CS219325B2

CS219325B2 - Method of isolation of the polysaccharide

Info

Publication number: CS219325B2
Application number: CS772085A
Authority: CS
Inventors: Saburo Ueno; Chikao Yoshikumi; Fumio Hirose; Yoshio Ohmura; Toshihiko Wada; Takayoshi Fujii; Eiichi Takahashi
Original assignee: Kureha Chemical Ind Co Ltd
Priority date: 1976-07-07
Filing date: 1977-03-29
Publication date: 1983-03-25
Also published as: MX4255E; CH628245A5; DE2713536A1; NL169197B; DK145424B; BE853178A; IT1075830B; NL169197C; PH12619A; AT360146B; DK151977A; ZA773441B; GB1570538A; YU39796B; HU176828B; YU76477A; US4229570A; DK145424C; AU497397B2; BG33008A3

Description

Způsob izolace polysacharidu obsahujícího 2 až 8 % hmotnostních dusíku a vykazujícího protinádorovou účinnost, extrakcí houby z třídy Basidiomycetes vodným rozpouštědlem, vyznačující se tím, že se houba rodu Coriolus čeledi Polyporaceae nejprve extrahuje vodou nebo zředěným vodným roztokem hydroxidu sodného v množství odpovídajícím pětinásobku až dvěstěnásobku hmotnosti houby, při teplotě 50 až 100 °C, načež se opakovaně extrahuje vodnými roztoky hydroxidu sodného s postupně se zvyšující koncentrací až do 2,0 N, v množství odpovídajícím pětinásobku až dvěstěnásobku hmotnosti houby, při teplotě 50 až 100 stupňů C, přičemž tato extrakce se opakuje třikrát až osmkrát a celková doba extrakce činí 1 až 20 hodin.

Shora uvedený polysácharid je mj. protinádorově účinný při orálním podání.

Vynález se týká způsobu izolace polysacharidu s obsahem dusíku, vykazujícího protinádorovou účinnost, několikastupňovou extrakcí houby třídy Basidiomycetes, náležející к rodu Coriolus, vodným rozpouštědlem.

Z britského patentního spisu č. 1 331 513 je známo, že při čištění extraktu z hub třídy Basidiomycetes pomocí vodného rozpouštědla je možno izolovat polysacharid vykazující protinádorovou účinnost. Tento známý způsob však má vážný nedostatek spočívající v nízké účinnosti extrakce aktivní složky, což má za následek výrazné ztráty cenné protinádorové účinné látky. Praktická upotřebitelnost této metody, zejména pokud jde o její použtí к produkci protinádorové účinné látky v průmyslovém měřítku, je tedy velmi problematická.

Nyní bylo zjištěno, že polysacharid s obsahem dusíku, vykazující protinádorovou účinnost a různé jiné farmakodynamické účinky, je možno izolovat ve vysokém výtěžku tak, že se houba rodu Coriolus čeledi Polyporaceae třídy Bosidiomycetes nejprve extrahuje vodou nebo zředěným vodným roztokem zásady a pak se dále opakovaně extrahuje vodnými roztoky zásady s postupně se zvyšující koncentrací.

Předmětem vynálezu je tedy shora zmíněný výhodný způsob izolace polysachaiidu s obsahem dusíku, vykazujícího protinádorovou účinnost a různé jiné farmakodynamické účinky, z hub náležejících к rodu CorioluS třídy Basidiomycetes.

Výrazem „houba rodu Coriolus“, jež se používá jako výchozí materiál při práci způsobem podle vynálezu, se označují známé druhy hub náležejících к čeledi Polyporaceae a třídě Basidiomycetes. Mezi tyto druhy náležejí například Coriolus versicolor (Fr.) Quél., Coriolus consors (Berk.) Imaiz., Coriolus conchifer (Schw. ] Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quél., Coriolus pargamenus (Fr.), Pat. a Coriolus biformis (Klotz.) Pat. [viz „Coloured Illustrations of Fungi of Japan“, Rokuya Imiaizeki a Tsuguo Hongo, sv. I (1974) a sv. II (1975)]. Z těchto hub jsou Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P č. 2414), Coriolus consors (Berk). Imaz. (FERM-P č. 988), Coriolus hirsutus (Fr.) Quél. (FERM-P č. 2711) a Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (FERM-P č. 2712) uloženy pod FERM-P č. 2412—2426, 988, 2711 a 2712 ve sbírce Fermentation Research Institute, Agency of Indusitrial Science and Technology (Chiba-shi, Japonsko), což je vládní úřad jmenovaný generálním ředitelem japonského patentního úřadu. Výraz „houba rodu Coriolus“ se vztahuje jak na plodnice, tak na mycelium shora uvedených druhů hub. Pro účely vynálezu je nejvýhodnější mycelium získané z uměle vypěstované kultury Coriolus versicolor (Fr.) Quél.

Způsob izolace polysacharidu s obsahem dusíku podle vynálezu, rafinací extraktu plodnic nebo/a mycelia hub z třídy Basidio mycetes vodným rozpouštědlem, se vyznačuje tím, že se extrakce provede nejprve vodou nebo zředěným vodným roztokem zásady a pak se provádí opakovaně za použití zásaditých roztoků s postupně se zvyšující koncentrací.

К extrakci žádaného dusíkatého polysacharidu z húb třídy Basidiomycetes jako výchozího materiálu se v souladu s vynálezem tento výchozí materiál podrobí několikastupňové extrakci, tzn., že se výchozí materiál nejprve extrahuje vodou nebo vodným rozpouštědlem, obsahujícím malé množství alkálie (tedy zředěným alkalickým roztokem), a potom se dále v několika stupních extrahuje za použití vodného roztoku s postupně zvyšovanou koncentrací alkálií. Během extrakčního postupu je možné opakovat extrakci za použití extrakčního roztoku téže koncentrace. Výraz „vodné rozpouštědlo, obsahující malé množství alkálií“ znamená vodný roztok, jehož pH po smíchání s houbou je ve vodné fázi 7 či méně. Tato specifická definice je založena na skutečnosti, že smíchá-li se s houbou čistá voda nebo roztok hydroxidu sodného o koncentraci asi 0,01 N, pak pH roztoku se udržuje v rozmezí hodnot 4 až 7 v důsledku pufrující činnosti ve spojitosti s vlastní houbou.

Pokud se týká vodných alkalických roztoků použitých se stupňovitě se zvyšující koncentrací podle tohoto vynálezu, je výhodné upravit koncentraci takového roztoku tak, že nejvyšší koncentrace se pohybuje kolem asi 2 N nebo je nižší. Je to ovlivněno rozkladem účinné složky, ke kterému by došlo, jestliže by se extrakce prováděla za koncentrace vyšší, než je výše zmíněná hladina. Vodné rozpouštědlo, použité při extrakci Basidiomycet podle tohoto vynálezu, se používá v množství pětinásobném až dvousetnásobném hmotnostně, přepočteno na výchozí materiál (na sušinu) v každé šarži extrakce, a obvykle se extrakce provádí za teploty 50 až 100 °C po dobu 20 minut až 5 hodin. Je třeba poznamenat, že za extrakční teploty pod 50 °C dochází к méně účinné extrakci, zatímco za extrakční teploty nad 100 °C může dojít к degradaci konečného produktu. Počet extrakčních stupňů činí obvykle 2 až 10, s výhodou 3 až asi 8. Pro znemožnění rozkladu účinné složky je výhodné, aby celková doba zahřívání na výše uvedenou teplotu Činila nejvýše 20 hodin bez ohledu na počet extrakčních stupňů, použitých při extrakci. Je rovněž žádoucí, aby celková doba zahřívání činila nejvýše hodinu pro dosažení uspokojivé extrakční účinnosti. Jako alkálie, použitá při postupu podle tohoto vynálezu, se hodí hydroxid sodný, draselný nebo vápenatý, dále amoniak, přičemž nejobvykleji se používá hydroxidu sodného.

Vícestupňová extrakční metoda za použi tí vodného alkalického roztoku s postupně zvyšovanou koncentrací je spojena s vyšším výtěžkem konečného· produktu, než jak se· dá takového výtěžku dosáhnout za použití běžných postupů, a z toho důvodu má tento způsob z hlediska průmyslové výroby velkou důležitost. Znamená to, že mnohastupňová extrakce má nepředstavitelný vliv na překvapivě vysoké výtěžky ve srovnání s opakovanou extrakcí za použití pouhé čisté vody nebo vodného alkalického· roztoku téže koncentrace.

Mechanismus, jímž se dociluje vysoký ex· trakční efekt při tomto postupu podle vynálezu, není dosud bezpečně a s jistotou znám, ale má se za to, že extrakčním postupem se nejen indukuje eluování rozpustných složek z Basidiomycet, ale rovněž se způsobí mírný rozklad Basidiomycet za vzniku rozpustné účinné složky. Jinými slovy řečeno, má se za to, že se výchozí materiál vždy rozloží vlivem koncentrace alkalického vodného roztoku, použitého· při extrakci, a to vždy za zvýšení koncentrace alikálie, což zřejmě vyvolává účinné uvolnění aktivní látky.

Na druhé straně jestliže se extrakce provádí za použití vysoce koncentrovaných vodných roztoků alkálií od samého začátku bez předchozího použití extrakce vodou, pak výtěžek extrakce je skutečně poměrně vysoký v prvém stupni extrakce, ale pak prudce klesá v druhém a každém následujícím stupni extrakce. Má se za to, že důvody jsou tyto: Frakce, jež se má normálně extrahovat horkou vodou nebo zře děným alkalickým roztokem, se rozkládá nadměrně za pevně daných podmínek a v důsledku toho se snižuje vysoká molekulová hmotnost látky na molekulovou hmotnost pod 5 000.

Extrakt, získaný výše uvedeným postupem podle tohoto · vynálezu, se neutralizuje za použití · obvyklých postupů minerální kyselinou, jako je zředěná kyselina chlorovodíková, a potom se čistí. V takovém případě se může extrahovaný roztok z každého· stupně extrakce čistit, nebo se mohou roztoky, získané v různých extrakčních stupních spoji* dohromady a spojený roztok se čistí.

Jsou k dispozici různé postupy čištění, jako je ultrafiltrace, reversní osmosa, gelová filtrace, vysolení a srážení za použití organického rozpouštědla, jež může být použito. jako takové, nebo se může použít kombinace rozpouštědel. Podobným postupem čištění extrahovaného roztoku se může získat výhodný polysacharid, obsahující dusík a vyznačující · se protinádorovou účinností.

Z elementární analýzy polysacharidu, obsahujícího· dusík, je patrné, že primárně obsahuje uhlík, vodík, dusík a kyslík. Obsah dusíku kolísá v závislosti na obsahu dusíku ve výchozím materiálu, ale bylo pozorováno, že produkt obsahuje obvykle nad 2 %' dusíku, ponejvíce mezi 3 až 5 %.

Výsledky četnýdh barevných reakcí této látky jsou uvedeny v následující tabulce 1 dále.

Barevná reakce α-naftol a kyselina sírová (Molischova reakce) indol a kyselina sírová (Discheova reakce) anthron a kyselina sírová fenol a kyselina· sírová tryptofan a kyselina sírová

Lowry-Folin ninhydrinová reakce po hydrolýze kyselinou chlorovodíkovou

Tabulka 1

Barva Výsledky

purpurová	sacharidy	ano
hnědá	sacharidy	ano
zelenavo-modrá	sacharidy	ano
hnědá	sacharidy	ano
purpurově hnědá	sacharidy	ano
modrá	peptidové vazby	ano
purpurově modrá	a-aminokyseliny	ano

Výsledky těchto barevných reakcí jsou v souladu se skutečností, že konečným produktem podle tohoto vynálezu je polysacharid, obsahující dusík a obsahující primárně vázaný peptidický dusík.

Chromatografováním na sloupci bylo stanoveno, že molekulová hmotnost předmětné látky je v rozmezí přibližně 5 000 až 300 000, a střední molekulová hmotnost, stanovená ultracentrifugou, je v rozmezí 1ΟΌΟ0 až 100' 000. Frakce o nízké molekulové hmotnosti (s hodnotou mol. hmotnosti pod 5 000), které se odstraní výše uvedeným postupem čištění, se vyznačují takřka nulovým inhibičním efektem proti pevným tumorům Sarcoma-180 u myší při intraperitoneálním podávání, a rovněž mají hořkou, velmi nepříjemnou chuť. Má se tedy za to, že tyto látky s nízkou molekulovou hmotností nejsou v - žádné souvislosti s farmakodynamickým efektem předmětného polysacharidu, obsahujícího dusík, a mají spíše škodlivý vliv.

Polysacharid podle tohoto vynálezu, obsahující dusík, se vyznačuje protinádorovou účinností u myší a to nejen při intraperltoneálním, ale i při orálním podávání, jinými slovy řečeno, tento polysacharid, obsahující , dusík, může být vynikajícím protinádorovým činidlem při ' orálním podávání a skutečně byl tento účinek potvrzen četnými pokusy, jak je to zde ještě dále popisováno. Použití polysacharidu, obsahujícího dusík, .není omezeno· pouze 'na účinnost orálního protinádorového činidla; látka je rovněž účinná při regenerování imunity napadeného. Přesněji řečeno, je tato látka nejen účinná při prevenci vedlejších účinků při Chemoterapii rakoviny a zvyšování citlivostí radioterapeutik, ale rovněž předchází poklesu imunity nebo fyzické schopnosti pacienta po operaci nebo krevní transfúzi. Lze tak kontrolovat nebo- přecházet infekčním onemocněním, způsobeným viry nebo baktériemi v důsledku poklesu imunity nebo fyzické odolnosti. Polysacharid podle tohoto vynálezu, obsahující dusík, se vyznačuje rovněž vynikajícím způsobem při orálním podávání při zlepšování funkce jater, zvyšování chuti k jídlu, při léčbě žaludečních obtíží a při podpoře močení. Rovněž se vyznačuje účinností při léčbě lepry.

Vynález je nyní podrobně popisován následujícími příklady.

Příklad 1

200 g suchých mycelií s obsahem- vlhkosti

9,9 % kultury Coriolus versicolor (Fr) Quél. (FERM-P. No·. 2414), získaných z umělé kultury, a 3 litry vody se vnesou do -baňky objemu 5 litrů, vybavené mícháním, a reakční směs se míchá ve vroucí vodní lázni za teploty 95^ο+·2·°υ po 3 hodiny. Potom se reakční směs -ochladí, odsátím na Btichnerově nálevce se oddělí zbytky houby, a ty se promyjí asi litrem vody. Podíl z promýváni se spojí s podílem z filtrace.

Získá se tím přibližně 3,5 litru roztoku o hodnotě pH 5,8. Zbylá mycelia se dále smíchají se dvěma litry vody, provede se- podobná dvouhodinová extrakce, a promytím- mycelií litrem vody se získá eixtrakční roztok o objemu asi 3- litry. Zbylé zbytky houby se znovu extrahují za použití dvou litrů 0,1 N roztoku hydroxidu sodného 2 hodiny za teploty &5°+^2 °lC, načež se reakční -směs oohladí, neutralizuje se přidáním 2 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, a odsátím se oddělí roztok od zbytků hub. Po - oddělení se- zbytek promyje použitím asi 500- ml vody, a smícháním s roztokem z vlastní extrakce se získá 2,5 litru roztoku.

Podobné postupy se opakují za použití 2 litrů Q,2 N, 0,3 N a 0,4 N - roztoku hydroxidu sodného a '0,5 litru vody k promývání, vždy za vzniku 2,5 litru -extrahovaného roztoku z každého- stupně.

Uvedených 6 podí-lů roztoků z extrakcí o celkovém objemu 16,5 litru se- smíchá dohromady, -a zahuštěním na rotační odparce ve·, vak.uu za teploty 00 °C se získá 700 ml koncentrátu. Ten se vnese do diálytické celulosové trubice (Visking Tube, Union Carbide Corp.) s tím, že se provede běžná dialysa 70!. hodin za teploty 5 -°C, získaný dialysát se dále koncentruje, načež se následující lyofilisací isoluje 60· g játrově hnědého prášku o obsahu vlhkosti 7%. Výtěžek odpovídá 31,1 procent.

Elementární analysa: 40^,3 % C, 6,2 % H, 2,9 % N, 50,6 % O. Molekulová hmotnost látky měřená sloupcovou chromátografií činí přibližně 10· 000¹ až 250- 000, <a střední molekulová hmotnost, zjištěná ultracentrifugou za použití vody jako rozpouštědla! -činí 9-40100. Obsah kyslíku byl zjištěním odečtením- do sta.

Různé barevné reakce, provedené za použití tohoto prášku po rozpuštění ve vodě mají stejné výsledky, jak je- to uvedeno v tabulce 1, a bylo tím potvrzeno, že tato práškovitá látka je polysacharid, obsahující dusík.

Inhibiční poměr tésto^· látky proti pevným· tumorům Sarcoma-18.0 myší činí 90 - % při intraperitoneálním a 70 °/o při orálním podávání.

Protinádorová účinnost této látky se měří obvyklým postupem, který je zde -dále krátce popisován.

Nádorové buňky Sarcoma-180 se transplantují do břišní dutiny myší a. ponechají se - dostatečně vzrůst po 7 dní. Pak se 10⁶těchto buněk transplantuje pod axillární kůži jiné myši za vzniku pevného nádoru, a s podávání 'testované látky podle tohoto vynálezu se začne za 24 hodin po provedené transplantaci. V případě intraperitoneálního podávání se látka aplikuje v dávce 10 milígramů/kg každý den po 20· dní v celkové -dávce 0,2 ml/2O g hmotnosti těla- myši, při orálním podávání se látka aplikuje v dávce 1,000 mg/kg jednou denně po 20 dní v celkové dávce 0,21. ml/20 g hmotnosti těla myši. Za 25 dní po transplantaci se nádory vyjmou, a ínhibiční poměr růstu nádoru v % se propočte z průměrné váhy nádoru myši, které byla podávána látka podle tohoto vynálezu, a z průměrné váhy nádoru kontrolní myši.

Výsledky podobných extrakcí, provedených za použití vody jako jediného· rozpouštědla, jsou Uvedeny v tabulce 2 dále. Při všech těchto pokusech byly všechny extrak ce a stupně promývání prováděny s vodou v témže· množství, jako tornu bylo v případě rozpouštědla při výše zmíněném působení. Vodné roztoky po smíchání s vodnými podíly z · promývání byly zahuštěny ve vakuu, dialysovány, a. po ochlazení a sušení byl stanoven výtěžek v každém stupni extrakce, výsledky jsou v tabulce. Jak je to z tabulky patrné, výtěžek extrakce klešá prudce od druhého· stupně extrakce a dalšího, a je skutečně nemožné isolovat předmětnou látku ve vysokém výtěžku opakováním stupňů takové extrakce.

Tabulka 2

Číslo stupně extrakce	Objem roztoku z extrakce, litrů	Objem .roztoku z prdmývání, litrů	Výtěžek suchého práškovaného podílu hmot. %
1	3	1	7,0·
2	, 2	0,5	'2,1
3	2	0,5	0,1
4	2	0,5	0,3
5	2	0,5	0,1
6	2	0,5	0,1
celkem	13	3,5	10,4

Jako výchozí materiál bylo použito 200 g mycelia, extrakční teplota 95+2 °C.

Příklad 2

Z^ použití stejného zařízení, jak bylo popsáno v příkladu 1, se 200 g · suchého mycelia (obsah vlhkosti 8,8%) Coridlus versicolor · (Fr.) Quél. · (FERM-P No. 2414) extrahuje za· · použití 2 litrů 0,05 N, 0,1 N, 0,2 N a 0,4 N roztoku hydroxidu sodného postupně po sobě. Extrakční teplota se pohybuje od 90 až do· 95 °'C, extrakční doba při každém stupni: 2 hodiny. Po každém stupni extrakce se re akční směs ochladí, neutralisuje se 2 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, a potom se filtrací oddělí zbytek hub od extrakčního roztoku. Zbytek se promyje za použití 500· ml vody · v každém stupni extrakce, a vodný roztok z promývání se spojí s odpovídajícím extrakčním roztokem.

Kapalný podíl z každého stupně extrakce se zahustí ve vakuu, dialysuje se, znovu zahustí a lyofilizuje podobně, jak to bylo popsáno· v příkladu 1. Výsledkem je· játrově hnědý práškovaný produkt.

Výsledky v jednotlivých stupních extrakčního postupu jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Čísto· stupně extrakce	Koncentrace hydroxidu sodného	Hodnota pH v době extrakce	Výtěžek práškovaného· produktu, hmot. %
1	0,05 N	9,0	10,1
2	0,1 N	11,5	3,5
3	0,2 N	12,5	6,1
4	0,4 N	13,0	6,6

Celkový výtěžek činí 27 %. Elementární analysa: 4il,0% C, 6,3 % H, 3,7 % N, 40,0· % O.

Pomocí testů, provedených ·podobně, jako v příkladu 1, bylo potvrzeno, že výše uvedený práškovaný produkt je polysacharid, obsahující dusík, o molekulové hmotnosti 10 090 až 250' 060í a střední molekulovou hmotností 100· 000. Inhibiční poměr proti pevným nádorům· Sarcoma-1810 u ·myší činí 93 ·% v případě intraperitoneálního, a 7<3 % v případě orálního podávání.

.Pro srovnání výtěžků při extrakci byly tytéž pokusy jako v příkladu 1 provedeny za použití 1 N · a 0,4 N roztoků hydroxidu sodného.), přičemž bylo· dosaženo výtěžků, uvedených v tabulce 4. Jak je to z tabulky patrné, výtěžek poklesl, jak se postup extrakce opakuje za· použití extrakčního roztoku téže koncentrace, a bylo- zjstěno, že je velmi nesnadné dosáhnout tak vysokého výtěžku, jako byl dosažen při vícestupňové extrakci.

Tabulka 4

Číslo stupně extrakce	Výtěžek v hmot. % předmětného materiálu ' při extrakci 1' N roztokem hydroxidu sodného	Výtěžek v hmot. ' % předmětného materiálu při extrakci 0,4 N roztokem . hydroxidu sodného
1	10.5	13,8
2	2,4	2,9
3	1,1	2,0
4	0,5	1,5 .
celkem	14.5	20,2

Příklad 3

Za použití téhož zařízení, jako v příkladu 1, se extrahuje 200¹ g suchého mycelia (obsah vlhkosti 9,9 %) Coriolus veťslcolor (Fr.) Quél. (FERM-P No. 2414) nejprve za použití 3 litrů vody za teploty 95+2 °C po 3 hodiny, a potom se po ochlazení oddělí odsáváním- zbytek mycelií, který se promyje litrem vody, načež se' smícháním podílu z promývání s podílem· extrakce získá asi 3,5 litru extrakčního roztoku.

Dále se ke zbytku mycelií přidají 2 litry 1 N roztoku hydroxidu sodného· pro extrakci při 90 až 95' °C po dobu 30 minut s následujícím ochlazením, neutralisováním 2 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, odsáváním a promytím litrem vody. Získají se ' tím· 3 litry extrakčního roztoku a zbytky hub.

Všechny podíly z extrakcí se smíchají dohromady, a zahustí se ve vakuu, dále se zpracují dialysou, znovu zahuštěním· a lyofilisací stejným postupem, jako je to popsáno v příkladu 1. Získá se tím· 33 g játrově hnědého prášku s obsahem vlhkosti 7,0^!.%, což odpovídá výtěžku 21,0 %.

Elementární analysa: 41,7 % uhlíku, 6,4 · % vodíku, 3,9% dusíku a 48,0% kyslíku. Za použití testů, popsaných v příkladu 1 bylo· potvrzeno, že látkou je polysacharid, obsahující dusík, o molekulové hmotnosti 10 0Q0 až 300009· a., se · střední molekulovou hmotností 98 OClO.

Inhibiční poměr této látky na pe'vné nádory Sarcoma-180 u myší činí ' 94 % při inlraperitoneálním a 68 % při orálním · podávání.

P ř í k 1 a d 4

Za použití zařízení z příkladu 1 se 200 g suchých vláken Coriolus versicolor (Fr.) Quél (FERM-P No 2414) s obsahem vlhkosti 8,7 · % extrahuje nejprve za použití 2,4 litru vody za· · teploty 95+2 °C po 3 hodiny, načež se po· ochlazení oddělí odsátím zbytek od extraktu, a zbytek se dále promývá' za použití 500 ml vody. Smícháním s extrakčním roztokem se získá asi 2,5 litru extrakčního roztoku.

Zbytek se smíchá s dvěma litry 00 N roztoku hydroxidu sodného a extrakce· se provádí hodinu za teploty 90+2 °C, načež následuje ochlazení, neutralisování 2 N roz tokem kyseliny chlorovodíkové, odsávání a promytí za použití 500 ml vody. Oddělí 'se tím 2,5 litru extraktu od 'zbytku. Podobný postup- extrakce se opakuje za použití 2 litrů 1 N roztoku hydroxidu sodného za teploty 80+2 °C po· dobu jedné hodiny, a získá se tím 2,5 litru extrakčního· roztoku.

Všechny podíly z extrakcí se smíchají dohromady, následuje zahuštění ve vakuu, dialysa, opět zahuštění a lyofilisace jako v příkladu 1 za vzniku 43,4 g játrově hnědého prášku s obsahem vlhkosti 7,5 '%. Výtěžek činí 22%. Elementární analysa: 42,3ⁱ % C, 6,5 % H, 2,2% N a 49,(0 % O. Za použití testů z příkladu 1 bylo' rovněž potvrzeno, že látkou je polysacharid, obsahující dusík, a mající molekulovou hmotnost 10009’ až 3000000 se střední molekulovou hmotností 110' Ό00.

Inhibiční poměr této látky proti pevným nádorům Sarcoma-180 u myší odpovídá 96 ' % při intraperitoneálním podávání a 75·% při orálním podávání.

Pro srovnání výtěžků exktrace byl proveden podobný extrakční postup za použití pouhé vody jako extrakčního rozpouštědla. Výtěžek předmětné látky činil pouhých 7,6 procent.

Příklad '5

Do baňky opatřené míchadlem se předloží 200 g vysušeného mycelia vždy příslušného kmene Coriolus versicolor nebo kmene· dalších druhů náležejících k rodu Coriolus, u- _ vedených v následující tabulce 5, a, provede se první, extrakce při teplotě 95+2 *°C. Táto extrakce se provádí za míchání a trvá ' 3 hodiny. Po ochlazení na teplotu místnosti se směs rozdělí filtrací na filtrát a filtrační koláč, který se za stejných podmínek jako výše znovu extrahuje čerstvou vodou. Po oddělení a promytí se zbytek na filtru opakovaně extrahuje celkem čtyřikrát vždy 2 litry hodného roztoku hydroxidu sodného o normalitě 0,1 N, pak 0,2 N, ' 0,3 N a konečně 0,4 N. Všechny extrakce se provádějí ' shora ' popsaným způsobem s ' tím, že' se každý extrakt po filtraci vždy neutralizuje 2 N vodnou ' kyselinou chlorovodíkovou. Vodný extrakt, neutralizované extrakty v hydroxidu sodném a prolmývací kapaliny se spojí, zahustí se za sníženého tlaku na Objem 700 -ml a pak se hodiny dialyzují při teplotě 5°C. Dialyzát se dále zahustí a lyofilizuje se, čímž se vždy získá játrově hnědě zbarvený práškový produkt.

Vlastnosti těchto izolovaných práškových produktů se zjišťují způsobem popsaným v příkladu 1 a jsou shrnuty do následující tabulky 5.

Čísla uvedená ve sloupci označeném FERM-P č. představují příslušná čísla ve sbírce shora uvedeného Fermentation Research Institute, Agency of Science and Technology.

Stupeň inhibice v %, uváděný v tabulce 5, byl zjišťován na myši s transplantovaným nádobem Sarcoma 180.

Tabulka 5 vlastnosti produktů Izolovaných z různých kmenů Coriolus versicolor a dalších hub rodu Coriolus organismus

FERM-P č. výtěžek elementární analýza (%) stupeň

C Η N inhibice (%)

versicolor (Fr.) Quél.	2412	31,2	40,3	6,2	2,9	91
versicolor (Fr.) Quél.	2413	31,0	40,4	6,1	2,9	90
versicolor (Fr.) Quél.	2415	29,0	40,8	6,0	3,0	90
versicolor (Fr.) Quél.	2416	3'0,0	40,2	6 2	2,8	91
versicolor (Fr.) Quél.	2417	28,5	40,6	6 0	2,9	90
versicolor (Fr.) Quél.	2418	29,0	40,4	6,1	2,8	92
versicolor (Fr.) Quél.	2419	30,0	40,4	6,2	2,9	92
versicolor (Fr.) Quél.	2420	30,6	40,6	6.1	2,8	91
versicolor (Fr.) Quél.	2421	28,6	40,8	6,2	2,9	90
versicolor (Fr.) Quél.	2422	29,2	40,2	6,1	2,9	92
versicolor (Fr.) Quél.	2423	2'9,7	40,7	6,0	3,0	91
versicolor (Fr.) Quél.	2424	30,0	40,5	6,2	2,8	90
versicolor (Fr.) Quél.	2425	29,4	40,3	6,1	3,0	92
versicolor (Fr.) Quél.	2426	29,8	40,5	6,2	3,3	92
hirisutus (Fr.) Quél.	2711	29,0	40,2	6,0	5,0	91
pargamenus (Fr.) Pat.	2712	27,0	39,5	5,9	4,3	83
consors (Berg.) Imaz.	988	30,5	39,8	5,9	4,4	69

PŘEDMĚT VYNALEZU

Claims

1. Způsob izolace polysacharidu obsahujícího 2 až 8 % hmotnostních dusíku a vykazujícího proitinádorovou účinnost, extrakcí houby z třídy Basidiomycetes vodným rozpouštědlem, vyznačující se tím, že se houba rodu Coriolus čeledi Polyporaceae nejprve extrahuje vodou nebo zředěným vodným roztokem hydroxidu sodného v množství odpovídajícím pětinásobku až dvěstěnásobku hmotnosti houby, při teplotě 50 až 100 °C, načež se opakovaně extrahuje vodnými roztoky hydroxidu sodného s postupně se zvyšující koncentrací až do 2,0 N, v množství odpovídajícím pětinásobku až dvěstěnásobku hmotnosti houby, při teplotě 50 až ÍOO^C, přičemž tato extrakce se opakuje třikrát až osmkrát a celková doba extrakce činí 1 až 20 hodin.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako houba používají přírodní nebo uměle vypěstované buňky nebo mycelium.

.3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako houba používá Coriolus versicolor (Fr.) Quél.