erhalten wurden.
Dann wurde das Mycel mit 2 Liter ln-Natrlumhydroxidlösung versetzt und 0,5 Stunden bei 90 bis 95° C extrahiert. Anschließend wurde gekühlt, mit 2n-Salzsäure neutralisiert, angenutscht und mit 1 Liter Wasser gewaschen, so daß 3 Liter Extraktlösung erhalten wurden.
Alle erhaltenen Extraktlösungen wurden vereinigt und wie im Beispiel i Im Vakuum konzentriert, dialysiert, welter konzentriert und dann gefriergetrocknet. Es wurden 33 g leberbraunes Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 7% erhalten; Ausbeute 21,0%; Elementaranalyse: C 41,7%; H 6,4%; N 3,9%; O 48%. Wie In Beispiel 1 wurde festgestellt, daß die erhaltene Substanz aus einem stickstoffhaltigen Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 300 000 und einem mittleren Molekulargewicht von 98 000 bestand.
Die Hemmwirkung dieser Substanz gegen feste Sarcorna-lSO-Turncrzeücr. bei Mäusen betrüg 94% bei Iniraperltonealer Verabreichung und 68% bei oraler Verabreichung.
Beispiel 4
Unter Verwendung der gleichen Vorrichtung wie In Beispiel 1 wurden 200 g trockene Sporen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 545) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,7% zuerst mit 2,4 Liter Wasser drei Stunden bei 95 ± 2° C extrahiert. Nach dem Abkühlen wurde abgenutscht, um den Rückstand von der Extraktlösung zu trennen. Der Rückstand wurde mit 500 ecm Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Extraktlösung zu insgesamt 2,5 Liter Extraktlösung vereint.
Der Rückstand wurde darauf 1 Stunde bei 90 ± 2° C mit O,4n-Natriumhydroxldlösung extrahiert, anschließend gekühlt, mit 2n-SaIzsäure neutraHslert, abgenutscht
und mil 500 ecm Wasser gewaschen, so daß 2,5 Liter Extraktlösung erhallen wurden. Die Extraktion wurde dann nochmals mit 2 Liter I n-Natrlumhydroxldlösung bei 80 - 2; C 1 Stunde wiederholt, wobei ebenfalls 2.5 Liter Extrakllösung erhalten wurden.
Alle erhaltenen Extraktlösungen wurden vereinigt und wie In Beispiel 1 Im Vakuum konzentriert, dialysiert, weiter konzentriert und gefriergetrocknet. Es wurden 43,4 g leberbraunes Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% erhalten, Ausbeute 22%. Die Elementaranalyse ergab: C 42.3%: Ii 6.5%; N 2.2%; O 49.0lv. Wie in Beispiel 1 wurde festgestellt, dall die erhaltene Substanz aus
10
einem stickstoffhaltigen Polysaccharicl mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 300 000 und einem mittleren Molekulargewicht von 110 000 bestand.
Die Hemmwirkung dieser Substanz gegen feste Sar-■-, coma-180-Tumorzellen bei Mäusen betrug bei intraperitonealcr Verabreichung 96% und bei oraler Verabreichung 75%.
Verwendete man Im obigen Extraktionsverfahren ausschließlich Wasser als Extraktionslösungsmiltel. so Hi betrug die Ausbeute an der gewünschten .Substanz nur 7,6%.

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Isolierung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids mit Antitumorakiivität aus einem zur Familie Polyporaceae, Gattung Coriolus, gehörenden Pilz durch Extraktion mi: einem wäßrigen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man den Pilz bei einer Temperatur von 50 bis 100° C innerhalb von 1 bis 20 Stunden anfänglich mit Wasser oder einer verdünnten wäßrigen alkalischen Lösung und dann in weiteren Extraktionsstufen mit wäßrigen alkalischen Lösungen allmählich zunehmender Konzentration extrahiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pilz natürliche oder gezüchtete Sporen und/oder Mycele verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration der wäßrigen alkalischen Lösung stufenweise bis maximal 2n erhöht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion in drei bis acht Stufen durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßrige alkalische Lösungen Natriumhydroxidlösungen verwendet.
DE2713536A 1976-07-07 1977-03-26 Verfahren zur Isolierung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids Expired DE2713536C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8066576A JPS536413A (en) 1976-07-07 1976-07-07 Preparation of n-containing polysaccharides

Publications (2)

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