MXPA05009579A

MXPA05009579A - Proceso de purificacion para citolisina bacteriana.

Info

Publication number: MXPA05009579A
Application number: MXPA05009579A
Authority: MX
Inventors: Vandercammen Anne
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2003-03-13
Filing date: 2004-03-11
Publication date: 2005-11-17
Also published as: CA2518669C; WO2004081515A3; JP4597123B2; KR20050111357A; WO2004081515A2; HK1086013A1; NZ541969A; CA2812817A1; CA2518669A1; NO20054134D0; RU2005125832A; EP1601689B1; EG24449A; MA27666A1; US8084235B2; CN101818185A; DK1601689T3; RU2340627C2; CN101818185B; AU2010212257B2

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para purificar citolisinas tal como neumolisina neumococica. Una etapa de cromatografia unica produce excelente purificacion de la citolisina al unir citolisina agregada soluble a un material de cromatografia de interaccion hidrofobico en la presencia de detergente y rica en sal.

Description

PROCESO DE PURI FICACIÓN PARA CITOLISINA BACTERIANA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere al campo de purificación de citolisina bacteriana y particularmente a un método de purificación de neumolisina. Neumolisina es u na proteína de Streptococcus pneumoniae con buenas propiedades antigénicas q ue es adecuada como un componente de vacuna contra infección por S. pneumoniae o otitis media. El método de la invención describe una etapa ventajosa e inusual de purificar neumolisina en una etapa cromatográfica única al unirla a una columna de interacción hidrofóbica en la presencia de detergente y rica en sal. El proceso ventajosamente hace uso de la propiedad de citolisinas bacterianas de tener una alta afinidad a compuestos aromáticos q ue se parecen a colesterol , particularmente cuando están en una condición agregada y por lo tanto será generalmente aplicable para la purificación de miembros de esta familia de toxinas. Citolisinas activadas por tilo forman un grupo prominente de toxinas bacterianas de las cuales esteptolisina O es el prototipo (Billington et al FEMS Microbiol. Lett. (2000), 1 82; 1 97-205). Estas toxinas son líticas para células eucarióticas por la formación de poros en la membrana celular. Los agentes oxidantes afectan de manera adversa su actividad citolítica mientras que los agentes reductores pueden restaurar la actividad . Los miembros de este grupo muestran 30-60% de similitud en la secuencia de aminoácidos primarios y contienen una secuencia de undecapéptido casi invariante cerca del término C. colesterol es el receptor celular objetivo, principal para estas toxinas. Las citolisinas se unen a membranas que contienen colesterol y se oligomerizan para formar poros de transmembrana de hasta 30nm en diámetro y compuestos de 40-80 subunidades de monómero. La unión de colesterol de membrana induce un cambio conformacional en el monómero de toxina conduciendo los eventos subsiguientes de oligomerización , inserción de membrana y formación de poro. Sfrepfococcus pneumoniae es el agente causante de varias enfermedades humanas incluyendo neumonía , bacteriemia, meningitis, otitis media y sinusitis. Algunas veces estas enfermedades pueden conducir a fatalidades a pesar de la disponibilidad de antibióticos. La emergencia de cepas resistentes a antibióticos de S. Pneumoniae ha ag ravado los problemas causados por este patógeno. En este contexto, es importante que se desarrollen vacunas efectivas contra S. Pneumoniae. Las vacunas neumocócicas polivalentes conteniendo polisacáridos capsulares han estado disponible por varios años. Su aplicación se limita por inmunogenicidad deficiente particularmente en grupos de alto riesgo incluyendo infantes , personas de edad avanzada y aquellos con anemia de célula falciforme, mieloma múltiple, cirrosis o alcoholismo. También proporcionan protección específica de serotipo y solamente 23 de 90 serotipos conocidos se cubren por formulaciones existentes. Esto dará protección contra 90% de los seroíipos encontrados en la población en EE. U U. pero contra solamente aproximadamente 70% de los serotipos encontrados en poblaciones asiáticas. Recientemente una vacuna heptavalente ha estado disponible, cuya similitud tiene problemas de protección contra todas las cepas neumocócicas. Neumolisina (Ply) es una citolisina activada por tilo 53kDa encontrada en todas las cepas de S. pneumoniae, q ue se libera en autolisis y contribuye a la patogénesis de S. Pneumoniae. Se conserva altamente con solamente unas pocas substituciones de aminoácido ocurriendo entre las proteínas Ply de diferentes serotipos. El alto grado de conservación de neumolisina y su ¡nmunogenicidad la hace un candidato posible como un componente de vacuna. Sin embargo, Ply tipo silvestre es inadecuada para la incorporación en vacunas para utilizarse en humanos debido a su toxicidad. Ply causa daño a membranas celulares al interactuar con colesterol unido a membrana y oligomerizarse para formar poros en la membrana. Un motivo que contiene cisteína conservada encontrado cerca del término C se ha implicado en la actividad lítica. Se ha sugerido que las mutaciones de Ply disminuyen s u toxicidad (WO90/06951 , WO99/03884). Un método de dos etapas para la purificación de neumolisina se ha descrito por Lock et al. , (Microbial Patogénesis (1 996) 21 ; 71 -83). Neumolisina recombinante se purifica de un cultivo E. coli utilizando una combinación de intercambio iónico y cromatografía de filtración de gel. El método incluye las etapas de preparar un extracto y pasarlo bajo una columna de DEAE-Sefarosa seguida por una columna de Sefacrilo S200-HR. Este método podría utilizarse para purificar neumolisina nativa o recombinante. Kuo et al describen un método para purificar proteína de fusión de GST-neumolisina recombinante (Infection and I mmunity (1995) 63 ; 2706-2713) . La proteína de fusión se expresa en un cultivo E. coli y un lisato celular se carga sobre un gel de agarasa glutationa. La proteína de fusión se eluye con glutationa y trombina puede utilizarse para separar la proteína de fusión . Las proteínas se pasan sobre una columna de glutationa-agarosa de nuevo para remover GST. La neumolisina purificada por afinidad se purifica además utilizando una columna de hidroxilapatita. Mitchell et al (BBA ( 1 998) 1 007; 67-72) describen un método para purificar neumolisina utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica . Bajo las condiciones en q ue se utilizan (250m sal), la neumolisina fallo en unirse herméticamente a la columna aunq ue su progreso fue retardado y la neumolisina se eluyó como un pico amplio. Las etapas adicionales de determinar que fracciones contuvieron neumolisina pura, concentrar las fracciones positivas, recargar en la columna y eluir con un volumen pequeño de agua fueron necesarias para superar el problema de la neumolisina que no se une herméticamente al material de la columna. Permanece una necesidad continua de vacunas mejoradas contra S. pneumon iae. La incorporación de un componente Ply tiene esperaza aunque la toxicidad de la proteína sigue siendo un problema. El desarrollo de un procedimiento rápido y efectivo para la purificación voluminosa de neumolisina también se requiere. Los métodos descritos previamente incluyen el uso de múltiples etapas de purificación con análisis de intervención y etapas de concentración. La presente invención proporciona un método de purificación más eficiente que utiliza ventajosamente una etapa de cromatografía única, que es capaz de utilizarse para purificar grandes grupos de neumolisina.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 - Geles SDS-PAGE mostrando la purificación de neumolisina. Las siguientes muestras se pasan en geles SDS-PAGE: - vía 1 - estándares de peso molecular, vía 2 - sobrenadante de extracto celular, vía 3 - flujo directo de fenil-sefarosa, vía 4 - primer lavado de sefarosa, vía 5 - segundo lavado de fenil-sefarosa, vía 6 -lavado de fenil-sefarosa con 0.5 NaCI, vía 7 - solución de fenil-sefarosa con regulador bajo en sal, vía 8 - neumolisina después de etapas de desnaturalización/replegado, vía 9 - neumolisina después de filtración de esterilización. El panel A muestra el gel después de la coloración con azul coomassie. El panel B muestra el gel después de un procedimiento Western biotting utilizando anticuerpos anti-E.coli para probar las proteínas contaminantes. Figura 2 - Análisis de SDS-PAGE de neumolisina modificada por G BS (éster N-(y-maleimidobutiriloxi)succinimida) - coloreado con azul coomassie. Las siguientes muestras se pasan en un gel SDS-PAGE; vía 1 - estándares de peso molecular, vía 2 - neumolisina sin modificar, vía 3 - PLY tratado con GMBS a una proporción molar de GMBS/lisina de 4/1 , vía 4 - PLY tratada con GMBS a una proporción molar de GMBS/lisina de 4/1 e incuba por 7 días a 37°C, vía 5 - PLY tratada con GMBS a una proporción molar de GMBS/lisina de 8/1 , vía 6 - PLY tratada con GMBS a una proporción molar de GMBS/lisina de 8/1 después de incubación por 7 días a 37°C, vía 7 - PLY tratada con Sulfo-NHS acetato a una proporción molar de NHS/lisina de 10/1 , vía 8 - PLY tratada con NEM, vía 9 - PLY tratada con NEM después de 7 días de incubación a 37°C. Figura 3 - Toxicidad de neumolisina tratada con GMBS dada intranasalmente a ratones. La vía marcada con diamantes indica tasa de supervivencia de ratones con 2 ug de neumolisina nativa. La vía marcada con cuadrados indica la tasa de supervivencia de ratones con 10 ug de neumolisina tratada con GMBS. Figura 4 - Protección inducida por neumolisina tratada con GMBS en ratones con neumolisina nativa de manera intranasal. La línea marcada con rectángulos muestra la tasa de supervivencia en ratones inoculados con adyuvante solo. La línea marcada con diamantes indica la tasa de supervivencia de ratones inoculados con neumolisina nativa. La línea marcada con cuadrados indica la tasa de supervivencia para ratones inoculados con neumolisina tratada con GMBS.

Figura 5 - Protección inducida por inoculación con PhtD y neumolisina tratada con GMBS en ratones con cepa neumocócica tipo 2 D39 de manera intranasal . La l ínea marcada con rectángulos presenta la tasa de supervivencia de ratones inoculados con adyuvante solo. La l ínea marcada con diamantes representa la tasa de supervivencia de ratones inoculados con PhtD. La línea marcada con cuadrados representa la tasa de supervivencia de ratones inoculados con PhtD y neumolisina tratada con GMBS.

DESCRI PCIÓN DETALLADA Procesos El proceso de la invención es un método para purificar una citolisina bacteriana tal como neumolisina. Una citolisina, por ejemplo neumolisina, se purifica utilizando solamente una etapa de cromatografía de columna única sin requerir recargar en la columna. La proteína se une en una forma agregada a una columna de interacción hidrofóbica en la presencia de detergente y sal . Pocas proteínas se unen a la columna bajo estas condiciones permitiendo la purificación de una citolisina en una etapa única . Para los propósitos de la invención un agregado soluble de una citolisina, preferentemente neumolisina es una forma agregada de la citolisina q ue permanece en el sobrenadante después de centrifugación a 30 , 000g por 20 min utos. El agregado soluble se retiene en material de cromatografía de interacción hidrofóbica, preferentemente fenil-Sefarosa , en la presencia de sal alta, preferentemente 1 M. Opcionalmente, el agregado soluble es coloidal. La citolisina, preferentemente neumolisina se une a la columna como un agregado soluble. Es inusual cargar agregados sobre una columna por varias razones incluyendo filtros o columnas de coagulación y pérdida de material. Sin embargo, al utilizar un detergente q ue red uce el tamaño de los agregados para formar un agregado soluble, se encuentra que estos agregados se unen herméticamente a la columna bajo condiciones de detergente pero pueden eluirse a una pureza de al menos 50% , 60%, 70%, 80%, preferentemente 90%, 95% , más preferentemente 97%, 98% , o 99%, como se valora por análisis SDS-PAGE sin afectar de manera adversa los filtros de columna. El proceso preferentemente da una producción de al menos 1 00, 200, 500, 700, más preferentemente 1000, 1500, 1700 o 1 900mg de citolisina, preferentemente neumolisina por litro de fermentación . Preferentemente, al menos 1 % , 2%2 5%, 7% , 9% o 10%o de la proteína del cultivo de fermentación se recupera como citolisina purificada , preferentemente neumolisina . El proceso explota la habilidad de citolisinas tal como neumolisina para unirse a colesterol y otros compuestos aromáticos. Esta unión es particularmente hermética cuando la citolisina se agrega, permitiendo que la citolisina se una en la presencia de detergente. El proceso puede extenderse a otros miembros de la familia de citolisinas ya q ue todos los miembros comparten la habilidad de unirse a compuestos aromáticos y formar poros. De hecho, el método podría utilizarse para pu rificar otras familias de proteína que se unen a colesterol u otros compuestos aromáticos y/o forman poros, preferentemente ambos. De acuerdo con lo anterior, en una primer modalidad, se proporciona un proceso para purificación de citolisina bacteriana comprendiendo las etapas de: a) desarrollar un cultivo de células que expresan citolisina bacteriana; b) preparar un extracto del cultivo conteniendo citolisina bacteriana; c) unir citolisina bacteriana agregada soluble, contenida en el extracto, en la presencia de detergente (preferentemente detergente alifático) a un material de cromatografía de interacción hidrofóbica bajo condiciones ricas en sal (preferentemente 0.5-2M); d) eluir citolisina bacteriana en la presencia de detergente (preferentemente detergente alifático) bajo condiciones bajas en sal (preferentemente 0- 0.2 ). En una segunda modalidad se proporciona un proceso para purificación de citolisina bacteriana comprendiendo las etapas de: a) desarrollar un cultivo de células expresando citolisina bacteriana; b) preparar un extracto del cultivo conteniendo citolisina bacteriana ; c) unir citolisina bacteriana contenida en el extracto a material de cromatografía de interacción hidrofóbica en la presencia de una solución conteniendo 0.5-2M ' de sal y 0. 1 %-5% de detergente; d) eluir citolisina bacteriana utilizando una solución baja en sai (preferentemente 0-0.2 ) conteniendo 0.1 -5% de detergente. En cualq uiera de las modalidades anteriores, el proceso de la invención preferentemente comprende las etapas adicionales de: e) remover detergente de la citolisina bacteriana f) solubilizar la citolisina bacteriana por adición de un desnaturalizante; g) remover el desnaturalizante de la citolisina bacteriana. El proceso de la invención puede utilizarse ventajosamente para purificar neumolisina neumocócica. Otras citolisinas que pueden purificarse por el método de la invención incluyen piolisin de A. pyogenes, cereolisin de B. cereus, turingiolisin O de B. thuringiensis, laterosporolisin de B. latersporus, bifermentolisin de C. bifermentans, botukinolisin de C. botulinum, chauveolisin de C. chauvoel, histoliticolisin de C. histolyticum, oedematolisin de C. novyi tipo A, perfringolisin O de C. perfringens, septicolisin O de C. septicum, sordellilisin de C. sordellii, tetanolisin de C. tetani, ivanolisin O de L. ivanovi, listeriolisin O de L. monocytogenes, seeligerilisin O de L. seeligeri, alveolisin de P. alvei, streptolisin O de S. pyogenes, S. canis o S. equisimilis, intermedilisin de S. intermedius, suilisin de S. suis o pneumolisin de S. pneumoniae que pueden ser de tipo silvestre o pueden ser una toxinas genéticamente mod ificada con niveles inferiores de toxicidad tal como PdA y PdB descritos arriba . Por neumolisina o Ply se entiende neumolisina nativa de neumococo o neumolisina recombinante, neumolisina tipo silvestre o mutantes de neumolisina (por ejemplo, aq uellos descritos en WO90/06951 y WO99/03884). Opcional mente , neumolisina también significa cualq uier fragmento de neumolisina o cualq uier variante de neumolisina que comparte al menos 70 , 80 , 90 o 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de neumolisina tipo silvestre, que aún mantiene la habilidad de purificarse por los métodos de la invención, como se determina fácilmente por una persona experta en la materia. En modalidades preferidas de la invención , el mismo detergente está presente en las etapas b) y c), b) y d), c) y d), más preferentemente en las etapas b), c), y d), preferentemente a una concentración de 0. 1 %-5% (p/v). Para los propósitos de la invención, un detergente alifático se define como un detergente substancialmente alifático con carácter aromático insuficiente para prevenir la unión de citolisina a la columna en la etapa c). Preferentemente, el detergente tendrá uno o menos anillos aromáticos, más preferentemente no tiene anillos aromáticos.

Durante la etapa b), es ventajoso para el detergente romper los agregados más grandes de citolisina en agregados más pequeños que hacen un agregado soluble. Durante las etapas c) y d), el detergente mantiene ventajosamente el estado ag regado soluble de la citolisina, permitiéndole unirse a la columna en condiciones ricas en sal con alta afinidad. La citolisina, preferentemente neumolisina se expresa en un cultivo de células bacterianas, preferentemente S. pneumoniae, E. coli o alternativamente en células de levad ura, células de insecto, células de mamífero y cualq uier otro sistema de expresión adecuado para su expresión . En sistemas de expresión q ue producen altas producciones de neumolisina , la neumolisina con frecuencia se agrega por su propia voluntad y el proceso de la invención es ideal para su purificación . Preferentemente la neumolisina se expresa a altas producciones de manera q ue hace más del 2, 3, 4, 5, 7 o 1 0% de proteína total en el sistema de expresión. Preferentemente, la neumolisina está en forma de agregado y por lo tanto mayormente desprovista de actividad hemolítica. Por ejemplo, la expresión en E. coli en un fermentador bajo un promotor de fago ? u otros promotores que permite alta expresión se conocen bien por la persona experta en la materia. Preferentemente, la citolisina se extrae del sistema de expresión como un agregado . Alternativamente , un sistema de expresión de prod ucción más baja puede proporcionar citolisina soluble. En este caso, el extracto conteniendo citolisina, preferentemente neumolisina se ajusta a un pH por debajo de 7.5 que permite a la citolisina agregarse durante un periodo de al menos 8 horas, preferentemente al menos 24 horas. La preparación de un extracto en la etapa b) preferentemente incluye una o más etapas de rompimiento mecánico de las células y/o tratamiento de las células con detergente. Si se hace con un método de alta producción , la neumolisina permanece en la forma de agregados pero los agregados deben ser lo suficientemente pequeños de manera que permanezcan en el sobrenadante después de la centrifugación de la muestra bajo condiciones necesarias para formar bolitas de residuos celulares solubles. Preferentemente, el detergente utilizado en la invención es un detergente alifático que no contiene anillos aromáticos, preferentemente un detergente iónico, más preferentemente un detergente aniónico o catiónico y más preferentemente, el detergente es sarcosinato de lauroil sodio. Los detergentes preferidos son capaces de solubilizar neumolisina mientras se deja en la forma de agregados pequeños que se unen a la columna de interacción hidrofóbica sin causar bloqueo de filtros unidos a la columna. Los detergentes preferidos son capaces de reducir el tamaño de agregados de neumolisina, permitiendo que los agregados de neumolisina sean suficientemente pequeños de manera que permanecen en los sobrenadantes después de la centrifugación de la muestra a 30,000g por 20 minutos. Tales agregados solubles son purificables como tales en la columna de interacción hidrofóbica. El detergente está presente a una concentración de entre 0.1 % y 5%, preferentemente 0.5% y 3% (p/v), preferentemente entre 0.75% y 2%, más preferentemente aproximadamente 1 %. Preferentemente, el detergente es dialisable. Después de la interrupción de detergente y/o mecánica del cultivo en la etapa b), el proceso de la invención incluye centrifugación del material celular y recolectar el sobrenadante como el extracto a cargarse sobre el material de cromatografía durante la etapa c). Neumolisina está preferentemente presente en el sobrenadante como un agregado soluble. El proceso de la invención utiliza cromatografía de interacción hidrofóbica para purificar neumolisina en una etapa única. El material de la columna utilizado en la etapa c) preferentemente contiene grupos aromáticos, preferentemente grupos fenilo y más preferentemente fenil-sefarosa. La solución utilizada en la etapa c) y/o etapa d) durante la carga y elución de la columna comprende un detergente iónico, preferentemente un detergente aniónico o catiónico, preferentemente un detergente que es soluble en concentraciones de sal arriba de 0.5M, más preferentemente el detergente es sarcosinato -de lauroil sodio. El detergente utilizado es uno que reducirá el tamaño de citolisina, preferentemente neumolisina, agregados, permitiendo que la citolisina esté presente en la muestra como un agregado soluble de manera que se unirá al material de la columna de interacción hidrofíbica sin quedarse irreversiblemente en la columna. El detergente está presente en una concentración de preferentemente entre 0.1 % y 5% , preferentemente 0.5% y 3% (p/v), más preferentemente entre 0.75% y 2%, más preferentemente aproximadamente 1 % . La solución utilizada en la etapa c) y/o d) contiene una sal , preferentemente una sal seleccionada del grupo que consiste de cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio, sulfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de magnesio, fosfato de amonio y se regula preferentemente a pH 6-8, preferentemente aproximadamente pH 7. Cualquier regulador capaz de mantener el pH entre pH 5 y 8 puede utilizarse. La solución utilizada para unir neumolisina a la columna en el proceso de la invención contiene una alta concentración de sal, preferentemente 0.6 - 2M, más preferentemente aproximadamente 1 . La concentración de sal se elige de manera que la neumolisina está en una forma agregada soluble y es capaz de unirse al material de cromatografía hid rofóbica . Opcionalmente , la etapa c) puede contener una etapa extra de lavar la columna en condiciones de sal intermedias de aproximadamente 0.5M sal o una concentración de sal capaz de remover cualquier impureza de unión deficiente. El proceso de la invención utiliza un gradiente de sal decreciente para el uir neumolisina de la columna. Preferentemente la solución baja en sal utilizada para hacer el gradiente de sal en al etapa d) contiene entre 0-0.1 M de sal , más preferentemente 0-40 m de sal. Alternativamente, la elución paso por paso puede utilizarse con regulador bajo en sal utilizado en la etapa d) conteniendo entre 0-0.2M de sal, más preferentemente 0-40m sal. Las etapas opcionales pueden agregarse al proceso de la invención si se prefiere para desnaturalizar la neumoiisina y subsecuentemente replegarla por el retiro del desnaturalizante. Estas etapas opcionales aseguran que la citolisina pura, preferentemente neumoiisina, con una estructura nativa es obtenida. La primer etapa opcional e) incluye el retiro de detergente por diafiltración, diálisis o dilución. Esta etapa preferentemente incluye diafiltración/diálisis contra un regulador de pH 8-10, preferentemente aproximadamente 9, más preferentemente el regulador es uno capaz de regularse a valores de pH alcalinos, más preferentemente el regulador es DEA. La solución es preferentemente de baja intensidad iónica, preferentemente 1 0-50mM, más preferentemente aproximadamente 25 mM. La diafiltración o diálisis se lleva a cabo preferentemente a 4°C pero se lleva a cabo alternativamente a temperatura ambiente. En una segunda etapa opcional, citolisina, preferentemente neumoiisina se desnaturaliza y solubiliza por adición de un desnaturalizante. Preferentemente, el desnaturalizante utilizado en la etapa f) es hidrocloruro de guanidina, más preferentemente 5-8 hidrocloruro de guanidina, más preferentemente aproximadamente 6M de hidrocloruro de guanidina. La neumoiisina se incuba con hidrocloruro de guanidina por al menos 10 minutos, preferentemente por al menos 1 hora, más preferentemente por aproximadamente una hora . La citolisina , preferentemente neumolisina se contacta entonces preferentemente con 5-9M urea, preferentemente aproximadamente 8 urea durante la etapa f) . Esto se logra por diafiltración o d iálisis de la citolisina , preferentemente neumolisina contra urea. Preferentemente, el mismo regulador y pH se mantienen durante el intercambio de desnaturalizante. Preferentemente, un agente reductor (DTT, 2-mercaptoetanol o glutationa se agrega durante el intercambio de desnaturalizante. Preferentemente, la etapa f) incluye contactar citolisina, preferentemente neumolisina, con 5-8M hidrocloruro de guanidina seguido por el intercambio de hid rocloruro, de guanidina por 5-9M urea. Para prevenir que enlaces de disulfuro inapropiados se formen mientras la citolisina , preferentemente neumolisina se desnaturaliza, es ventajoso asegurar que un agente reductor esté presente durante al menos parte de las etapas f) y g). Un agente reductor preferido es 0.1 -10mM DTT, preferentemente aproximadamente 1 mM DTT. Alternativamente, glutationa o 2-mercaptoetanol se utiliza. La concentración preferida de glutationa es 1 -50mM, más preferentemente 10-30mM . La etapa opcional g) incluye retiro del desnaturalizante para replegar citolisina, preferentemente neumolisina, preferentemente por diafiltración o diálisis contra un regulador bajo en sal de pH 6-1 1 , preferentemente aproximadamente pH 9.

Preferentemente citolisina, preferentemente concentración neumolisina se mantiene a al menos 1 00ug/ml , preferentemente entre 100ug/ml y 1000ug/ml , más preferentemente a aproximadamente 500ug/ml . Opcionalmente, la diafiltración o diálisis es contra un regulador que contiene g licol de propileno a entre 10 y 30% , preferentemente a aproximadamente 1 5% . Preferentemente, un agente reductor como se describe arriba se mantiene durante la etapa g). La diafiltración o diálisis se lleva a cabo preferentemente a 4°C pero se lleva a cabo alternativamente a temperatura ambiente. Una etapa opcional adicional h) incluye el retiro del agente reductor después de q ue citolisina, preferentemente neumolisina, se haya replegado. Esto se logra preferentemente por diafiltración o diálisis contra un reg ulador bajo en sal de pH 6-1 1 , preferentemente aproximadamente pH 9. Opcionalmente, diafiltración o diálisis es contra un regulador q ue contiene glicol de propileno a entre 1 0 y 30%, preferentemente a aproximadamente 15% . Diafiltración o diálisis se lleva a cabo preferentemente a 4°C pero se lleva a cabo alternativamente a temperatura ambiente. En métodos preferidos de la invención , la citolisina, preferentemente neumolisina se repliega de manera q ue su actividad hemolítica se restaura a arriba de 25%, 50% , 75% más preferentemente a arriba de 90% de aq uella de la proteína apropiadamente plegada. Para los propósitos de la invención , proteína 'plegada' es una proteína q ue tiene la estructura terciaria de la proteína hecha por un proceso no desnaturalizante. En el caso de neumolisina tipo silvestre, la actividad hemolítica esperada de neumolisina replegada sería 500,000-1 ,000,000 unidades hemolíticas/mg neumolisina. En el caso de neumolisina mutada en la punta con una baja actividad hemolítica, la actividad hemolítica de la neumolisina replegada sería correspondientemente inferior. Destoxificación de una toxina La citolisina purificada por el método de la invención, preferentemente neumolisina puede someterse a una etapa opcional adicional de destoxificación por tratamiento q uímico. Esta etapa adicional es particularmente ventajosa si la citolisina, preferentemente neumolisina está por administrarse a un animal o un humano. La neumolisina tipo silvestre es altamente tóxica. Varias proteínas de neumolisina mutada se han aislado, las cuales tienen toxicidad reducida, aún estas mantienen toxicidad residual que puede ser problemática cuando la neumolisina se administra internamente (WO99/03884, WO90/06951 ). Alternativamente, puede destoxificarse por conjugación a polísacáridos (WO96/05859). El proceso de la invención puede destoxificar ya sea citolisina mutada o tipo silvestre, por ejemplo neumolisina por tratamiento químico. Las modalidades preferidas utilizan un agente de degradación, más preferentemente conteniendo uno o más químicos seleccionados del grupo que consiste de formaldehído, glutaraldehído y un reactivo de degradación conteniendo un éster N-hidroxisuccinimido y/o un grupo de maleimida (por ejemplo, GMBS). Los procesos de destoxificación por si mismos son un aspecto de la invención y pueden utilizarse para destoxificar toxinas bacterianas, preferentemente neumolisina preparada por otros métodos. En una modalidad, el método de destoxificación de la invención describe la destoxificación de una toxina bacteriana que comprende tratar la toxina con un compuesto químico, preferentemente un reactivo de degradación que es reactivo, preferentemente reactivo, más preferentemente específicamente reactivo con grupos amina, más preferentemente grupos amina primaria. Para los propósitos de esta aplicación, un reactivo de degradación se define como un compuesto con al menos dos grupos reactivos, al menos uno de los cuales es capaz de reaccionar con al menos un grupo de la toxina bacteriana. Un grupo reactivo adicional es capaz de reaccionar ya sea con un grupo en la toxina bacteriana o un compuesto separado (por ejemplo, un aminoácido, péptido, polipéptido, azúcar o polisacárido). Preferentemente, el compuesto químico del reactivo de degradación es reactivo, más preferentemente reactivo, más preferentemente específicamente reactivo con amina y grupos sulfhidrilo. Preferentemente, el compuesto químico reacciona con un grupo amina primario de lisina, más preferentemente, el reactivo de degradación reacciona con un grupo amina primario de lisina y el grupo sulfhidrilo de cisteína. Este método es particularmente ventajoso donde neumolisina se desintoxica ya que la modificación de ambos residuos de lisina y cisteína cond uce a una disminución sinerg ística en el nivel de hemolisis comparada con la actividad de hemolisis residual donde el reactivo de degradación reacciona con solamente lisina o cisteína. De esta manera, una modalidad alternativa proporciona un método para destoxificar toxinas bacterianas comprendiendo modificar un residuo de cisteína (opcionalmente cerca del término C de la toxina) incluido en la actividad citotóxica de la toxina (preferentemente la actividad lítica) que comprende tratar la toxina con un reactivo de degradación (preferentemente un reactivo de deg radación heterobifuncional) q ue deg rada los grupos sulfhidrilo con otro aminoácido de la toxina, preferentemente más de 2, 5, 10, 15 , 20, 30, 40 aminoácidos lejos de la cisteína en la estructura primaria. Preferentemente , el otro aminoácido contiene un grupo amina primario y más preferentemente el aminoácido es lisina. En algunas modalidades, arriba del 50% , 60%, 70%, 80% , 90% o 95% de la toxina retiene un peso molecular dentro de 5% , 10%, 20% , 30% , 40% , 50% , 60%, 70% , 80% o 90%, más preferentemente entre 1 -50%, más preferentemente entre 5- 1 0% de su peso molecular original después de q ue el tratamiento se valoró por SDS-PAGE. Preferentemente la toxina adquiere un peso molecular ligeramente más alto después del tratamiento de destoxificacion debido a varios residuos de aminoácidos que se modifican al unirse covalentemente al compuesto químico. Sin embargo, el método de la invención preferentemente no incluye conjugación extensiva de la toxina , ya sea al unirla covaientemente a otras moléculas de toxina de manera que una toxina con una estructura cuaternaria multimérica se forma, o al unir la toxina a otras proteínas grandes, polisacáridos o lipopolisacáridos. Más preferentemente, los métodos, proteínas o productos descritos en WO96/05859 no se cubren por esta invención. Los métodos de la invención pueden utilizarse para destoxificar las toxinas bacterianas. Las toxinas preferidas incluyen la piolisina de citolisinas activadas por tiol de A. pyogenes, cereolisin de B. cereus, turingiolisin O de B. thuringiensis, laterosporolisin de B. latersporus, bifermentolisin de C. bifermentans, botukinolisin de C. botulinum, chauveolisin de C. chauvoel, histoliticolisin de C. histolyticum, oedematolisin de C. novyi tipo A, perfringolisin O de C. perfringens, septicolisin O de C. septicum, sordellilisin de C. sordellii, tetanolisin de C. tetani, ivanolisin O de L. ivanovi, listeriolisin O de L. monocytogenes, seeligerilisin O de L. seeligeri, alveolisin de P. alvei, streptolisin O de S. pyogenes, S. canis o S. equisimilis, intermedilisin de S. intermedius, suilisin de S. suis o pneumolisin de S. pneumoniae que puede ser de tipo silvestre o puede ser una toxina genéticamente modificada con niveles inferiores de toxicidad tales como PdA y PdB descritos arriba (W090/06951 , W099/03884). El método también puede utilizarse para destoxificar las toxinas Neisseral FrpA, FrpC (WO92/01460), FrpB (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J . Bacteriol. 181 ; 2895-2901 (1 999) ) NM- ADPRT (1 3th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al p135). FrpA y FrpC contienen una región que se conserva entre estas dos proteínas y un fragmento preferido de las toxinas sería un polipéptido q ue contiene este fragmento conservado, preferentemente comprendiendo aminoácidos 277-1 004 de la secuencia de FrpA/C. El método de la invención también puede utilizarse para destoxificar las toxinas Bordetella incluyendo ciclasa de adenilato (CyaA) (Glaser (1 988) Mol. Microbiol. 2; 19-30), toxina dermonecrótica (Livey (1 984) J . Med, Microbiol. 1 7; 91 -103) y toxina pertussis (PT) (Muñoz et al (1981 ) Infecí I mmun 33; 820-826). El método de la invención también es útil para destoxificar toxina de tétanos (TT) y toxina de difteria (DT) y toxina de S. aureus y S. Epidermidis incluyendo autolisina y hemolisina (WOO/99499, W002/59148). Los métodos de la invención conducen a una reducción de la cantidad de toxicidad y/o actividad hemolítica de la toxina de al menos 90% , preferentemente 95% , 96%, 98% , 99% , 99.5%, 99.9% o 99.99% . (Actividad hemolítica se mide utilizando el método del Ejemplo 3 y la toxicidad puede medirse por el método del Ejemplo 5). Neumolisis nativa tiene una actividad hemolítica de 500,000-1 ,000,000 unidades por mg de neumolisina. Algunas variantes mutadas en la punta de neumolisina tienen toxicidad reducida y actividad hemolítica. Lá destoxificación de una neumolisina variante puede no ser capaz de lograr a gran escala una reducción de porcentaje en actividad hemolítica debido al punto inicial más bajo del cual la actividad hemolítica se reduce, sin embargo, se contempla que la mayoría de la actividad hemolítica restante se remueve por los métodos de la invención. La etapa de destoxificación del método de la invención preferentemente proporciona una reacción de degradación que es substancialmente no reversible. La reversión se valora al monitorear el nivel de la actividad hemolítica de la toxina desintoxicada directamente después de la destoxificación y después incubar a una temperatura arriba de 25°C, preferentemente arriba de 30°C, más preferentemente arriba de 35°C, más preferentemente arriba de 37°C por al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días. Una reacción substancialmente no reversible resulta en destoxificación substancialmente no reversible y se define como una reacción en donde el nivel de actividad hemolítica aumenta por menos del 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% después de la incubación a una temperatura elevada como se describe arriba. Muchos métodos de destoxificación, por ejemplo, al utilizar el tratamiento de formaldehído, resultan en destoxificación que no es estable pero incrementa en toxicidad con el tiempo. En una etapa de destoxificación preferida del método de la invención arriba del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 98% de la toxina retiene una estructura cuaternaria monomérica después de la reacción de degradación. Muchos reactivos de degradación forman degradaciones intermoleculares (por ejemplo, formaldehído y glutaraldehído). Esto puede efectuar las propiedades inmunológicas de la toxina ya que algunos epítopes se ocultarán dentro del agregado. Métodos de la invención preferentemente incluyen modificar simplemente los residuos de aminoácidos, preferentemente grupos amina primaria y/o sulfhidriio de aminoácidos y/o la formación de degradaciones principalmente intramoleculares. La estructura cuaternaria monomérica resultante permite que los epítopes permanezcan expuestos en la superficie de la toxina. En una modalidad preferida de la etapa de destoxificación, el reactivo de degradación es heterobifuncional. Los reactivos de degradación preferidos contienen un grupo N-hidroxisuccinimida éster que reacciona preferentemente, más preferentemente de manera específica, con grupos amina primaria. A un pH de aproximadamente 7, un grupo maleimida reacciona 1000 veces más rápido con grupos sulfhidriio que lo que lo hace con aminas. Preferentemente, el reactivo de degradación contiene tanto un grupo N-hidroxisuccinimida éster y un grupo maleimida. El agente de degradación es preferentemente no separable utilizando un agente reductor, ya que conduce a destoxificación menos efectiva. La distancia entre los grupos reactivos del reactivo de degradación es capaz de efectuar la eficiencia de destoxificación. Preferentemente, la distancia entre los grupos del reactivo de degradación que son reactivos con amina y grupos sulfhidriio es entre 1 .5 y 20 Angstroms, más preferentemente entre 5 y 15 Angstroms y más preferentemente aproximadamente 10 Angstroms en el método de la invención. Preferentemente, los residuos de aminoácidos en la toxina bacteriana se modifican por la adición de un grupo que es de 5, 7, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 500 Angstroms de largo. Preferentemente, el grupo de modificación está entre 5 y 100 Angstroms, más preferentemente entre 10 y 20 Angstroms en tamaño. La etapa de destoxificación del método de la invención permite que los residuos suficientes se modifiquen de manera que la interferencia estérica y/o cambios conformacionales inhiben la función de la toxina bacteriana. Preferentemente al menos 5, 7, 10, 12, 14, 15, 20 o 25 residuos de aminoácidos de la toxina bacteriana se modifican. Donde los grupos maleimida sin reaccionar están presentes en el reactivo de degradación, una reacción Ellman puede utilizarse para estimar (indirectamente) el número de moléculas de degradación unidas a cada molécula de toxina Ellman 1959 Aren. Biochem. Biophys. 82; 70). Los reactivos de degradación preferidos son SMPT, Sulfo-LC-SMPT, Sulfo-KMUS, LC-SMCC, K UA, Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, Sulfo-SMPB, SMPH, Sulfo-SMCC, SMCC, SIAB, Sulfo-SIAB, G BS éster (N-(y-maleimidobutiriloxi)succinimida, Sulfo-G BS, MBS, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, EMCA, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP y SIA (Pierce). En un método preferido de la invención la toxina se trata con el compuesto químico o reactivo de degradación bajo condiciones de pH de entre 5.0 y 9.0, preferentemente 6.5 a 8.0, más preferentemente 7.0 a 7.8. En tratamientos en donde la reacción de un grupo maleimida a un grupo sulfhidrilo se alienta, el pH preferido de la reacción es 6.0 y 8.0, más preferentemente 6.5 y 7.5. La concentración preferida de sales durante la reacción es entre 100mM y 1 M, más preferentemente 150mM y 500mM, más preferentemente entre 200m y 300mM. Sin embargo, los inventores han encontrado que algunas veces es preferible realizar la reacción a baja concentración de sal donde ninguna solución de cloruro u otra sal se agrega. Donde la reacción se realiza a un pH de entre 7.6 y 7.8, la reacción puede llevarse a cabo opcionalmente sin la adición de sal. De manera similar, el uso de proporciones más altas de GMBS a toxina puede realizarse sin la adición de sal a valores de pH entre 7.0 y 8.0. Preferentemente un exceso molar de 50-500, más preferentemente 130-350 o 350-900, más preferentemente aproximadamente 250 veces del compuesto químico o reactivo de degradación para cada toxina se utiliza. Neumolisina neumocócica contiene 31 residuos de lisina. Por lo tanto un exceso molar de 248 veces de compuesto químico o reactivo de degradación sobre neumolisina es equivalente a un exceso molar de 8 veces de compuesto químico o reactivo de degradación para cada residuo de lisina. Preferentemente, una proporción molar de 2-20, más preferentemente 4-15 o 15-30, más preferentemente aproximadamente 8 veces de compuesto químico o reactivo de degradación a residuos de lisina, se utiliza en métodos de la invención. El tratamiento con reactivo de degradación procede por al menos 15 minutos, preferentemente por al menos 30 minutos, más preferentemente por aproximadamente una hora a entre 4°C y 40°C, preferentemente entre 15°C y 25°C, más preferentemente a temperatura ambiente. El método de la invención puede comprender además una etapa de mitigación utilizando un compuesto que contiene un grupo sulfhidrilo, preferentemente el compuesto de mitigación tiene un peso molecular de arriba de 50, 100 o 120, más preferentemente el reactivo de mitigación es un aminoácido tal como cisteína. Alternativamente, los grupos pueden reaccionarse con una porción de polisacárido o péptido capaz de reacción con maleimida, por ejemplo, un péptido que contiene un residuo de cisteína. Esto es particularmente apropiado donde el grupo maleimida sin reaccionar está presente antes de la etapa de mitigación. La etapa de destoxificación es adecuada para utilizarse en toxinas bacterianas como se describe arriba. Preferentemente la toxina bacteriana es de Streptococcus pneumoniae, más preferentemente la toxina es neumolisina. La neumolisina es una proteína recombinante o nativa o una proteína que se ha formado genéticamente para reducir su toxicidad (como se describe arriba). Proteínas de fusión de toxinas, preferentemente neumolisina o fragmentos de toxinas, preferentemente neumolisina pueden destoxificarse utilizando el método de la invención. De esta manera en una modalidad preferida, una toxina (tal como neumolisina) se destoxifica con un reactivo de degradación que es preferentemente heterobifuncional teniendo grupos que son reactivos con residuos de cisteína y lisina y es de un cierto tamaño, más preferentemente teniendo los grupos reactivos espaciados 10-20 Angstroms, de manera que cualquiera o preferentemente ambos o lo siguiente ocurre: a) entre 5 y 30, preferentemente aproximadamente 12- 14 residuos de aminoácidos de la toxina se modifican por una molécula de degradación que se une de manera covalente preferentemente a un residuo de arginina o lisina (preferentemente, como se mide indirectamente por una reacción Ellman), el otro extremo habiéndose mitigado (preferentemente con cisteína) y/o; b) una cadena lateral de cisteína incluida en la actividad citotóxica de la toxina (preferentemente hacia el término C de la toxina) se degrada a otra cadena lateral de la toxina (preferentemente a un residuo de arginina o lisina) que se separa preferentemente por más de 2, 5, 1 0, 20, 30 o 40 aminoácidos del residuo de cisteína en la secuencia primaria de la toxina. En una modalidad preferida adicional, una toxina (preferentemente neumolisina) se destoxifica con un compuesto químico monofuncional que reacciona preferentemente con aminoácidos que contienen un grupo amina primario, más preferentemente lisina, y es de un cierto tamaño, más preferentemente 10-100 Angstroms de manera que la toxina se cubre con entre 5 y 30, más preferentemente aproximadamente 14 compuestos químicos unidos a residuos de aminoácidos. Conjugados de polisacáridos Un problema asociado con ei planteamiento de polisacárido para vacunación , es el hecho de que los polisacáridos per se son inmunógenos deficientes. Para superar esto, los polisacáridos pueden conjugarse con vehículos de proteína, que proporcionan ayuda a la célula T "bystander". El proceso de la invención puede contener ventajosamente una etapa adicional de conjugar la citolisina , preferentemente neumolisina con un polisacárido bacteriano, por ejemplo, un lipo-oligosacárido o preferentemente un polisacárido capsular. Un conjugado preferido de la invención comprende citolisina, preferentemente neumolisina obtenida por el método de la invención conjugada a polisacáridos capsulares derivados de Streptococcus pneumoniae. Los antígenos de polisacárido capsular neumocócico se seleccionan preferentemente de los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 1 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F , 23F y 33F (más preferentemente de serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14.1 8C, 1 9F y 23 F), o mezclas de dos o más de dichos conjugados (4, 7, 9, 1 1 , 1 3 o 23). Citolisina, preferentemente neumolisina, purificada por el proceso de la invención también se conjuga preferentemente con polisacáridos capsulares de otras cepas de bacterias. Tales polisacáridos pueden aislarse de: por ejemplo, H . ¡nfluenzae, H. influenzae tipo B (Hib), N. meningitid is grupos A, C, W, Y, Streptococci diferentes a S. pneumoniae (por ejemplo, Grupo B Streptococcus, S. pyogenes, etc.), Estafilococos (por ejemplo, S. aureus, S. epidermidis), E. coli, Enterococos (por ejemplo, E. faecalis y E. faecíum) , etc. Preferentemente, los polisacáridos son de H . influenzae tipo B (Hlb), y/o N. mem'ngiíidis grupos A, C, W 135, y/o Y. El polisacárido puede enlazarse a citolisina, preferentemente neumolisina, por cualquier método conocido (por ejemplo, por Likhite, Patente de EE. UU . 4,372,945 y por Armor et al., Patente de EE. UU . 4,474,757). Preferentemente, conjugación CDAP se lleva a cabo (WO 95/08348). Para aumentar inmunogenicidad, los polisacáridos pueden ser adyuvantarse y/o liofílizarse. Los polisacáridos de la invención pueden ser de tamaño completo o dimensionarse después de la purificación a oligosacáridos o polisacáridos más pequeños. El proceso de la invención preferentemente comprende una etapa adicional de formular citolisina, preferentemente neumolisina en una vacuna. Proteínas y composiciones inmunoqénicas Una modalidad adicional de la invención es citolisina, preferentemente neumolisina, purificada por el método de la invención . Esto incluye un conjugado de polisacárido capsular bacteriano de neumolisina hecho por el proceso de la invención. U na modalidad adicional de la invención es una composición inmunogénica que comprende citolisina, preferentemente neumolisina o polisacárido capsular bacteriano de pneumolisina obtenido por el proceso de la invención (como se describe arriba). La composición inmunogénica de la invención preferentemente comprende además uno o más miembros de la familia de proteína de unión de colina neumocócica, preferentemente proteína A de unión de colina o un fragmento inmunogénico de la misma y/o uno de los miembros de la familia trivalente de polihistidina (incluyendo proteínas de fusión de los mismos), preferentemente PhtA, PhtB, PhtD o PhtE o un fragmento inmunogénico de los mismos. Con respecto a la familia de Proteína de Unión de Colina (CbpX), los miembros de esta familia se identificaron originalmente como proteínas neumocócicas que podrían purificarse por cromatografiía de afinidad de colina. Todas las proteínas de unión de colina se unen no covalentemente a porciones de fosforilcolina de ácido teicócio de pared celular y ácido lipoteicóico asociado a membrana. De manera estructura, tienen varias regiones en común sobre la familia completa, aunque la naturaleza exacta de las proteínas (secuencia de aminoácidos, longitud, etc) puede variar. En general, las proteínas de unión de colina comprenden una región de terminal N (N), regiones de repetición conservadas (R1 y/o R2), una región rica en prolina (P) y una región de unión de colina conservada (C), elaboradas de múltiples repeticiones, que comprenden aproximadamente una mitad de la proteína. Como se utiliza en esta solicitud, el término "familia de proteína de unión de colina (CbpX)" se selecciona del grupo que consiste de Proteínas de Unión de Colina como se identifica en W097/41 151 , PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, y CbpG. CbpA se describe en W097/41 151 . CbpD y CbpG se describen en WOOO/29434. PspC se describe en W097/09994. PbcA se describe en W098/21337. SpsA es una proteína de unión de colina descrita en WO 98/39450. Preferentemente las proteínas de unión de colina se seleccionan del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Otra modalidad preferida es truncados de CbpX, en donde "CbpX" se define arriba y "truncados" se refiere a proteínas CbpX que carecen de 50% o más de la región de unión de colina(C). Preferentemente, tales proteínas carecen de la región de unión de colina completa. Más preferentemente, tales truncados de proteína carecen (i) de la región de unión de colina y (ii) de una porción de la mitad de terminal N de la proteína también, aún manteniendo al menos una región de repetición (R1 o R2). Más preferentemente, el truncado tiene 2 regiones de repetición (R1 y R2), más preferentemente el truncado retiene la región rica en prolina (P). Ejemplos de tales modalidades preferidas son NR1 xR2 y R1 xR2 como se ilustra en W099/51266 o W099/51 188 y NR1 XR2P, sin embargo, otras proteínas de unión de colina que carecen de una región de unión de colina también se contemplan dentro del alcance de esta invención. La familia LytX es de proteínas asociadas a membranas asociadas con lisis celular. El dominio de terminal N comprende dominio(s) de unión de colina, sin embargo, la familia LytX no tiene todas las características encontradas en la familia CbpA observada arriba y de esta manera la familia LytX se considera distinta de la familia CbpX. En contraste con la familia CbpX, el dominio de terminal C contiene el dominio catalítico de la familia de proteínas LytX. La familia comprende LytA, B y C. Con respecto a la familia LytX, LytA se describe en Ronda et al. , Eur J Biochem, 164: 621 -624 (1 987). LytB se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp46. LytC también se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp91 . Un miembro preferido de la familia es LytC. Otra modalidad preferida son los truncados de LytX en donde "LytX" se define arriba y "truncados" se refieren a proteínas de LytX que carecen de 50% o más de la región de unión de colina. Preferentemente tales proteínas carecen de la región de unión de colina completa. Un ejemplo de tales truncados pueden encontrarse en la sección de Ejemplos de esta invención. Todavía otra modalidad preferida de esta invención son proteínas quiméricas de truncado LytX-truncado CpbX (o fusiones). Preferentemente este comprende NR1 xR2 (o R1 xR2, o NR1 XR2P) de CbpX y la porción de terminal C (Cterm, es decir., que carece de los dominios de unión de colina) de LytX (por ejemplo, LytCCterm o Sp91 Cterm). Más preferentemente, CbpX se selecciona del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Más preferentemente aún, es CbpA. Preferentemente, LytX es LytC (también referido como Sp91 ). Otra modalidad de la presente invención es PspA o PsaA, o truncados que carecen del dominio de unión de colina (C) opcionalmente expresado como una proteína de fusión con LytX. Preferentemente, LytX es LytC. La familia de Pht (trivalente de polihistídina) comprende las proteínas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. La familia se caracteriza por una secuencia de lipidación, dos dominios separados por una región rica en prolina y varios trivalentes de histidina, posiblemente incluidos en actividad enzimática o de unión de nucleósido o metal, regiones (3-5) embobinados, un término N conservado y un término C heterogéneo. Está presente en todas las cepas de neumococos probados. Los miembros preferidos de la familia comprenden PhtA, PhtB y PhtD. Más preferentemente, comprende PhtA o PhtD. Se entiende, sin embargo, que los términos Pht A, B, D, y E se refieren a proteínas teniendo secuencias descritas en las citaciones abajo así como también variantes que ocurren de manera natural (y hechas por el hombre) de las mismas que tienen homología de secuencia que es menor al 90% idénticas a las proteínas referenciadas. Preferentemente, al menos 95% idénticas y más preferentemente 97% idénticas.. La composición inmunogénica de la invención puede incorporar proteínas de fusión de proteínas trivalentes de histidina. Las proteínas de fusión preferidas contienen i) PhtD o fragmento de la misma enlazado a PhtE o un fragmento de la misma o ii) PhtB o un fragmento de la misma enlazada a PhtE o un fragmento de la misma. Con respecto a las proteínas PhtX, PhtA se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp36. Como se observa arriba, es una proteína de la familia trivalente de polihistidina y tiene el motivo de señal tipo II de LXXC. PhtD se describe en WO 00/37105, y también se refiere como Sp036D. Como se observa arriba, también es una proteína de la familia trivalente de polihistidina y tiene el motivo de señal LXXC tipo I I . PhtB se describe en WO 00/371 05 , y también se refiere como Sp036B. Otro miembro de la familia PhtB es el polipéptido de degradación C3, como se describe en WO 00/17370. Esta proteína también es de la familia trivalente de polihistidina y tiene el motivo de señal LXXC tipo I I . Un equivalente inmunológicamente funcional preferido es la proteína Sp42 descrita en WO 98/1 8930. Un truncado de PhtB (aproximadamente de 79kD) se describe en W099/15675 que también se considera un .miembro de la familia PhtX. PhtE se describe en WO00/30299 y se refiere como BVH- 3. Para generar una composición inmunogénica de la invención, capaz de producir una respuesta inmune contra más de un patógeno inclu ido en otitis media, es ventajoso para composiciones inmunogénicas de la invención comprender además un antígeno de uno o más (2,3, 4, 5, 6, ) de S, pneumoniae, Haemophilus influenzae sin tipo, Moraxella catarrhalis, RSV, virus de parainfluenza y/o virus de influenza. La presente invención también contempla vacunas de combinación que proporciona protección contra un rango de diferentes patógenos. Muchas vacunas pediátricas se dan ahora como una vacuna de combinación para reducir el número de inyecciones que un niño tiene que recibir. De esta manera , para vacunas pediátricas otros antígenos de otros patógenos pueden formularse con las vacunas de la invención . Por ejemplo, las vacunas de la invención pueden formularse con (o administrarse por separado pero af mismo tiempo) la vacuna de combinación 'trivalente' q ue comprende toxoide de difteria (DT), toxoide de tétanos (TT), y componentes de pertussis [típicamente toxoide de Pertussis detoxificado (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) con pertactina opcional (PRN) y/o aglutitina 1 +2], por ejemplo la vacuna comercializada I N FAN RIX-DTPaT™ (SmithKIineBeecham Biologicals) que contiene antígenos DT, TT, PT, FHA y PRN , o con un componente de pertussis de célula completa por ejemplo como se vende por SmithKIineBeecham Biologicals s.a., como Tritanrix™. La vacuna combinada también puede comprender otro antígeno, tal como antígeno de superficie de Hepatitis B, antígenos del virus de polio (por ejemplo, virus de polio trivalente inactivo -I PV), proteínas de membrana de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus ¡nfluenzae sin tipo, proteínas de membrana exterior de N. meningitides B. Ejemplos de antígenos de proteína Moraxella catarrhalis que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) son: OMP 06 fWO 97/41 731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)] ; OMP21 ; LbpA &/o LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA &/o TbpB [WO 97/1 3785 & WO 97/32980 (PMC)] ; CopB [Helminen ME, et al . (1 993) Infect. Immun. 61 : 2003-201 0]; UspA1 y/o UspA2 [WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); Iipo1 0 (GB 9918208.1 ); Upo1 1 (GB 991 8302.2); lipo1 8 (GB 991 8038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmpiAI (PCT/EP99/06781 ); Hly3 (PCT/EP99/03257); y OmpE. Ejemplos de antígenos de Haemophilus influenzae sin tipo que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) incluyen: proteína de Fimbrin [(US 5766608-Ohio State Research Foundation)] y fusiones que comprenden péptidos de los mismos [por ejemplo, fusiones de péptidos LB1(f); US 5843464 (OSU) o WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortees)] ; P6 [EP 281673 (Universidad Estatal de New York)]; TbpA y/o TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1 ; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); proteína D (EP 594610); P2; y P5 (WO 94/26304). Otras combinaciones contempladas son la citolisina, preferentemente neumolisina de la invención en combinación con antígenos virales, por ejemplo, de influenza (atenuada, cortada, o subunidad [por ejemplo, neuraminidasa de glucoproteínas de superficie (NA) y hemaglutinina (HA). Ver, por ejemplo, C aloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Des. 1996, 15:121-127], RSV (por ejemplo, antígenos F y G o fusiones de F/G, ver por ejemplo, Schmidt A. C. et al, J Vlrol, May 2001, p4594-4603), virus de parainfluenxa virus 3 (PIV3) (por ejemplo, proteínas HN y F, ver Schmidt et al. supra), Varicela (por ejemplo, atenuada, glicoproteínas l-V, etc.), y cualquiera (o todos) del(los) componente(s) de MA (sarampión, paperas, rubéola). Vacunas Una modalidad adicional de la invención es una vacuna que comprende citolisina, preferentemente neumolisina de un conjugado de polisacárido capsular bacteriano-neumolisina, obtenido por el proceso de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante. Una vacuna de la invención puede comprender las composiciones inmunogénicas de la invención descritas arriba y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las vacunas de la invención son capaces de generar una respuesta inmune protectora contra infección por S. Pneumoniae y/u otitis media. Una modalidad adicional de- la invención incluye un método para hacer una vacuna al tomar una citolisina, preferentemente neumolisina, hecha por el proceso de la invención y formularla como una vacuna con un excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente con uno o más de los antígenos adicionales descritos arriba. Una modalidad adicional de la invención incluye método de tratamiento o prevención de infección bacteriana, preferentemente infección por Streptococcus pneumoniae u otitis media que comprende la administración de la vacuna o composición inmunogénica de la invención. Una modalidad adicional de la invención es el uso de la citolisina, preferentemente neumolisina y/o conjugado polisacárido capsular bacteriano-neumolisina, cualquiera de los cuales se obtiene por un proceso de la invención, en la preparación de una vacuna para el tratamiento o prevención de infección bacteriana, preferentemente infección por Streptococcus pneumoniae u otitis media. Las vacunas de la presente invención se adyuvantan preferentemente. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio, pero también pueden ser una sal de calcio, magnesio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares aciladas, polisacáridos derivados catiónica o aniónicamente, o polifosfacenos. Se prefiere que el adyuvante se seleccione para ser un inductor preferencial de un tipo TH 1 de respuesta. Tales altos niveles de citoquinas tipo Th 1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno dado, mientras que altos niveles de citoquinas tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno. Es importante recordar que la distinción de respuestas inmunes tipo Th2 y Th1 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como siendo predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de aquellas descritas en clones de célula T CD4 +ve de murino por Mosmann y Coffman ( osmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH 1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th 1 se asocian con la producción de las citoquinas IL-2 e INF-y por linfocitos T. Otras citoquinas se asocian directamente con la inducción de las respuestas inmunes tipo Th 1 que no se producen por células T, tal como IL-12. En contraste, las respuestas tipo Th2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, I L-10. Los sistemas adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente Th1 incluyen: lípido A de monofosforilo o un derivado del mismo, particularmente lípido A de monofosforilo 3-de-O-acilado (3D-MPL) (para su preparación ver GB 222021 1 A); y una combinación de lípido A de monofosforilo, preferentemente lípido A de monofosforilo 3-de-O-acilado, junto con ya sea una sal de aluminio (por ejemplo, fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión de aceite en agua. En tales combinaciones, el antígeno y 3D-MPL se contienen en las mismas estructuras particuladas, permitiendo suministro más eficiente de señales inmunoestimuladoras y antigénicas. Los estudios han mostrado que 3D-MPL es capaz de aumentar más la inmunogenicidad de un antígeno absorbido de alum [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14 ; EP 689454-B1]. Un sistema mejorado incluye la combinación de un lípido A de monofosforilo y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en WO 94/00153, o una composición reactogénica menor en donde QS21 se mitiga con colesterol como se describe en WO 96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente QS21 , 3D- PL y tocoferoí en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210, y es una formulación preferida. Preferentemente, la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferentemente QS21 . La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferoi (WO 95/17210). La presente invención también proporciona un método para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una citosina de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL. Oligonucleótidos que contienen CpG sin metilar (WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta de TH1 y son adecuados para utilizarse en la presente invención. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una vacuna como se describe en la presente para utilizarse en medicina. En una modalidad existe un método para prevenir o mejorar neumonía en un humano de edad avanzada (más de 55 años de edad) que comprende administrar una cantidad efectiva y segura de una acuna de la invención, y opcionalmente un adyuvante Th1 , a dicho paciente de edad avanzada. En una modalidad adicional se proporciona un método para prevenir o mejorar otitis media en infantes (hasta 24 meses) o más grandes (típicamente 24 meses a 5 años), que comprende administrar una cantidad efectiva y segura de una vacuna que comprende una citolisina, preferentemente neumolisina de la invención, opcionalmente con uno o más de los antígenos adicionales descritos arriba y opcionalmente un adyuvante Th1 , a dicho infante o niño más grande. Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden utilizarse para proteger o tratar a un mamífero (preferentemente un paciente humano) susceptible de infección, por medio de administrar dicha vacuna a través de vía mucosal o sistémica. Estas administraciones pueden incluir inyección a través de vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o a través de administración mucosal a los tractos oral/alimenticio, respiratorio, genitourinario. La administración intranasal de las vacunas para el tratamiento de neumonía u otitis media se prefiere (debido a que la conducción nasofaringeal de neumococo puede evitarse de manera más efectiva, se atenúa así la infección en su etapa más temprana). Aunque la vacuna de la invención puede administrarse como una dosis única, los componentes de la misma también pueden co-administrarse juntos al mismo tiempo o en tiempo diferente (por ejemplo, si los polisacáridos están presentes en una vacuna estos podrían administrarse por separado al mismo tiempo o 1 -2 veces después de la administración de la combinación de proteína bacteriana para coordinación óptima de las repuestas inmunes entre sí). Además de una vía de administración única, 2 diferentes vías de administración pueden utilizarse. Por ejemplo, antígenos virales pueden administrarse ID (intradérmicamente), mientras que proteínas bacterianas pueden administrarse IM (intramuscularmente) o IN (intranasalmente). Si los polisacáridos están presentes, pueden administrarse IM (o ID) y las proteínas bacterianas pueden administrarse 1N (o ID). Además, las vacunas de la invención pueden administrarse I para dosis de cebador e IN para dosis de impulsión. La cantidad de antígeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significativos en vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de que inmunógeno específico se emplea y como está presente. El contenido de antígenos de proteína en la vacuna típicamente estará en el rango 1 -10C^g, preferentemente 5-5C^g, más típicamente en el rango 5-25µ9- Si los polisacáridos se incluyen, generalmente se espera que cada dosis comprenderá 0.1 -10C^g de polisacárido, preferentemente 0.1 -5(^g, más preferentemente ?.? -? ?µ?, de los cuales 1 a 5 es el rango más preferible. Las cantidades óptimas de componentes para una vacuna particular pueden acertarse por estudios estándar incluyendo observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de impulsión separadas de manera adecuada. Típicamente, una vacuna comprenderá antígeno (proteínas), un adyuvante, y excipientes o un vehículo farmacéuticamente aceptable. La preparación de vacuna se describe generalmente en Diseño de Vacuna ("The subunit and adjuvant approach" (eds Po ell M. F. & Newman M. J. ) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación dentro de las liposomas se describe por Fullerton, Patente de EE.UU 4, 235, 877 Aunque las vacunas de la presente invención pueden administrarse por una vía, la administración de las vacunas descritas en la piel (ID) forma una modalidad de la presente invención. La piel humana comprende una cutícula "cornuda" exterior, llamada el estrato córneo, que cubre la epidermis. Por debajo de esta epidermis se encuentra una capa llamada la dermis, que a su vez cubre el tejido subcutáneo. Los investigadores han mostrado que la inyección de una vacuna en la piel, y en particular la dermis, estimula una respuesta inmune, que también puede asociarse con un número de ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas en la presente forma una característica preferida de la presente invención. La técnica convencional de inyección intradérmica, el "procedimiento mantoso" comprende etapas de limpiar la piel, y después estirarla con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (calibre 26-31 ) que da hacia arriba de la aguja se inserta a un ángulo de entre 10-15°. Una vez que el bisel de la aguja se inserta, el barril de la aguja se baja y avanza además mientras proporciona una ligera presión para elevarla bajo la piel. El líquido se inyecta entonces muy lentamente formando así una ampolla o protuberancia en la superficie de la piel, seguida por extracción lenta de la aguja. Más recientemente, los dispositivos que se diseñan específicamente para administrar agentes líquidos en o a través de la piel se han descrito, por ejemplo, los dispositivos descritos en WO 99/34850 y EP 1092444, también los dispositivos de inyección de chorro descritos por ejemplo en WO 01 /13977; US 5,480,381 , US 5,599,302, US 5,334, 144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569, 189, US 5,704,91 1 , US 5,383,851 , US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339, 163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520,639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941 ,880, US 4,940,460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Los métodos alternativos de la administración intradérmica de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringas convencionales y agujas, o dispositivos diseñados para suministro balístico de vacunas sólidas (WO 99/27961 ), o parches transdérmicos (WO 97/48440 ; WO 98/28037); o aplicarse a la superficie de la piel (suministro transdérmico o transcutáneo WO 98/20734; WO 98/28037). Cuando las vacunas de la presente invención son para administrarse a la piel, o más específicamente en la dermis, la vacuna está en un volumen bajo en líquido, particularmente un volumen de entre aproximadamente 0.05 mi y 0.2 mi. El contenido de antígenos en la piel o vacunas intradérmicas de la presente invención puede ser similar a dosis convencionales como se encuentra en vacunas intramusculares. De acuerdo con lo anterior, los antígenos de proteína presentes en las vacunas intradérmicas pueden estar en el rango de - 00µg, preferentemente 5-50µg. Del mismo modo, si está presente, la cantidad de antígeno conjugado de polisacárido en cada dosis de vacuna se espera generalmente que comprenda 0.1 -1 00µ? de polisacárido, preferentemente 0.1 -50 g, preferentemente 0.1 -1 Q^g, y puede estar entre 1 y 5 g. Sin embargo, es una característica de la piel o vacunas intradérmicas que las formulaciones puedan ser "de dosis baja". De acuerdo con lo anterior, los antígenos de proteína en vacunas "de dosis baja" están preferentemente presentes en tan poco como 0.1 a 10µg, preferentemente 0.1 a 5 g por dosis;: y si está presente los antígenos de conjugados de polisacárido pueden estar presentes en el rango de 0.01 -1 µg, y preferentemente entre 0.01 a 0^g de polisacárido por dosis. Como se utiliza en la presente, el término "suministro intradérmico" significa suministro de la vacuna a la región de la dermis en la piel. Sin embargo, la vacuna no se ubicará necesariamente de manera exclusiva en la dermis. La dermis es la capa en la piel ubicada entre aproximadamente 1 .0 y aproximadamente 2.0 mm de la superficie en piel humana, pero existe una cierta cantidad de variación entre individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, puede esperarse alcanzar la dermis al ir 1.5mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis se ubica entre estrato córneo y la epidermis en la superficie y la capa subcutánea abajo. Dependiendo del modo de suministro, la vacuna puede ubicarse por último solamente o principalmente dentro de la dermis, o puede distribuirse por último dentro de la epidermis y la dermis. Las composiciones inmunogénicas y vacunas de la ¡nvención pueden evaluarse en varios modelos animales o con suero humano. Como una ilustración, los siguientes modelos animales pueden utilizarse para evaluar infección neumocócica. Los ratones C3H/HeJ (6 a 8 semanas de edad) pueden inmunizarse s.c. con 15 9 de proteína adyuvantada con 50 9 CFA, seguida por 3-4 semanas después por impulsión con 15µ9 de proteína con IFA. Para demostrar protección activa y pasiva de infección sistémica, los ratones pueden administrarse intraperitonealmente con suero inmune o proteínas antes de la inyección ¡ntraperitoneal con 15 a 90 LD50 neumococo en la semana 8-10. Adicionalmente, las proteínas pueden probarse en un modelo de colonización de nasofarlnge de ratón por (Wu eí al Microbial Patogénesis 1997; 23: 127-137). Además de los ratones, las ratas infantes son susceptibles de colonización e infección por S. Pneumoniae. En estudios protectores pasivos, la administración de sueros inmunes de ratón (1 00 ul i. p o 10 ul i.n.) en crías de rata infantes de 2-5 de edad. La colonización puede determinarse al colocar en láminas lavados nasales (20-40 ul vertidos, 10 ul extraídos). Las interacciones favorables entre los componentes de la proteína (o proteína y polisacárido) de la vacuna de combinación pueden demostrarse al administrar una dosis de cada proteína (o proteína y polisacárido) en la vacuna que sería sub-protectora en una vacuna monovalente. La eficacia protectora incrementada de la vacuna de combinación comparada con vacunas monovalentes puede atribuirse a una interacción favorable entre los componentes.

La invención se ilustra en los ejemplos acompañantes. Los ejemplos se llevan a cabo utilizando técnicas estándar, que se conocen bien y son rutinarios para aquellos expertos en la materia, excepto donde se describe de otra manera en detalle. Los ejemplos se proponen para ilustrar, pero no limitar la invención . Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de neumolisina Después de inducción de 1 8 horas del cultivo E. coli al incrementar la temperatura a 39.5°C, E. coli se formó en bolitas por centrifugación a 1 7,000g por 1 hora. La bolita se resuspende en 25mM dietanolamina pH9.0 e E. coli se rompe mecánicamente utilizando un paso a 500 PSI en un aparato Rannie, 1 % de sarcosinato de lauroil sodio (SLS) se agrega a E. coli roto y la mezcla se incuba por 1 hora a temperatura ambiente antes de la centrifugación a 30 ,000 g por 20 minutos de manera que los residuos celulares se forman en bolitas. El sobrenadante se diluye 2.5 veces para terminar en 20mM de fosfato pH 7.0 conteniendo 1 M NaCI y 1 %SLS y después se carga en una columna de fenil-sefarosa H P eq uilibrada en el mismo regulador (20mM fosfato pH 7.0 conteniendo 1 M NaCI y 1 % SLS=regulador de eq uilibrio). La columna se lava con 4 volúmenes de columna de regulador de equilibración seguido por 2 volúmenes de columna de 20mM reg ulador de fosfato pH7.0 conteniendo 0.5M NaCI y 1 % SLS. Neumolisina se eluye de la columna al aplicar un regulador bajo en sal conteniendo 20mM regulador de fosfato pH 7.0 conteniendo 1 % SLS. Las fracciones conteniendo neumolisina se identifican utilizando análisis SDS-PAGE, se agrupan y el regulador se intercambia con 25mM dietanolamina pH 9.0 utilizando diafiltración. La neomolisina se solubiliza por desnaturalización al agregar hidrocloruro de guanidina sólido hasta una concentración final de 6M e incubar por una hora. Después se diafiltra contra 8M urea en 25m dietanolamina pH9.0 conteniendo 1 mM DTT. Neumolisina se repliega por diafiltración contra 20mM regulador de borato pH9.0 conteniendo 1 mM DTT. Después de renaturalización, DTT se remueve por diafiltración contra 20mM regulador de borato pH 9.0. La pureza de neumolisina lograda se analizó al pasar en un SDS-PAGE y colorear con azul brillante Coomassie. Un gel separado se analiza por Western blotting utilizando un anticuerpo contra E . coli para detectar el nivel de proteínas de E. coli restante en la preparación de neumolisina purificada. La actividad biológica de la neumolisina purificada se valora utilizando un análisis de hemolisis in vi tro. Resultados Como se muestra en la fig ura 1 , el método descrito arriba fue capaz de producir una purificación altamente eficiente de neumolisina después de una etapa de cromatografía ún ica . El gel coloreado con azul Coomassie en el panel A muestra la elución de la columna con regulador bajo en sal no conteniendo cloruro de sodio agregado fue capaz de eluir una banda 53kDa correspondiente a neumolisina de la columna en una forma altamente purificada. La banda mucho más débil de aproximadamente 45kDa también se piensa que es neumolisina ya que esta segunda banda se une a anticuerpos anti-neumolisina (resultados no mostrados) y también falla en unirse a los anticuerpos anti E. coli como se muestra en el panel B. Wester blot del panel B es un método altamente sensible de detectar cualquier proteína contaminante que permanece en la neumolisina purificada. Este método fue capaz de detectar muy pocos contaminantes y aquellos presentes estuvieron a un nivel bajo que estuvo por debajo del nivel de detección de coloración con Coomassie. La neumolisina por lo tanto se purifica a un nivel de 98-100% de pureza. La producción del método de purificación también es buena con una corrida típica dando aproximadamente 1 900 mg de neumolisina por litro de fermentación . Aproximadamente 1 0% de la proteína del cultivo de fermentación se recupera como neumolisina purificada. La actividad de la neumolisina en un análisis de hemolisis se valora después de que la neumolisina se ha tratado con hidrocloruro de g uanidina/urea y se ha replegado por el retiro del desnaturalizante. La actividad hemolítica se detecta en diluciones de la neumolisina purificada por debajo de concentraciones de 1 .3 mg/ml mostrando que esa actividad hemolítica se ha reestablecido . Esto corresponde a entre 500,000 y 1 ,000,000 unidades hemolíticas por mg de neumolisina tipo silvestre. Ejemplo 2 - Destoxificación de neumolisina de S. oneumoniae utilizando G BS Neumolisina purificada se destoxifica por modificación de grupos amina primaria y sulfhidrilo utilizando el reactivo de degradación de éster NHS-maleimida GMBS éster (?-(?-maleimidobutiriloxi)succinimida). Neumolisina a una concentración de 0.5 mg/ml, se dializa contra 50mM regulador de fosfato pH 7.0. GMBS se disuelve inicialmente en DMSO y se agrega a neumolisina en un exceso molar de 248 veces de GMBS. El tratamiento continuó por una hora a temperatura ambiente. GMBS en exceso y subproductos se remueven por diálisis contra 100mM fosfato de sodio pH 6.8. Grupos de maleimida adicionales se mitigan al reaccionar con 0.6mg/ml cisteína por dos horas a temperatura ambiente. Para remover el exceso de cisteína, la muestra de dializa contra 2 mM de fosfato de sodio pH7.1 5. Ejemplo 3 - Caracterización de neumolisina destoxificada Actividad hemolítica Un análisis hemolítica se utiliza para valorar la toxicidad restante de neumolisina destoxificada. Diluciones seriales de 2 veces de neumolisina se incuban con células de glóbulos rojos de oveja. Después de la centrifugación, el sobrenadante se transfiere a inmunoplacas y hemoglobulina liberada se mide utilizando densidad óptica leyéndose a 405 nm. Los resultados se expresan como neumolisina ng/ml correspondiente al punto medio de la curva OD. El análisis se repite después de incubar la neumolisina destoxificada a 37°C por 7 días para monitorear la reversión de la destoxificación.

Como se muestra en la tabla 1 , el tratamiento con GMBS fue capaz de reducir substanciaimente la actividad hemolítica de PLY con hasta una reducción 3,000 veces en actividad hemolítica lográndose. Las proporciones molares más altas de GMBS/lisato fueron capaces de producir mejor retiro de actividad hemolítica con proporciones de 4/1 y 5/1 siendo óptimas en este experimento. Este tratamiento se estima que resulta en modificación de aproximadamente 14 residuos de lisato. Donde pocos residuos de lisina se modifican, la reducción en actividad hemolítica fue menor. ELISA La antigenicidad de la neumolisina destoxificada se valora por ELISA. Las placas de ELISA se revisten con un anticuerpo de anti-neumolisina de conejillo de India. Las muestras conteniendo diluciones de neumolisina se incuban en las placas por 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, la neumolisina unida se detecta utilizando anticuerpos policlonales de conejo contra neumolisina, conjugada con peroxidasa de rábano picante. Después de lavar las placas, una reacción de substrato se utiliza para valorar la cantidad de neumolisina unida a cada cavidad. Como se muestra en la tabla 1 , el tratamiento con GMBS condujo a alguna pérdida de antigenicidad como se valora por ELISA. Sin embargo, las lecturas de ELISA de aproximadamente 86% de ese dado por PLY sin tratar podrían lograrse mostrando que muchos anticuerpos podrían aún reconocer la neumolisina modificada. Análisis SDS-PAGE Las proteínas de neumolisina destoxificadas se pasaron en SDS-PAGE (Novex 4-20% gel de poliacrilamida, Invitrogen) y azul brillante Coomassie se utiliza para visualizar las proteínas. Como se muestra en la figura 2, el tratamiento con G BS condujo a un incremento ligero en el peso molecular de PLY de 53kDa a aproximadamente 56kDa. Este incremento se debe a la modificación de múltiples residuos de aminoácidos con GMBS. Un porcentaje pequeño de PLY se convierte en formas multiméricas como puede observarse por la apariencia de bandas débiles de peso molecular de aproximadamente 1 10kDa y 170kDa, sin embargo, la mayoría de PLY permanece en una forma esencialmente monomérica. La incubación de PLY a 37°C por 7 días no resultó en ningún cambio substancial en la apariencia de PLY en un SDS-PAGE que muestra que la PLY no modificada no se somete a degradación o formación de multímero covalentemente enlazado subsiguiente. Tabla 1 : Pruebas de destoxificación PL Y por GMBS Las pruebas se realizan en 1 mg de PLY ( 1 mg/ml) excepto por el último análisis para el cual 3 mg se trataron (PLY a 0.68 mg/ml). Ejemplo 4 Evaluación de reactogenicidad de neumolisina destoxificada en ratas Los grupos de tres ratas OFA se inmunizan una vez por inoculación intramuscular (tibiales) con salina, el adyuvante QS21 (US5,057,540), neumolisina, neumolisina adyuvantada, neumolisina destoxificada de formaidehído, neumolisina destoxificada de formaldehído adyuvantado, neumolisina destoxificada GMBS, neumolisina destoxificada GMBS adyuvantada, neumolisina destoxificada NHS-acetato o neumolisina destoxificada NHS-acetato. Tres días después de la inmunización, todas las ratas se matan y las tibiales se preparan para examinación histológica. Las tibiales se fijan en formalina y corta en pedazos de 2mm que se deshidratan e incrustan de parafina. Secciones de 7um se cortan y colorean utilizando el método Trichrome Masson, antes de examinarse microscópicamente. La reactogenicidad, se evalúa utilizando cuatro criterios: degeneración/necrosis, inflamación endomisial, hemorragia e inflamación de aponeurosis. Para cada criterio histológico, una puntuación se atribuye a cada músculo de cada grupo y una puntuación de lesión promedio se calcula entonces para cada grupo. Una puntuación de 0=normal, 1 =mín¡ma, 2=ligera, 3=moderada, 4=marcada y 5=severa. Resultados La histología de secciones se examina. Las puntuaciones promedio para degeneración/necrosis, inflamación endomisial, hemorragia e inflamación de aponeuorisis se muestran en la Tabla 2. Tabla 2 Una comparación de puntuaciones histológica de neumolisina destoxificada y nativa sin adyuvantar muestra que GMBS es un reactivo de degradación particularmente efectivo para utilizarse para la destoxificación de neumolisina, produciendo una gran disminución en generación/necrosis, inflamación endomisial, hemorragia e inflamación de aponeurosis. La adición de adyuvante (500ug de fosfato de aluminio y 5 ug MPL) a las inoculaciones incrementa la cantidad de reactogenicidad como un efecto secundario de estimular el sistema inmune. La destoxificación de neumolisina con GMBS permitió que el nivel de degeneración/necrosis se reduzca a aquel producido por el adyuvante solo que fue inferior a aquel del nivel producido por inoculación con neumolisina nativa. Neumolisina destoxificada por GMBNS produjo un nivel de hemorragia inferior a aquel producido por neumolisina nativa. Los niveles de inflamación endomisial se elevaron por el adyuvante y este nivel aún estuvo presente en la presencia de neumolisina destoxificada por GMBS o nativa adyuvante.

La inflamación de aponeurosis se reduce sin embargo del nivel producido por adyuvante solo por neumolisina destoxificada por GMBS o nativo, con el nivel de aponeurosis siendo ligeramente inferior en donde la neumolisina se ha tratado por GMBS. Ejemplo 5 - Evaluación de toxicidad de neumolisina tratada por GMBS en ratones Los grupos de 20 ratones OF1 se trataron intranasalmente con ya sea neumolisina nativa o neumolisina tratada con GMBS y los ratones se modificaron por los siguientes 9 días. Como se muestra en la figura 2, el tratamiento con 2ug de neumolisina nativa condujo muy rápidamente a la muerte de todos los ratones en ese grupo. La neumolisina produjo lesiones a través del sistema respiratorio que condujo a dificultades respiratorias y muerte. En contraste, GMBS tratado con neumolisina ha reducido subtancialmente la toxicidad con todos los ratones inoculados con 2ug, 5ug o 10ug de la neumolisina tratada con GMBS sobreviviendo el tratamiento. Ejemplo 6 - estudios de protección utilizando neumolisina destoxificada Grupos de 20 ratones OF1 se inmunizaron 3 veces intramuscularmente, los días 0, 14 y 28 con 5 ug de MPL como adyuvante. Los ratones de control se inmunizan con adyuvante solo. La neumolisina ya sea no se trata o se destoxifica utilizando el tratamiento GMBS descrito arriba. El día 42 a los ratones se les da un tratamiento letal, intranasal con 2 ug de neumolisina nativa. La supervivencia de los ratones durante los siguientes 9 días se monitorea. Resultados El modelo de tratamiento letal conduce a 90% de mortalidad en ratones de control (figura 4). La inmunización con neumolisina destoxificada con GMBS produjo muy buena protección con solamente 5% de ratones muriendo durante los siguientes 9 días. Esto fue comparable para protección dada después de la inoculación con neumolisina nativa, después de lo cual 10% de ratones murieron. Ejemplo 7 Evaluación de neumolisina destoxificada en combinación con PhtD en un modelo de tratamiento letal de ratón Grupos de 20 ratones OF1 se inmunizaron intramuscularmente con a) adyuvante solo o b) 1 ug PhtD y adyuvante o c) 1 ug PhtD y 5ug neumolisina destoxificada con GMBS y adyuvante. El adyuvante utilizado se compone de 50ug de fosfato de aluminio y 50ug MPL e inmunizaciones tuvieron lugar el día 0 y día 14. Los ratones se trataron con una dosis letal ¡ntranasal de 5.105 CFU de serotipo 2 S. pneumoniae cepa D39 y la supervivencia se monitoreo durante los siguientes 10 días. Resultados Como se muestra en la figura 5, el tratamiento con cepa D39 condujo a 75% de letalidad después de 1 0 días en los ratones de control. La inmunización con PhtD solo no proporcionó protección significativa con 70% de ratones en este grupo muriendo después de 10 días (p=0.29). La inmunización con PhtD junto con neumolisina destoxificada por GMBS dio significativamente mejor protección con letalidad siendo reducida a 50% (P=0.04). Ejemplo 8 Destoxificación de neumolisina utilizando formaldehído Una reserva de neumolisina purificada a una concentración de aproximadamente 0.4mg/ml fue 25mM de regulador de fosfato de potasio pH 7.0 que se trató con 50mM de lisina y 0.1 % de formaldehído (p/v) por 21 días a 40°C.

Claims

EIVINDICACIONES 1 . Un proceso para purificación de una citolisina bacteriana comprendiendo las etapas de: a) desarrollar un cultivo de células que expresan citolisina bacteriana; b) preparar un extracto del cultivo conteniendo citolisina bacteriana; c) unir citolisina bacteriana agregada soluble, contenida en el extracto, en la presencia de detergente a un material de cromatografía de interacción hidrofóbica bajo condiciones ricas en sal (preferentemente 0.6- 2M); d) eluir citolisina bacteriana en la presencia de detergente bajo condiciones bajas en sal (preferentemente 0-0.2M). 2. El proceso según la reivindicación 1 comprendiendo además las etapas de: e) remover detergente de la citolisina bacteriana f) solubilizar la citolisina bacteriana por adición de un desnaturalizante; g) remover el desnaturalizante de la citolisina bacteriana. 3. El proceso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la citolisina bacteriana es neumolisina neumocócica. 4. El proceso según las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque la etapa b) incluye rompimiento mecánico de las células. 5. El proceso según las reivindicaciones 1 -4, caracterizado porque la etapa b) incluye el tratamiento con detergente. 6. El proceso según las reivindicaciones 1 -5, caracterizado porque el mismo detergente está presente en las etapas c) y d). 7. El proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque el mismo detergente está presente en las etapas b), c) y d). 8. El proceso según las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el detergente está presente en una concentración de entre 0.1 y 5% (p/v). 9. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la etapa b) incluye centrifugación de material celular interrumpido y recolección de un sobrenadante como el extracto de la etapa c). 10. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el material de cromatografía de interacción hidrofóbico utilizado en la etapa c) contiene grupos aromáticos. 1 1 . El proceso según la reivindicación 10, caracterizado porque el material de cromatografía hidrofóbico es fenil-sefarosa. 12. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el detergente presente en la solución utilizada en la etapa c) y/o etapa d) es un detergente alifático. 13. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el detergente es sarcosinato de lauroil de sodio. 14. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque las condiciones ricas en sal de la etapa c) contienen entre 0.6M y 2M sal. 15. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la solución utilizada en la etapa c) y/o d) contiene una sal seleccionada del grupo que consiste de cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de amonio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio, sulfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de magnesio, fosfato de amonio. 16. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque las condiciones utilizadas en la etapa c) y/o etapa d) son entre pH 6.8, preferentemente aproximadamente pH 7. 17. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque las condiciones utilizadas en la etapa d) contienen 0-0. M sal. 18. El proceso según la reivindicación 17, caracterizado porque las condiciones utilizadas en la etapa d) contienen 0-40mM sal. 1 9. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la etapa e) incluye el retiro de detergente por diafiltración o diálisis. 20. El proceso según la reivindicación 19, caracterizado porque la diafiltración/diálisis es contra un regulador bajo en sal de pH 8-10, preferentemente aproximadamente pH 9. 21 . El proceso según las reivindicaciones 2-20, caracterizado porque la etapa f) incluye desnaturalizar la citolisina bacteriana por la adición de un desnaturalizante y etapa g) incluye replegar la citolisina bacteriana al remover gradualmente el desnaturalizante. 22. El proceso según las reivindicaciones 2-21 , caracterizado porque el desnaturalizante utilizado en la etapa f) es hidrocloruro de guanidina. 23. El proceso según la reivindicación 22, caracterizado porque 5-8M hidrocloruro de guanidina se utiliza. 24. El proceso según las reivindicaciones 22-24, caracterizado porque la citolisina bacteriana se contacta con 5-9M urea durante la etapa f). 25. El proceso según la reivindicación 24, caracterizado porque la etapa f) incluye contactar citolisina bacteriana con 5-8M hidrocloruro de guanidina seguido por intercambio del hidrocloruro de guanidina por 5-9M urea. 26. El proceso según las reivindicaciones 21 -25, caracterizado porque un agente reductor está presente durante al menos parte de las etapas f) y g). 27. El proceso según la reivindicación 26, caracterizado porque el agente reductor es 0.1-10mM DTT, preferentemente aproximadamente 1 mM DTT. 28. El proceso según las reivindicaciones 2-27, caracterizado porque la etapa g) incluye retiro del desnaturalizante por diafiltración o diálisis. 29. El proceso según la reivindicación 28, caracterizado porque la diafiltración o diálisis es contra una solución de pH 7-9. 30. El proceso según cualquier reivindicación precedente, comprendiendo además una etapa adicional de destoxificar la citolisina bacteriana por tratamiento químico. 31 . El proceso según la reivindicación 30, caracterizado porque el tratamiento químico incluye uso de un agente de degradación. 32. El proceso según la reivindicación 31 , caracterizado porque el reactivo de degradación contiene uno o más químicos seleccionados del grupo que consiste de: formaldehído, glutaraldehído, ásteres de N-hidroxisuccinim¡do y GMBS. 33. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende una etapa adicional de conjugar la citolisina bacteriana con un polisacárido capsular bacteriano. 34. El proceso según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende una etapa adicional de formular citolisina bacteriana en una composición de vacuna con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 35. El proceso según la reivindicación 34, caracterizado porque la citolisina bacteriana se formula con proteína de unión de colina A o un fragmento inmunogénico de la misma. 36. El proceso según la reivindicación 34 o 35, caracterizado porque la citolisina bacteriana se formula con uno o más de PhtA, PhtB, PhtD o PhtE o un fragmento inmunogénico de los mismos. 37. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 34-36, caracterizado porque la citoiisina bacteriana se formula con un antígeno de Haemophilus influenzae sin tipo (NtHi). 38. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 34-37, caracterizado porque la citoiisina bacteriana se formula con un antígeno de Moraxella catarrhalis. 39. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 34-38, caracterizado porque la citoiisina bacteriana se formula con un antígeno de RSV. 40. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 34-39, caracterizado porque la citoiisina bacteriana se formula con un antígeno de virus de parainfluenza. 41 . El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 34-40, caracterizado porque la citoiisina bacteriana se formula con un antígeno de virus de influenza. 42. Un proceso para destoxificación de una toxina bacteriana comprendiendo tratar una toxina con un compuesto químico que es reactivo con grupos amina primaria en donde arriba del 50% de la toxina mantiene un peso molecular dentro del 20% de su peso molecular original después de tratamiento, como se valora por SDS-PAGE.