DE3024282A1 - Vakzinierende glycopeptid-antigenfraktion mit grosser immunisierungsfaehigkeit, isoliert aus kulturen pathogener keime, verfahren zur isolierung dieser fraktion und diese enthaltende vakzinen - Google Patents

Vakzinierende glycopeptid-antigenfraktion mit grosser immunisierungsfaehigkeit, isoliert aus kulturen pathogener keime, verfahren zur isolierung dieser fraktion und diese enthaltende vakzinen

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DE3024282A1 DE19803024282 DE3024282A DE3024282A1 DE 3024282 A1 DE3024282 A1 DE 3024282A1 DE 19803024282 DE19803024282 DE 19803024282 DE 3024282 A DE3024282 A DE 3024282A DE 3024282 A1 DE3024282 A1 DE 3024282A1
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Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft eine vakzinierende Glycopeptid-Antigenfraktion mit sehr großer Immunisierungsfähigkeit, isoliert aus Kulturen pathogener Keime, sowie Verfahren zur Extraktion dieser Antigenfraktion aus Kulturen pathogener Keime und zur Reinigung, um den aktiven Glycopeptidbestandteil zu isolieren. Die Erfindung betrifft auch die Herstellung von Vakzinen mit großer Immunisierungsfähigkeit, die diese Fraktion enthalten.
Gegenwärtig gibt es zahlreiche medizinische Anwendungsmöglichkeiten für Antigenfraktionen: Serotherapien verschiedener Arten, Serodiagnostik, die Feststellung pathogener Keime in den verschiedensten pathologischen Produkten, epidemiologische Untersuchungen und insbesondere Vakzinationen bzw. Impfungen. Bekanntlich stellt die Impfung häufig die einzige Waffe und die einzige Prophylaxie gegen zahlreiche Erkrankungen dar, weswegen die Forscher der Entwicklung von Verfahren zur Erzielung von Antigenen mit einer großen antigenen Wirkung und verstärkter Spezifität besondere Bedeutung beimessen. Die Untersuchungen richteten sich insbesondere auf eine Immunisierung gegen bakterielle/ insbesondere enterale Infektionen, die beispielsweise hervorgerufen werden durch Bakterien der Gruppe der Salmonellen und insbesondere von Salmonella thyphimurium, mittels einer Vakzine, die aus völlig abgetöteten Bakterien besteht. Jedoch ist die Anwendung derartiger Vakzinen nicht frei von Gefahren aufgrund von deren Toxizität, des starken Gehalts der Zellmembranen dieser Bakterien an Endotoxinen^ eine Toxizität, die häufig sehr starke allergische Reaktionen hervorruft. Es wurde daher versucht, Vakzinen herzustellen, die aus gereinigten, aus Bakterienkulturen extra-
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hierten Fraktionen bestehen. So wurden Vakzinen empfohlen, die erhalten wurden aus Oberflächenantigenfraktionen? extrahiert aus Brucella melitensis und Brucella abortus, die im wesentlichen aus einem Lipopolysaccharid-Proteinkomplex bestehen {_ Diaz, Jones, Leong und Wilson, Journal of Bacteriology, Oktober 1968, Band 96, Nr. 4, S.893-901, "Surface antigensof Smooth Brucellae"_7· Die Autoren dieser Veröffentlichung beschreiben, daß der wirksame Bestandteil der Antigenfraktion der vorstehend genannte Lipopolysaccharid-Proteinkomplex ist, jedoch enthält die Antigenfraktion außerdem Proteinbestandteile, die an interne Antigene von Brucellae gebunden sind, sowie einen Polysaccharid-Proteinkomplex, der kein Lipid enthält, von dem gesagt wird, daß er offensichtlich keine bedeutende Rolle bei den Agglutinationsreaktionen spielt, da seine Antikörper durch Absorption abgetrennt werden könnten, ohne den Agglutinationsgrad zu beeinflussen. Außerdem wurden polyvalente Vakzinen gegen Pseudomonas aeruginosa empfohlen, die erhalten wurden, ausgehend von Oberflächenantigenen, die eine gesteigerte Immunisierungsfähigkeit aufweisen und im wesentlichen bestehen aus einem Lipopolysaccharid-Proteinkomplex, der eine satrke Immunisierungsfähigkeit aufweist und keine toxischen Bestandteile enthält, extrahiert aus Bakterienkulturen auf einem speziellen Medium.
Eine andere zur Entfernung der durch das Endotoxin der Zellmembranen der Bakterien bedingten Toxizität besteht in azellulären Vakzinen, die als Antigenquelle Exkretionsprodukte (oder "Schleim" bzw. "slime") von Bakterienkulturen enthalten, insbesondere von Kulturen von Pseudomonas aeruginosa»/ die vorher durch Waschen von den toxischen Produkten, die auch in dem Schleim enthalten sind, insbesondere von labilen Exkretionsprodukten und Verunreinigungen des Kulturmediums ^-FR-PS 2 29O 219, Institut Pasteur, vom 5. November 1974 und P. Berche, M. Veron und R. Tinelli, Ann. Microbiol. (Institut Pasteur) 1976, JJTA, S.247-259_? befreit wurden.
Jedoch haben diese verschiedenen Versuche zur Reinigung von Bak-
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terienkultüren nicht zunangestrebten Ziel geführt/ da einerseits der antigene Bestandteil nicht wirksam identifizierbar war zur Sicherstellung der gewünschten Immunisierung und andererseits keine Vakzinen erhalten werden konnten, die in wirksamer Weise von ihrer Toxizität befreit waren. Es wurden daher Untersuchungen in diesen beiden Richtungen durchgeführt. So wurde eine Antigenfraktion empfohlen, extrahiert durch geeignete Techniken aus Kulturen pathogener Keime, insbesondere aus Kulturen von Salmonella thyphimurium,Malleomyces mallei, Pseudomonas mallei, Vibrio cholerae, die die allergischen Reaktionen der bisher empfohlenen Vakzinen nicht aufweist. Diese Antigenfraktion, die als eine Lipidoproteinfraktion identifiziert wurde, ist dadurch charakterisiert, daß sie ein erstes Maximum (Peak) im Ultraviolett-Absorptions-Diagramm bei 280 nm aufweist und daß sie gegen ein in einem Tier, ausgehend von der gleichen Kultur erzeugten Immunserum, die Bande (oder das Bandenpaar) ergibt, das der Antigenquelle in einerDiffusionsprobe in einem Gelosemilieu und bei der immunelektrophoretischen Analyse (FR-PS 73 037 34 vom 2. Februar 1973, Anvar, A. Dodin) am nächsten kommt. Es hat sich jedoch erwiesen, daß keiner der Immuniaationsversuche mit den empfohlenen gereinigten Antigenfraktionen zufriedenstellend war, da alle diese Fraktionen einen Lipidanteil enthalten, dem die Toxizität zuzuschreiben war / Lüderitz, Galanos, Lehmann, Nurminen, Rietschel, Rosenfelder, Simon und Westphal, 1973, "Lipid A: chemical structure and biological activity" in "Bacterial lipopolysaccharides", Kali und Wollf, The University of Chicago Press, Chicago_7· Zwar wurden diese Versuche durchgeführt, um eine Immunisierung der Maus gegen Pseudomonas aeruginosa durch kapseiförmige Polysaccharide zu erzielen, die aus dem "Schleim" von Pseudomonas aeruginosa extrahiert wurden £ Pier, Sidberry & Sadoff, Infection and Immunity, Dezember 1978, Band 22, Nr. 3, S.908-918 und Pier et al., loc.cit. S. 919-925_7, jedoch wurde eingestanden, daß es nicht möglich ist, Vakzinen, ausgehend von Polysacchariden, wie die, die aus den Exkretionsprodukten von Bakterienkulturen extrahiert wurden, oder erhalten wurden durch Abspalten des Lipidanteils des Moleküls von Lipopolysacchariden (LPS), da derartige Vakzinen eine sehr geringe
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immunisierende Wirkung aufweisen, was daher kommt, daß die Polysaccharide, sowohl die kapseiförmigen,als auch die aus dem
"Schleim" stammenden, wenn sie für die Antigenspezifität veran— wortlich sind, keine Immunisierungsfähigkeit aufweisen.
Es wurde auch empfohlen, eine Immunisierung der Maus gegen
Bordetella pertussis mittels eines Oligopeptids zu bewirken,
das aus diesem Bakterium isoliert wurde, ausgehend von einer
Gruppe von Ribonukleoproteinen mit geringem Molekulargewicht
^"Wilhelm & Römer, ZbI. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. B. 166, S.264-271 (1978)_7, eine Immunisierung mittels Peptidkömplexen, von
Organismen, die Desoxyribonukleinsäuren enthalten, wobei von
diesen Komplexen gesagt wird, daß sie spezifische Antigeneigenschaften gegenüber dem Organismus aufweisen, aus dem sie isoliert wurden; dies wurde insbesondere in der FR-PS 2 387 991 vom 19. April 1978 (R. und Z. Vermögensverwaltungsgesellschaft GmbH) empfohlen.
Jedoch wurde vor diesen letztgenannten Veröffentlichungen angenommen/ daß die Proteine, die an das in der Zellmembran der
Bakterien vorhandene Endotoxin assoziiert sind, geeignete Adjuvantien zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern sind und selbst keine antigene Wirksamkeit aufweisen /_ Amstedt und Lindholm, Immunology, 33, S.629-633 (1977)_7· In gleicher Weise wurden einige Patentschriften auf Vakzinen gerichtet, in die die Polysaccharide und/oder die Glycopeptide als Immunitatsadjuvantien
und zur Stabilisation assoziiert an RNS (bzw. AEN) oder an aus
pathogenen Keimen extrahierte Ribosomen eingehen.
Eine andere Forschungsrichtung richtet sich auf die Herstellung eines synthetischen Konjugationsprodukts von Polysaccharid-Protein, das geeignet ist als aktives immunisierendes Mittel aufgrund der unterschiedlichen pathogenen Keime (insbesondere Pneumokokken, Salmonella) , ausgehend von der Tatsache, daß der PoIysaccharidanteil des Lipopolysaccharids (LPS) der Zellmembranen
eine Antigenspezifität aufweist, deren Bedeutung wesentlich für die immunisierende Wirkung der Vakzine ist und daß, wenn man dieses
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Polysaccharid als Hapten, das eine ausgezeichnete antigene Determinante darstellt, an einen Träger binden könnte, der aus einem Immunogen-Protein besteht, und keine Toxizität aufweist, man ein immunisierendes Mittel zur Herstellung spezifischer Vakzinen erhalten könnte /_ Paul, Katz und Benaceraf, The Journal of Immunology, Band 1o7, Nr. 3, September 1971, S.685-688; Ekborg et al., Immunochemistry (1977), Band 14, S.153-157; Svenson und Lindberg, Ferns Microbiology Letters 1 (1977), S.145-148; Lindberg et al., Infection & Immunity, Band 10, Nr. 3, September 1974, S.541-545; Svenson und Lindberg, The Journal of Immunology, Band 120, Nr. 5, Mai 1978, S.1750-1757, Zopf et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 185, Nr. 1 (1978), S.61-71; Svenungsson und Lindberg, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B.86, S.35-40 (1978)_7· Jedoch haben Vergleichsversuche, die von verschiedenen Forschern durchgeführt wurden, gezeigt, daß zwar derartige synthetische Konjugationsprodukte die von ihnen erwartete gute immunisierende Wirksamkeit aufweisen und nicht toxisch sind, daß jedoch ihre immunisierende Wirksamkeit immer noch weit unter der von Vakzinen liegt, die aus vollständigen, abgetöteten Bakterien erhalten wurden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer vakzinierenden bzw. Impfwirkung aufweisenden Antigenfraktion mit großer immunisierender Wirksamkeit,,die isoliert wird aus Kulturen pathogener Keime, die eine bestimmte Glycopeptidzusammensetzung aufweist und charakterisiert ist durch ein . gut definiertes immunologisches Bild.
Gegenstand der Erfindung ist eine vakzinierende Antigenfraktion mit großer Immunisierungsfähigkeit, isoliert aus einer Kultur von pathogenen Keimen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus einem Osid-Teil besteht, der in einem Anteil von etwa 50 % mit einem Proteinteil vorhanden ist, die miteinander durch kovalente Bindung verbunden sind und daß sie, wenn sie einer Immundiffusion in Gelose gegen ein Immunserum unterzogen wird, das von einem Tier stammt, das mit der gleichen Kultur behandelt wurde, ein immunologisches Bild ergibt, das im wesentlichen eine "deutliche"
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Ausfällungs linie in der Nähe des Loches (puits)des Antigens enthält.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Vakzinierenden Antigenfraktion ist diese dadurch gekennzeichnet/ daß sie bei der Immundiffusion in Gelose außer der genannten "deutlichen" Ausfällungslinie in der Nähe des Antigen-Loches bzw. der Antigen-Quelle, in der durch Markieren mit Jod 125 mit Chloramin T die Anwesenheit von Aminosäuren festgestellt wurde, eine "verschwommene" Ausfällungslinie aufweist, die in einer variablen Lage zwischen dem Antigen- und dem Antikörper-Loch liegt, die die Beteiligung von Polyosiden bei der Bildung dieser zweiten Ausfällung zeigt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen vakzinierenden Antigenfraktion zeichnet sich diese Fraktion dadurch aus, daß das bei der Geloseimmundiffusion erhaltene immunologische Bild in Form der "deutlichen" Linie durch die Behandlung der vakzinierenden Antigen-fraktion gemäß der Erfindung mit Proteasen nicht verändert wird.
Gemäß einem weiteren vorteilhaften Charakteristikum zeichnet sich die erfindungsgemäße vakzinierende Antigenfraktion dadurch aus, daß ihr bei der Geloseimmundiffusion erhaltenes Bild in Form der "deutlichen" Linie nach der Behandlung dieser Fraktion mit Natriumhydroxid verschwindet.
Außerdem zeichnet sich die vakzinierende Antigenfraktion gemäß der Erfindung dadurch aus, daß die "verschwommene" Ausfällungslinie bei der Immundiffusion in Gelose inhibiert wird, wenn man Ösen zu der Gelose fügt, in der die Immundiffusionsreaktion abläuft.
Diese Inhibierung beweist die Beteiligung von Polyosiden an der Bildung dieser zweiten Ausfällung, die immunchemisch durch die "verschwommene" Linie definiert wird.
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Erfindungsgemäß wurde gezeigt, daß die Anwesenheit von für die Bildung der "deutlichen" Ausfällungslinie verantwortlichen Determinanten unerläßlich dafür ist, daß die erfindungsgemäße Antigenfraktion eine gute Schutzwirkung aufweist, was durch folgende Versuche gezeigt wurde:
Das aus Klebsieila pneumoniae extrahierte Kapselpolyosid ergibt bei der Immundiffusion nur wenig Ausfällung in Form der "deutlichen"Linie und im Gegensatz hierzu eine starke Ausfällung in Form der "verschwommenen" Linie: seine Schutzwirkung bei der Maus ist sehr gering (Größenordnung von 80 ng);
Oberflächenantigenpräparate, die bei der Immundiffusion nur die "deutliche" Linie ergeben, sind bei Schutzuntersuchungen (1 ng) sehr aktiv;
die Behandlung von Oberflachenantigenpraparaten mit Natriumhydroxid, die zum Verschwinden der Ausfällung in Form der "deutlichen" Linie führt, verringert das Schutzvermögen des Präparats beträchtlich (zumindest um einen Faktor 100).
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen vakzinierenden Antigenfraktion wird letztere aus Kulturen von pathogenen Keimen isoliert, die Toxine weder in Form von Sekreten noch Exkreten abscheiden, die ein Schutzantigen enthalten, das bei der Geloseimmundiffusion durch eine Ausfällungslinie, zentriert um das Antigenloch, definiert ist, wenn man die Immundiff. gegen ein Immunserum durchführt , das von einem mit einer Kultur des gleichen pathogenen Keims behandelten Tier stammt.
Gemäß einer bevorzugten Variante dieser Durchführungsform wird die vakzinierende Antigenfraktion aus Kulturen von pathogenen Keimen isoliert, die aus der Gruppe von Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio chlorerae, Hemophilus influenzae, Bordetella pertussis, stammen.
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Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen vakzinierenden Antigenfraktion zeichnet sich diese Fraktion dadurch aus, daß der durch Säulerichromatographie erhaltene Peak bzw. der durch Säulenchromatographie erhaltene Maximalwert . (für eine Ultraviolettabsorption bei.280 nm) einer Zusammensetzung in der Größenordnung von 25 bis 25/55 %Proteinen, und in der Größenordnung von 73,40 bis 73,42 % Kapselpolysacchariden entspricht, wobei der Gehalt an Phosphor etwa 0,41 % nicht überschreitet, der Gehalt an 2-Keto-3-desoxypctanoat (KDO), spezifisch für LPS, unter 0,32 % liegt und der Gehalt an N-Acetylglucosamin unter 0,32 % liegt.
Eine derartige Analyse verdeutlicht einerseits die Glycoproteinzusammensetzung der erfindungsgemäßen vakzinierenden Antigenfraktion und andererseits die Abwesenheit von DNS (bzw. ADN) oder RNS (bzw. ARN).
Gegenstand der Erfindung sind auch Extraktionsverfahren zur Reinigung der Oberflächenantigene von Kulturen pathogener Keime zur Erzielung der vorstehend definierten vakzinierenden Antigenfraktion mit gesteigertem Immunisierungsvermögen.
Gemäß einem Extraktions- und Reinigungsverfahren für die Oberflächenantigene einer Kultur pathogener Keime gemäß der Erfindung extrahiert ein bis mehrere Male den Bakterienbodenzusatz unter sehr kräftigem Bewegen bzw. Rühren mit einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert in der Gegend von 6, wobei die überstehende Flüssigkeit, die die rohen Oberflächenbestandteile enthält, durch Ultrafiltration konzentriert wird, wobei nur die Teilchen gewonnen werden, deren Molekulargewicht über 10 000 liegt, das erhaltene Ultrafiltrat mit Natriumdesoxychölat (DOC) in einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert in der Gegend von 8 behandelt wird, das behandelte Ultrafiltrat durch absolutes Äthanol ausgefällt wird, die erhaltene Ausfällung mit dem gleichen Puffer vom pH-Wert etwa 8, versetzt mit 2 % DOC aufgenommen wird, worauf sie gegen den Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8 dialysiert, adsorbiert
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an DEAE-Cellulose wird und das Antigen mit dem gleichen Puffer, der mit steigender Molarität verwendet wird, eluiert und anschließend durch Ultrafiltration konzentriert wird.
Nach einer vorteilhaften Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Bakterienbodensatz extrahiert mit einem Puffer folgender Zusammensetzung:
Lithiumacetat 0,2 molar
EDTA 10 m molar
Natriumazid
("Azide de sodium") 0,02 %
Essigsäure QSP -> pH 6
wobei 50 bis 70 ml Puffer pro g des feuchten Bakterienbodensatzes verwendet werden.
Gemäß einer weiteren Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Lösung der rohen Oberflächenbestandteile an Millipore (Milliporen) vor der Ultrafiltration filtriert.
Gemäß einer weiteren Durchführungsform des Gegenstands der Erfindung wird das mit dem Tris-Puffer auf den pH-Wert von etwa eingestellte Ultrafiltrat mit einer Lösung von DOC von 5 % in einem Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8 behandelt, bestehend aus
Tris-HCl 10 m molar
EDTA 10 m molar
derart, daß die Konzentration der Lösung an Oberflächenbestandteilen auf etwa 1 % (Gew./Vol.) DOC gebracht wird.
Gemäß einer weiteren Durchführungsform der Erfindung wird das behandelte Ultrafiltrat mit dem 4- bis 5fachen seines Volumens an absolutem Alkohol ausgefällt.
Gemäß einer weiteren Durchführungsform des erfindungsgemäßen
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Gegenstandes erfolgt die Bestimmung der Röhrchen, die das Antigen nach dem Durchlaufen, der DEAE-Cellulosesäule enthalten, durch Untersuchung des Schutzes und/oder durch die Immundiffusions- und/oder Immunelektrophorese-Untersuchung.
Gemäß einem weiteren Extraktions- und Reinigungsverfahren der Oberflächenantigene einer Kultur pathogener Keime gemäß der Erfindung erhält man eine wie vorstehend definierte reine vakzinierende Antigenfraktion durch Reinigung eines Präparats, das diese Oberflächenantigene enthält, durch AffinitätsChromatographie.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform wird dieses Reinigungsverfahren durch ÄffinitätsChromatographie durchgeführt unter Verwendung eines Immunadsorbans, bestehend aus spezifischen Antikörpern des Bestandteils, der die Ausfällung in "deutlicher" Linie bildet, di'e unlöslich gemacht wurden unter Anwendung jeglicher geeigneter Mittel.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Durchführungsform werden die Antikörper erhalten durch HyperImmunisierung von Säugern, wie Kaninchen, insbesondere mittels eines Oberflächenantigenpräparats pathogener Keime, gegen die man eine Immunisierung zu erzielen wünscht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser spezifischen Antikörper werden diese erhalten unter Anwendung von nach an sich bekannten biochemischen Methoden gereinigten Oberflächenantigenpräparaten als Antigene, die dem zu immunisierenden Tier injiziert werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der spezifischen Antikörper werden diese erhalten durch direkte Verwendung der Ausfällung mit "deutlicher" Linie, die in der Gelose im Verlauf der Immundiffusionsreaktion gebildet wird, wobei diese Ausfällung erhalten wird durch Ausschneiden in situ aus der Gelose, vorteilhaft nach einer Wäsche der Gelose, um die im Verlauf der Immun-
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diffusionsreaktion nicht komplex gebundenen Antigene oder Antikörper zu entfernen, worauf sie dem zu immunisierenden Tier injiziert wird.
Gemäß dieser Ausführungsform zur Erzielung spezifischer Antikörper erhält man die Ausfällung in "deutlicher" Linie, unter Verwendung von gereinigten Reagentien, die spezifisch für die Determinante sind; oder erhält man sie unter Verwendung von ungereinigten Antigen- und Antikörperpräparaten.
Gemäß diesem Extraktions- und Reinigungsverfahren für Oberflächenantigene werden die spezifischen Antikörper, die als Immunadsorbentien bei der Reinigungstechnik der Antigene durch Affinitätschromatographie verwendet werden,in üblicher Weise gewonnen, nach Gewinnung des Blutes der hyperimmunisierten Tiere und Trennung der roten Blutkörperchen und des mit spezifischen Antikörpern angereicherten Serums.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die so gewonnenen spezifischen Antikörper unlöslich gemacht durch Polymerisation mittels Glutaraldehyd oder durch Fixieren an Kugeln bzw. Kügelchen von Dextrangel, Sepharose oder Glas, die beispielsweise aktiviert sind mit Bromcyan oder analogen Mitteln.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens besteht das der Reinigung durch AffinitatsChromatographie unterzogene Oberflächenantigenpräparat aus einer Bakterienkultur oder der überstehenden Flüssigkeit einer derartigen Kultur oder auch aus der überstehenden Flüssigkeit, die die rohen Oberflächenbestandteile enthält, erhalten durch Extraktion eines Bakterienbodensatzes oder besteht es auch aus dem Ultrafiltrat, erhalten durch Ultrafiltration der die rohen Oberflächenbestandteile enthaltenden überstehenden Flüssigkeit und deren Behandlung mit Natriumdesoxycholat (DOC).
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Die Erfindung betrifft auch die Anwendung der vakzinierenden Glycopeptid-Antigenfraktion mit großer Immunisierüngswirkung gemäß der Erfindung zur Herstellung von Vakzinen sowie als diagnostisches Mittel.
Insbesondere betrifft die Erfindung auch die Anwendung der durch Hyperimmunisierung von geeigneten Tieren mit der erfindungsgemäßen vakzinierenden Glycopeptid-Antigenfraktion erhaltenen spezifischen Antikörper als Reagentien für die Charakterisierung des Schutzantigens, insbesondere durch Gel-Ausfällungsreaktion oder durch spezifische Bestimmung des Schutzantigens in biologischen Flüssigkeiten (insbesondere durch Radioimmununtersüchung oder durch immun-enzymatische Untersuchungen) oder in Antigenpräparaten.
Außer den vorstehend genannten Gegenständen umfaßtdie Erfindung auch weitere Gegenstände, die aus der folgenden Beschreibung ersichtlich sind.
Die Erfindung betrifft die vakzinierende Antigenfraktion entsprechend den vorstehenden Ausführungen, sowie die Verfahren zu deren Herstellung,die spezifischen Antikörper, die mittels dieser Antigenfraktion erhalten wurden, die Vakzinen, diagnostischen Mittel und Reagentien, die mit Hilfe der vakzinierenden Antigenfraktion erhalten wurden,und die geeigneten Mittel zur Durchführung der vorstehenden Verfahren und zur Herstellung der Antigenfraktionen und deren genannten spezifischen Antikörper.
Zum besseren Verständnis der Erfindung sind im folgenden Beispiele zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antigenfraktion, Beispiele zur Charakterisierung dieser Antigenfraktion, Beispiele zur Herstellung von Vakzinen mit dieser Antigenfraktion, sowie Versuchsberichte angegeben, die Impfungen von Mäusen mittels dieser erfindungsgemäßen Antigenfraktion betreffen.
Diese Beispiele und Versuchsberichte sollen lediglich zur Erläuterung der Erfindung dienen, ohne sie zu beschränken.
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Beispiel 1
Extraktion und Reinigung einer Oberflächenantxgenfraktion, ausgehend von einer Kultur von Klebsiella pneumoniae Serotyp 2
1. Extraktion der Bakterien
Der bakterielle Bodensatz ("culot") einer Kultur von Klebsiella pneumoniae wird mit 60 ml LEA-Puffer pro g (Feuchtgewicht) des Bodensatzes versetzt.
LEA-Puffer:
Lithiumacetat 0,2 molar
EDTA 10 m molar
Essigsäure QSP ^ pH 6
Natriumazid
("Azide de sodium") 0,02 %
Das Gemisch wird 2 h mit Glaskugeln kräftig bei 45 C gerührt und anschließend 20 Minuten bei 25 000 g zentrifugiert.
Man gewinnt die überstehende Flüssigkeit: CS1 (Oberflächenbestandteile ..) , die man beiseite stellt.
Der Bodensatz vom Zentrifugieren wird in einem LEA-Puffer der gleichen Zusammensetzung wie vorstehend angegeben aufgenommen, und man extrahiert erneut unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Extraktion.
Durch Zentrifugieren während 20 Minuten bei 25 000 g erhält man einen Bodensatz, den man verwirft und eine überstehende Flüssigkeit CS „ (Oberflächenbestandteile „).
Die beiden überstehenden Flüssigkeiten, CS1 + CS2, werden an einem Millipor-Filter von 0,2 um (μ) filtriert, und man gewinnt ein FiItrat, das aus rohen Oberflächenbestandteilen
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(CSB) besteht.
2. Reinigung des Antigens
a) Die CSB werden einer Ultrafiltration an einem Amicon PM 10-' Filter unterzogen, um 10- bis 30fach zu konzentrieren und einen gereinigten Rückstand der Oberflächenbestandteile (CS) zu erzielen, von dem man die Teilchen mit einem Molekulargewicht unter 10 000 verwirft und nur solche mit einem Molekulargewicht von über 10 000 beibehält.
b) Behandlung_mit_Natrium-d.esoxYcholat_^DOC]_
Man bringt den pH-Wert des CS > 10 000 durch Tris-Puffer auf den Wert von 8.
Man behandelt mit einer DOC-Lösung von 5 % in einem TE-Puffer der folgenden Zusammensetzung:
Tris HCl 10 m molar
EDTA 10 m molar
pH δ
Man bringt die Konzentration der Lösung CS >1O 000 auf 1 % (Gew./VoI) von DOC (wobei man eine Klärung der Suspension feststellen sollte).
Man beläßt 30 Minuten bei Laboratoriumstemperatur , worauf man CS.DOC gewinnt,
Man fallt das CS.DOC mit 4 bis 5 Volumina absolutem Äthanol bei 4°C aus.
Man zentrifugiert 15 Minuten bei 40 000 g.
Man verwirft die überstehende Flüssigkeit und gewinnt den 030062/0906
Bodensatz, den man in einem TE-Puffer, versetzt mit 2 % DOC, aufnimmt.
Man erhält eine Ausfällung von CS.DOC in Äthanol.
Man dialysiert die Ausfällung von CS.DOC in Äthanol gegen den Puffer:
Tris HCL 10 m molar
PH 8
der zur Gleichgewichtseinstellung der Cellulose diente und eluiert durch Erhöhen der Molarität des Tris-Puffers.
Beispielsweise eluiert man bei Präparaten von Klebsiella pneumoniae, 0,01 molar, die verunreinigenden Proteine und 0,5 molar das Schutz-Antigen.
durch:
Untersuchung des Schutzes und/oder j Immundiffusion
(_ Immunelektrophorese
Man gruppiert die positiven Röhrchen um, d.h. solche die eine "deutliche" Ausfällungslinie ergeben und konzentriert an Amicon PM 10.
Die Fraktion der Oberflächenbestandteile (CS), die man schließlich gewinnt, CS-Peak DEAE, entspricht dem durch Chromatographie an DEAE-Cellulose erhaltenen Peak und weist folgende Zusammensetzung für Klebsiella pneumoniae Serotyp auf:
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Proteine (Folin-Bestimmung) 800 //ml
neutrale Hexosen 1900 ί/ml
Uronsäuren 400 ί/ml
Phosphor 13 1/ml
N-Acety!glucosamin (Spuren) έ 10 //ml
3. Charakterisierung der erhaltenen Antigenfraktion A) Gelose-Immundiffusion
Zur Durchführung dieser Untersuchung verwendet man Gelose in einer Schale, in die man zwei Löcher bohrt: eines enthält die Antigenfraktion von Klebsielle pneumoniae Serotyp hergestellt wie vorstehend beschrieben/ und das andere ein spezifisches Immunserum der Antigenfraktion.
1. Herstellung des Immunserums
Man verabreicht an Kaninchen auf intradermalem Wege eine erste Injektion der vakzinierenden Fraktion mit einem Freund-Komplett-Adjuvans (Dosierungen von 100 bis 1000 yug Proteine pro Kaninchen). Man frischt auf intramuskulärem Wege im Zeitraum von 2 bis 3 Wochen mit Dosierungen der vakzinierenden Fraktion von 10 bis 100 jug Proteine pro Kaninchen auf*
Man entnimmt 10 bis 15 Tage nach den Auffrischungen Blut und kontrolliert die erhaltenen Seren durch Doppel-Immundiffusion an Gelose. Man tötet die Kaninchen, wenn der Gehalt der erhaltenen Antikörper zufriedenstellend ist (nach 2 bis 4 Auffrischungen).
2. Durch Doppeldiffusion in Gelose erhält man zwei Ausfällungen (wie dies aus der Figur 1 der beigefügten Zeichnung ersichtlich ist):
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a) Die Ausfällung Nr. 1 weist folgende Charakteristika auf:
Es ist die erste Ausfällung, ausgehend von dem Loch des Antigens;
sie ist deutlich zum Antigenloch zentriert; sie zeigt eine deutliche Umrißlinie;
sie ist verschiedenen Serotypen von Klebsielle pneumoniae gemein;
sie wird unterdrückt, wenn man das antigene Präparat vorher unter folgenden Bedingungen mit Natriumhydroxid behandelt:
0,25 n-NaOH während 3 h bei 560C;
b) die Ausfällung Nr. 2 weist folgende Charakteristika auf:
sie ist von dem Loch 3 des Antigens weiter entfernt als die Ausfällung 1, und ihre Lage ist zwischen den Antigen- und Antikörperlöchern variabel;
ihre Umrisse sind unscharf;
sie wird von Ösen inhibiert: wenn man zu Gelose, bei der es sich um die Reaktionsstelle der Immundiffusion handelt, Glucuronsäure (bei der es sich um einen der Bestandteile des kapseiförmigen Polyosids (PC), das spezifisch für den Serotyp 2 von Klebsiella pneumoniae ist, handelt) in einer Menge von 50 mg/ml Gel zusetzt, so tritt die Ausfällung Nr. 2 nicht auf.
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Diese beiden Ausfällungen können einander mehr oder minder nahe sein und in bestimmten Fällen können sie verschmolzen sein.
Die folgenden im Rahmen der Erfindung durchgeführten Untersuchungen ermöglichen den Nachweis, daß die Anwesenheit von zur Bildung der Ausfällung Nr. 1 verantwortlichen Determinanten in der Antigenfraktion unerläßlich ist zur Bildung eines guten Schutzes durch die Antigenfraktion: das Schutzvermögen der vakzinierenden Antigenfraktion ist im wesentlichen an die Anwesenheit und an den Umfang bzw. die Menge der Ausfällung Nr. 1 gebunden.
Versuch Nr. 1
Ein aus Kulturen von Klebsiella pneumoniae nach klassischen Methoden isoliertes Präparat /_ Heidelberger et al. , J. Exp. Med. 150, 91 , S.341-349 für Pneumococcus; Pier et al., Infection & Immunity 1978, 22 (3), S.908-925 für Pseudomonas aeruginosa_/ ermöglicht es durch Immundiffusionsreaktion in Gelose nur eine "verschwommene" Linie entsprechend der Ausfällung Nr. 2 zu bilden, die aus dem Kapselpolyosid (PC), praktisch ohne jegliches Vakzinationsvermögen (DP5Q in der Größenordnung von 80 ng) besteht: vgl. Figur 2, wo man in der Nachbarschaft des Antigenloches, das das kapseiförmige Polyosid vom Serotyp 2 in Anwesenheit des kapseiförmigen Serum-Antipolyosids vom Typ 2, eine verschwommene Ausfällungslinie Nr. 21 erhält, die charakteristisch für PC ist.
Versuch Nr. 2
Frische Präparate des kapseiförmigen Polyosids, das etwa
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4 % Proteine enthält (die in diesem Falle als Verunreinigungen angesehen werden), zeigen bei der Immundiffusion eine als "deutlich" bezeichnete Linie. Nach dem Lyophilisieren erhält man fast ausschließlich die "verschwommene" Linie, die schlecht vakziniert (100 ng PC = DP50 für die Maus). Die nachstehend erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die DP|-O bei der gereinigten vakzinierenden Antigenfraktion, die aus dem kapselförmigen Polyosidteil und dem Peptidteil entsprechend der Erfindung besteht, wesentlich geringer ist.
In vitro wird die erfindungsgemäße Schutz-Antigenfraktion wie folgt definiert:
Versuch Nr. 3
In eine Geloseschale, die Glucuronsäure (einen der BestandteiLe von PC) enthält, bohrt man zwei Löcher: eines enthält das Antigen von Klebsiella pneumoniae Typ 2, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, und das andere ein spezifisches Antigenimmunserum. Man stellt eine als "deutliche" Linie bezeichnete Ausfällungslinie mit einer geringeren Intensität als im Versuch Nr. 2 in der Nähe des Antigenloches fest.
Versuch Nr. 4
Man arbeitet unter den gleichen Bedingungen wie im Versuch Nr. 3, jedoch enthält die Gelose keine Glucuronsäure. Man stellt zwei Ausfällungslinien fest: eine "deutliche" in der Nähe des Antigenloches und eine zweite "verschwommenere" Linie, die zwischen den beiden Löchern liegt.
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Versuch Nr. 5
Markierungen mit Jod 125, eine spezifische Methode zur Verdeutlichung von Proteinen, beweisen bei der Immundiffusion und der Immunelektrophorese, daß die "deutliche" Linie einen Peptidteil enthält. Mit den in den Versuchen 3 und 4 erhaltenen Ergebnissen, die die Anwesenheit eines Kapselpolyosids zeigen, läßt sich auf eine Assoziation des Typs "Glycopeptid" schließen, die verantwortlich ist für das S.chützvermögen hei Immunisierungen der Maus.
Aus dem Vorhergehenden folgt:
daß in der vakzinierenden Antigenfraktion gemäß der Erfindung ein Kapselpolyosid vorliegt;
daß eine andere Substanz an dieses Polyosid assoziiert ist;
die Tatsache, daß im Versuch Nr. 3 die "deutliche Linie" eine schwächere Intensität aufweist als im Versuch Nr. 4, zeigt, daß die Determinanten, die sich in der "verschwommenen" Linie befinden, an die Substanz assoziiert sind, die in der Form der "deutlichen Linie" ausfällt.
Es sei präzisiert, daß das Vakzinationsvermögen an die "deutliche Linie" gebunden ist. Diese "deutliche Linie" verschwindet, wenn man das vakzinierende Antigenpräparat mit Natronlauge unter folgenden Bedingungen behandelt:
0,25 n-NaOH während 3 h bei 56°C;
man stellt eine beträchtliche Verringerung des Schutzvermögens fest.
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Wie die Gesamtzusammensetzung der gereinigten vakzinierenden Fraktion zeigt, ist die Anwesenheit eines Proteins oder eines Peptids gewiß. Jedoch verändert eine Behandlung mit "Pronase" (Proteasengemisch) das charakteristische Aussehen der "deutlichen Linie" bei der Immundiffusion nicht/ und das Schutzvermögen bei der Maus wird beibehalten.
Versuchsbedingungen
0,5 ml CS-Peak-DEAE mit 1900 //ml Proteinen werden mit 10/ "Pronase" in 0,3 ml Tris-HCl-Puffer vom pH 7,8 während 48 h bei 56°C inkubiert.
B) Charakterisierung durch Immundiffusion in Gelose wird durch die Elektrophorese bekräftigt.
Tatsächlich zeigt eine Elektrophorese an Polyacrylamidgel, daß der für das Vakzinierungsvermögen verantwortliche Teil in dem oberen Drittel (negative Klemmspannung) von normalem Gel oder von Gel mit SDS 2 % + Mercaptoäthanol von 5 % (angelegte Spannung = 7,5 niA) verbleibt. Bei der Immunelektrophorese (Veronalpuffer, pH 8,6 und 5 Volt/cm während 2 h) erhält man ein immunologisches Bild, das durch die Figur 3 der beigefügten Zeichnung dargestellt wird, worin
das Bezugszeichen 4 das Loch mit dem Immunserum vom Antiserumtyp 2 bedeutet,
das Bezugszeichen 5 das Loch mit dem Immunserum vom Antiserumtyp 1 bezeichnet,
das Bezugszeichen 6 das Loch mit der erfindungsgemäßen Oberflächenantigenfraktion, extrahiert aus Klebsiella pneumoniae Typ 2, bezeichnet,
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das Bezugszeichen 7 die "deutliche" Linie bezeichnet,
das Bezugszeichen 8 die "verschwommene" Linie bezeichnet, und
das Bezugszeichen 9 das Vakzinationsvermögen (PVS) bei der Maus angibt.
Diese Charakterisierung zeigt ebenfalls, daß die Schutzaktivität der "deutlichen" Ausfällungslinie zuzuschreiben ist und somit einer Assoziation von Peptid-Kapselpolyosid. Die "verschwommene" Linie ist spezifisch für den Serotyp.
Beispiel 2
Extraktion und Reinigung einer Oberflächenantigenfraktion, ausgehend von Klebsie11a pneumoniae .
1. Extraktion der Bakterien
Der Bakterxenbodensatz einer Kultur von Klebsiella pneumoniae wird mit 60 ml LEA-Puffer pro g (Feuchtgewicht) des Bodensatzes aufgenommen.
LEA-Puffer:
Lithiumacetat 0,2 molar
EDTA 10 m molar
Essigsäure QSP ^ pH 6
Natriumazid
("azide de sodium") 0,02 %
Das Gemisch wird kräftig "mit Glaskugeln während 2 h bei 45°C gerührt und anschließend 20 Minuten bei 25 000 g zentrifugiert. Man gewinnt eine überstehende Flüssigkeit CS^ (Oberflächenbe-
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•fei
standteile ^), die man beiseite stellt. Der Bodensatz von der Zentrifugation wird in dem LEA-Puffer mit der gleichen Zusammensetzung wie vorstehend angegeben aufgenommen, und man führt eine weitere Extraktion unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Extraktion durch.
Durch Zentrifugieren während 20 Minuten bei 25 000 g erhält man einen Bodensatz, der verworfen wird und eine überstehende Flüssigkeit CS2 (Oberflächenbestandteile ~).
Diese beiden überstehenden Flüssigkeiten, CS. + CS2/ werden an einem Millipore-filter 0,2 um (11) filtriert, und man gewinnt ein Filtrat, das aus CSB, den rohen Oberflächenbestandteilen, besteht.
2. Herstellung des Immunserums
Die Herstellungsbedingungen des Immunserums sind gleich den vorstehend im Beispiel 1 beschriebenen.
Als Variante kann die zur Immunisierung verwendete Antigenfraktion bestehen:
entweder aus nach biochemischen, in der Literatur beschriebenen Methoden gereinigten Oberflächen-Antigenpräparaten,
oder aus der Ausfällung Nr. 1, die aus der Gelose in situ geschnitten wurde, nach Wäsche der Gelose zur Entfernung der nicht umgesetzten Antigene und Antikörper.
3. Die in dem Immunserum, das unter 2. erhalten wurde, enthaltenen Antikörper werden durch Polymerisation mit Glutaraldehyd unlöslich gemacht und in eine Säule eingebracht, in die man die Bestandteile der rohen Oberflächen (erhalten wie vorstehend unter 1) einleitet.
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Man erhält durch AffinitätsChromatographie an diesen Immunadsorbentien durch Reinigung aus der unter 1. erhaltenen Fraktion eine Antigenfraktion, die durch den ersten Peak definiert ist, der an einer DEAE-Cellulosesäule austritt, für eine Absorption bei 280 nm im Ultraviolett und deren Zusammensetzung vorstehend angegeben wurde. Bei der Zusammensetzung handelt es sich nach der Reinigung an dem Immunadsorbens um die gleiche, wie nach dem Durchlauf durch die DEAE-Säule.
Die Aktivität der nach dieser Reinigungsmethode erhaltenen Antigenfraktion ist sehr gut, da sie bei 0,1 bis 0,3 ng (DP 50) liegt.
Versuchsergebnisse der Impfung bzw. Vakzinationen von Mäusen
Man Verwendung unter den im folgenden angegebenen Versuchsbedingungen die aus Kulturen von Klebsie11a pneumoniae Typ 1 und 2 im Beispiel 1 erhaltene extrahierte und gereinigte Antigenfraktion.
A) Versuchsprotokoll
Mäuse (SWISS) im Alter von 4 Wochen,
subkutane Immunisierung von 0,5 ml des Produkts in steigenden Verdünnungen mit apyrogenem physiologischem Serum,
14 Tage nach der Immunisierung, Untersuchung mit 100 DL5 des virulenten Stammes auf intraperitonealem Wege,
Die Untersuchungen auf intravenösem Wege oder durch Aerosol ergeben die gleichen Ergebnisse wie auf intraperitonealem Wege:
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Die Berechnung der Schutzdosis 50 % (= DP 50)wird nach der Methode von Reed sMuench (Amer. J. Hyg. 1938, 27, S.493-497) durchgeführt. Die DP 50 ist die Dosis, die 50 % der Mäuse schützt.
B) Ergebnisse
vakzinierende Fraktion
DP 50
Klebsiella pneumoniae Typ 2
rohes Oberflächenantigen (= CBS)
CS-Peak-DEAE
(erfindungsgemäße Antigenfraktion)
10 ng Proteine
1 ng Proteine
Klebsiella pneumoniae Typ 1
CBS CS-Peak-DEAE
100 ng Proteine nicht durchgeführt
Streptococcus pneumoniae Typ 1
CBS
CBS, behandelt mit A'thanol-Desoxycholat
1,5 ng Proteine 0,4 ng Proteine
Streptococ cus pneumoniae Typen 2 und
CBS
CBS, behandelt mit Äthanol-öesoxyeholat
400 ng Proteine nicht durchgeführt
Aus der vorstehenden Beschreibung ist ersichtlich, daß unabhängig von dem Durchführungswege, der Durchführung und den Anwendungswegen eine Glycopeptid-Antigenfraktion, die vakzinierend ist bzw. Impfwirkung aufweist, mit einer sehr großen immunisierenden Wirkung aus Kulturen pathogener Keime erhalten wird, die im Bezug auf Antigenfraktionen^ die nach dem Stand der Technik erhalten
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wurden, günstige Eigenschaften und beträchtliche Vorteile aufweisen, von denen einige vorstehend erwähnt wurden, und andere Eigenschaften und Vorteile sich aus der Anwendung dieser Antigenfraktion ergeben.
Wie aus dem vorstehenden ersichtlich, wird die Erfindung nicht durch die Ausführungsformen, Durchführungs- und Anwendungsmethoden beschränkt, die im vorstehenden genauer beschrieben wurden; sie umfaßt vielmehr sämtliche Varianten, die sich für den Fachmann bei Kenntnis der vorliegenden Erfindung ergeben.
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Zusammenfassung
Vakzinierende Glycopeptid-Antigenfraktion mit großer Immunisierungsfähigkeit, isoliert aus Kulturen pathogener Keime, Verfahren zur Isolierung dieser Fraktion und diese enthaltende Vakzinen
Die Erfindung betrifft eine vakzinierende Antigenfraktion mit großem Immunisierungsvermögen, isoliert aus einer Kultur von pathogenen Keimen.
Diese Fraktion besteht aus einem Osidteil in einem Anteil von etwa 50 % mit einem Proteinteil, die miteinander durch kovalente Bindung verbunden sind. Sie weist bei der Gelose-Immundiffusion gegen ein geeignetes Immunserum ein immunologisches Bild auf, das im wesentlichen aus einer "deutlichen" Ausfällungslinie in der Nähe des Antigenloches besteht.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung zur Herstellung von Vakzinen und als diagnostische Mittel.
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Leerseite

Claims (30)

KRAUS & WEISERT PATENTANWÄLTE 3 O 2 A 2 8 2 DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 - TELEFON 089/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 2622 INSTITUT PASTEUR Paris, Frankreich Vakzinierende Glycopeptid-Antigenfraktion mit großer Immunisierungsfähigkeit/ isoliert aus Kulturen pathogener Keime, Verfahren zur Isolierung dieser Fraktion und diese enthaltende Vakzinen PATENTANSPRÜCHE
1. Vakzinierende Antigenfraktion mit sehr großer Immunisierungsfähigkeit, isoliert aus einer Kultur von pathogenen Keimen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Osid-Teil besteht, der in einem Anteil von etwa 50 % mit einem Proteinteil vorliegt, die miteinander durch Kovalenz-Bindung verbunden sind, und daß sie bei der Immundiffusion in Gelose gegen ein Immunserum, das von einem Tier stammt, das mit einer Kultur der gleichen pathogenen Keime behandelt wurde, ein immunologisches Bild zeigt, das im wesentlichen aus einer "deutlichen" Ausfällungslinie in der Nähe
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des Antigenloches bzw. der Antigenquelle besteht.
2. Vakzinierende Antigenfraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei der Iiratiundiffusion in Gelose außer der "deutlichen" Ausfällungslinie in der Nähe des Antigenloches bzw. der Antigenquelle, in der durch Markierung mit Jod 125 mit Chloramin T die Anwesenheit von Aminosäuren verdeutlicht wurde, eine "verschwommene" Ausfällungslinie aufweist, die sich in einer variablen Lage zwischen den Antigen- und Antikörper-Löchern bzw. -Quellen befindet und die die Beteiligung von Polyosiden bei der Bildung dieser zweiten Ausfällung verdeutlicht.
3. Vakzinierende Antigenfraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der Immundiffusion in Gelose als "deutliche" Linie erhaltene immunologische Bild nach der Behandlung dieser Fraktion mit Proteasen nicht modifiziert wird.
4. Vakzinierende Antigenfraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihr bei der Immundiffusion in Gelose erhaltenes immunologisches Bild der "deutlichen" Linie nach der Behandlung der Fraktion mit Natriumhydroxid verschwindet.
5. Vakzinierende Antigenfraktion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Auftreten der "verschwommenen" Ausfällungslinie bei der Immundiffusion in Gelose inhibiert wird, wenn man zu der Gelose, in der die Immundiffusionsreaktion abläuft, Ösen fügt.
6. Vakzinierende Antigenfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Kulturen pathogener Keime isoliert wurde, die Toxine weder sekretieren noch exkretie-
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rien, die ein Schutzantigen enthalten, definiert durch eine Ausfällungslinie, zentriert um das Antigenloch bzw. die Antigenquelle bei der GeIoseimmundiffusion gegen ein Imraunserum , das von einem Tier stammt, das mit einer Kultur des gleichen pathogenen Keims behandelt wurde.
7. Vakzinierende Antigenfraktion nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie isoliert wurde aus Kulturen von pathogenen Keimen, aus der Gruppe von Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Hemophilus influenzae, Bordetella pertussis.
8. Vakzinierende Antigenfraktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der durch Säulenchromatographie erhaltene Peak (für eine Ultraviolettabsorption bei 280 nm) einer Zusammensetzung von etwa 25 bis 25,55 % Proteinen und etwa 73,40 bis 73,42 % Kapselpolysacchariden entspricht, wobei der Phosphorgehalt etwa 0,41 % nicht übersteigt, der Gehalt an 2-Keto-3-desoxyoctanoat (KDO), spezifisch für LPS, unter 0,32 % liegt und der Gehalt an N-Acety!glucosamin unter 0,32 % liegt.
9. Verfahren zur Extraktion und Reinigung der vakzinierenden Antigenfraktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein bis mehrere Male einen Bakterienbodensatz unter sehr kräftigem Bewegen bzw. Rühren mit einem geeigneten Puffer vom pH-Wert von etwa 6 extrahiert, die erhaltene überstehende Flüssigkeit, die die rohen Oberflächenbestandteile enthält, durch Ultrafiltration konzentriert und nur die Teilchen gewinnt, deren Molekulargewicht über 10 000 liegt, worauf das erhalte Ultrafiltrat mit Natriumdesoxycholat (DOC) in einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert von etwa 8 behandelt wird und dieses behandelte Ultrafiltrat mit absolutem Äthanol ausgefällt wird, die erhaltene Ausfällung mit dem gleichen Puffer vom pH-Wert
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etwa 8, versetzt mit 2 % DOC aufgenommen wird und gegen den Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8 dialysiert wird, adsorbiert an DEAE-Cellulose, worauf das Antigen mit dem gleichen Puffer, der in ansteigender Molarität verwendet wird, eluiert wird und schließlich durch Ultrafiltration konzentriert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den Bakterienbodensatz mit einem Puffer der Zusammensetzung
Lithiumacetat 0,2 molar
EDTA 10 m molar
Natriumazid 0,02 %
Essigsäure QSP ^ pH 6
in einer Menge von 50 bis 70 ml Puffer pro g des feuchten Bakterienbodensatzes extrahiert.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,daß die Lösung mit den rohen Oberflächenbestandteilen vor der Durchführung der Ultrafiltration an Millipore filtriert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9,dadurch gekennzeichnet, daß das Ultrafiltrat mit Tris-Püffer auf einen pH-Wert von.etwa 8 eingestellt wird und mit einer Lösung von DOC von 5 % in einem Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8, bestehend aus
Tris-HCl 10 m molar
EDTA 10 m molar
derart behandelt wird, daß die Konzentration der Lösung der Oberflächenbestandteile auf etwa 1 % (Gew./VoI) DOC gebracht wird.
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13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das behandelte Ultrafiltrat mit dem 4- bis 5-fachen seines Volumens an absolutem Alkohol ausfällt.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung der Rohre bzw. Röhrchen, die das Antigen nach dem Durchlaufen der DEAE-Cellulosesäure enthalten, mit dem Schutztest und/oder der Immundiffusions-und/oder Immunelektrophoreseuntersuchung durchführt.
15. Verfahren zur Extraktion und Reinigung der vakzinierenden Antigenfraktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Fraktion erhält durch Reinigung eines Präparats, das diese Oberflachenantigene enthält, durch Affinitätschromatographie.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung durch AffinitätsChromatographie unter Verwendung eines Immunadsorbens durchführt, das aus spezifischen Antikörpern des Bestandteils besteht, der die Ausfällung in "deutlicher" Linie bildet und nach jedem beliebigen geeigneten Mittel unlöslich gemacht wurden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die spezifischen Antikörper durch Hyperimmunisation von Säugern, wie Kaninchen, insbesondere durch ein Präparat von Oberflächenantigenen pathogener Keime, gegen die man eine Immunisation zu erzielen wünscht, herstellt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die spezifischen Antikörper durch Injizieren von nach an sich
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bekannten biochemischen Methoden gereinigten Oberflächenantigenpräparaten in ein zu immunisierendes Tier erzeugt.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die spezifischen Antikörper unter direkter Anwendung der "deutlichen" Ausfällungslinie, die sich in der Gelose im Verlauf der Immundiffusionsreaktion bildet, erhält, wobei man sie in situ aus der Gelose ausschneidet, vorteilhaft nach einer Wäsche der Gelose zur Entfernung von im Verlauf der Immundiffusionsreaktion nicht komplex gebundenen Antigenen oder Antikörper, worauf man sie dem zu immunisierenden Tier injiziert.
20. Verfahren nach Anspruch 19,dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausfällung in "deutlicher Linie" erhält durch Anwendung der gereinigten Reagentien, die spezifisch für die Determinante sind.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausfällung in "deutlicher Linie" erhält unter Anwendung von ungereinigten Antigen- und Antikörperpräparaten.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die als Immunadsorbentien bei der Technik zur Reinigung der Antigene durch AffinitatsChromatographie verwendeten spezifischen Antikörper gewinnt nach der Gewinnung des Blutes von hyperimmunisierten Tieren und der Trennung der roten Blutkörperchen und des mit spezifischen Antikörpern angereicherten Serums.
23. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antikörper durch Polymerisation mit Glutaraldehyd unlös-
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lieh macht.
24. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antikörper durch Fixieren an Kugeln bzw. Kügelchen von
geeigneten Polymeren oder Glaskugeln bzw. Glaskügelchen, die in geeigneter Weise aktiviert sind, unlöslich macht.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das Präparat von Oberflächenantigenen, das der Reinigung durch AffinitätsChromatographie unterzogen wird aus der Gruppe von Bakterienkulturen oder den überstehenden Flüssigkeiten derartiger Kulturen oder aus den überstehenden Flüssigkeiten, die den rohen Oberflächenbestandteil enthalten, erhalten durch Extraktion eines Bakterienbodensatzes, oder auch aus dem Ultrafiltrat nimmt, das nach Ultrafiltration der überstehenden Flüssigkeit, die den rohen Oberflächenbestandteil enthält, und Behandlung des letzteren mit Natrium-desoxycholat
(DOC) erhalten wurde.
26. Verwendung der vakzinierenden Antigenfraktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von Vakzinen gegen verschiedene pathogene Keime, insbesondere aus der im Anspruch 7 aufgeführten Gruppe.
27. Diagnostisches Mittel, enthaltend die vakzinierende Antigenfraktion gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
28. Spezifische Antikörper, erhalten unter Einsatz des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 17 bis 24.
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—■ R —
29. Verwendung der spezifischen Antikörper gemäß Anspruch 28 als Reagentien zur Charakterisierung von Schutzantigen, insbesondere durch Gelausfällungsreaktion.
30. Verwendung der spezifischen Antikörper gemäß Anspruch 28 als Reagentien zur spezifischen Bestimmung von Schutzantigenen
gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in biologischen Flüssigkeiten (insbesondere durch Radio-Immununtersuchung oder durch immunenzymatische Untersuchungen) oder in Antxgenpraparaten.
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