CH652028A5 - Extrakt aus pflanzen vom genus epimedium sp., verfahren zur herstellung dieses extrakts und verwendung des extrakts als wirksame komponente in einem immunstimulierenden mittel. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Extrakte mit so immunstimulierenden Eigenschaften, erhalten aus Kraut von Pflanzen vom Genus Epimedium sp. der Familie Berbe-ridaceae, auf ein Verfahren zur Herstellung dieses Extrakts und auf immunstimulierende Mittel, die den Extrakt als wirksame Komponente enthalten. 65

Als Pflanzen vom Genus Epimedium sp. sind Epimedium macranthum, M. et D. var. violaceum, Fr., Epimedium sa-gittatum, Bäk., Epimedium macranthum, M. et. D., Epimedium koreanum, Nak. etc. bekannt. Diese Pflanzen sind perennierende Kräuter, welche in Japan, China und Korea etc. natürlich wachsen. Stengel, Blätter und Wurzeln werden in der chinesischen Medizin mit «Inyokaku» bezeichnet-. Die getrockneten Kräuter dieser Pflanzen werden infundiert und als cardial oder tonisch wirksame Heilmittel verwendet. Die Wirkung ist unter den verschiedenen Spezies von Epimedium sp. nicht gross verschieden. Eine einzelne Spezies oder ein Gemisch von zwei oder mehreren Spezies wird als rohe Droge gehandelt unter der Bezeichnung «Barrenwort». Komponenten dieser «Barren-wort» wurden untersucht und die Ergebnisse wurden publiziert, z. B. durch Akai et. al. [Yakugaku Zasshi, 55, 537, 705, 719, 788 und 1139 (1935),] Tomita et al. [Yakugaku Zasshi, 77, 114 und 212 (1957]), Maeda [Tokyo Iji Shinshi, 2133 und 2795 (1932]), Miyake [Okayame Igakukai Zasshi, 49,44 und 2043 (1937]) und Hiroshima et al. [Clinical Report, 4,139 (1979]). Diese Untersuchungen sind jedoch immer noch in vielen Punkten unklar.

Wir haben Untersuchungen an diesen «Barren-wort» unternommen und gefunden, dass ein Extrakt, erhalten durch extrahieren von Pflanzen vom Genus Epidmedium sp. mit einer Mischung von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder mit Wasser allein und Abtrennen einer hochmolekularen Verbindungen enthaltenden Fraktion aus dem erhaltenen wässerigen Extrakt eine ausgezeichnete immunstimulierende Wirkung aufwies. Auf dieser Erkenntnis basiert die vorliegende Erfindung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der im Anspruch 1 definierte Extrakt. Zur Herstellung des Extraktes wird normalerweise mit einer Mischung aus Wasser mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder mit Wasser allein extrahiert und der erhaltene Extrakt wird im Vakuum eingeengt. Als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel kann z.B. ein niedriger Alkohol wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, ein Keton wie Aceton oder ein mit Wasser mischbarer Äther wie Dioxan und ähnliche verwendet werden. Ein Gemisch von zwei oder mehreren dieser mit Wasser mischbaren Lösungsmittel kann auch verwendet werden. Ferner können niedrialiphatische Säuren, wie Essigsäure in Konzentrationen unterhalb 1-normal, mit Wasser mischbare niedrige Amine wie Äthanolamin in einer Konzentration von kleiner als 1 mol/1 und Alkalihydroxide, welche leicht in Wasser löslich sind, wie Natriumhydroxid in einer Konzentration von kleiner als 1-normal als Extraktionslösungsmittel verwendet werden.

Vorzugsweise beträgt der Anteil von organischem Lösungsmittel im Gemisch mit Wasser weniger als 50 Vol.%. Mit Hinblick auf die Konzentrierung wird vorzugsweise der wässerige Extrakt unter Verwendung einer Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel hergestellt. In der vorliegenden Erfindung wurde ein im Handel erhältliches «Barren-wort» eingesetzt, entweder unverändert oder vorzugsweise nach fein zerteilen desselben.

Die Extraktionsoperation wird im folgenden in einer Ausführungsform beschrieben.

«Barren-wort» wird im obengenannten Extraktionslösungsmittel bei Zimmertemperatur während mehreren Stunden bis mehrmals zehn Stunden stehengelassen und anschliessend filtriert. Der Rückstand wird gleicherweise nochmals extrahiert und filtriert und die Operationen werden wiederholt. Alle erhaltene Filtrate werden dann vereinigt und im Vakuum zu einem wässerigen Extrakt eingeengt. Die Extraktion erfolgt üblicherweise bei Zimmertemperatur, sie kann jedoch auch unter Erwärmen erfolgen, wodurch die Extraktionszeit abgekürzt wird. Die Extraktion mit Erwärmen wird vorzugsweise auf dem Wasserbad durchgeführt bei

3

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einer Wasserbadtemperatur von 35 r-55 C während 4-6 h unter Verwendung eines Rückflussaufsatzes. Dabei kann ein Percolator verwendet werden. Der Anteil des verwendeten Lösungsmittels beträgt 5 bis 15 Mal (V/G) denjenigen der Pflanzen vom Genus Epimedium sp. Der Extraktionsrückstand wird vorzugsweise unter denselben Bedingungen drei oder mehrmals weiter extrahiert unter Verwendung des Lösungsmittels in einem Anteil von 0,4 bis 0,6 Mal (V/V) den Anteil vom zuerst verwendeten Lösungsmittel. Die Abtrennung kann durch Filtrieren durch Papier oder Zentrifugieren oder auf ähnliche Weise erfolgen, beste Resultate werden jedoch erhalten durch Unterdruckfiltration unter Verwendung von im Handel erhältlichen Filterhilfsmitteln wie z. B. Ra-diolite Showa Chemical Industry Co., Ltd., Japan oder Fibra Cel, Johns Manville Co. Ltd., USA. Die Druckreduktion erfolgt in herkömmlicher Weise z. B. durch einen Aspi-rator oder eine Vakuumpumpe oder ähnliche. Ein Extrak-tionsgefäss mit innerer Oberfläche aus Glas oder mit emaillierter Oberfläche oder ein Extraktionsgefass aus rostfreiem Stahl wird verwendet.

Der so erhaltene wässerige Extrakt wird anschliessend entfettet. Dieses Entfetten erfolgt durch Zugabe von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln wie niederen aliphatischen Estern wie Äthylacetat, halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Chloroform, mit Wasser nicht mischbaren Äthern wie Diäthyläther oder aliphatischem Kohlenwasserstoff wie n-Hexan und ähnlichen, durch genügendes Schütteln des Gemischs und Abtrennen der wässerigen Phase. Die erhaltene wässerige Phase wird nochmals gleich behandelt und auf dem Wasserbad erwärmt, um das organische Lösungsmittel vollständig zu entfernen und darauf filtriert, wobei ein entfetteter wässeriger Extrakt erhalten wird. Vorzugsweise wird das Lösungsmittel in einem Anteil von 0,5 bis 1,5 Mal (V/V) den Anteil in wässerigem Extrakt eingesetzt und die Operation wird drei bis fünf Mal wiederholt. In einer Variante kann auch das Entfetten vor der Extraktion mit einem gemischten Lösungsmittel eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels und Wasser oder mit Wasser allein durchgeführt werden. Anschliessend wird eine hochmolekulare Verbindungen enthaltende Fraktion aus dem entfetteten wässerigen Extrakt durch fraktionierte Ausfallung, Dialyse oder auf andere herkömmliche Weise erhalten. Es können auch mehrere Verfahren kombiniert werden. Die abgetrennte Fraktion wird dann im Vakuum eingeengt, wobei der gewünschte Extrakt erhalten wird.

Im folgenden soll nun diese Operation im Detail beschrieben werden und zwar in den folgenden zwei spezifischen Ausführungsformen.

(1) Ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wird bei Zimmertemperatur zum entfetteten wässerigen Extrakt gegeben, um Ausfällung zu erreichen. Der Anteil des verwendeten Lösungsmittels ist nicht kleiner als derjenige des wässerigen Extrakts (V/V). Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert und mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel in fünf bis zehnfacher Menge (V/ G) des Niederschlags gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird dann in die 20 bis 50fache (V/G) Menge Wasser gegeben. Dann wird ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel in drei oder mehrfacher (V/V) Menge zur Lösung gegeben um erneute Ausfallung zu bewirken. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wobei der gewünschte Extrakt erhalten wird. Als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel kann z. B. ein niedriger Alkohol wie Methanol oder Äthanol oder ein Keton wie Aceton und ähnliche verwendet werden. Ein Gemisch von zwei oder mehreren dieser organischen Lösungsmittel kann auch verwendet werden. Der so erhaltene Extrakt kann durch Extrahieren mit Wasser weiter gereinigt werden. Im Besonderen kann der Extrakt mit der bis zu zwanzigfachen Menge Wasser (V/G) gemischt werden, worauf bei Zimmertemperatur gerührt und dann filtriert wird. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt, um einen gereinigten Extrakt zu erhalten. Bei diesem Vorgehen erfolgt die Abtrennung des Niederschlags aus dem Filtrat durch Papierfiltration oder durch Zentrifugieren.

(2) Der entfettete wässerige Extrakt wird in einen Dialy-sierschlauch gegeben und Dialyse erfolgt unter Verwendung von destilliertem Wasser oder Leitungswasser als äusserer Flüssigkeit und der Inhalt des Dialysierschlauchs (Anteil mit hochmolekularen Verbindungen enthaltender Fraktion)

wird weiter verarbeitet. Bessere Resultate werden erhalten, wenn die äussere Flüssigkeit mit einem Rührer gerührt wird oder vorbeiströmen gelassen wird. Vorzugsweise dauert die Dialyse ca. 1 Woche, wenn die äussere Flüssigkeit vorbeiströmen gelassen wird. Neben dieser Dialyse kann auch Gelfiltration, Ultrafiltration, Ultrazentrifugierung oder inverse Osmose eingesetzt werden. Zwei oder mehrere dieser Methoden können in Kombination eingesetzt werden. Vom industriellen Standpunkt erfolgt die Dialyse vorzugsweise unter Verwendung einer Dialysierapparatur mit Hohlfasermembranen, z.B. PVA Hollow Fiber Dialyzer (Kuraray Co. Ltd., Japan), SF Filtration System (Kuraray Co. Ltd. Japan) oder Nitto Module (Nitto Denko Co. Ltd. Japan) oder ähnliche.

Das Aussalzen kann als Vorbehandlung vor der Dialyse erfolgen. So kann z. B. ein bekanntes wasserlösliches Salz zum entfetteten wässerigen Extrakt bis zu einer Sättigungskonzentration zugegeben werden, und der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und in Wasser wieder aufgelöst, und anschliessend erfolgt die Dialyse. Als Salze für dieses Aussalzen eignen sich z. B. Chloride wie Natriumchlorid, Cal-ciumchlorid und Aluminiumchlorid, Nitrate wie Kaliumnitrat, Calciumnitrat und Aluminiumnitrat und Sulfate wie Ammoniumsulfat und Magnesiumsulfat und ähnliche.

Die so erhaltene innere Flüssigkeit (der Anteil welcher die hochmolekulare Verbindungen enthaltende Fraktion enthält) wird auf ca. 1/10 konzentriert. Ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wird in der drei- oder mehrfachen Menge (V/V) der konzentrierten Flüssigkeit eingesetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet und ergibt den gewünschten Extrakt. Wie unter (1) genannt, kann der so erhaltene Extrakt durch Extraktion mit Wasser gereinigt werden.

Der so erhaltene Extrakt gemäss vorliegender Erfindung hat die folgenden Charakteristika:

1 Eigenschaften:

(a) Braunes Pulver

(b) bei Auflösung von 100 mg des Extraktes in 50 ml Wasser beträgt der pH-Wert etwa 6,5.

2 Löslichkeit:

(a) Löslich in Wasser

(b) Unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Chloroform.

3 Farbrekationen:

Positiv gegenüber (a) Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, (b) Bial-Reaktion, (c) Molisch-Reaktion und (d) Skatol-Reaktion, jedoch negativ gegenüber (a) Ninhydrin-Reak-tion, (b) 2,4-DNP-Reaktion, (c) Seliwanoff-Reaktion und (d) Naphtoresorcinol-Reaktion.

4 Saccharid-Zusammensetzung:

Arabinose und Calactose.

5 IR-Absorption:

Das IR-Absorptions-Spektrum ist in Fig. 1 wiedergegeben und weist folgende Maxima auf: Ä (cm-1) 3400,1600,1400,1100

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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4

6 UV-Absorption:

Das UV-Absorptions-Spektrum ist in Fig. 2 wiedergegeben und weist folgende Maxima auf:

^5i? (um) 280, 325.

Die unter (4) angeführte Zusammensetzung kann nachgewiesen werden, indem 20 mg des Extraktes durch Zugabe von 5 ml 1-N-Schwefelsäure hydrolisiert werden und nach anschliessendem 2-stündigem Erwärmen auf 100°C durch Zugabe von Bariumhydroxid neutralisiert werden.

Um die Verwendbarkeit der erfindungsgemässen Extrakte nachzuweisen, wurden die folgenden Tests durchgeführt: 1) Macrophage Phagocytose-Funtionstest:

1. Phagocytose an Staphylococcus aureus:

Als Versuchstiere wurden 7 bis 10 Wochen alte weibliche Mäuse vom ICR/JCL-Stamm mit Körpergewicht von 27± 3 g verwendet. Nach zwei Tagen Behandlung mit der Probe wurden aus dem Peritoneum entnommene Proben von mit den Testsubstanzen behandelten Mäusen und von Mäusen einer Kontrollgruppe (behandelt mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit pH von 7,0 im folgenden mit «PBS» bezeichnet) mit RPMI-1640-Medium [G.E. Moore, The Journal of the American Medicai Association, 199, pages 519-524 (1967)] von Nissui Seiyaku Co. Ltd., Japan, gewaschen, wobei abgestossene peritoneale Zellen (im folgenden als «PEC» bezeichnet) gesammelt wurden. Die «PEC» wurden einmal mit RPMI-1640-Medium gewaschen und dann in 10% FBS-RPMI-1640- Medium suspendiert (Nährmedium, erhalten durch Zugabe von 10% foetalem Bovinserum zu RPMI-1640-Medium). Die Zellsuspension wurde mit Türk-Lösung auf 1 x 10® Zellen pro ml eingestellt, s Dann wurden 2 ml der so erhaltenen «PEC»-Suspension in eine TD-15-Flasche mit 4 daran befestigten Deckgläsern gegeben und bei 37 °C während 60 min in einem 5% C02-Inkubator inkubiert, und 0,1 ml einer Suspension von Staphylococcus aureus 209P mit einer Konzentration von io 4 x 108 Zellen pro ml wurde dann zugegeben und die Kultivierung wurde während 20 min fortgesetzt, um Phagocytose zu erreichen. Am Schluss wurde die Kulturlösung dreimal mit Hank's-Lösung gewaschen [J.H. Hanks und R.E. Wallace, Proceedings of the Society for Expérimental Biology is and Medicine, 71, page 196, (1949)] (von Nissui Seiyaku Co. Ltd. Japan). Die Macrophagen-Deckgläser wurden mit Methanol fixiert und mit Giemsa gefärbt um Proben zur Auszählung der Anzahl phagocy tierter Bakterien zu erhalten und 200 Macrophagen wurden auf jedem Deckglas gezählt 20 durch mikroskopische Beobachtung mit Ölimmersionsob-jektiv (1000 bis 2000fache Vergrösserung), um das Phagocy-tose-Verhältnis und die mittlere phagocytierte Bakterienzahl (phagocytierte Bakterienzahl I) zu ermitteln. Ferner wurde die Anzahl Bakterien, phagocytiert durch 100 phagocytie-25 rende Macrophagen gezählt, um die mittlere phagocytierte Bakterienzahl (phagocytierte Bakterienzahl II) zu bestimmen.

Phagocytose-Verhältnis = Anzahl phagocytierender Macrophagen x

200 (Macrophagen)

„ , . . ,, T Anzahl phagocytierte Bakterien

Phagocytierte Bakterienzahl I = -—-—£

200 (Macrophagen)

.. . „ i * • .irr Anzahl phagocytierte Bakterien

Phagocytierte Bakterienzahl II = —-—

100 (phagocytierende Macrophagen)

. • , Jeder gemessene Wert (M) der behandelten Gruppe

Aktivierungsindex = - —- —

Jeder gemessene Wert (M) der nicht behandelten Gruppe

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

2. Phagocytose-Test auf Salmonella Enteritis:

Dieser Test wurde in gleicher Weise wie in 1 beschrieben durchgeführt, wobei jedoch Salmonella enteritidis 116-45 als

Testbakterium verwendet wurde und wobei die Kultivierung 60 min nach Zugabe der Bakteriensuspension erfolgte. Die 45 Berechnung erfolgte in gleicher Weise wie beschrieben unter 1. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Ergebnisse aus Macrophagen-Phagocytose-Test

1 Staphylococcus 2 Salmonella aureus

Test 1 Kontrollgruppe

Mit der Probe behand. Tiere

Test 2 Kontrollgruppe

Mit der Probe behand. Tiere

Phagocytose-Verhältnis I Phagocytose-Bakterienzahl I Phagocytose-Bakterienzahl II

Phagocytose-Verhältnis (%) Phagocytose-Bakterienzahl I Phagocytose-Bakterienzahl II

Phagocytose-Verhältnis {%) Phagocytose-Bakterienzahl I Phagocytose-Bakterienzahl II

Phagocytose-Verhältnis < Phagocytose-Bakterienzahl I Phagocytose-Bakterienzahl II

37.3 ±2.3 (1) 1.29+0.14(1) 3.55 + 0.33(1)

55.73+4.25(1.49) 2.79 + 0.47(2.18) 4.99 + 0.57(1.41)

24.8 ±2.1 (1) 0.59 ±0.04(1) 2.39 ±0.19(1)

33.1 ±8.9 (L34) 0.91 ±0.36(1.54) 2.59 ±0.39(1.08)

28.67 ±0.29(1) 0.48 ±0.06(1) 1.78 ±0.13(1)

40.5 ±2.6 (1.41) 0.93 ±0.18(1.94) 2.37+0.32(1.33)

16.0 ±1.5 (1) 0.25 ±0.06(1) 1.31 ±0.07(1)

18.5 ±1.5 (1.16) 0.36 ±0.02(1.44) 1.37 ±0.06(1.05)

5 * 652 028

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Ergebnisse aus Macrophagen-Phagocytose-Test

1 Staphylococcus 2 Salmonella aureus

Test 3

Kontrollgruppe

Phagocytose-Verhältnis Phagocytose-Bakterienzahl I Phagocytose-Bakterienzahl II

26.83 + 2.57(1) 0.76+0.11(1) 3.03 + 0.14(1)

28.67 ±0.29(1) 0.48+0.06(1) 1.78 ± 0.13(1)

Mit der Probe behand. Tiere

35.50 ±3.10(1.24) 0.68 ±0.06(1.42) 1.97 ±0.10(1.11)

Phagocytose-Verhältnis (%) 42.63 ± 3.36(1.59)

Phagocytose-Bakterienzahl I 1.37 ± 0.35(1.80)

Phagocytose-Bakterienzahl II 3.09±0.51(1.02)

Bemerkungen:

1. In Tabelle 1 bedeutet jeder angegebene Wert den Mittelwert + Standardabweichung.

2. Die in Klammer angegebenen Zahlen bedeuten den Aktivierungsindex.

3. In Test 1 wurde der gemäss Beispiel 12 hergestellte Extrakt subcutan in den Rücken der Maus injiziert in einer Rate von 32 p.g/0,1 ml (PBS)/Maus und eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

In Test 2 wurde der gemäss Beispiel 25 hergestellte Extrakt subcutan in den Rücken der Maus injiziert in einer Rate von 48 ng/0,1 ml (PBS)/Maus und die Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

In Test 3 wurde der Extrakt, hergestellt gemäss Beispiel 36, subcutan in den Rücken der Maus injiziert in einer Rate von 40,5 ng/0,1 ml (PBS)/Maus und eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

4.

5.

3. Reticuloendothealial-Funktions-Test:

Die Probe wurde durch intraperitoneale Injektion bei 7 Wochen alten männlichen Mäusen vom ICR/JCL-Stamm mit Körpergewicht von 30+ 2 g insgesamt 5 Mal während 5 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht.

Um den Einfluss auf die Phagocytose im reticuloendo-thelialen System zu untersuchen, wurde colloidale Aktivkohle (Pelikan acting carbon Cn/1431a von Günther Wagner Co. Ltd., Westdeutschland) in die Schwanzvene der entsprechenden Tiere aus der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe 24 h nach der letzten Behandlung injiziert und die Entfärbung des Bluts wurde nach dem folgenden Verfahren ermittelt. Colloidale Aktivkohle wurde mit physiologischer Kochsalzlösung, enthaltend 3% Gelatine verdünnt, so

25

30

35

Phagocytose-Index : K

20

dass die Kohlekonzentration auf Vz reduziert wurde und die Verdünnung wurde in die Schwanzvene in einer Rate von 10 ml/kg injiziert. Dann wurden 0,010 ml Blut mit einer he-parinbehandelten Micropipette entnommen und unmittelbar in 2 ml 0,1 % Na2C03 zur Auflösung gegeben. Die Absorption bei 650 nm wurde gemessen auf Hitachi Double Beam Model 124 von Hitachi Co. Ltd. Japan. Der Phagocytose-Index wurde bestimmt durch Injizierung der colloidalen Aktivkohle-Lösung in die Vene, Entnehmen von Blut nach 2 min (tx) und 20min (t2) und Durchführen der Berechnung basierend auf den Kohlenkonzentrationen (Cj und C2: nach Verstreichen von 2 min resp. 20 min) in den Proben gemäss folgender Formel:

(logC1) - (logC2)

Halblebenszeit in Blut: T 1/2 :

t2 " fcl

0,301

K

20

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Ergebnisse aus Reticuloendothelial-Funktions-Test

Kl0

T 'A (min.)

Test 1

Kontrolltiere

0.0137 + 0.0039

23.945+ 7.793

Behandelte Tiere

0.0224 + 0.0096

16.281+ 7.762

Test 2

Kontrolltiere

0.0163 + 0.0081

23.505+13.595

Behandelte Tiere

0.0219+0.0104

15.948+ 5.430

Test 3

Kontrolltiere

0.0063+0.0009

48.550+ 6.899

Behandelte Tiere

0.0115+0.0020

27.120 + 5.111

Test 4

Kontrolltiere

0.0165+0.0064

21.377 + 10.619

Behandelte Tiere

0.0223 + 0.0095

15.834+ 5.969

1. In Tabelle 2 sind jeweils Mittelwerte + Standardabweichungen wiedergegeben.

2. In Test 1 bestand eine Gruppe aus 12 Mäusen und der in Beispiel 12 erhaltene Extrakt wurde in einer Rate von 65 p.g/0,1 ml (PBS)/Maus/Tag verabreicht.

3. In Test 2 bestand eine Gruppe aus 12 Mäusen und der Extrakt aus Beispiel 25 wurde in einer Rate von 97 ng/0,1 ml (PBS)/Maus/Tag verabreicht.

4. In Test 3 bestand eine Gruppe aus 6 Mäusen und der Extrakt aus Beispiel 26 wurde in einer Rate von 132 ng/0,1 ml (PBS)/Maus/Tag verabreicht.

5. In Test 4 bestand eine Gruppe aus 22 Mäusen und der Extrakt aus Beispiel 36 wurde in einer Rate von 82 |ig/ 0,1 ml (PBS)/Maus/Tag verabreicht.

652 028

6

In jedem der vorangehenden Tests 1 bis 4 wurde der Pha-gocytose-Index vergrössert durch Behandeln mit dem Extrakt gemäss vorliegender Erfindung und die Halblebenszeit im Blut wurde abgekürzt. Demzufolge konnte nachgewiesen werden, dass die Fähigkeit colloidale Kohle im reticuloen-dothelialen System aufzufangen durch Behandeln mit den erfmdungsgemässen Extrakten vergrössert wird.

Macrophagen werden eingeteilt in freie und fixierte Typen, und Zellen vom freien Typ sind gegenwärtig im Knochenmark, im Blut, in peritonealen Hohlräumen und Alveolen und Zellen vom fixierten Typ sind vorhanden in der Milz, in Lymphknoten und in der Leber. Der Phagocytose-Aktivitäts-Test 1 auf Staphylococcus aureus und der Phago-cytose-Aktivitäts-Test 2 auf Salmonella sind Tests auf Zellen vom freien Typ, und der Reticuloendothelial-Test 3 ist ein Test auf Zellen vom fixierten Typ. Aus den vorgenannten Testergebnissen kann festgestellt werden, dass die Anzahl Bakterien und Fremdstoffe wie sie durch Macrophagen vom freien als auch vom fixierten Typ phagocytiert werden durch Behandeln mit dem erfmdungsgemässen Extrakt vergrössert wird.

(2) Cytotoxizitäts-Test:

(a) als Versuchstiere wurden 7 bis 10 Wochen alte weibliche Mäuse vom BALB/c-Stamm mit Körpergewicht von 22+2 g verwendet. Am Tag der Behandlung mit der Probe wurden BC-47-Zellen (der Stamm, deriviert aus dem Blasenkrebs der Ratte vom ACI-Stamm und in Generationen in Röhrchen kultiviert) in intraperitonealer Injektion in einer Rate von 1 x 107 Zellen pro Maus sowohl bei der behandelten Gruppe als auch bei der Kontrollgruppe (behandelt mit 0,1 ml PBS) verabreicht, um Immunisierung zu erreichen. 7 Tage später wurde das Peritoneum jeder Maus der obengenannten zwei Gruppen mit RPMI- 1640-Medium gewaschen, um PEC zu sammeln. Die gesammelten Zellen wurden zusammengegeben und die PEC wurden zweimal mit RPMI-1640-Medium gewaschen, zentrifugiert und einmal mit 20% FBS-RPMI-1640-Medium gewaschen und dann im letztgenannten Medium suspendiert. Bezüglich jeder Gruppe wurde die PEC-Konzentration auf 3,2 x 105 Zellen pro ml eingestellt durch Auszählen der Anzahl Zellen unter Verwendung von Trypanblau.

(b) BC-47-Zellen, kultiviert im Reagenzglas wurden in 20% FBS-RPMI-1640-Medium suspendiert, wobei eine Suspension von lebenden Zellen in einer Konzentration von 8 x 104 lebenden Zellen pro ml erhalten wurde.

(c) In einer Microplatten-Apparatur mit horizontalem Boden für die Kultur von Zellen [Modell N-1480 mit 96 Lö-

s ehern von NUNC Co., Ltd. Sweden,] 0,1 ml pro Loch der PEC-Suspension (3,2 x 104 Zellen) und 0,1 ml pro Loch der Reagenzglaskultur von BC-47 Zellsuspension (8 x 103 Zellen) wurden bei 37 :C während 24 h in einem 5% C02-Inku-bator kultiviert und dann wurden 0,05jiCi14C-Thymidin in io jedes Loch gegeben und die Kultivierung erfolgte während weiterer 24 h unter denselben Bedingungen.

(d) Nach beendigter Kultur wurde jedes Loch mit PBS gewaschen und BC-47-Zellen, welche am Boden der Löcher festklebten und wuchsen, wurden auf Filterpapier gesam-

i5 melt. Die Quantität 14C, aufgefangen durch dieBC-47-Zellen in jedem Loch (Anzahl 14C-Atome, zerfallen pro min) wurde mit einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Modell LSC-673 von Aloka & Co. Ltd., Japan) ermittelt.

Das Ausbreitungs/Hemmungs-Verhältnis wurde nach 20 folgender Formel berechnet:

A - B

x 100 {%)

A

25

worin A die Menge (M) (dpm/Loch) von 14C, aufgefangen in BC-47-Zellen, allein kultiviert und B die Menge (M) (dpm/Loch 14C, aufgefangen in BC-47-Zellen, kultiviert zusammen mit PEC der normalen Maus, der immunisierten 30 oder der immunisierten und mit der Probe behandelten Maus bedeuten.

Der Aktivierungsindex wurde gemäss folgender Formel berechnet: _

0

35 —-

D

worin C das Ausbreitungs/Hemmungs-Verhältnis (M) der immunisierten und mit der Probe behandelten Maus und D 40 das Ausbreitungs/Hemmungs-Verhältnis (M) der immunisierten Maus bedeutet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle 3

Verbesserte Wirkung auf zelluläre Immunität

Test 1

Test 2

Test 3

BC-47-Zellen allein kult. Normale Mäuse Immun. Mäuse Immun. + behand. Mäuse BC-47-Zellen allein kult. Normale Mäuse Immun. Mäuse Immun. + behand. Mäuse BC-47-Zellen allein kult. Normale Mäuse Immun. Mäuse Immun. + behand. Mäuse

30884 27365 22284. 16862 11208 9905 6081 2920 11208 9905 6649 3960

.3 ±349.7

3 ±926.3

3 ±939.1

.8+725.8

.2+411.1

.4+429.6

.6+819.0

.3 + 176.1

2±411.1

.4+429.6

.83±819.0

.21310.7

0

11.39 27.85

45.40 0

11.62 45.74 73.95 0

11.62 40.67 64.67

1.00 1.63

1.00 1.62

1.00 1.59

Bemerkungen:

1. In Test 1 wurde der Extrakt aus Beispiel 12 subcutan in den Rücken der Maus in einer Rate von 32 ng/0,1 ml (PBS)/Maus verabreicht und eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

2. InTest 2 wurde der Extrakt aus Beispiel 25 subcutan in den Rücken der Maus in einer Rate von 32 |ig/'0,l ml (PBS)/Maus verabreicht und eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

3. In Test 3 wurde der Extrakt aus Beispiel 36 subcutan in den Rücken der Maus in einer Rate von 40.5 ja.g/0,1 ml (PBS)/ Maus verabreicht und eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.

7

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Aus den vorgenannten Ergebnissen kann festgestellt werden, dass durch Behandeln mit dem erfmdungsgemässen Extrakt die Ausbreitung von BC-47-Zellen in der Maus gehemmt werden kann und dass die zelluläre Immunität gegenüber BC-47-Zellen vergrössert wird.

(3) Akute Toxizität:

Die akute Toxizität wurde gemessen nach dem Lichfield-Wilcoxon-Test [J. Pharm. Exp. Ther., 96, 99, (1949)] unter Verwendung von männlichen Mäusen vom ICR/JCL-Stamm. Es wurde gefunden, dass der LD50-Wert (mg/kg) des Extrakts aus Beispielen 12 bis 36 1990 bis 2050 betrug (intraperitoneale Injektion).

Aus den vorangehenden Testergebnissen geht klar hervor, dass der erfindungsgemässe Extrakt wirksam ist für die Vorbeugung und Hemmung von infektiösen Erkrankungen bei Patienten mit reduzierter Immunoaktivität, z. B. alten Patienten mit Krebserkrankungen, welche mit karzinostati-schen Mitteln behandelt werden. Die erfmdungsgemässen Extrakte eignen sich ebenfalls zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Verabreichung in Kombination mit chemotherapeutischen Mitteln oder die erfmdungsgemässen Extrakte können bei Patienten mit reduzierter Leberfunktion oder zur Eliminierung von körperfremden Stoffen (z. B. Medikamenten) eingesetzt werden, wodurch die reduzierte Leberfunktion kompensiert wird.

Die erfmdungsgemässen Extrakte können bei Menschen oral, durch Injektion (intravenös, subcutan oder intramuskulär) oder in irgend einer anderen Form verabreicht werden.

Wenn die erfmdungsgemässen Extrakte in Form von festen Zubereitungen für orale Verabreichung verwendet werden, so können diese Verabreichungsarten Tabletten, Granulate, Pulver, Kapseln oder ähnliche sein. Die Zubereitungen können Zusätze, z.B. Saccharide oder Zellulose, Bindemittel wie Stärkepaste oder Methylzellulose, Füllstoffe etc. enthalten, wobei solche Zusätze pharmazeutisch gebräuchlich sind. Bei Verwendung der erfmdungsgemässen Extrakte in oralen flüssigen Zubereitungen können diese vorliegen in Form von wässerigen Zubereitungen wie Suspensionen, Emulsionen, Sirupen etc. und ferner können sie in Form von getrockneten Produkten vorliegen, welche vor Verwendung aufgelöst werden.

Bei oraler Verabreichung der erfmdungsgemässen Extrakte beim erwachsenen Menschen wird eine Dosis von 3 bis 20 mg/kg pro Tag eingesetzt. Je nach Krankheitszustand, Alter des Patienten, Verabreichungsform etc. kann diese Dosis grösser oder kleiner sein.

Die erfmdungsgemässen Extrakte können in Form von wässerigen Lösungen, Suspensionen oder öligen oder wässerigen Emulsionen injiziert werden, üblicherweise werden jedoch die Injektionen hergestellt durch Auflösen oder Suspendieren der Extrakte in einem wässerigen Medium wie sterilem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung. Je nach Notwendigkeit können Auflösungshilfsstoffe, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Zusätze zur Herstellung isotonischer Lösung etc. zu den Injektionslösungen gegeben werden.

Die so erhaltenen Injektionslösungen werden intravenös, intramuskulär, subcutan oder in irgend einer anderen geeigneten Weise verabreicht. Bei parenteraler Verabreichung beim Erwachsenen betragen die verwendeten Dosen 0,1-5 mg/kg pro Tag. Diese Dosen können je nach Krankheitszustand, Alter des Patienten, Zubereitungsart und Art der Verabreichung grösser oder kleiner gewählt werden.

Beispiel 1

401 von 50% Äthanol (V/V) wurden zu 5 kg fein zerteiltem im Handel erhältlichen «Barren-wort» (epimedium ko-reanum nak. von Korea) gegeben und die Extraktionslösung wurde während 6 h auf 50 C auf dem Wasserbad und mit einem Rückflusskondensator erhitzt. Nach Extraktion wurde das noch warme Gemisch filtriert und der Rückstand wurde nochmals drei Mal in gleicher Weise extrahiert unter Verwendung von jeweils 201 frischem 50% Äthanol (V/V). Die vereinigten Filtrate wurden dann im Vakuum bei 45 C eingeengt, wobei 301 eines wässerigen Extrakts erhalten wurden. Dieser Extrakt wurde in einen Scheidtrichter gegeben und mit 201 Äthylacetat versetzt und das Gemisch wurde durchgeschüttelt und dann die wässerige Phase abgetrennt. Diese wässerige Phase wurde weiter drei Mal in gleicher Weise wie oben erwähnt extrahiert unter Verwendung von jeweils 201 frischem Äthylacetat. Die wässerige Phase wurde im Vakuum eingeengt und das verbleibende Äthylacetat wurde abdestilliert und der Rückstand wurde filtriert, wobei 22,5 1 des entfetteten wässerigen Extrakts erhalten wurden.

Beispiel 2

201 Wasser wurden zu 2 kg fein zerteiltem im Handel erhältlichen «Barren-wort» (epimedium koreanum, nak. von Korea) gegeben und die Extraktionslösung wurde während 6 h auf dem Wasserbad mit Rückflusskondensator versehen auf 50 °C erhitzt. Nach Extraktion wurde das noch warme Gemisch filtriert und der Rückstand wurde drei Mal in gleicher Weise unter Verwendung von jeweils 101 Wasser extrahiert. Die Filtrate wurden vereinigt und bei 45 °C im Vakuum eingeengt und ergaben 121 eines wässerigen Extrakts.

9,01 entfetteter wässeriger Extrakt wurde darauf in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten.

Beispiel 3

20150% Äthanol (V/V) wurden zu 2 kg fein zerteiltem im Handel erhältlichen «Barren-wort» (epimedium macranthum, m. et d. var. violaceum, fr. von Japan) gegeben und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Dann wurde filtriert und der Rückstand wurde drei Mal in gleicher Weise jeweils mit 101 frischem 50% Äthanol (V/V) extrahiert. Die Filtrate wurden vereinigt und dann bei 45 °C und vermindertem Druck eingeengt, wobei 121 eines wässerigen Extrakts erhalten wurden.

Bei gleichem Vorgehen wie in Beispiel 1 wurden daraus 9,01 eines entfetteten wässerigen Extrakts erhalten.

Beispiel 4

201 Wasser wurden zu 2 kg fein zerteiltem im Handel erhältlichem «Barren-wort» (epimedium macranthum, m. et d. violaceum, fr. von Japan) gegeben und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen und dann filtriert und der Rückstand wurde drei Mai in gleicher Weise jeweils mit 101 frischem Wasser extrahiert. Die Filtrate wurden vereinigt und dann bei 45 °C im Vakuum eingeeingt, wobei 121 eines wässerigen Extrakts erhalten wurden.

Bei gleichem Vorgehen wie in Beispiel 1 wurden daraus 9,01 eines entfetteten wässerigen Extrakts erhalten.

Beispiel 5

161 Äthylacetat wurden zu 2 kg fein zerteiltem im Handel erhältlichem «Barren-wort» (epimedium sagittatum, bak. von China lueta) gegeben. Die Extraktion erfolgte bei 50 °C während 6 h mit einem Rückflusskondensator auf dem Wasserbad. Nach beendigter Extraktion wurde das noch warme Gemisch filtriert und der Rückstand wurde zwei Mal in gleicher Weise jeweils mit 161 frischem Äthylacetat extrahiert. Der verbleibende Rückstand nach der letzten Extraktion mit Äthylacetat wurde an der Luft getrocknet und mit 161 Wasser versetzt. Das Gemisch wurde bei 50 °C während 6 h auf dem Wasserbad mit Rückflusskondensator extrahiert, der Rückstand wurde anschliessend zwei Mal in gleicher Weise

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mit jeweils 161 Frischwasser extrahiert, die Filtrate wurden vereinigt, bei 45 r'C im Vakuum eingeengt und filtriert und ergaben 9,01 eines wässerigen Extrakts.

Beispiele 6 bis 11 In gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wurden 2 kg fein zerteiltes, im Handel erhältliches «Barren-wort» behandelt, wobei jedoch die gemäss nachfolgender Tabelle genannten Extraktions- und Entfettungs-Lösungsmittel verwendet wurden. Die erhaltenen Resultate sind ebenfalls wiedergegeben.

Beispiel

Extraktions-

Entfettungs-

Menge des

No.

Lösungsmittel

Lösungsmittel entfetteten

wässerigen

Extrakts (1)

6

59% Methanol (V/V)

Äthylacetat

9,0

7

50% Aceton (V/V)

Äthylacetat

9,0

8

50% Dioxan (V/V)

Äthylacetat

9,0

9

50% Äthanol (V/V)

Chloroform

9,0

10

50% Äthanol (V/V)

Diäthyläther

9,0

11

50% Äthanol (V/V)

n-Hexan

9,0

Beispiel 12

13,51 Äthanol wurden zu 4,51 des entfetteten wässerigen Extrakts aus Beispiel 1 gegeben und das Gemisch wurde gerührt und über Nacht stehen gelassen und der ausgeschiedene Niederschlag wurde abfiltriert. Der Niederschlag wurde mit 100 ml Äthanol gewaschen und in 400 ml Wasser aufgelöst und 1,61 Äthanol wurden zu der Lösung gegeben und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert. Der Niederschlag wurde dann im Vakuum getrocknet und ergab 10 g eines gewünschten Extrakts. Dieser Extrakt wurde dann in 500 ml Wasser extrahiert und filtriert und das Filtrat wurde konzentriert und im Vakuum getrocknet und ergab 8 g eines gereinigten Extrakts in Form eines braunen Pulvers.

Beispiele 13 bis 22 Extrakte der vorliegenden Erfindung und gereinigte Extrakte der vorliegenden Erfindung wurden erhalten aus 4,51 der entfetteten wässerigen Extrakte aus Beispielen 2 bis 11 in gleicher Weise wie in Beispiel 12 beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:

Beispiel Verwendeter, entfetteter Menge Extrakt Menge

No.

wässeriger Extrakt vor dem Reinigen (g)

gereinigter Extrakt (g)

13

wässeriger Extrakt aus Beispiel 2

17,5

14,0

14

wässeriger Extrakt aus Beispiel 3

8,8

7,0

15

wässeriger Extrakt aus Beispiel 4

10,5

7,5

16

wässeriger Extrakt aus Beispiel 5

9,3

. 7,5

17

wässeriger Extrakt aus Beispiel 6

9,3

7,5

18

wässeriger Extrakt aus Beispiel

8,9

7,1

19

wässeriger Extrakt aus Beispiel 8

8,8

7,0

20

wässeriger Extrakt aus Beispiel 9

8,9

7,1

21

wässeriger Extrakt aus Beispiel 10

9,0

7,2

22

wässeriger Extrakt aus Beispiel 11

8,1

6,5

Beispiel 23

Der entfettete wässerige Extrakt (4,51) aus Beispiel 1 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt, wobei jedoch Methanol an Stelle von Äthanol als Ausfallungsmittel verwendet wurde und wobei 4,6 g Rohextrakt und 2,6 g eines gereinigten Extrakts erhalten wurden.

Beispiel 24

Der entfettete wässerige Extrakt (4,51) aus Beispiel 1 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt, wobei jedoch Aceton an Stelle von Äthanol als Ausfallungsmittel verwendet wurde und wobei 8,8 g eines Rohextrakts und 6,4 g eines gereinigten Extrakts erhalten wurden.

Beispiel 25

Der entfettete wässerige Extrakt (4,51) aus Beispiel 1 wurde in einen Dialysierschlauch aus Cellulose gegeben (Visking tube von Union Carbide Co. Ltd. U.S. A.) und Dialyse erfolgte in fliessendem Wasser während einer Woche. Die innere Lösung (der Anteil mit den hochmolekularen Verbindungen) wurde im Vakuum auf 500 ml eingeengt. 2,01 Äthanol wurden zur konzentrierten Lösung gegeben und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert. Der Niederschlag wurde dann im Vakuum getrocknet und ergab 12 g Rohextrakt. Dieser Rohextrakt wurde dann zwei Mal mit 500 ml Wasser extrahiert und filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und getrocknet und ergab 10 g eines gereinigten Extrakts in Form eines braunen Pulvers.

Beispiele 26 bis 33

In gleicherweise wie in Beispiel 25 beschrieben, wurden die entfetteten wässerigen Extrakte (je 4,51) aus Beispielen 2 bis 11 behandelt und ergaben Rohextrakte und gereinigte Extrakte der vorliegenden Erfindung. Die Ergebnisse waren die folgenden:

Beispiel

Verwendeter entfetteter

Anteil

Anteil

No.

wässeriger Extraxt

Rohextrakt (g)

gereinigter Extrakt (g)

26

wässeriger Extrakt aus Beispiel 2

12,0

10,0

27

wässeriger Extrakt aus Beispiel 5

10,0

8,0

28

wässeriger Extrakt aus Beispiel 6

11,2

10,0

29

wässeriger Extrakt aus Beispiel 7

10,6

9,0

30

wässeriger Extrakt aus Beispiel 8

10,6

8,6

31

wässeriger Extrakt aus Beispiel 9

10,6

8,8

32

wässeriger Extrakt aus Beispiel 10

10,8

8,6

33

wässeriger Extrakt aus Beispiel 11

9,8

8,0

Beispiel 34

Der entwässerte wässerige Extrakt (4,51) aus Beispiel 3 wurde mit einem PVA Hohlfaser-Dialysator mit Polyvinylal-kohol-Hohlfaser-Membran (Model KL-1-30 von Kuraray Co. Ltd. Japan) dialysiert. 1,61 Äthanol wurden zu der so erhaltenen konzentrierten Lösung (400 ml) gegeben und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert. Dann wurde der Niederschlag im Vakuum getrocknet und ergab 10,6 g eines rohen Extrakts. Dieser Extrakt wurde dann mit 500 ml Was8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

652 028

ser extrahiert und filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und getrocknet und ergab 8,5 g eines gereinigten Extrakts.

Beispiel 35

In gleicher Weise wie in Beispiel 34 beschrieben, wurde der entfettete wässerige Extrakt aus Beispiel 4 behandelt und ergab 6,1 g eines Rohextrakts und 4,5 g eines gereinigten Extrakts.

Beispiel 36

Der entfettete wässerige Extrakt (4,5 1) aus Beispiel 1 wurde langsam mit Ammoniumsulfat unter Umrühren vermischt bis zum Erreichen der Sättigungskonzentration von Ammoniumsulfat. Dann wurde das Gemisch über Nacht stehen gelassen. Der ausgeschiedene Niederschlag wurde ab-filtriert, an der Luft getrocknet und mit 6,01 Wasser extrahiert. Dann wurde der Extrakt in einen Zellulose-Dialysier-schlauch gegeben (Visking tube von Union Carbide Co. Ltd. U.S. A.) und Dialyse erfolgte in fliessendem Wasser während 6 Tagen. Die innere Lösung (der Anteil mit hochmolekularen Verbindungen) wurde im Vakuum auf 500 ml eingeengt. 2,01 Äthanol wurden zur konzentrierten Lösung gegeben und der ausgeschiedene Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde im Vakuum getrocknet und ergab 8,1 g eines rohen Extrakts. Dieser Extrakt wurde dann mit 500 ml Wasser extrahiert und filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und getrocknet und ergab 6,0 g eines gereinigten Extrakts.

5

10

15

20

25

30

3S

40

45

50

55

60

65

S

1 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

1. 652 028

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Ein hochmolekulare Verbindungen enthaltender Extrakt, mit immunstimulierenden Eigenschaften, erhalten durch Extraktion von Pflanzen vom Genus Epimedium sp. mit folgenden Charakertistika: s

   1 Eigenschaften:

   (a) Braunes Pulver

   (b) bei Auflösung von 100 mg des Extraks in 50 ml Wasser, beträgt der pH-Wert etwa 6,5.

   2 Löslichkeit: io

   (a) Löslich in Wasser

   (b) Unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylace-tat, Diäthyläther, Hexan und Chloroform.

   3 Farbreaktionen:

   Positiv gegenüber (a) Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, (b) is Bial-Reaktion, (c) Molisch-Reaktion und (d) Skatol-Reak-tion;

   Negativ bei (a) Ninhydrin-Reaktion, (b) 2,4-DNP-Reaktion, (c) Seliwanoff-Reaktion und (d) Naphtoresorcinol-Reak-tion. 20

   4 Saccharid Zusammensetzung:

   Arabinose und Galactose.

   5 IR-Absorbtion, ist in Figur 1 wiedergegeben und weist folgende Maxima auf: (cm-1) 3400,1600, 1400, 1100

   6 UV-Absorption, ist in Figur 2 wiedergegeben und weist & folgende Maxima auf: (nm) 280, 325
2. 2. Verfahren zur Herstellung von Extrakten gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Pflanzen vom Genus Epimedium sp. zur Erzielung eines wässerigen Extraktes extrahiert werden, und worauf dieser wässerige Extrakt entfettetso wird und anschliessend eine hochmolekulare Verbindungen enthaltende Fraktion aus dem entfetteten wässerigen Extrakt isoliert wird.
3. 3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel für die Extraktion Wasser oder 35 eine Mischung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit Wasser verwendet wird.
4. 4. Verfahren gemäss Anspruch 3, worin das genannte mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel ein niedriger Alkohol, ein Keton der ein mit Wasser mischbarer Äther ist. «o
5. 5. Verfahren gemäss Anspruch 2, worin als Lösungsmittel für die Entfettung ein niederaliphatischer Ester, ein halo-genierter Kohlenwasserstoff, ein mit Wasser nicht mischbarer Äther oder ein aliphatischer Kohlenwasserstoff verwendet wird. 45
6. 6. Verfahren nach Anspruch 2, worin die genannte hochmolekulare Verbindungen enthaltende Fraktion durch fraktionierte Ausfallung erhalten wird.
7. 7. Verfahren gemäss Anspruch 2, worin die genannte hochmolekulare Verbindungen enthaltende Fraktion durch 50 Dialyse erhalten wird.
8. 8. Immunstimulierende Mittel, enthaltend als wirksame Komponente einen Extrakt gemäss Anspruch 1.

   55