DE3031152C2

DE3031152C2 -

Info

Publication number: DE3031152C2
Application number: DE3031152A
Authority: DE
Inventors: Kenzo Kanazawa Jp Tami; Isamu Saikawa; Takashi Yasuda; Shohachi Toyama Jp Murakami; Toyoo Kanazawa Jp Maeda; Hisatsugu Toyama Jp Tsuda; Hiroshi Takaoka Jp Sakai; Masatoshi Toyama Jp Sugita; Yoshiko Namerikawa Jp Yamamoto; Hisashi Minami; Takako Toyama Jp Hori
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1979-08-24
Filing date: 1980-08-18
Publication date: 1989-08-03
Also published as: FI68080C; FI68080B; DK361680A; CA1174618A; PT71730A; FR2463619B1; FR2463619A1; CH648042A5; DE3031152A1; SE8005921L; FI802641A; GB2059969A; NL8004759A; NO802499L; DK151639C; AU6164680A; DK151639B; AT375674B; GB2059969B; SE446406B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen definierten neuen Substanzen mit carcinostatischer und die Immunreaktion stimulierender Wirksamkeit, nämlich die in der vorliegenden Anmeldung auch als "TF-Substanz" bezeichneten Sunstanzen TF-100, TF-110, TF-120, TF-130, TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-136, TF-140 und TF-150. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der neuen Substanzen, die Verwendung der neuen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen sowie den Mikroorganismus Fusobacterium nulceatum TF-031=DSM 2900 als Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In den letzten Jahren wurden in verstärktem Maße Heilmittel zur Behandlung von Patienten mit verschiedenen Krebstypen eingesetzt, die immunologische Funktionen des Wirtes verstärken und einen carcinostatischen Effekt mit Hilfe der immunologischen Funktion erzielen. Unter den Antitumormitteln, die für derartige Heilmittel verwendet wurden, sind bekannte Komponenten, die von Organismen verschiedener Bakterien oder aus Kulturen verschiedener Bakterien erhalten wurden. Es sind darunter auch Polysaccharide, die aus Fruchtkörpern von Basidiomycetes oder kultivierten Pilzkörpern derselben erhalten wurden. Diese Antitumormittel sind jedoch bisher nicht befriedigend, und zwar hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, schädlicher Nebeneffekte und hinsichtlich des Herstellungsverfahrens.

Andererseits gibt es Berichte über Organismen und eine überstehende Flüssigkeit, die durch die Kultivierung von Bakterien erhalten wurden, die zur Fusobacterium-Gattung gehören, wie z. B. Fusobacterium KO31-3B, Fusobacterium fusifomis W-12, Fusobacterium girans 1012 und Fusobacterium nucelatum 1010 [Dental Surgery, 23, 322-333 (1974), und 21, 534-539 (1972) (japanisch)]. Es wurde bisher jedoch noch keine Untersuchung der Komponenten durchgeführt, die aus einer Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit erhalten wurden, welche durch Kultivierung von Bakterien hergestellt wurde, die zu Fusobacterium nucleatum gehören. Es wurden weiterhin auch keine pharmakologischen Aktivitäten der Komponenten untersucht.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben die pharmakologische Aktivität einer überstehenden Flüssigkeit untersucht, die durch Kultivierung von Bakterien, die zu Fusobacterium nucleatum gehören, und durch Abtrennung des Organismus von der Kultur erhalten wurde. Dabei haben sie gefunden, daß eine spezifische, aus der überstehenden Flüssigkeit erhaltene Komponente eine carcinostatische Aktivität aufweist. Sie haben weiterhin gefunden, daß diese Komponente im wesentlichen keine Hemmwirkung auf die Bildung einer Kolonie von Krebszellen bei einem Kolonie- Schaumbildungsassay-Verfahren aufweist und daß die Komponente nicht dadurch eine carcinostatische Aktivität aufweise, daß sie Krebszellen abtötet, sondern daß die Komponente eine carcinostatische Aktivität zeigt, indem sie nämlich die Antitumor-Aktivität des mit dem Medikament behandelten Wirts oder die Immunität des Wirts erhöht und sich auf diese Weise die Hilfe der Immunität zunutze macht.

Die Erfinder haben weiter gefunden, daß die genannte Komponente eine sehr geringe Toxizität aufweist und auch durch Behandeln der Kultur erhalten werden kann.

Es ist also Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, bei dem ein zu Fusobacterium nucleatum gehörendes Bakterium unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird und neue TF-Substanzen mit carcinostatischen und immunostimulierenden Aktivitäten aus der resultierenden Kultur oder der überstehenden Flüssigkeit derselben isoliert werden. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, die genannten TF-Substanzen zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Mittel zur Herstellung der genannten TF-Substanzen zu schaffen.

Erfindungsgemäß wird Fusobacterium nucleatum TF-031=DSM 2900 verwendet.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Fusobacterium nucleatum TF-031 sind wie folgt.

(I) Form

(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)
(2) Polymorphie der Zellen: fehlt
(3) Beweglichkeit: fehlt
(4) Sporen: fehlen
(5) Gram-Färbung: gramnegativ
(6) Säurebeständigkeit: negativ

(II) Wachstumsbedingungen in einem Kulturmedium

(1) TF-a Agarplatte und geneigtes Kulturmedium äußere Form: rund
Größe: etwa 1 mm
Protuberanz: hemisphärische Form
Struktur: tautropfartig
Oberfläche: glatt
Kanten: glatt
Farbe: milchig gelblich-weiß
Transparenz opak
(2) TF-a flüssiges Kulturmedium
Wachstumsgrad: heftig
Trübung: Koagulum
Präzipität: keines
Wachstum an der Oberfläche: keines, kein Wachstum bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm
Gas: keines

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Produktion von Hydrogensulfid: +
(2) Reduktion von Nitraten: -
(3) Produktion von Buttersäure: +
(4) Produktion von Indol: +
(5) Urease: -
(6) Catalase: -
(7) Hydrolyse von Stärke: -
(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob
(9) Produkt von Ammoniak: +
(10) Produktion von Kohlendioxid: +
(11) Wachstumsbereich: pH 5 bis 8,5, Temperatur 30 bis 45°C
(12) Gasbildung aus Sacchariden: L-Arabinose (-), D-Xylose (-), D-Glucose (-), D-Mannose (-), D-Fructose (-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-), Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-), Stärke (-).

Die neuen TF-Substanzen gemäß der vorliegenden Erfindung werden, schematisch dargestellt, folgendermaßen hergestellt:

Das oben erwähnte Herstellungsverfahren wird im folgenden näher erläutert.

(1) Kultivierung des Bakteriums

Die Kultivierung des Fusobacterium nucleatum DSM 2900 wird mittels eines herkömmlichen Verfahrens zur Kultivierung anaerober Bakterien durchgeführt. Das heißt, es wird ein Kulturmedium verwendet, das eine Stickstoffquelle wie Kalbshirn-Herz-Extrakte, verschiedene Peptone oder dgl.; eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt oder dgl.; ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid oder dgl.; eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder dgl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Thioglykollat oder dgl., entält. Das Medium wird auf einen pH von 6 bis 8,5 und vorzugsweise 7,2 bis 8,2 eingestellt und die Bakterien werden dem Kulturmedium eingeimpft. Daraufhin wird eine steady-state-Kultivierung unter anaeroben Bedingungen bei 35 bis 42°C und vorzugsweise bei 36 bis 38°C während 1 bis 5 Tagen und vorzugsweise während 24 bis 72 Stunden durchgeführt. Es ist insbesondere wünschenswert, das in der Tabelle 1 beschriebene Kulturmedium (im folgenden als "TF-Kulturmedium" bezeichnet) zu verwenden. Die Hirn-Herz-Infusion, bei der es sich um einen Kalbshirn- Herz-Extrakt handelt, ist jedoch nicht mehr als Kohlenstoffquelle notwendig und kann durch eine Herzinfusion ersetzt werden, bei der es sich um einen Kalbsherzextrakt handelt, sowie durch einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt, durch Maisquellwasser oder dgl. ersetzt werden. Unter den verschiedenen Peptonen sind Proteosepepton und Phytonpepton nicht mehr notwendig. Das Trypticasepepton kann durch ein Polypepton ersetzt werden.

Falls Agar nicht verwendet wird, so ist es wünschenswert, eine Kultivierung unter Rühren durchzuführen.

Tabelle 1

(2) Isolierung einer überstehenden Flüssigkeit von der Kultur (Entfernung der Organismen)

Die Organismen werden von der oben erhaltenen Kultur abgetrennt, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die Abtrennung der Organismen kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens erfolgen. Beispielsweise kommt ein Zentrifugieren und ein Filtrierverfahren unter Verwendung eines Filtrierhilfsmittels, wie Hyflo Super Cel, in Frage. Unter dem Gesichtpunkt von Verfahrensführung, dem Grad der Abtrennung der Organismen und der Ausbeute an überstehender Flüssigkeit wird insbesondere ein Zentrifugierverfahren bevorzugt. Die Organismen werden vorzugsweise bei dieser Verfahrensstufe entfernt, sie können jedoch auch in einer nachfolgenden Verfahrensstufe (3) entfernt werden.

(3) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-100

Der oben erhaltenen überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur wird ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zugesetzt, und das dabei gebildete Präzipitat wird aufgefangen. Zu diesem Zeitpunkt ist der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur auf pH 2 bis 7 eingestellt. Die hydrophilen, organischen Lösungsmittel sind Alkohole, wie Äthanol, Methanol oder dgl., und Ketone, wie Aceton und dgl., wenn auch Alkohole, insbesondere Äthanol, zu den besten Ergebnissen führen. Das hydrophile, organische Lösungsmittel wird in zweckentsprechender Weise zugesetzt, so daß seine Konzentration 30 bis 70 Vol.-% und insbesondere 50 bis 70 Vol.-% ausmacht. Nach der Zugabe des hydrophilen, organischen Lösungsmittels wird das resultierende Gemisch bei niedriger Temperatur, vorzgusweise bei etwa 5°C, mehrere Stunden bis einige Tage stehengelassen, um die Bildung des Präzipitats zu vervollständigen. Das auf diese Weise gebildete Präzipitat wird mittels herkömmlicher Verfahren, wie mittels Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren und dgl., abgetrennt.

Anschließend wird Wasser in einer Menge von dem 10- bis 15fachen des oben erhaltenen Präzipitats demselben zugesetzt [das Wasser kann durch einen Phosphatpuffer oder durch einen Natriumchlorid enthaltenden Phosphorpuffer ersetzt werden, falls beabsichtigt wird, TF-120 oder 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 oder 136) zu erhalten, wie im folgenden noch näher beschrieben wird]. Die gebildeten, wasserunlöslichen Materialien werden mittels eines herkömmlichen Verfahrens, wie mittels Zentrifugieren, Filtrieren oder dgl., abgetrennt, worauf die wasserlösliche Fraktion aufgefangen wird. Falls die Kultur verwendet wird, werden die Organismen mittels der oben erwähnten Verfahren entfernt. Die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion wird mittels Lyophilisation (Gefriertrocknung) oder dgl. getrocknet. Dabei erhält man eine carcinostatische Substanz TF-100. Das so erhaltene TF-100 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(4) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-110

Die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion wird einer Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen. Alternativ wird TF-100 in Wasser aufgelöst, und zwar in einer Wassermenge von dem 10- bis 15fachen des TF-100, und die resultierende Lösung wird der Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen. Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Aminosäuren und anorganiche Materialien, werden mittels der oben erwähnten Behandlung entfernt. Die bei der Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene, innere Lösung wird aufgefangen und danach getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-110 erhält. Das auf diese Weise erhaltene TF-110 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(5) Isloierung der carcinostatischen Substanz TF-120

Die in der obigen Stufe 3 erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder gegebenenalls die innere Lösung, die bei der Durchführung der Dialyse oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhalten wurde (die innere Lösung, die in der obigen Stufe (4) erhalten wurde), oder eine Lösung eines Pulvers aus TF-110 in einer geringen Menge Wasser wird mit einem Ionenaustauscher behandelt. Als Ionenaustauscher wird ein schwach basischer Ionenautauscher oder ein schwach basisicher Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung vorzugsweise verwendet. Beispielsweise ist Di äthylaminoäthyl-Sephadex A-50 zur Verwendung geeignet. Eine mit einem Ionenaustauscher gepackte Säule wird äquilibriert, und zwar beispielsweise mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von etwa 8. Daraufhin wird die oben erwähnte Lösung, die behandelt werden soll, durch die Säulen laufenlassen und die eluierte Lösung wird aufgefangen und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet. Alternativ werden der gleiche Puffer, wie er oben verwendet wurde, und die zu behandelnde Lösung in ein Gefäß gegeben, das einen Ionenaustauscher enthält. Der Inhalt wird gerührt und anschließend wird filtriert, woraufhin das Filtrat getrocknet wird. Auf diese Weise kann eine carcinostatische Substanz TF-120 mit den weiter unten beschriebenen Eigenschaften erhalten werden. TF-120 kann auch durch Entsalzen der eluierten Lösung oder des Filtrats, z. B. mittels Dialyse unter Verwendung eines Cellophanrohrs oder dgl., unter Verwendung von Sephadex G-25 oder mittels Ultrafiltration und anschließendem Trocknen des Filtrats erhalten werden. Das auf diese Weise erhaltene TF-120 hat die in Tabelle 2 ausgeführten Eigenschaften.

(6) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-130

Eine Säule, die die adsorbierten Komponenten enthält, aus denen TF-120 mittels der Behandlung der obigen Stufe (5) entfernt wurde, wird mit einem Phosphatpuffer behandelt, und zwar vorzugsweise einem Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,6 M und einem pH von etwa 8 (der Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,6 M wird im folgenden als "0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer" bezeichnet). Alternativ wird die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion, gegebenenfalls nach Dialyse oder Ultrafiltration, der Behandlung mit einem Ionenaustauscher unter Verwendung eines 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid- Phosphatpuffers unterworfen. Man erhält auf diese Weise eine Fraktion, die nicht mit einem Phosphatpuffer eluiert wird, der frei von Natriumchlorid ist, aber andererseits mit einem 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird.

Dieses Verfahren kann entweder in einem Säulensystem oder chargenweise durchgeführt werden. Die angestrebte Fraktion, die auf diese Weise erhalten wird und die mit dem Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird mittels Gefrietrocknung oder dgl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-130 erhält. Das die angestrebte Fraktion enthaltende Eluat, das mit dem zuvor erwähnten Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, kann entsalzt werden, und zwar beispielsweise mittels Dialyse unter Verwendung eines Cellophanrohrs, durch Molekularsiebung unter Verwendung von Sephadex G-25 oder durch Ultrafiltration, und kann anschließend getrocknet werden.

Der hier verwendete Ausdruck "TF-130" bezeichnet umfassend alle angestrebten, eluierten Fraktionen, die durch Behandlung der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder gegebenenfalls der Komponente der inneren Lösung, die durch Dialyse oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhalten wurde, mit einem Ionenaustauscher erhalten werden, und zwar alle solche Fraktionen, die nicht mit einem Phosphatpuffer, der frei von Natriumchlorid ist, eluiert werden, aber andererseits mit einem 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert werden. TF-130 umfaßt konkrete beispielsweise folgende Fraktionen:

(i) Eine Fraktion, die nicht mit einem Natriumchlorid freien Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird ( die Fraktion wird als "TF-1316" bezeichnet).
(ii) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird [die Fraktion wird als "TF-132a und b" bezeichnet; die TF- 132a-Fraktion wird erhalten, indem man einen Ionenaustauscher, der die zuvor erwähnte adsorbierte Komponente enthält, mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer wäscht, den Ionenaustauscher mit einem 0,2 M Natriumchlorid- Phosphatpuffer behandelt und anschließend die Fraktion auffängt, die mit dem 0,2 M Natriumchlorid-Phos phatpuffer eluiert wird; die TF-132b-Fraktion wird erhalten, indem man die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung (TF-110) mit einem Ionenaustauscher behandelt].
(iii) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird (die Fraktion wird als "TF-133a und b" bezeichnet; a und b haben jeweils die gleiche Bedeutung, wie im Falle von TF-132a und b definiert).
(iv) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird (die Fraktion wird als "TF-1323" bezeichnet).
(v) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,5 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird (die Fraktion wird als "TF-136" bezeichnet).

Da diese Substanzen TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 und 136 in folgender Hinsicht gemeinsame Eigenschaften aufweisen, werden die Substanzen mit den gemeinsamen Eigenschaften als "TF-130" bezeichnet. Das heißt, das auf die oben erwähnte Weise erhaltene TF-130 weist folgende Eigenschaften auf:

(a) Grauweiß-hellbraunes Pulver.
(b) Es inhihiert das Wachstum von Ehrlich ascites-Tumor bei Mäusen, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma 180 Carcinom und es besitzt eine immunostimulierende Ak tivität.
(c) Es ist in Wasser löslich und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther.
(d) Es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert deutlich über 200°C.
(e) Ein Infrarot-Absorptionsspektrum, das mittels eines Verfahrens unter Verwendung von KBr-Tabletten erhalten wurde, zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1.
(f) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Ab sorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 256-280 nm.
(g) Es zeigt eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion; seine Ninhydrin-Reaktion ist negativ.
(h) Elementaranalyse-Wert: C 27,5 bis 39,8%; H 3,2 bis 5,7%; N 2,8 bis 6,3%.
(i) Sein Saccharidanteil, bestimmt mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens, beträgt etwa 19,0 bis etwa 64,0 Gew.-% (ausgedrückt als Glucose), und sein Proteingehalt, bestimmt mittels des Lowry-Folin-Verfahrens, liegt in der Nähe von 6,0 bis 28,0 Gew.-% (ausgedrückt als Kalbserumalbumin).

Die oben erwähnte Ionenaustauscherbehandlung wird im folgenden noch näher erläutert. Als Ionenaustauscher bei den folgenden Verfahren wird vorzugsweise ein schwach basicher Ionenaustauscher oder ein schwach basischer Ionenaustauscher mit Molkularsiebwirkung verwendet. Beispielsweise eignet sich das in der obigen Stufe (5) verwendete Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50, und es kann folgendes Verfahren in einem Chargensystem durchgeführt werden.

(i) ein 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, wird durch eine Säule eines die adsorbierten Komponenten enthaltenden Ionenaustauschers, durch den die zu behandelnde Lösung in der obigen Stufe (5) laufenlassen wurde, hindurchgeleitet und die eluiert Fraktion wird aufgefangen. Die Fraktion wird gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. entsalzt und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-1316 erhält. Das auf diese Weise erhaltene TF-1316 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(ii)-1) Ein 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, wird durch eine Säule eines Ionenaustauschers, enthaltend die nach Durchlaufen der zu behandelnden Lösung in der obigen Stufe (5) adsorbierte Komponente, durchlaufen lassen, um die Säule zu waschen. Daraufhin wird ein 0,2 M Natrium chlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, durch die Säule laufenlassen und die eluiert Fraktion wird aufgefangen, gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. entsalzt und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-132a erhält. Das auf diese Weise erhaltene TF-132a hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(ii)-2) Unter Verwendung der in Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder der in Stufe (4) erhaltenen, inneren Lösung werden auf die folgende Weise Verfahren zur Isolierung der Fraktion durchgeführt, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird. Auf diese Weise wird TF-132b erhalten. Das heißt, die mit dem Ionenaustauscher bepackte Säule wird mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 erwähnt, äquilibriert. Daraufhin wird der zuvor erwähnte 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder die durch Behandeln der wasserlöslichen Fraktion mittels Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene Komponente der inneren Lösung durch die Säule laufenlassen und die eluiert Lösung wird aufgefangen. Gegebenfalls wird die Säule mit dem erwähnten 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen und die eluiert Lösung und die Waschlösungen werden kombiniert. Die Behandlung mit dem Ionenaustauscher kann mehrere Male durchgeführt werden. Anschließend wird eine Lösung, die durch Verdünnen der oben erwähnten, eluierten Lösung mit einem Phosphatppuffer in der Weise hergestellt wurde, daß die Natriumchloridkonzentration 0,1 M sein kann, durch eine Säule laufenlassen, in der der Ionenaustauscher mit 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert wurde. Die Fraktion, die mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird entfernt und anschließend wird der oben erwähnte 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu erhalten. Bei dem konkreten Beispiel der oben erwähnten Behandlung mit dem Ionenaustauscher wird eine Fraktion aufgefangen, die nicht an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen wurde und anschließend mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, um ein Eluat zu erhalten. Es kann auch ein Verfahren verwendet werden, bei dem umgekehrt die Fraktion, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, aufgefangen wird und bei dem anschließend ein Verfahren zur Abtrennung der genannten Fraktion aus einer Fraktion durchgeführt wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, und wobei eine Fraktion, die mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, aufgefangen wird.

Anschließend wird das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Eluat gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. entsalzt und daraufhin mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-132b zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-132b hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(iii)-1) Die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung wird durch eine Säule aus einem Ionenaustauscher laufenlassen, der mit einem Phosphatpuffer äquilibriert ist, welcher vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist. Ein 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 wird durch die genannte Säule laufenlassen, um die Säule zu waschen, und anschließend wird 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 durch die Säule geleitet. Alternativ wird der oben erwähnte 0,3 M Natrium chlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet, die in der obigen Stufe (ii)-1) behandelt wurde und noch die restliche, adsorbierte Komponente aufweist. Die eluierte Fraktion wird aufgefangen, gegebenfalls konzentriert, mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. entsalzt und dann mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substan TF-133a erhält. Die so erhaltene Substanz TF-133a besitzt die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(iii)-2) Die Fraktion, die nicht mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der Ionenaustauscher behandlung eluiert wird, wird auf die folgende Weise aufgefangen, um TF-133b zu erhalten. Dabei handelt es sich um das gleiche Verfahren wie bei der obigen Stufe (ii)-2). Das heißt, die mit dem Ionenaustauscher bepackte Säule wird mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert. Daraufhin wird der oben erwähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder es wird die durch Behandeln der wasserlöslichen Fraktion mittels Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene Komponente der inneren Lösung durch die Säule laufenlassen und die eluierte Lösung wird aufgefangen. Gegebebenenfalls wird die Säule mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen und die eluiert Lösung und die Waschflüssigkeit werden kombiniert. Die Ionenaustauscherbehandlung kann mehrere Male durchgeführt werden. Danach wird eine Lösung, die in der Weise durch Verdünnen der zuvor erwähnten eluierten Lösung mit einem Phosphatpuffer hergestellt wurde, daß die Natriumchloridkonzentration 0,2 M betragen kann, durch eine Säule laufenlassen, in der der Ionenaustauscher mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit vorzugsweise einem pH von etwa 8 äquilibriert wurde. Die Fraktion, die mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird entfernt, woraufhin der zuvor erwähnte 0,3 M Natriumchlorid- Phosphatpuffer durch die Säule geleitet wird, um ein Eluat zu erhalten. In dem konkreten Beispiel der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung wird eine Fraktion aufgefangen, die nicht an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid- Phosphatpuffer äquilibriert wurde, an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen wurde und anschließend mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, um ein Eluat zu zu erhalten. Es kann auch ein Verfahren angewendet werden, bei dem umgekehrt eine Fraktion aufgefangen wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem obgengenannten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, und bei dem anschließend ein Verfahren zur Abtrennung der genannten Fraktion von einer Fraktion durchgeführt wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, welcher mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, wobei eine Fraktion aufgefangen wird, die mit dem obengenannten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde.

Anschließend wird das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Eluat gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. entsalzt und nachfolgend mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet, um die angestrebte carcinostatosche Substanz TF-133b zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-133b hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(iv) Die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung wird in einen 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 überführt und der auf diese Weise erhaltene Puffer wird durch eine Ionenaustauschersäule laufenlassen, die zuvor mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird durch Zugabe eines Phosphatpuffers in der Weise eingestellt, daß die Natriumchloridkonzentration 0,1 M betragen kann. Anschließend wird die Lösung durch eine Ionenaustauschersäule geleitet, die zuvor mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde, und anschließend wird der oben erwähnte 0,3 M Natriumchlorid- Phosphatpuffer durch die genannte Säule geleitet, woraufhin die eluierte Fraktion aufgefangen wird, gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. entsalzt wird und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet wird, um eine carcinostatische Substanz TF-1323 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-1323 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
(v) Die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung wird durch eine Säule eines Ionenaustauschers laufenlassen, der mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde. Ein 0,5 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 wird zum Waschen durch die genannte Säule geleitet und danach wird ein 0,6 M Natriumchlorid- Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 durch die genannte Säule laufenlassen. Alternativ wird der zuvor erwähnte 0,5 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule laufenlassen, die zuvor in der obigen Stufe (ii)-2) behandelt wurde und noch die verbleibende, absorbierte Komponente umfaßt, woraufhin der zuvor erwähnte 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet wird. Die eluierte Fraktion wird aufgefangen, gegebenenfalls konzentriert, mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. entsalzt und anschließend mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-136 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-136 hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigen schaften.

(7) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-140

Zur Bildung eines Bariumsalzes werden Bariumionen entweder zu der in den obigen Stufen (1) oder (2) erhaltenen Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit oder zu der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu der durch Auflösen von TF-100 in Wasser erhaltenen Lösung gegeben. Anschließend wird das Präzipitat abgetrennt und danach einem Verfahren zur Entfernung des Bariums unterworfen. Die wasserlösliche Fraktion wird aufgefangen und danach einer Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen, um TF-140 zu erhalten. Im einzelnen wird folgendermaßen vorgegangen: Eine wäßrige Bariumhydroxidlösung, vorzugsweise eine 0,1 bis 0,5 molare wäßrige Bariumhydroxidlösung, wird zu der in den obigen Stufen (1) oder (2) erhaltenen Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit oder zu der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu einer durch Auflösen von TF-100 in Wasser erhaltenen, wäßrigen Lösung gegeben, und zwar in einer Menge von etwa dem 10- bis 15fachen der Menge des TF-100. Der pH der resultierenden Mischung wird vorzugsweise auf 10 bis 13 eingestellt, um ein Bariumsalz zu bilden. Durch die Zugabe einer Bariumhydroxidlösung scheidet sich ein Präzipitat ab, und die zugegebene Menge an Bariumionen wird vorzugsweise so eingestellt, daß die Konzentration der Gesamtmenge der Bariumionen, bezogen auf das Endvolumen der Mischung, 0,005 bis 0,1 M beträgt. Die auf diese Weise erhaltene Mischung wird filtriert, und es wird ein Verfahren zur Abtrennung des Bariums aus dem erhaltenen Bariumsalz durchgeführt. Das Barium wird vorzugsweise entfernt, indem man das Bariumsalz zu Natriumsulfat, und vorzugsweise einer 5- bis 15%igen wäßrigen Natriumsulfatlösung, gibt, die resultierende Mischung rührt und danach eine Filtration durchführt, um eine Lösung zu erhalten. Der abgetrennte Niederschlag wird mit einer wäßrigen Natriumsulfatlösung wiederholt gewaschen und die Waschflüssigkeiten werden mit der oben erwähnten Lösung kombiniert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird einer Dialyse, Ultrafiltration oder dgl. unterworfen, um den Überschuß an Natriumsulfat oder Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Die resultierende Lösung wird anschließend mittels Gefriertrocknung oder dgl. getrocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-140 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-140 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(8) Islolierung der carcinostatischen Substanz TF-150

Die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene, innere Lösung wird mit einem quaternären Ammoniumsalz behandelt. Das dabei gebildete Präzipitat wird abgetrennt und danach unter Verwendung einer Lösung, enthaltend Natriumchlorid, dissoziiert, woraufhin ein hydrophiles, organisches Lösungmittel zu der löslichen Fraktion zugegeben wird. Das auf diese Weise gebildete Präzipitat wird abgetrennt und danach getrocknet, wobei man TF-150 erhält. Als quaternäres Ammoniumsalz, das bei diesem Verfahren eingesetzt werden kann, kommt gewöhnlich irgendein Komplex mit einem Polysaccharid in Frage. Besonders bevorzugte Beipsiele deselben umfassen Cetyl-pyridiniumchlorid, Cetyl- trimethylammoniumbromid etc.. Die Behandlung mit einem quaternären Ammoniumsalz wird vorzugsweise in Gegenwart eines Puffers, wie eines Boratpuffers oder dgl., durchgeführt. Im folgenden wird die obige Behandlung mit einem quaternären Ammoniumsalz und das Dissoziationsverfahren unter Verwendung einer Natriumchlorid enthaltenen Lösung näher erläutert. Beispielsweise wird eine wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumsalzes tropfenweise zu der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu der in der obigen Stufe 4 erhaltenen, inneren Lösung zugegeben, während der pH schwach basich gehalten wird. Die resultierende Mischung wird bei 0 bis 50°C während 10 Minuten bis mehrere Stunden gerührt, woraufhin das ausgefallene Präzipitat abgetrennt wird. Das Präzipitat wird mehrere Male mit einer Pufferlösung, vorzugsweise einem 0,1%igen Boratpuffer, enthaltend 0,1 M Natriumchlorid und eine geringe Menge eines quaternären Ammoniumsalzes, gewaschen und danach mit einem Puffer, vorzugsweise einem 0,1%igen Boratpuffer, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid und eine geringe Menge eines quaternären Ammoniumsalzes, dissoziiert, um eine lösliche Fraktion zu erhalten. Nachfolgend wird ein hydrophiles, organisches Lösungsmitel, vorzugsweise ein Alkohol, nachdem die lösliche Fraktion auf einen pH von vorzugsweise 2 bis 6 eingestellt wurde, der löslichen Fraktion in der Weise zugesetzt, daß deren Endkonzentration 50 bis 90% und vorzugsweise 70 bis 90% (nach Volumen) betragen kann. Die auf diese Weise erhaltene Mischung wird mehrere Stunden bis 90 Stunden bei 0 bis 30°C stehengelassen, woraufhin das ausgeschiedene Präzipitat abgetrennt wird, um eine carcinostatische Substanz TF-150 zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-150 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

Tabelle 2

Tabelle 2 (Fortsetzung)

In Tabelle 2 wurde das mit "+" gekennzeichnete Sephadex G-50 eine Säule von 50 mm ⌀×600 mm und destilliertes Wasser als Eluierungsmittel verwendet. Für das mit "++" bezeichnete Sephadex G-200 wurde für TF-110, 120, 132a, 133a, 136 und 140 eine Säule von 44 mm ⌀×500 mm und für TF-1316, 132b, 133b, 1323 und 150 eine Säule von 21 mm ⌀×400 mm verwendet. Als Eluierungsmittel wurde ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7 bei allen Substanzen verwendet. Um das mit "+++" bezeichnete Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm zu erhalten, wurde eine 7,9 mm ⌀×600 mm×2 Säule, beschickt mit TSK-Gel G3000SW, verwendet und die Eluierung wurde bei Zimmertemperatur unter Verwendung eines 0,1 M Phosphatpuffers mit einem pH von 7 als Eluierungsmittel bei einer Durchflußrate von 0,8 m/min durchgeführt.

Die pharmakologischen Wirkungen der erfindungsgemäßen carcinostatischen Substanzen TF-100, TF-110, TF-120, TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF133a, TF-133b, TF 1323, TF-140 und TF-150 sollen im folgenden erläutert werden.

(I) Wirkung der TF-Substanzen auf die Zell-Lebensfähigkeit (Koloniebildungs-Assay)

Es wird nach dem Verfahren von J. H. Kim et al. [Cancer Res. 25, 698 (1955)] gearbeitet. HeLa S-3-Zellen werden in Eagle's MEM, versetzt mit 10% Kalbsserum, während 3 bis 5 Tagen bei 37°C kultiviert, und zwar in einem CO₂- Inkubator. Danach wird die Kultur entnommen. Zu den am Glas anhaftenden Zellen gibt man eine PBS(-)-Lösung (ein wäßrige Lösung von 8,0 g/l Natriumchlorid, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l einbasisches Natriumphosphat und 0,2 g/l zweibasisches Kaliumphosphat), welches 0,01 Gew.-% Äthylendiamintetraessigsäure und 0,1 Gew.-% Trypsin enthält. Die Zellen werden von der Glasfläche der Kulturfläche abgelöst und durch Pipettierung zu einzelnen Zellen getrennt. Sodann wird die Anzahl der Zellen mikroskopisch festgestellt. Die Zellsuspension wird mit Eagle's MEM mit einem Gehalt von 20% Kalbsserum verdünnt, so daß pro 1 ml 200 Zellen vorliegen. Petrischalen werden mit 1 ml der Zellsuspension geimpft. Sodann erfolgt eine Kultivierung in einem CO₂-Inkubator bei 37°C während 24 h. Die in dem nachstehenden Beispiel 1 (1) erhaltene Flüssigkeit wird zu der Zellsuspension gegeben, so daß man eine Konzentration von 1/16 bis 1/128 erhält. Zu jeweils 1 ml- Portionen der bei 37°C während 24 h kultivierten Zellsuspension gibt man die jeweiligen Testsubstanzen, und in jedem Falle werden die HeLa-Zellen während 7 Tagen kultiviert. Sodann wird das Kulturmedium entfernt. Danach werden die Kulturgefäße mit Hank's Lösung gewaschen. Dann werden die Zellen mit 70 Gew.-% Äthanol fixiert und sodann mit 100 Gew.-% Äthanol gewaschen. Nach Entfernung des Äthanols werden die Zellen mit einer Gimsa-Färblösung angefärbt. Dann werden die Kolonien gezählt und die Lebensfähigkeit oder Vermehrungsfähigkeit der Zellen wird berechnet.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengestellt. Die Lebensfähigkeit oder Vermehrungsfähigkeit der Zellen wird nach folgender Gleichung berechnet.

Die Vermehrungs- oder Lebensfähigkeit der Zellen wird bei jeder Testsubstanz als Durchschnittswert von fünf Versuchen angegeben.

Tabelle 3

Wirkung der überstehenden Flüssigkeit auf die Zellenvermehrungsfähigkeit

Tabelle 4

Wirkung der TF-Substanz auf die Zellenvermehrungsfähigkeit

Man erkennt auf diesen Versuchen, daß die erfindungsgemäßen TF-Substanzen im Vergleich zu der überstehenden Flüssigkeit einen sehr geringen cyctotoxischen Effekt auf HeLa-Zellen haben.

(II) Immunostiumulierende Wirkung

Vier Mäuse vom ICR-Stamm werden jeweils pro Gruppe verwendet. Jede Testsubstanz wird in 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und dann den Mäusen intraperitoneal verabreicht. 24 h nach der Verabreichung werden 0,2 ml einer Kohlenstoffsuspension in den Schwanz der Maus intravenös injiziert. Die Kohlenstoffsuspension wird hergestellt durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche 17, Schwarz und 2 ml physiologischer Salzlösung, welche 3 Gew.-% Gelantine enthält. 1, 5, 10 und 15 min nach der Injektion werden 0,02 ml Blut aus der Augenhöhle entnommen. Hierzu wird eine Hämatokrit-Kapillare verwendet, welche mit Heparin beschichtet ist. Danach wird sofort verdünnt und mit 1,6 ml einer 0,1 Gew.-%igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung hämolysiert. Die Suspension wird sodann bei 675 nm kolorimetriert und der phagocytotische Index, nämlich der K-Wert, wird nach der Gleichung von Halpern et. al. ermittelt. Den Mäusen in der Blindgruppe verabreicht man 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung.

C₀ bedeutet den Kohlepulvergehalt im Blut zur Zeit t₀. C bedeutet den Kohlepulverghalt im Blut zur Zeit t. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 bis 7 zusammengestellt.

Tabelle 5

Tabelle 6

Tabelle 7

Man erkennt aus den Tabellen 5 bis 7, daß die mit den erfindungsgemäßen TF-Substanzen behandelten Gruppen eine Aktivierung der retikuloendothelialen Makrophagen im Vergleich zur Vergleichsgruppen zeigen. Die zelluläre Immunität der normalen Mäuse wird erhöht.

(III) Carcinostatische Aktivität (a) Antitumor-Aktivität gegen Ehrlich ascites Tumor

Ehrlich ascites Tumorzellen werden Mäusen vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt), intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Menge von 1×10⁵ Zellen/Maus. Sodann wird die jeweilige Testsubstanz in 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und dann intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal pro Tag, wiederholt an 7 Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Impfung mit Tumorzellen, oder alternativ einmal am Tag, und zwar am ersten Tag sowie am dritten Tag bis siebten Tag (an insgesamt sechs Tagen). Im Falle der Testsubstanzen der Tabelle 9 erfolgt die Verabreichung derselben einmal pro Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen) nach der Impfung mit Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 8 und 9 zusammengestellt.

Tabelle 8

Man erkennt aus den Tabellen 8 und 9, daß die mit den erfindungsgemäßen TF-Substanzen behandelten Mäuse im Vergleich zu den unbehandelten Mäusen eine verlängerte Lebensdauer zeigen.

(b) Antitumor-Aktivität gegen Ehrlichs festen Tumor

(1) Ehrlich Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stammes (weibliche; 6 Wochen alt) transplantiert, und zwar in einer Anzahl von 4×10⁶ Zellen/Maus. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz den Mäusen einmal am Tag insgesamt sieben Tagen wiederholt verarbreicht, und zwar beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Tumorzellen, oder alternativ einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen). Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Das Gewicht des jeweiligen Tumors wird am 11. oder 14. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen bestimmt. Das Gewicht der Tumoren wird ermittelt durch Messung des größten Durchmessers a (mm) und des kleinsten Durchmessers b (mm), und zwar mit Hilfe eines Testgeräts. Das Gewicht wird nach folgender Gleichung ermittelt:

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 10 zusammengestellt. In dieser und in den folgenden Tabellen werden folgende Abkürzungen gewählt:

i. v. = intravenös; i. p. intraperitoneal;
s. c. = subkutan; i. m. intramuskulär.

Tabelle 10

(2) Ehrlichs Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des ICT-Stamms (weiblich; 6 Wochen alt) in einer Menge von 4×10⁶ Zellen/Maus tranplantiert. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz verbreicht. Die Mäuse werden in Gruppen unterteilt. Die Verabreichung erfolgt intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär, und zwar in einer Dosis von 10 mg/kg oder 20 mg/kg einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten Tag bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen) nach der Transplantation der Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Tumorgewichte werden am 13. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen ermittel.

Tabelle 11

Man erkennt aus den Teilen 10 und 11, daß bei Verabreichung der erfindungsgemäßen TF-Substanz ein Tumorwachs tumsinhibierungseffekt beobachtet wird.

(c) Antitumor-Aktivität gegen Sarcoma-180 Carcinome

Sarcoma-180 Carcinom wird intraperitoneal transplantiert, und zwar an Mäusen vom ICR-Stamm (weiblich; 6 Wochen alt) in einer Menge von 1×10⁵ Zellen/Maus. Nachfolgend wird jede Testsustanz intraperitoneal verarbreicht, und zwar in einer Menge von 1 mg/kg, 5 mg/kg oder 10 mg/kg einmal am Tag vom ersten Tag bis zum siebten Tag wiederholt (an insgesamt 7 Tagen), beginnend mit dem Tag der Transplantation der Tumorzellen, der alternativ einmal pro Tag am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen). Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt.

Tabelle 12

Man erkennt aus Tabelle 12, daß die mit den erfindungsgemäßen TF-Substanzen behandelten Tiere im Vergleich zu den Vergleichsgruppen Antitumor-Aktivitäten zeigen.

(d) Antitumor-Aktivität gegen B-16 Melanome

(1) B-16 Melanom-Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des BDF₁-Stammes (männliche; 7 Wochen alt) transplantiert, und zwar in einer Menge von 1×10⁶ Zellen/Mäusen. Nachfolgend wird die Substanz TF-133a intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Dosis von 5 mg/kg oder 10 mg/kg einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen), nach der Transplantation der Tumorzellen. In gleicher Weise werden den Vergleichstieren 0,2 ml physiologischer Salzlösung verabreicht. Einer weiteren Gruppe wird 5-FU verabreicht, und zwar in einer Menge von 20 mg/kg. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengestellt.

Tabelle 13

Man erkennt aus Tabelle 3, das die mit TF-133a behandelten Tiere eine offensichtliche Tumorwachstums-Inhibierungsaktivität zeigen, und zwar im Vergleich zu denjenigen der Blindgruppe. Die Tiere zeigen bei Behandlung mit 5 mg/kg und 10 mg/kg T-133a die gleiche oder eine bessere Tumorwachstums-Inhibierungsaktivität als mit 5-FU behandelte Tiere.

(2) Nach dem in Abschnitt (1) beschriebenen Verfahren werden B-16 Melanom-Tumorzellen transplantiert und TF-132a, TF-133a und 5-FU sowie eine physiologische Salzlösung werden jeweils verabreicht. Am 21. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen werden die Mäuse seziert und die Metastasen der Melanom-Tumorzellen in den Lungen werden ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 auf geführt.

Tabelle 14

Man erkennt aus Tabelle 14, daß bei Verabreichung von TF-132a und TF-133a die Bildung von Metastasen der B-16 Melanom-Tumorzellen in erheblichem Maße inhibiert wird,. und zwar im Vergleich zu der mit 5-FU behandelten Gruppe.

(IV) Akute Toxizität

Die LD₅₀-Werte bei Mäusen sind in Tabelle 15 zusammen gestellt.

Tabelle 15

Die obigen pharmakologischen Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen TF-Substanzen brauchbare carcinostatische Mittel sind. Sie zeigen eine erhebliche Wirksamkeit gegen verschiedene Krebserkrankungen. Sie sind insbesondere wirksam bei festen bzw. soliden Tumoren. Alle TF-Substanzen der vorliegenden Erfindung zeigen ausgezeichnete Effekte. Die Substanzen TF-130, und insbesondere 132a, 132b, 133a, 133b und 1323 sind unter verschiedensten Gesichtspunkten besonders bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen TF-Substanzen können zu verschiedensten pharmazeutischen Mitteln verarbeitet werden, insbesondere zu oral verabreichbaren Mitteln, injizierbaren Mitteln, Suppositorien oder dgl.. Bevorzugt sind Injektionsmittel, Falls orale Mittel hergestellt werden, so können diese verschiedenste Hilfsstoffe enthalten. Sie können in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulatform vorliegen. Wenn Injektionsmittel hergestellt werden, so kann es sich um solche für subkutante Injektionen, intramuskuläre Injektionen und intravenöse Injektionen handeln. Es kommen Suspensionen oder Lösungen oder auflösbare oder dispergierbare Pulver in Frage. Die Injektionsmittel können ein Lokalanaesthetikum enthalten.

Die Dosis der erfindungsgemäßen TF-Substanzen wird je nach dem Zustand des Patienten ausgewählt. Es ist im allgemeinen erwünscht, bei Erwachsenen eine Dosis von 0,01 bis 50 mg/kg einmal am Tag oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise subkutan, intramuskulär oder intravenöse oder durch Injektion direkt in die beeinträchtigte Körperregion.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und anhand von Zeichnungen näher erläutert; es zeigen

Fig. 1 eine mikroskopische Photographie der Form von Fusobacterium nucleatum TF-031, welche erfindungsgemäß eingesetzt wird;

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-100;

Fig. 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von TF-100;

Fig. 4 ein Eluierungsmuster, erhalten bei Gelfiltration dieser Substanz mit Sephadex G-50;

Fig. 5 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 6 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-110;

Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 8 ein Elutionsmuster bei Gelfiltration dieser Substanz mit Sephadex G-200;

Fig. 9 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 10 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-120;

Fig. 11 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 12 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 13 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 14 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-1316;

Fig. 15 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 16 ein Elutionsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 17 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 18 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-132a;

Fig. 19 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 20 ein Elutionsmuster bei Gelfiltration dies 26293 00070 552 001000280000000200012000285912618200040 0002003031152 00004 26174er Substanz an Sephadex G-200;

Fig. 21 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 22 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-132b;

Fig. 23 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 24 ein Elutionierungsmuster bei Gelfiltration dieser Substanz an Sephadex G-200;

Fig. 25 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 26 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-133a;

Fig. 27 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 28 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 29 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 30 in Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-133b;

Fig. 31 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 32 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 33 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 34 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-1323;

Fig. 35 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 36 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 37 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 38 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-136;

Fig. 39 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 40 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 41 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 42 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-140;

Fig. 43 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 44 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 45 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 46 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-150;

Fig. 47 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 48 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200; und

Fig. 49 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

(1) In fünfzehn, jeweils mit einer Schraubkappe ausgerüsteten 2 l Kulturtaschen werden jeweils 2 l eines Kulturmediums gegeben, das 34 g Trypticasepepton, 6 g Phytonpepton, 20 g Proteosepepton, 70 g einer Hirn-Herz- Infusion, 6 g Hefeextrakt, 15 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,5 g L-Cystin, 0,2 g Natriumsulfit, 1,0 g Natriumethioglykolat und 1,4 g Agar enthält; das Kulturmedium wird auf einen pH von 7 eingestellt. Das Kulturmedium wird unter 1,2 at Druck 15 min bei 120°C sterilisiert, anschließend 20 min auf einem siedenden Wasserbad erwärmt und unmittelbar anschließend mit Wasser gekühlt. Daraufhin wird eine Präkulturlösung von Fusobacterium nucelatum TF-031, die zuvor durch Kultivierung in einem Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben hergestellt wurde, dem obigen, wassergekühlten Kulturmedium unter sterilen Bedingungen in einer Menge von 100 ml/Kulturflasche eingeimpft. In einem Inkubator wird während 48 h bei 37°C eine Kultivierung im stabilen Strömungsgleichgewicht durchgeführt. Nach vollständiger Kultivierung wird die Kultur zur Entfernung der Organismen 20 min bei 5°C mit 4000 U/min zentrifuigiert. Die Menge der erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit beträgt etwa 27 l.

(2) Zu der in der obigen Stufe (1) erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit gibt man 40 l Äthanol unter Rühren bei 5°C. Das resultierende Gemisch wird in einem Kühlraum stehengelassen, bis sich das amorphe Präzipitat vollständig abgesetzt hat. Anschließend wird das Gemisch 15 min bei 5°C mit 6000 U/min zentrifugiert. Das Präzipitat wird abgetrennt, mit Äthanol gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält etwa 60 g rohes Pulver.

(3) 20 g des in der obigen Stufe (2) erhaltenen, rohen Pulvers werden in 120 ml Wasser aufgelöst und die wasserunlöslichen Materialien, die sich zu diesem Zeitpunkt gebildet haben, werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min abgetrennt. Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion mit den Waschlösungen kombiniert, die beim zweitmaligen Waschen der wasserunlöslichen Materialien mit 60 ml-Portionen Wasser erhalten wurden. Die resultierende Lösung wird unter vermindertem Druck getrocknet, und man erhält 14 g grauweißes-hellbraunes Pulver von TF-100.

Beispiel 2

Die in Beispiel 1-(3) beschriebene Lösung, die durch Kombinieren der wasserlöslichen Fraktion, die keine wasserunlöslichen Materialien enthält, mit den durch Waschen der wasserunlöslichen Materialien enthaltenen Waschlösungen hergestellt wurde, wird einer Ultrafiltration unterworfen, indem man ein hohles Ultrafiltrationssystem vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) einsetzt. Die innere Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 10 g eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-110.

Beispiel 3

10 g des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine Säule gegeben, die mit Diäthylaminoäthyl- Sephadex A-50 bepackt ist und mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Weiterhin werden 2,5 l des gleichen Phosphatpuffers wie oben, durch die Säule laufenlassen, und die erhaltene, eluierte Lösung wird mit der zuvor aufgefangenen, eluierten Lösung kombiniert. Daraufhin wird die resultierende Lösung unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt, unter vermindertem Druck konzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei man 470 g eines grauweißen- hellbraunen Pulvers von TF-120 erhält.

Beispiel 4

2 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers werden in 24 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min entfernt. Die wasserlösliche Fraktion wird über Nacht gegen destilliertes Wasser bei 5°C dialysiert, indem man ein Cellophanrohr verwendet, und die innere Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Anschließend wird die konzentrierte Lösung auf eine mit 150 ml Di äthylaminoäthyl-Sephadx-A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen, indem man 600 ml eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einem pH von 8 druchlaufen läßt, woraufhin man einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,6 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt, um ein Eluat zu erhalten. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml konzentriert, gegen destillieres Wasser bei 5°C dialysiert, wiederum unter vermindertem Druck konzentriert, unter Verwendung einer Sephadex G-25- Säule entsalzt und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 470 mg grauweißes-hellbraunes TF-1316.

Beispiel 5

Die in Beispiel 1-(3) beschriebene Lösung, die durch Kombinieren der wasserlöslichen Fraktion, welche keine wasserunlöslichen Materialien enthält, und den durch Waschen der wasserunlöslichen Materialien erhaltenen Waschlösungen hergestellt wurde, wird über Nacht gegen destilliertes Wasser bei 5°C dialysiert, und zwar unter Verwendung eines Cellophanrohrs, und die innere Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird dann auf eine mit 50 g Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. 2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einem pH von 8 und 2,5 l eines 0,025 M Phosophatpuffers mit einer Natrium chloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 werden nacheinander durch die Säule laufenlassen, woraufhin man 2,5 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt, um den an der Säule adsorbierten Wirkstoff zu erluieren. Das erhaltene Eluat wird unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystem vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 600 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-132a.

Beispiel 6

In 1,2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natrium chloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 werden 44,2 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers aufgelöst. Die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super Cel entfernt, und das erhaltene Filtrat wird anschließend auf eine Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die erluierte Lösung wird aufgefangen. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, und die Waschlösungen werden mit der oben erwähnten, erluierten Lösung vereinigt. Man erhält 1,67 l einer Lösung. Die Lösung wird erneut auf eine Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die mit 400 ml Di äthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Man erhält 1,68 l einer eluierten Lösung. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natrium chloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, wobei man 1,64 l Waschlösung erhält. Die eluierte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt, und es wird ein 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 in der Weise zugegeben, daß 4,98 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 erhalten werden. Die auf diese Weise erhaltene Pufferlösung wird auf eine Säule gegeben, die einen Durchmesser von 8 cm aufweist und mit 500 ml Diäthylaminoäthyl- Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 gewaschen. Zu 7 l einer Lösung, die durch Vereinigen der Waschlösungen mit der eluierten Lösung erhalten wurde, gibt man einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 zu, 14 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 zu erhalten. Die auf diese Weise erhaltene, eluierte Lösung wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird entfernt. Die Säule wird mit 2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 gewaschen. Anschließend läßt man 2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchlorid konzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufen und fängt die eluierte Lösung auf. Die eluierte Lösung wird konzentriert und unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafilter UK-10) entsalzt. Die Lösung wird weiter entsalzt, indem man eine Sephadex G-25-Säule verwendet, und mittels Aktivkohle entfärbt. Anschließend wird die Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 880 g eines grauweißen- hellbraunen Pulvers von TF-132b.

Beispiel 7

10 g des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Danach läßt man 5 ml eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufen, woraufhin 2,5 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule geschickt werden, um den auf der Säule adsorbierten Wirkstoff zu eluieren. Die erhaltene, eluierte Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird unter Verwendung eines Cellophanrohrs entsalzt und unter Verwendung von Sephadex G-25 vollständig entsalzt. Danach wird die Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 600 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von FT-133a.

Beispiel 8

In 1,2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natrium chloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 löst man 44,2 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers. Die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super Cel entfernt, und das erhaltene Filtrat wird dann auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen und die Waschlösung wird mit der zuvor erwähnten, eluierten Lösung vereinigt, wobei man 1,67 l einer Lösung erhält. Die Lösung wird wiederum auf eine mit 40 ml Diäthylaminoäthyl- Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Man erhält 1,68 l einer eluierten Lösung. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, wobei man 1,64 l Waschlösung erhält. Die eluierte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und es wird ein 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 zugegeben, so daß man 4,98 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchlorid konzentration von 0,2 M und einem pH von 8 erhält. Die auf diese Weise erhaltene, eluierte Lösung wird auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 gewaschen, woraufhin man 2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt und die eluierte Lösung auffängt. Die eluierte Lösung wird konzentriert und unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafilter UK-10) entsalzt. Die Lösung wird weiter unter Verwendung einer Sephadex G-25 entsalzt und mittels Aktivkohle entfärbt. Anschließend wird die Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 590 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-133b.

Beispiel 2

(1) 20 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen, rohen Pulvers werden in 120 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien, die sich zu diesem Zeitpunkt gebildet haben, werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min entfernt. Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion und die durch zweimaliges Waschen der wasserunlöslichen Materialien mit 60 ml-Portionen Wasser erhaltenen Waschlösungen vereinigt und nachfolgend unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) einer Ultrafiltration unterworfen. Die innere Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 10 g eines grauweißen- hellbraunen Pulvers.

(2) In 1 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 werden 25 g des mittels obiger Stufe (1) erhaltenen Pulvers aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird auf ähnliche Weise mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, und die eluierte Lösung und die Waschlösungen werden vereinigt, wobei man 1,6 l einer Mischung erhält. Die Mischung wird auf eine mit 400 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmeser von 8 cm gegeben, die auf ähnliche Weise mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natrium chloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde, und man erhält 1,65 l einer eluierten Lösung. Die eluierte Lösung wird mit 1,7 l der durch Waschen der Säule mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 erhaltenen Waschlösung kombiniert, und das resultierende Gemisch wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 in der Weise verdünnt, daß 10,35 l eines 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 erhalten werden.

Anschließend wird auf die auf diese Weise erhaltene Pufferlösung auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 gewaschen, worauf man 2 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt. Die eluierten Lösungen werden aufgefangen. Die erhaltene, eluierte Lösung wird unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafil ter AK-10) entsalzt und konzentriert, an Sephadex G-25 weiter entsalzt, mittels Aktivkohle entfärbt und danach gefriergetrocknet, und man erhält 1,65 g eines grauweißen- hellbraunen Pulvers von TF-1323.

Beispiel 10

10 g des in Beipsiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Danach werden 6 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,5 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenlassen, woraufhin man 2,5 l eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,6 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenläßt, um den auf der Säule adsorbierten Wirkstoff zu eluieren. Die erhaltene, durchgelaufene Lösung wird unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt, unter vermindertem Druck konzentriert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 130 mg eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-136.

Beispiel 11

15 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen, rohen Pulvers werden in 200 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min entfernt. Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion durch tropfenweise Zugabe einer 0,2 M wäßrigen Bariumhydroxidlösung auf pH 10 eingestellt. Durch die Zugabe der wäßrigen Barium hydroxidlösung scheidet sich ein weißes Präzipitat ab. Es werden weiterhin Bariumionen zugesetzt, bis die Gesamtkonzentration der Bariumionen in dem Endvolumen 0,01 M beträgt. Danach wird die Lösung 30 min gerührt, und das Präzipitat wird durch Filtration isoliert. Das auf diese Weise erhaltene Präzipitat eines Bariumsalzes wird in 10 ml einer 10 gew.-%igen wäßrigen Natriumsulfatlösung suspendiert, ausreichend gerührt und danach abfiltriert. Das Filtrat wird aufgefangen, gerührt und danach auf die gleiche Weise wie oben filtriert, und zwar einmal mit 10 ml einer 10 gew.-%igen wäßrigen Natriumsulfatlösung und zweimal mit 5 ml-Protionen der genannten Lösung. Jedes Filtrat wird aufgefangen. Das zurückbleibende Präzipitat wird weiterhin zweimal mit 10 ml-Protionen Wasser gewaschen und anschließend filtriert, um die Waschlösungen zu isolieren. Das oben erwähnte, aufgefangene Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert, unter vermindertem Druck konzentriert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 0,45 g eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-140.

Beispiel 12

32 g des in Beispiel 1-(2) erhaltenen Pulvers werden in 450 ml Wasser aufgelöst, die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super Cel entfernt, und das erhaltene Filtrat wird über Nacht gegen fließendes Wasser Verwendung eines Cellophanrohres dialysiert. Zu der dialysierten Lösung gibt man tropfenweise 80 ml einer 20%igen (nach Gewicht) wäßrigen Cetylpyridiniumchlorid-Lösung unter Rühren, während man gleichzeitig 200 ml eines 10 gew.-%igen Boratpuffers (pH 9,0) addiert. Das resultierende Gemisch wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt und danach wird das Präzipitat durch Filtration isoliert. Das Präzipitat wird in 150 ml eines 0,1 gew.-%igen Boratpuffers (pH 9,0), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 Gew.-% Cetyl pyridiniumchlorid, suspendiert. Die resultierende Suspension wird 30 min gerührt. Anschließend wird das Präzipitat durch Filtration von der Suspension abgetrennt und erneut in 150 ml eines Boratpuffers (pH 9,0) der obigen Zusammensetzung suspendiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird 30 min gerührt, woraufhin das Präzipitat durch Filtration isoliert wird. Das isolierte Präzipitat wird in 150 ml eines 0,1 gew.-%igen Boratpuffers (pH 9,0), enthaltend 0,5 M Natriumchlorid und 0,2% Cetylpyridiniumchlorid, suspendiert. Die resultierende Suspension wird gerührt und 30 min dissoziieren lassen. Anschließend wird das Präzipitat von der Suspension durch Filtration abgetrennt, und man erhält eine lösliche Fraktion. Das durch Filtration abgetrennte Präzipitat wird nochmals dem gleichen Dissoziierunrgsverfahren, wie oben, unterworfen, um eine lösliche Fraktion zu erhalten. Die beiden löslichen Fraktionen werden vereinigt, und die resultierende, lösliche Fraktion wird mit 10%iger Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 bis 4 eingestellt. Anschließend wird Äthanol in der Weise zugegeben, daß seine Konzentration schließlich 80% des Volumens ausmacht. Die resultierende Lösung wird über Nacht bei 5°C stehengelassen, und das gebildete Präzipitat wird durch Filtration abgetrennt. Man erhält 5,6 g eines grauweißen-hellbraunen Pulvers von TF-150.

Herstellungsbeispiel 1

Die in den Beispielen 1, 2 und 3 erhaltenen Pulver von TF-110 und 120 werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer Lösung, die 0,5% Lidocain enthält, oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und anschließend als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Herstellungsbeispie 2

Die in den Beispielen 4, 5 und 6 erhaltenen Pulver von TF-1316, 132a und 132b werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten pyhsiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und danach als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Herstellungsbeispiel 3

Das in Beispiel 7 erhaltene Pulver von TF-133a wird in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.

Herstellungsbeispiel 4

Das in Beispiel 8 erhaltene Pulver von TF-133b wird in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird bei Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Herstellungsbeispiel 5

Das in Beispiel 9 erhaltene Pulver von TF-1323 wird in Mengen von 1 mg oder 5 mg im Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird in einer sterilisierten physiologischen Salz lösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung bei der Verwendung aufgelöst und danach als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.

Herstellungsbeispiel 6

Die in den Beispielen 10, 11 und 12 erhaltenen Pulver von TF-136, 140 und 150 werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und anschließend als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.

Claims

1. Carcinostatische Substanz TF-100 mit folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor und Ehrlich festem Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mittels dem KBr-Tabletten-Verfahren, weisen Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1 auf;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung weist eine starke Absorption an der Absorptionskante auf und weist einen Absorptionspeak in der Nähe von 256 bis 260 nm auf;
(g) falls es mittels Gelfiltration (Säule: 50 mm ⌀×600 mm; Eluierungsmittel: destilliertes Wasser) unter Verwendung von Sephadex G-50 fraktioniert wird, weist es bei der Messung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bei 400, 430-530, 700-800 und 840-870 ml auf und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich von Porenvolumen bis 390 und 410 bis 430 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7: Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min bei Zimmertemperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolettabsorption bei 220 nm und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, bei 38-60 und 65 min auf;
(i) es zeigt eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion, Lowry- Folins-Reaktion und Ninhydrin-Reaktion;
(j) Elementaranalysenwerte: C 30,6-35,7%, H 4,2-5,2%; N 4,2-5,2%.
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt ist etwa 40,0 bis etwa 46,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folins-Verfahren bestimmter Proteingehalt ist etwa 20,0 bis etwa 23,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbs serumalbumin.

2. Carcinostatische Substanz TF-110 mit folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist in Wasser löslich und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels dem KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1 auf;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorpionskante und zeigt einen Absorptionspeak im Bereich von 256-260 nm;
(g) falls es mittels Gefiltration (Säule: 44 mm ⌀×500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert wird, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett- Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 380 und 600-920 ml, bei der Bestimung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 380, 420-520 und 630-750 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolmen im Bereich vom Porenvolumen bis 380, 420-450 und 620-760 ml auf:
(h) sein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolettabsorption bei 220 nm und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38-60 und 65 min auf;
(i) es zeigt eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion und eine negative Ninhydrin-Reaktion;
(j) Elementaranalysenwerte: C 35,9-41,0%, H 4,5-5,2%; N 4,2-5,2%.
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 30,0 bis etwa 69,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folins-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 18,0 bis etwa 22,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

3. Carcinostatische Substanz TF-120 mit folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist in Wasser löslich und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels dem KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1380-1360, 1140-1000 und 820 cm^-1 auf;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorpionskante und zeigt einen Absorptionspeak im Bereich von 268-272 nm;
(g) falls es mittels Gefiltration (Säule: 44 mm ⌀×500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert wird, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 325 und 775-875 ml; bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 360, 360-480 und 510-760 ml; und bei Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure- Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 380, 420-520 und 620-760 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38-60 min auf;
(i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion und eine negative Ninhydrin-Reaktion;
(j) Elementaranalysenwerte: C 35,1-40,2%; H 4,5-5,5%; N 2,0-3,1%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 56,0 bis etwa 73,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folins-Verfahrens bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 9,0 bis etwa 13,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

4. Carcinostatische Substanz TF-130 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sacroma-180 Carcinom und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels dem KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Spektrum weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1 auf;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorpionskante und zeigt einen Absorptionspeak im Bereich von 256-280 nm;
(g) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;
(h) Elementaranalysenswerte: C 27,5-39,8%, H 3,2-5,7; N 2,8-6,3;
(i) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 19,0 bis etwa 64,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folins-Verfahrens bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 6,0 bis etwa 28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

5. Carcinostatische Substanz TF-1316 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sacroma-180 Carcinom und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptions banden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 256 bis 260 nm auf;
(g) wird es mittels Gelfiltration (Säule: 21 mm ⌀×400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktionniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett- Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 160 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 160 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront und 40-60 min und bei der Bestimmung der Utraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront und 40-60 min auf;
(i) es hat eine postive Molischreaktion, Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;
(j) Elementaranalysenwerte: C 30,0-34,0%; H 3,8-4,4%; N 4,9-5,7%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 35,0 bis etwa 50,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folins-Verfahrens bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 10,0 bis etwa 23,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

6. Carcinostatische Substanz TF-132a mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sacroma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptions banden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 270 bis 280 nm auf;
(g) wird mittels Gelfiltration (Säule: 44 mm ⌀×500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7 unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett- Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 340, 600- 700 und 720-880ml; bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Po renvolumens bis 340, 340-580 und 720-900 ml; und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bei 340 und 340-580 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsrate: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀ 600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultravilolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 30, 38-60 und 65 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 62 und 65 min auf;
(i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;
(j) Elementaranalysewerte: C 34,8-39,8%; H 4,5-5,7%; N 2,8-3,6%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 55,0 bis etwa 64,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folins-Verfahrens bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 18,0 bis etwa 28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumablumin.

7. Carcinostatische Substanz TF-132b mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Aktivität;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich über etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) ein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und hat eine Schulter im Bereich von 265 bis 280 nm;
(g) wird es mittels Gelfiltration (Säule: 21 mm ⌀×400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sepadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultra violett-Absorption bei 260 nm eine schwache Absorptionsbande bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis zu 150 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einen pH von 7, Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur), das unter Verwendung von TSK- GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 36-37 und 48-50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett- Absorption bei 260 nm sehr niedrige Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 32-39 und 45-52 min auf;
(i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol- Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;
(j) Elementaranalysewerte: C 35,3-39,5%; H 4,5-5,6%; N 2,8-5,4%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 23,6 bis etwa 45,5 Gew.-%, ausgedrükt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folins-Verfahrens bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 15,5 bis etwa 28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

8. Carcinostatische Substanz TF-133a mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich über etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) ein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 258-262 nm auf;
(g) wird es mittels Gelfiltration (Säule: 44 mm ⌀×500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sepadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultra violett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 300 und 630-940ml; bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 420 ml; und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 420 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, zeigt bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38 und 50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittel, 50-60 und 62 min;
(i) es ist positiv bei der Molischreaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folins-Reaktion und negativ bei der Ninhydrinreaktion;
(j) Elementaranalysewerte: C 28,0-36,6%; H 3,5-5,1%; N 4,5-6,3%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäuresäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 26,0 bis etwa 35,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folins-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 22,0 bis etwa 28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

9. Carcinostatische Substanz TF-133b mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimilierende Aktivität;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chlorform, Äthylacetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670- 1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1 auf;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Ab sorptionskante und hat eine Schulter in der Nähe von 270 bis 280 mm;
(g) wird es mittels Gelfiltration (Säule: 21 mm ⌀×400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ul traviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 170 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmer temperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, zeigt bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 49-50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38-39 und 52 min auf;
(i) es hat eine positive Molischreaktion, Phe nol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folin's-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;
(j) Elementaranalysenwerte:
C 31,1-38,5%; H 3,9-5,2%; N 3,4-4,7%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccaridgehalt beträgt etwa 19,0 bis etwa 24,5 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 12,9 bis etwa 22,9 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

10. Carcinostatische Substanz TF-1323 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Aktivität;
(c) es ist löslich in Wasser und löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthyl acetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, be ginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorp tionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Schulter in der Nähe von 265 bis 280 nm;
(g) wird es durch Gelfiltration (Säule: 21 mm ⌀×400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 160 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolulmen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmer temperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 36 und 48-50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 36 und 50 min auf;
(i) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phe nol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäurereaktion und Lowry- Folin's-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;
(j) Elementaranalysenwerte:
C 29,9-39,4%; H 3,9-5,6%; N 2,8-5,4%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 19,0 bis etwa 25,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 11,0 bis etwa 17,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

11. Carcinostatische Substanz TF-136 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthyl acetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, be ginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptions banden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und einen Absorptionspeak im Bereich von 256 bis 260 nm;
(g) wird es durch Gelfiltration (Säule: 44 mm ⌀×500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich von 540-930 ml auf, bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol- Schwefelsäure-Verfahrens und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure- Verfahrens weisen alle Fraktionen eine geringe Absorptionsbande auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmer temperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, zeigt bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 28-40 und 42-60 min, und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Ab sorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittel front und 42-60 min;
(i) es hat eine positive Molischreaktion, Phe nol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reak tion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folin's-Reaktion und eine negative Ninhydrin-Reaktion;
(j) Elementaranalysenwerte:
C 27,5-32,6%; H 3,2-4,0%; N 5,0-6,1%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Sacharidgehalt beträgt etwa 19,0 bis etwa 30,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 6,0 bis etwa 12,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

12. Carcinostatische Substanz TF-140 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthl acetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, be ginnt sich bei etw 210°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 280°C;
(e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptions banden in der Nähe von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1140-1000 und 820 cm^-1;
(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 255 bis 260 nm auf;
(g) wird es durch Gelfiltration (Säule: 44 mm ⌀×500 mm; Eluierungsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 300, 500-900 und 900-1000 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 500, 650-850 und 850-1000 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmer temperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront und 40-60 min auf;
(i) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folin's-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;
(j) Elementaranalysenwerte:
C 22,0-28,0%; H 3,0-3,5%; N 5,0-6,5%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure- Verfahrens bestimmter Sacharidgehalt beträgt etwa 5,0 bis etwa 15,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 23,0 bis etwa 32,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

13. Carcinostatische Substanz TF-150 mit den folgenden Eigenschaften:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;
(b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulie rende Wirkung;
(c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthyl acetat und Diäthyläther;
(d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, be ginnt sich bei etwa 110°C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200°C;
(e) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wäßrigen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak in der Nähe von 255 bis 260 nm auf;
(f) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltens Infrarot-Absorptionsspektrum weist Absorptionsbanden im Bereich von 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 und 820 cm^-1 auf;
(g) wird es mittels Gelfiltration (Säule: 21 mm ⌀×400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7) unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 100 und 100-160 ml; und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml auf;
(h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm (Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmer temperatur), das unter Verwendung von TSK-GEL G3000SW (Säule: 7,9 mm ⌀×600 mm×2) erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 32 und 48-60 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 32 und 48-50 min auf;
(i) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phe nol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry- Folin's-Reaktion und eine negative Ninhydrin-Reaktion;
(j) Elementaranalysenwerte:
C 31,0-34,0%; H 4,0-4,4%; N 2,8-3,2%;
(k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Ver fahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt etwa 40,0 bis etwa 55,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 7,0 bis etwa 14 Gew.-%, ausgedrückt als Kalb serumalbumin.

14. Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-100 ge mäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Fusobacterium nucleatum DSM 2900 unter anaeroben Bedingungen kultiviert, der Kultur oder deren überstehender Flüs sigkeit einen Alkohol oder ein Keton so zusetzt, daß seine Konzentration 30 bis 70 Vol.-% ausmacht, wobei der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur auf 2 bis 7 ein gestellt ist, das gebildete Präzipitat abtrennt, eine wasser lösliche Fraktion aus dem Präzipitat auszieht und an schließend trocknet.

15. Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-110 ge mäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Fusobacterium nucleatum DSM 2900 unter anaeroben Bedingungen kultiviert, der Kultur oder deren überstehender Flüssig keit einen Alkohol oder ein Keton so zusetzt, daß seine Konzentration 30 bis 70 Vol.-% ausmacht, wobei der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur auf 2 bis 7 ein gestellt ist, das gebildete Präzipitat abtrennt, eine wasser lösliche Fraktion des Präzipitats der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft und die dabei erhaltene, innere Lösung auffängt und trocknet.

16. Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-120 gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Fusobacterium nucleatum DSM 2900 unter anaeroben Bedingungen kultiviert, der Kultur oder deren überstehender Flüssig keit einen Alkohol oder ein Keton so zusetzt, daß seine Konzentration 30 bis 70 Vol.-% ausmacht, wobei der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur auf 2 bis 7 ein gestellt ist, das gebildete Präzipitat abtrennt, eine wasser lösliche Fraktion des Präzipitats gegebenenfalls einer Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft, die dabei erhaltene, innere Lösung danach mit einem schwach basischen Ionenaustauscher oder einem schwach basischen Ionenaus tauscher mit Molekularsiebwirkung behandelt, die eluierte Lösung auffängt und trocknet.

17. Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-130 gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die gemäß Anspruch 16 an dem Ionenaustauscher adsorbierten Komponenten mit einem Phosphatpuffer entfernt und trocknet.

18. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 5 definierten Substanz TF-1316 nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die adsorbierten Komponenten mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphpatpuffer eluiert.

19. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 6 definierten Substanz TF-132a nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß Anspruch 16 erhaltenen Ionenaustauscher mit den adsorbierten Komponenten mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer wäscht, dann mit einem 0,2 M Nateriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert und diese Fraktion auffängt.

20. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 7 definierten Substanz TF-132b nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die gemäß Anspruch 19 aufgefangene Fraktion gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse oder Ultrafiltration entsalzt und trocknet.

21. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 8 definierten Substanz TF-133a nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß Anspruch 16 erhaltenen Ionenaustauscher mit den adsorbierten Komponenten mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer wäscht, dann mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert und diese Fraktion auffängt.

22. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 9 definierten Substanz TF-133b nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die gemäß Anspruch 21 angefangene Fraktion gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse oder Ultrafiltration entsalzt und trocknet.

23. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 10 definierten Substanz TF-1323 nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß Anspruch 16 erhaltenen Ionenaustauscher mit den adsorbierten Komponenten mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer wäscht, dann mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert.

24. Verfahren zur Herstellung der in Anspruch 11 definierten Substanz TF-136 nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß Anspruch 16 erhaltenen Ionenaustauscher mit den adsorbierten Komponenten mit einem 0,5 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer wäscht und dann mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert.

25. Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-140 gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Fusobacterium nucleatum DSM 2900 unter anaeroben Bedingungen kultiviert, der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit Bariumionen zusetzt, um ein Bariumsalz zu bilden, oder der Kultur oder deren überstehender Flüssig keit einen Alkohol oder ein Keton so zusetzt, daß seine Konzentration 30 bis 70 Vol.-% ausmacht, wobei der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur auf 2 bis 7 ein gestellt ist, und das gebildete Präzipitat isoliert und dann der wasserlöslichen Fraktion des so isolierten Prä zipitats Bariumionen zusetzt, oder der durch Auflösen von TF-100 des Anspruchs 1 in Wasser erhaltenen Lösung Bariumionen zusetzt, um ein Bariumsalz zu bilden, das ge bildete Bariumsalz abtrennt und danach einem Verfahren zur Entfernung des Bariums unterwirft, die wasserlösliche Fraktion auffängt und der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft.

26. Verfahren zur Herstellung der Substanz TF-150 gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Fusobacterium nucleatum DSM 2900 unter anaeroben Bedingungen kultiviert, der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit einen Alkohol oder ein Keton so zusetzt, daß eine Konzentration 30 bis 70 Vol-% ausmacht, wobei der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur auf 2 bis 7 eingestellt ist, das gebildete Präzipitat abtrennt, eine wasserlösliche Fraktion des Präzipitats oder eine durch dIalyse oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhaltene, innere Komponente der Lösung mit einem quater nären Ammoniumsalz behandelt, das gebildete Präzipitat ab trennt und nachfolgend unter Verwendung einer Natrium chlorid enthaltenden Lösung dissoziiert, worauf ein hydro philes, organisches Lösungsmittel zu der löslichen Fraktion zugegeben, das auf diese Weise gebildete Präzipitat abgetrennt und danach getrocknet wird.

27. Verwendung der carcinostatischen Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Behandldung von Krebs erkrankungen.

28. Fusobacterium nucleatum DSM 2900 als Mittel zur Durchführung der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 26.