DE69329922T3

DE69329922T3 - Herstellung eines tetanusimpfstoffes

Info

Publication number: DE69329922T3
Application number: DE69329922T
Authority: DE
Inventors: Anthony James Beckenham SHEPPARD; Peter Anthony Beckenham KNIGHT
Original assignee: Evans Vaccines Ltd
Current assignee: Seqirus Vaccines Ltd
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-05-20
Publication date: 2010-12-09
Anticipated expiration: 2013-05-21
Also published as: DE69329922T2; EP0652771B2; JPH07509481A; ES2157219T5; AU4082693A; JP3901212B2; EP0652771B1; GR3035683T3; DK0652771T4; PT652771E; ES2157219T3; US6060067A; CA2141410C; CA2141410A1; NZ252253A; EP0652771A1; ATE199059T1; DE69329922D1; WO1994003206A1; DK0652771T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Toxin zur Verwendung in Tetanus-Impfstoffen.
Der existierende Tetanus-Impfstoff wird aus einer 7-Tage-Flaschenkultur von Clostridium tetani hergestellt, welche durch die Zugabe von Formaldehyd inaktiviert (”toxoidiert”) wird. Der Formaldehyd wird als Formalin zugesetzt. Toxoid wird zur Verwendung in einem Impfstoff durch Salzfraktionierung auf eine spezifische Aktivität von etwa 1200-Flockulationseinheiten (Limes flocculationis, Lf)/mg Protein-Stickstoff (PN) gereinigt, was 30% bis 40% Reinheit entspricht.
Es wurden Versuche unternommen, die spezifische Aktivität des Impfstoffs durch Reinigen des Toxoids unter Verwendung von Immunoadsorbentien zu erhöhen (Hughes et al., J. Appl. Bact. 37, 603–621, 1974). Dies führte jedoch lediglich zu einer begrenzten Erhöhung auf 1600 Lf/mg PN. Dawson & Mauritzen (Aust J. Biol. Sci, 1969, Band 22, Seite 1217) beschreiben Untersuchungen zur Wechselwirkung von Formaldehyd mit Tetanus-Toxin, welche die Bindung von Formaldehyd in Gegenwart der Aminosäuren Leucin und Lysin während der Detoxifikation von Tetanus-Toxin einschließt. Bacterial Vaccines („Bakerielle Impfstoffe”) (Ausg. R. Germanier, Academic Press, 1984, Seiten 48–50) beschreibt Verfahren, die bei der Detoxifikation von Tetanus-Toxin zur Verwendung in Impfstoffen, und insbesondere menschlichen Impfstoffen angewandt werden. Die WO-A-91/12020 beschreibt ein neues detoxifiziertes toxisches Antigen, insbesondere B. Pertussis-Toxin, erhalten durch teilweise Detoxifikation unter Verwendung von Glutaraldehyd, gefolgt von einer Umsetzung des teilweise detoxifizierten Antigens mit Formalin in Gegenwart ausgewählter Aminosäuren. Das detoxifizierte B. Pertussis-Toxin gilt als stabil gegenüber einer Reversion zur Toxizität. Die GB-A-969772 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Toxoids aus einem gereinigten bakteriellen Toxin, insbesondere gereinigtem Diphtherie-Toxin, durch Behandeln des Toxins in einem wäßrigen Medium mit Formaldehyd in Gegenwart eines aliphatischen Diamins mit einem Molekulargewicht von unterhalb 200, welches eine primäre oder sekundäre Aminogruppe enthält. Bevorzugte Diamine sind Lysin und Ethylendiamin.
Wir entwickelten jetzt ein neues Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Toxoid. Statt das Toxin zu toxoidieren und anschließend das Toxoid zu reinigen, reinigten wir das Toxin und toxoidierten danach das gereinigte Toxin. Überraschenderweise erwiesen sich aber viele dieser Präparate als instabil und zeigten unterschiedliche Grade der Reversion zu Toxizität bei einer Lagerung bei 37°C in Abwesenheit von Formalin.
Wir befaßten uns dann mit der Hinzufügung von Aminosäuren zu der Toxoidierungsreaktion in verschiedenen Konzentrationen, wobei auch die Formalin-Konzentration, der pH-Wert und die Inkubationszeiten variiert wurden. Die Reversion zu Toxizität war schwierig zu vermeiden, außer auf Kosten der niedrigen (TCP)/Lf-Verhältnisse der Gesamtbindekraft, die zu Präparaten mit schlechter Immunogenizität führten. Nur unter spezifischen Bedingungen konnten stabile und hochimmunogene Präparate erhalten werden.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Toxoid bereit, wobei das Verfahren das Inkubieren von gereinigtem Tetanus-Toxin mit einer spezifischen Aktivität von 2000 Lf/mg PN oder mehr und einem Lf-Gehalt von 250 Lf/ml oder mehr mit 0,2 bis 1% (v/v) Formaldehyd in Gegenwart von 0,005 bis 0,25 M Lysin während 24 bis 32 Tagen bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 und einer Temperatur von 30 bis 45°C umfasst, wobei das gereinigte Toxin mit dem Formaldehyd in Abwesenheit von dem Lysin 20 bis 40 Minuten lang bei 35 bis 40°C vorinkubiert wird.
Das Tetanus-Toxin wird typischerweise aus einer Kultur von Clostridium tetani erhalten. Es kann jeder geeignete Stamm von Cl. tetani verwendet werden. Das Toxin kann aus einer Fermentationsbrühe zunächst durch Zentrifugieren der Brühe und anschließendes Klären des Kulturüberstandes, zum Beispiel durch eine zweistufige Filtration, gereinigt werden. Der geklärte Überstand kann konzentriert werden. Der Überstand kann anschließend einer Diafiltration, um kleine geladene Molekularspezies zu entfernen, und danach einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen werden.
Das gereinigte Toxin hat einen Lf-Gehalt von 250 Lf/ml oder mehr, zum Beispiel von 250 bis 500 Lf/ml. Wenn der Lf-Gehalt geringer als 250 Lf/ml ist, kann das Toxin durch einen zusätzlichen Konzentrationsschritt erneut behandelt werden, um die Toxinausbeute zu erhöhen.
Die spezifische Aktivität des Toxins kann durch Schätzen des Protein-Stickstoff-(PN-)Gehalts des gereinigten Materials und durch Berechnen des Verhältnisses von Lf zu PN bestimmt werden. Das gereinigte Toxin besitzt ein Verhältnis von Lf zu PN von 2000 Lf/mg PN oder mehr, zum Beispiel von 2000 bis 3000 Lf/mg PN oder von 2000 bis 2800 Lf/mg PN. Wenn die spezifische Aktivität von Toxin niedriger als 2000 Lf/mg PN ist, kann das gereinigte Material durch eine Ionenaustauschsäule erneut behandelt werden. Eine spezifische Aktivität von 2000 Lf/mg PN entspricht einer Reinheit von etwa 70%. 100% reines Toxin soll eine spezifische Aktivität von 3000 bis 3200 Lf/mg PN besitzen.
Die Reinheit des Toxins kann alternativ oder weiterhin durch eine Hochdruck-Flüssigchromatographie-(HPLC-)Analyse und/oder durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt werden. Die Reinheit wird vorzugsweise durch HPLC bewertet, wodurch Elutionspeaks integriert werden und der Bereich der toxinbedingten Peaks als Prozentsatz des gesamten integrierten Peakbereichs ausgedrückt wird. Die Analyse durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen trennt das Toxinmolekül in seine schweren (100 kD) und leichten (50 kD) Kettenbestandteile. Die zwei Banden können nach einem Färben identifiziert werden, und ihre kombinierten Intensitäten, wie durch Densitometrie bestimmt, werden als ein Prozentsatz der gesamten Banden ausgedrückt.
Wenn die HPLC-Analyse und/oder SDS-PAGE-Analyse zeigt, daß das Toxin zu weniger als 70% rein ist, kann das Material durch eine Ionenaustauschsäule erneut behandelt werden, um die Reinheit zu erhöhen. Vorzugsweise ist das Toxin daher zu 70% oder mehr rein, beispielsweise zu 70% bis 100% rein, wie durch HPLC und/oder SDS-PAGE ermittelt. Das Toxin kann zu 80% oder mehr oder 90% oder mehr rein sein.
Das gereinigte Tetanus-Toxin wird durch 0,2 bis 1% (v/v) Formaldehyd in Gegenwart von 0,005 bis 0,25 M Lysin toxoidiert. Ein Puffer, wie Natriumborbernsteinsäurepuffer, wird üblicherweise zugesetzt, um den pH-Wert der Lösung von gereinigtem Toxin auf 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, einzustellen. Die Konzentration des gereinigten Toxins in Lösung wird typischerweise auf 150 bis 300 Lf/ml, vorzugsweise etwa 200 Lf/ml, eingestellt.
Das gereinigte Toxin wird zuerst mit dem Formaldehyd in Abwesenheit von Lysin gereinigt. Die Vorinkubation erfolgt während 20 bis 40 Minuten, zum Beispiel während etwa 30 Minuten. Die Vorinkubationstemperatur beträgt 35 bis 40°C, zum Beispiel etwa 37°C.
Lysin wird anschließend hinzugegeben. Das Lysin ist typischerweise L-Lysin, wie L-Lysinmonohydrochlorid. Ein Puffer wie Natriumbicarbonatpuffer kann zur Einstellung des pH-Wertes hinzugegeben werden. Die Inkubation des gereinigten Toxins mit dem Formaldehyd und dem Lysin erfolgt vorzugsweise für etwa 28 Tage. Die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise 35 bis 40°C, zum Beispiel etwa 37°C. Die Formaldehyd-Konzentration ist vorzugsweise 0,25 bis 0,5% (v/v). Die Lysin-Konzentration ist vorzugsweise 0,05 bis 0,2 M. Geeignete Bedingungen sind: –0,25% (v/v) Formaldehyd mit 0,05 bis 0,1 M L-Lysin, und –0,5% (v/v) Formaldehyd mit 0,1 bis 0,2 M L-Lysin.
Das resultierende Toxoid kann anschließend gereinigt werden. Restliches Formaldehyd und Lysin werden entfernt. Das Toxoid kann daher durch Ultrafiltration konzentriert werden, diafiltriert werden, um das restliche Formaldehyd und Lysin zu entfernen, und durch Membranfiltration sterilisiert werden. Vorzugsweise ist das Lf/PN-Verhältnis des Toxoids 2000 Lf/mg PN oder mehr, beispielsweise 2000 bis 3000 Lf/mg PN oder 2000 bis 2800 Lf/mg PN. Weiter bevorzugt besitzt das Toxoid eine Reinheit von 70% oder mehr, zum Beispiel von 70% bis 100%, wie durch HPLC und/oder SDS-PAGE bestimmt. Das Toxoid kann daher zu 80% oder mehr rein oder 90% oder mehr rein sein, wie durch HPLC und/oder SDS-PAGE bestimmt. Wenn das Lf/PN-Verhältnis weniger als 2000 LF/mg PN beträgt und/oder wenn das Toxoid weniger als 70% rein ist, wie durch HPLC und/oder SDS-PAGE bestimmt, kann das Toxoid durch eine Ionenaustauschsäule wiederbehandelt werden.
Ein auf diese Weise hergestelltes Tetanus-Toxoid kann daher keiner Reversion zu Toxin unterliegen, wenn es bei 37°C 3 Monate oder länger, vorzugsweise bis zu 6 Monate gelagert wird; besitzt eine spezifische Aktivität von 2000 bis 2800 Lf/mg PN, beispielsweise 2400 bis 2700 LF/mg PN; und besitzt eine Potenz von 130 bis 270 Internationale Einheiten (Iu)/3,5 Lf, beispielsweise 200 bis 250 Iu/3,5 Lf.
Das resultierende Toxoid unterliegt keiner Reversion zur Toxizität und ist immunogener als der bereits existierende Impfstoff. Das Toxoid kann daher mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel zur Bildung einer Impfstoffzusammensetzung formuliert werden. Das Toxoid kann mit einem physiologisch annehmbaren Lösungsmittel wie physiologischer Salzlösung gemischt werden. Das Toxoid kann alternativ in einer physiologischen Salzlösung oder einer anderen geeigneten, mit Blut isotonischen Lösung auf einem geeigneten mineralischen Träger präzipitiert werden oder durch diesen adsorbiert werden. Solche Formulierungen werden allgemein bei 2 bis 8°C vor dem Gebrauch gelagert. Thiomersal kann in der Impfstoffformulierung vorhanden sein. Das Toxoid kann Teil eines Mehrkomponentenimpfstoffs, wie eines kombinierten Diphterie-Tetanus-Impfstoffs oder eines kombinierten Diphtherie-Tetanus-pertussis-Impfstoffs, sein.
Ein Mensch kann daher gegen Tetanus durch Verabreichung einer wirksamen Menge des vorliegenden Tetanus-Toxoids immunisiert werden. Typischerweise erfolgt die Verabreichung intramuskulär oder subkutan. In jedem Fall kann die verabreichte anfängliche Dosis von Toxoid 3 Lf bis 10 Lf betragen. Diese Dosis kann bis zu zweimal in Abständen von 2 Monaten wiederholt werden. Eine Booster-Dosis von 3 Lf bis 10 Lf kann 5 oder 10 Jahre später verabreicht werden.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung. Ein Referenzbeispiel und Vergleichsbeispiele sind ebenfalls angegeben.
Referenzbeispiel: Herstellung von gereinigtem Tetanus-Toxin
Cl. tetani-Stamm CN 3911, bei dem es sich um eine Subkultur von dem Harvard-Stamm von Cl. tetani handelt (Mueller und Miller, J. Immunol. 50, 377–384, 1945), wurde in einem modifizierten Mueller-Medium (Latham et al., Appl. Microbiol. 10, 146, 1962) kultiviert. Insbesondere wurden 10% (v/v) einer 48-Stunden-Impfkultur verwendet, um sie entweder in einer statischen Flasche oder in einem regulierten Fermentator bzw. Gärbottich, enthaltend ein modifiziertes Mueller-Medium, zu inokulieren. Im Falle der statischen Kultur wurde dem Medium vor der Animpfung Aluminiumpulver zugegeben. Der Fermentator, ein 15-l-Fermentator, wurde mit 50 U/min umgerührt und 0,2 μM filtrierte Luft wurden über die Oberfläche der Kultur in einer Rate von 500 ml/min gezogen. Die Fermentierung in der statischen Flasche oder in dem Fermentator wurde 4 bis 7 Tage bei 33 ± 2°C fortgeführt.
Die Fermentationsbrühe wurde durch satzweises Zentrifugieren (6 × 1-Liter-Rotor) mit 3000 g 40 Minuten lang abgetrennt. Der Überstand wurde weiter durch eine zweistufige Filtration durch einen 1,2/0,8-μm-Kombinationsflter und danach einen 0,2-μm-Sterilfilter geklärt.
Der Kulturüberstand wurde anschließend zehnfach unter Verwendung einer 30K-Cut-off-Ultrafiltrationsmembran konzentriert und anschließend unter Verwendung derselben Membran unter Verwendung von 10 Volumina Puffer [20 mM Tris, 25 mM NaCl, 0,2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH-Wert: 7,5] extensiv diafiltriert. Dies führte zu einer achtzehnfachen Erhöhung der Reinheit, wie durch HPLC ermittelt. Die mittlere Rückgewinnung aus diesem Schritt wurde mit 80% ermittelt.
Das filtrierte Material wurde anschließend auf eine Anionen-Ionenaustauschsäule (DEAE-Sepharose Fast Flow) geladen. Die Säule wurde mit 20 mM Tris-Puffer, pH-Wert = 7,5, gewaschen. Tetanus-Toxin wurde mit 80 mM NaCl, Tris-Puffer, pH-Wert = 7,5, eluiert. Das eluierte Material wurde durch einen 0,2-μm-Sterilfilter steril-filtriert. Das auf diese Weise gereinigte Material wurde den folgenden Tests unterzogen.
(i) Schätzung des Lf-Gehalts
Dieser Test überwachte die Toxin-Ausbeute des gereinigten Toxinmaterials. Ungefähr 5 ml an gereinigtem Toxinmaterial wurden für die Tests hergenommen. Die Probe wurde vor dem Testen nicht gelagert. Die Lf-Bestimmung wurde durch die bei Ramon, G. (1922), Sur une technique de titrage in vitro due serum anti-diphtherique C. P. SOC. BIOL. (Paris) 86, 711–712, beschriebene Verfahrensweise durchgeführt. Der Lf-Gehalt des gereinigten Materials war 250–500 Lf/ml.
(ii) Schätzung des Lf: Protein-Stickstoff-Verhältnisses
Dieser Test ermittelte die Reinheit des gereinigten Materials. Nicht weniger als 1 ml des gereinigten Materials wurden für die Tests herangezogen. Die Probe wurde bei 5°C ± 3°C gelagert, wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Der Protein-Stickstoff-(PN-)Gehalt wurde unter Verwendung der Kjeldahl-Digeriertechnik (Kjeldahl J. (1888) C. R. CARLSBERG LABOR. (Kopenhagen) 2, 1–12) nach der Präzipitierung mit Trichloressigsäure geschätzt. Das Verhältnis von Lf:PN war 2000–3000 Lf/mg PN.
(iii) Bestimmung des HPLC-Profils durch Größenausschluß
Dieser Test stellte sicher, daß das HPLC-Profil des gereinigten Toxins sich innerhalb der annehmbaren Grenzen befand. Nicht weniger als 1 ml gereinigtes Material wurde für die Tests herangezogen. Die Probe wurde bei +4°C vor dem Test aufbewahrt. Eine Probe des gereinigten Toxinmaterials wird auf eine HPLC-Gel-Filtrationssäule (TSK G 3000 SW × 1) aufgebracht. Die Abtrennung der Probenkomponenten wird bei 280 nm überwacht, und die Peakbereiche werden integriert. HPLC-Resultate:

– Peak 1 (Verweilzeit 10,6–10,7 Minuten) – Toxinmonomer;
– Peak 2 (Verweilzeit 12,4–12,5 Minuten) – Toxinfragment C; und
– Peak 3 (Verweilzeit > 14 Minuten) – Verunreinigungen.

Die kombinierten integrierten Bereiche der Peaks 1 und 2 betrugen 70 bis 100% der gesamten integrierten Bereiche der Peaks 1 bis 3.
(iv) Bestimmung des SDS-PAGE-Profils
Dieser Test stellte sicher, daß das SDS-PAGE-Profil des gereinigten Toxins innerhalb annehmbarer Grenzen lag. Nicht weniger als 0,5 ml des gereinigten Toxinmaterials wurden für die Tests herangezogen. Die Probe wurde bei 4°C vor dem Testen aufbewahrt. Die Probe wurde nach der Reduktion unter Verwendung von Mercaptoethanol durch SDS-PAGE durch das von Laemili beschriebene Verfahren untersucht (Nature, 227, 680–685, 1970). Das Gel wurde durch ein Densitometer abgetastet, und es wurden die Peakbereiche integriert. Die schweren (100 kD) und leichten (50 kD) Toxin-Banden repräsentierten 70 bis 100% der gesamten mit Coomassieblau gefärbten Banden, berechnet aus den durch Densitometrie nachgewiesenen integrierten Banden.
BEISPIEL: Toxoidierung von gereinigtem Tetanus-Toxin
Das gereinigte Tetanus-Toxin aus dem Referenzbeispiel wurde mit ausreichend Natriumborbernsteinsäure-(SBSA-)Puffer, pH-Wert = 7,5, verdünnt, wodurch eine letztendliche Toxinkonzentration von 200 Lf/ml erhalten wurde. Die Aliquoten wurden wie folgt toxoidiert:

1. 0,25% (v/v) Formaldehyd in der Form von Formalin wurden einer Aliquote zugesetzt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert. L-Lysin-monohydrochlorid wurde anschließend auf eine Endkonzentration von 0,1–0,2 M in Gegenwart von 0,1 M Natriumbicarbonat zugesetzt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung war 6,5 bis 7,5, und die Toxoidierung wurde 28 Tage lang bei 37°C ± 2°C weiterlaufen gelassen.
2. 0,5% (v/v) Formaldehyd in der Form von Formalin wurden einer weiteren Aliquote zugesetzt und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert. L-Lysin-monohydrochlorid wurde anschließend einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,1 M in Gegenwart von 0,1 M Natriumbicarbonat zugegeben. Der pH-Wert der Reaktionsmischung war 6,5 bis 7,5, und die Toxoidierung wurde 28 Tage lang bei 37°C ± 2°C weiterlaufen gelassen.

Der Lf-Gehalt des inkubierten Materials wurde wie in dem Referenzbeispiel beschrieben untersucht. Das inkubierte Material wurde durch eine Ultrafiltration-30K-Cutoff-Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Das Konzentrat wurde unter Verwendung derselben 30K-Membran gegenüber einem SBSA-Puffer, pH-Wert = 7,5, diafiltriert, um restliches Formaldehyd und Lysin zu entfernen. Thiomersal (Ethylmercurithiosalicylsäure, Natriumsalz) wurde hinzugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 0,1 g/Liter (2,5 × 10^–4 Mol/Liter) Thiomersal erhalten wurde. Die resultierende Lösung wurde durch Membranfiltration (0,2-μm-Membran) sterilisiert. Es wurden Proben entnommen und wie folgt getestet:
(i) Schätzung des Protein-Stickstoff-Gehalts
Dieser Test wurde wie in dem Referenzbeispiel beschrieben durchgeführt. Das Resultat war 2000–2800 Lf/mg PN.
(ii) Schätzung des Gesamtbindevermögens (TCP)
Dieser Test bestimmte den Antigengehalt des Tetanus-Toxoids. TCP ist ein weithin verwendeter Begriff im Tetanus-Fachbereich und wird in dem WHO-Leitfaden (11, Anhang T. 10) erwähnt. Dieser ist als reziproker Wert des Toxoidvolumens definiert, welches bei Verdünnung, wie sich erweist, 1 internationalen Einheit (WHO BLG/UNDP/77,1 Rev. 1) entspricht. Die Qualität von Toxoiden kann durch Bestimmung des Verhältnisses von TCP (Bindeeinheiten) zu Lf-Einheiten gemessen werden, welche größer als 1 sein sollte.
Nicht weniger als 5,0 ml des Toxoids wurden für die Untersuchung herangezogen. Die Probe wurde bei 5°C ± 3°C aufbewahrt, wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Ein geeigneter Bereich der Volumina von 0,01–0,03 μl des Testmaterials und ein Referenz-Tetanus-Toxoid von 87 internationalen Einheiten (Iu)/ml, die eine korrigierte geometrische Progression erzeugen, wurden in eine Reihe von Röhrchen verteilt. Ein feste Dosis von 2 Iu/0,5 ml an Tetanus-Antitoxin-Referenzlösung wurde jedem Röhrchen hinzugegeben und 60 Minuten lang auf Raumtemperatur gehalten.
Ein der halben Antitoxin-Dosis entsprechendes Volumen des Tetanus-Testtoxins wurde jedem Röhrchen hinzugegeben und 30 Minuten stehen gelassen. Der Inhalt jedes Röhrchens wurde subkutan in Mäuse injiziert, die jeweils ein Gewicht von 18–22 g hatten. Die Mäuse wurden 4 Tage auf Anzeichen einer typischen Tetanus-Paralyse hin beobachtet.
Wenn eine spezifische Tetanus-Paralyse innerhalb von 3 Tage auftrat, enthielt das Testmaterial Tetanus-Toxoid, das mehr als der Hälfte der zugegebenen Antitoxin-Dosis entsprach. Wenn die Maus mehr als 3 Tage ohne eine spezifische Tetanus-Paralyse überlebte, enthielt das Testmaterial Tetanus-Toxoid, das weniger als der Hälfte der zugesetzten Antitoxin-Dosis entsprach. Die Herbeiführung einer spezifischen Tetanus-Paralyse am dritten Tag war ein Hinweis darauf, daß das Volumen von Tetanus-Toxoid exakt als der halben zugesetzten Antitoxin-Dosis entsprechend angenommen wurde.
Die Resultate wurden als Durchschnitt von zwei Tests angenommen, unter der Maßgabe, daß diese vom Durchschnittswert nicht um mehr als 20% abwichen. Die Resultate waren 200–350 u/ml.
(iii) Schätzung des Lf-Gehalts
Der Lf-Gehalt wurde wie in dem Referenzbeispiel beschrieben bestimmt. Die Resultate waren 150–250 Lf/ml.
(iv) Bestimmung des HPLC-Profils
Das HPLC-Profil wurde wie in dem Referenzbeispiel beschrieben bestimmt. Das Resultat war 70–100% Reinheit.
(v) Reversionstest
Dieser Test wies das Ausbleiben einer Reversion des Toxoids zu Toxin während der Lagerung oder des Gebrauchs nach und erfüllt die Anforderungen der Technischen Berichtsreihe der WHO Nr. 725, Seite 67. 10 ml an diafiltriertem Toxoid-Material wurden genommen und bei 5 ± 3°C gelagert, bis der Lf-Gehalt wie obenstehend beschrieben geschätzt wurde. Die Probe wurde auf 16 Lf/ml verdünnt. Die verdünnte Probe wurde auf 37°C gehalten. Die Probe wurde nach einer Lagerung von 6 Wochen, 2 Monaten und 3 Monaten auf Nicht-Toxizität untersucht. 5 ml der Probe wurden subkutan in jedes von 2 gesunden Meerschweinchen eingeimpft. Die Tiere wurden 14 Tage lang hinsichtlich einer Todesfolge oder von Anzeichen einer spezifischen Paralyse beobachtet. Es gab keinen Hinweis auf eine Reversion zu Toxin.
(vi) Charakterisierung von Toxoid durch elektrophoretische Mobilität
In diesem Test wurde die Potenz des toxoidierten Materials vorausgesagt. 0,5 ml diafiltriertes Toxoid-Material wurden für den Test hergenommen. Die Probe wurde bei 5 ± 3°C gelagert, wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Glasplatten wurden mit 1% (v/v) Agarose in 60 mM Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 überzogen (0,18 ml/cm²). Die Proben (5 ul) wurden in der ersten Dimension mit 20 Volt/cm 60 Minuten lang einer Elektrophorese unterzogen. Die Elektrophorese in der zweiten Dimension in Agarose, die Pferde-Antitetanusserum enthielt (0,06% v/v), wurde bei 6 Volt/cm 16 Stunden lang durchgeführt.
Das Gel wurde mit Coomassieblau gefärbt, und es wurde die Mobilität des Toxoidpeaks ab dem Ausgangspunkt gemessen. Die Resultate, einschließlich des Resultats für ein Referenz-Toxoid (14 mm), waren 5–30 mm.
(vii) Untersuchung der Potenz
Dieser Test erfüllt die Anforderungen der ”British Pharmacopoiea” (amtliches britisches Arzneibuch) (1980), Band II, Seite 880, Ph. Eur., Anhang zu Band III (1977), Seite 175, und der Technischen Berichtsreihe der WHO Nr. 638, Seite 90, Abschnitt A.3.5.6. Die Potenz wurde anhand der Reaktion auf die Immunisierung mit einem Impfstoff, welcher durch Adsorption des toxoidierten Materials an einem Hilfsmittel (Aluminiumhydroxid, Alhydrogel) hergestellt wurde, bestimmt.
Eine Probe aus einem Transportbehälter einer am Ende erhaltenen Masse von adsorbiertem Impfstoff wurde für den Test herangezogen. Die Probe wurde bei 5°C ± 3°C gelagert, wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Die Probe wurde durch das in Ph. Eur., Anlage zu Band III (1977), Seite 175, beschriebene Verfahren untersucht. Die Potenz wurde mit 130 bis 270 Iu/3,5 Lf ermittelt, was wesentlich höher ist als die Potenz von 70–110 Iu/7 Lf des gebräuchlichen Impfstoffs, welcher durch Toxoidierung mit Formaldehyd und anschließendes Reinigen des Toxoids hergestellt wird.
(viii) Untersuchung der spezifischen Toxizität
Dieser Test basiert auf den Anforderungen der ”British Pharmacopoiea” (amtliches britisches Arzneibuch) (1988), Band II, Seite 1062; Ph. Eur., 1985, Seite 452, und der Technischen Berichtsreihe der WHO Nr. 638, Seite 90, Abschnitt A.3.5.5. Der Test wies das Fehlen einer nachweisbaren Toxizität nach, die auf das Tetanus-Toxoid zurückzuführen ist. Nicht weniger als 12,5 ml toxoidiertes Material wurden für den Test hergenommen. Die Probe wurde bei 5°C ± 3°C gelagert, wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Das Verfahren basierte auf dem in Ph. Eur., 1985, Seite 452, beschriebenen. 1 ml einer Verdünnung, die mindestens 500 Lf-Einheiten Tetanus-Toxoid enthielt, wurde subkutan in jedes von fünf normalen Meerschweinchen injiziert, die jeweils ein Gewicht von 250 g–350 g hatten. Die Tiere wurden 21 Tage lang auf Anzeichen einer spezifischen Toxizität oder Paralyse hin beobachtet. Es gab keine Hinweise auf Toxizität, die auf Tetanus-Toxoid zurückzuführen ist.
Vergleichsbeispiel 1: Toxoidierung in Abwesenheit von Lysin
Das gereinigte Tetanus-Toxin des Referenzbeispiels wurde unter Zugabe lediglich von Formalin toxoidiert. 0,25–1,0% Formaldehyd in der Form von Formalin wurden mit Toxin mit 200 Lf/ml 14 Tage lang bei 37°C ± 2°C inkubiert. Es wurde daher kein Lysin hinzugegeben.
Die resultierenden Toxoide wurden auf eine Reversion wie in dem Beispiel beschrieben untersucht. Die Toxoide unterlagen der Reversion zur Toxizität. Die der Reversion unterliegenden Toxoide führten in der Tat selten zu einem klassischen Tetanus, erzeugten aber ein anderes neurologisches Syndrom.
Vergleichsbeispiel 2: Toxoidierung in Gegenwart von Lysin unter verschiedenen Bedingungen
Das gereinigte Tetanus-Toxin des Referenzbeispiels wurde wie folgt toxoidiert:

(i) Gereinigtes Tetanus-Toxin aus dem Referenzbeispiel wurde mit ausreichend SBSA-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 unter Erhalt einer letztendlichen Toxinkonzentration von 200 Lf/ml verdünnt. 0,1 bis 1,0% Formaldehyd, in der Form von Formalin, wurden einer Aliquote hinzugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert. L-Lysin-monohydrochlorid wurde anschließend einer Endkonzentration von 0,005 bis 0,1 M in Gegenwart von 0,1 M Natriumbicarbonat hinzugegeben. Der pH-Wert der Reaktionsmischung war 6,5 bis 7,5, und die Toxoidierung wurde 14 Tage lang bei 37°C weiterlaufen gelassen.
(ii) Wie (i), jedoch wurde der pH-Wert der Toxoidierungsreaktion von 6,0 zu 8,5 verändert.
(iii) Wie (i), jedoch wurde Arginin (0,05 bis 0,1 M) an Stelle von Lysin verwendet.
(iv) Wie (i), jedoch wurde der Inkubationszeitraum von 14 Tagen auf 21 Tage erhöht.
(v) Wie (i), jedoch ohne Vorinkubationszeit.

Alle resultierenden Toxoide wurden auf eine Reversion wie in dem Beispiel beschrieben untersucht. Die Toxoide unterlagen einer Reversion zur Toxizität.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Toxoid, wobei das Verfahren das Inkubieren von gereinigtem Tetanus-Toxin mit einer spezifischen Aktivität von 2000 Lf/mg PN (Limes flocculationis/mg Protein-Stickstoff) oder mehr und einem Lf-Gehalt von 250 Lf/ml oder mehr mit 0,2 bis 1% (v/v) Formaldehyd in Gegenwart von 0,005 bis 0,25 M Lysin für 24 bis 32 Tage bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 und einer Temperatur von 30 bis 45°C umfaßt, wobei das gereinigte Toxin mit dem Formaldehyd in Abwesenheit des Lysins während 20 bis 40 Minuten bei 35 bis 40°C vorinkubiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Tetanus-Toxin von einer Kultur von Clostridium tetani gereinigt wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das gereinigte Toxin eine spezifische Aktivität von 2000 bis 3000 Lf/mg PN und einen Lf-Gehalt von 250 bis 500 Lf/ml besitzt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das gereinigte Toxin zu 80% oder mehr rein ist, wie durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und/oder Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das gereinigte Toxin mit dem Formaldehyd und Lysin etwa 28 Tage lang bei 35 bis 40°C inkubiert wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei 0,25 bis 0,5% (v/v) Formaldehyd in dem Inkubationsschritt verwendet werden.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei 0,05 bis 0,2 M Lysin in dem Inkubationsschritt verwendet werden.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das toxoidierte Toxin mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel zur Bildung einer Impfstoffzusammensetzung formuliert wird.