NO336672B1 - Prosess for rensing av et bakterielt cytolysin - Google Patents

Description

Teknisk område.

Foreliggende oppfinnelse vedrører området bakterielt cytolysin-rensing og særlig en fremgangsmåte for rensing av et bakterielt cytolysin. Pneumolysin er et protein fra Streptococcus pneumoniae med gode antigen-egenskaper som er en egnet vaksinebestanddel mot S. pneumoniae-\ rfieks\ on eller otitis media. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen beskriver et uvanlig og fordelaktig trinn med rensing av cytolysin i ett enkelt kromatografi-trinn, ved å binde det til en hydrofob interaksjonskolonne i nærvær av et vaskemiddel og høyt saltinnhold. Prosessen gjør fordelaktig bruk av den egenskapen at bakterielle cytolysiner har høy affinitet til aromatiske forbindelser som ligner kolesterol, særlig når de er i en aggregert tilstand, og vil dermed generelt være anvendelig for rensing av medlemmer av denne familien av toksiner.

Tiol-aktiverte cytolysiner danner en fremtredende gruppe av bakterielle toksiner, av hvilke steptolysin 0 er prototypen (Billington et al FEMS Microbiol. Lett. (2000), 182; 197-205). Disse toksinene er lytiske overfor eukaryote celler ved dannelsen av porer i cellemembranen. Oksyderende midler påvirker på ugunstig måte deres cytolyse-aktivitet, mens reduksjonsmidler kan gjenopprette aktivitet. Medlemmer av denne gruppen viser 30-60% likhet når det gjelder primær aminosyresekvens, og inneholder en nesten uforanderlig undecapeptid-sekvens nær C-terminus. Kolesterol er den viktigste målcellereseptoren for disse toksinene. Cytolysiner binder seg til kolesterolholdige membraner og oligomeriseres og danner transmembrane porer opptil 30 nm i diameter og sammensatt av 40-80 monomer-delenheter. Bindingen av membran-kolesterol bevirker en konformasjonell endring av toksin-monomerer som driver de påfølgende hendelsene med oligomerisering, membran-innsettelse og poredannelse.

Streptococcus pneumoniae er det agens som forårsaker flere menneskelige sykdommer, innbefattende pneumoni, bakteriemi, meningitt, otitis media og sinusitt. Noen ganger kan disse sykdommene føre til dødsfall, til tross for at antibiotika er tilgjengelig. Fremveksten av antibiotika-resistente stammer av S. pneumoniae har forverret problemene forårsaket av dette patogenet. I denne sammenhengen er det viktig at effektive vaksiner mot S. pneumoniae blir utviklet.

Flerverdige pneumokokk-vaksiner som inneholder rensede kapsel-polysakkarider har vært tilgjengelig i flere år. Deres anvendelse er begrenset av dårlig immunogenisitet særlig hos høyrisikogrupper, innbefattende spedbarn, eldre og de med sigdcelleanemi, multiple myelomer, cirrhose eller alkoholisme. De gir også serotype-spesifikk beskyttelse og kun 23 av 90 kjente serotyper er dekket av eksisterende formuleringer. Dette vil gi beskyttelse mot 90% av serotypene funnet hos USAs befolkning, men kun mot tilnærmet 70% av serotypene funnet hos asiatisk befolkning. Nylig er en konjugert, sjuverdig vaksine blitt tilgjengelig, som likeledes har problemer med å beskytte mot alle pneumokokk-stammene.

Pneumolysin (Ply) er et 53 kDa thiol-aktivert cytolysin funnet hos alle stammer av S. pneumoniae, som frigjøres ved autolyse og bidrar til patogenesen ved S. pneumoniae. Den er meget konservert, med kun noen få aminosyre-substitusjoner som forekommer mellom Ply-proteinene hos forskjellige serotyper. Pneumolysins høye grad av konservering og dets immunogenisitet gjør det til en potensiell kandidat som vaksinebestanddel. Imidlertid er villtype-Ply uegnet for innlemmelse i vaksiner for anvendelse til mennesker, på grunn av dets toksisitet. Ply forårsaker skade på cellemembraner ved å interagere med membranbundet kolesterol og oligomeriseres og danner porer i membranen. Et konservert cystein-inneholdende motiv funnet nær C-terminus har vært implisert i lyse-aktiviteten. Mutasjoner av Ply er blitt foreslått for å redusere denne toksisiteten (WO 90/06951, WO 99/03884).

En to-trinns fremgangsmåte for rensing av pneumolysin er blitt beskrevet av Lock et al (Microbial Pathogenesis (1996) 21; 71-83). Rekombinant pneumolysin blir renset fra en E. co//-kultur ved anvendelse av en kombinasjon av ionebytte- og gelfiltrerings-kromatografi. Fremgangsmåten innebærer trinnene å fremstille en ekstrakt og føre den ned en DEAE-Sepharose-kolonne, fulgt av en Sephacryl S200-HR-kolonne. Denne fremgangsmåten kan anvendes til å rense rekombinant eller nativt pneumolysin.

Kuo et al beskriver en fremgangsmåte for rensing av rekombinant GST-pneumolysin-fusjonsprotein (Infection and Immunity (1995) 63; 2706-2713). Fusjonsproteinet blir uttrykt i en E. co//'-kultur og et cellelysat blir satt på en glutation-agarosegel. Fusjonsproteinet blir eluert med glutation og thrombin kan anvendes til å spalte fusjonsproteinet. Proteinene ble ført over en glutation-agarosekolonne igjen for å fjerne GST. Det affinitetsrensede pneumolysin ble videre renset ved anvendelse av en hydroksylapatitt-kolonne.

Mitchell et al (BBA (1989) 1007; 67-72) beskriver en fremgangsmåte for rensing av pneumolysin ved anvendelse av hydrofob interaksjons-kromatografi. Under betingelsene som de anvender (250 mM salt) sviktet pneumolysinet med hensyn til å binde seg tett til kolonnen, selv om dets progresjon var retardert og pneumolysinet ble eluert som en bred topp. Ytterligere trinn for å bestemme hvilke fraksjoner som inneholdt rent pneumolysin, konsentrering av de positive fraksjonene, ny påsetting på kolonnen og eluering med et lite volum av vann, var nødvendig for å overvinne problemet med at pneumolysin ikke binder seg tett til kolonnematerialet.

Det gjenstår et fortsatt behov for forbedrede vaksiner mot S. pneumoniae. Innlemmelsen av en Ply-bestanddel gir løfter, selv om toksisiteten til proteinet gjenstår som et problem. Utviklingen av en rask og effektiv prosedyre for masse-rensing av pneumolysin er også nødvendig. Fremgangsmåter beskrevet tidligere innebærer anvendelse av mange rensetrinn, med analyse- og konsentreringstrinn innimellom. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en mer effektiv rensemetode som fordelaktig anvender ett enkelt kromatografitrinn, som kan anvendes til å rense store satser av pneumolysin.

Beskrivelse av figurene.

Figur 1: SDS-PAGE-geler viser rensingen av pneumolysin. Følgende prøver ble kjørt på SDS-PAGE-geler: bane 1: molekylvekt-standarder, bane 2: supernatant av celle-ekstrakt, bane 3: fenyl-sepharose-gjennomstrømning, bane 4: fenyl-sepharose første vask, bane 5: fenyl-sepharose andre vask, bane 6: fenyl-sepharose-vask med 0,5M NaCI, bane 7: fenyl-sepharose-eluering med lav saltbuffer, bane 8: pneumolysin etter denaturering/tilbakefoldingstrinn, bane 9: pneumolysin etter steriliseringsfiltrering.

Panel A viser gelen etter coomassie blå-farging. Panel B viser gelen etter en Western blotting-prosedyre ved anvendelse av anti-E. co//-antistoffer for å probe for forurensende proteiner.

Figur 2: SDS-PAGE-analyse av GMBS- (N-[y-maleimidobutyryloksy)suksin-imidester) modifisert pneumolysin - coomassie blå-farget.

Følgende prøver ble kjørt på en SDS-PAGE-gel: bane 1: molekylvekt-standarder, bane 2: umodifisert pneumolysin, bane 3: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 4:1, bane 4: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 4:1 og inkubert i 7 dager ved 37°C, bane 5: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 8:1, bane 6: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 8:1 etter inkubering i 7 dager ved 37°C, bane 7: PLY behandlet med Sulfo-NHS-acetat i et molforhold mellom NHS og lysin på 10:1, bane 8: PLY behandlet med NEM, bane 9: PLY behandlet med NEM etter 7 dagers inkubering ved 37°C. Figur 3: Toksisitet av GMBS-behandlet pneumolysin gitt intranasalt til mus. Linjen markert med romber indikerer overlevelsesrate for mus utfordret med 2 ug nativt pneumolysin. Linjen markert med firkanter indikerer overlevelsesraten for mus utfordret med 10 ug GMBS-behandlet pneumolysin. Figur 4: Beskyttelse bevirket av GMBS-behandlet pneumolysin hos mus utfordret intranasalt med nativt pneumolysin. Linjen markert med rektangler viser overlevelsesrate for mus inokulert med adjuvans alene. Linjen markert med romber indikerer overlevelsesraten for mus inokulert med nativt pneumolysin. Linjen markert med firkanter indikerer overlevelsesrate for mus inokulert med GMBS-behandlet pneumolysin. Figur 5: Beskyttelse bevirket av inokulering med PhtD- og GMBS-behandlet pneumolysin hos mus utfordret intranasalt med type 2 D39-pneumokokk-stamme. Linjen markert med rektangler representerer overlevelsesrate for mus inokulert med adjuvans alene. Linjen markert med romber representerer overlevelsesraten for mus inokulert med PhtD. Linjen markert med firkanter representerer overlevelsesraten for mus inokulert med PhtD og GMBS-behandlet pneumolysin.

Detaljert beskrivelse.

Prosesser.

Prosessen ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for rensing av et bakterielt cytolysin, så som pneumolysin. Et cytolysin, for eksempel pneumolysin, blir renset ved anvendelse av kun ett enkelt kolonne-kromatografitrinn, uten behov for ny påsetting på kolonnen. Proteinet er bundet i en aggregert form til en hydrofob interaksjonkolonne i nærvær av vaskemiddel og salt. Få proteiner binder seg til kolonnen under disse betingelsene, og tillater rensing av et cytolysin i ett enkelt trinn.

For formålene ifølge oppfinnelsen er et løselig aggregat av et cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, en aggregert form av cytolysinet som forblir i supernatanten etter sentrifugering ved 30.000 g i 20 minutter. Det løselige aggregatet blir holdt på hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale, fortrinnsvis fenyl-Sepharose, i nærvær av et høyt saltinnhold, fortrinnsvis 1M. Eventuelt er det løselige aggregatet kolloidalt.

Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, er bundet til kolonnen som et løselig aggregat. Det er av forskjellige årsaker uvanlig å påsette aggregater på en kolonne, innbefattende tilstopping av filtre eller kolonner og tap av materiale. Imidlertid er det, ved anvendelse av et vaskemiddel som reduserer størrelsen på aggregatene som skal danne et løselig aggregat, funnet at disse aggregatene binder seg tett til kolonnen under betingelser med vaskemiddel, men kan elueres til en renhet på minst 50%, 60%, 70%, 80%, fortrinnsvis 90%, 95%, mer foretrukket 97%, 98% eller 99%, som fastslått ved SDS-PAGE-analyse, uten på ugunstig måte å påvirke kolonnefiltrene. Fremgangsmåten gir fortrinnsvis et utbytte på minst 100, 200, 500, 700, mer foretrukket 1000, 1500, 1700 eller 1900 mg cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, pr. liter fermentering. Fortrinnsvis blir minst 1%, 2%, 5%, 7%, 9% eller 10% av proteinet fra fermenteringskulturen gjenvunnet som renset cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin.

Prosessen utnytter evnen som cytolysiner, så som pneumolysin, har til å binde seg til kolesterol og andre aromatiske forbindelser. Denne bindingen er spesielt tett når cytolysinet er aggregert, noe som tillater cytolysinet å binde seg i nærvær av et vaskemiddel. Prosessen kan utvides til andre medlemmer av cytolysin-familien, siden alle medlemmene har evnen til å binde seg til aromatiske forbindelser og danne porer. Faktisk kan metoden anvendes til å rense andre familier av proteiner som binder seg til kolesterol eller andre aromatiske forbindelser og/eller danner porer, fortrinnsvis begge deler.

Følgelig blir det, i en første utførelsesform, tilveiebragt en prosess for rensing av et bakterielt cytolysin, idet den omfatter trinnene: a) å dyrke en cellekultur som uttrykker bakterielt cytolysin; b) å fremstille et ekstrakt fra kulturen som inneholder bakterielt cytolysin; c) å binde løselig aggregert bakterielt cytolysin som finnes i ekstraktet i nærvær av et vaskemiddel til et hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale under betingelser med høyt saltinnhold på 0,6-2 M salt; d) å eluere bakterielt cytolysin i nærvær av et vaskemiddel under betingelser med lavt saltinnhold på 0-0,2 M salt.

I en andre utførelsesform blir det tilveiebragt en prosess som videre omfatter trinnene: e) å fjerne vaskemiddel fra det bakterielle cytolysinet; f) å solubilisere det bakterielle cytolysinet ved å tilsette et denatureringsmiddel; g) å fjerne denatureringsmidlet fra det bakterielle cytolysinet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig anvendes til å rense

pneumokokk-pneumolysin. Andre cytolysiner som kan renses ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter pyolysin fra A. pyogenes, cereolysin fra B. cereus, thuringiolysin 0 fra B. thuringiensis, laterosporolysin fra

B. latersporus, bifermentolysin fra C. bifermentans, botukinolysin fra C. botulinum, chauveolysin fra C. chauvoel, histolyticolysin fra C. histolyticum, oedematolysin fra C. novyi type A, perfringolysin 0 fra C. perfringens, septicolysin O fra C. septicum, sordellilysin fra C. sordellii, tetanolysin fra C. tetani, ivanolysin 0 fra L. ivanovi, listeriolysin 0 fra L. monocytogenes, seeligerilysin O fra L. seeligeri, alveolysin fra P. alvei, streptolysin 0 fra S. pyogenes, S. canis eller S. equisimilis, intermedilysin fra S. intermedius, suilysin fra S. suis eller pneumolysin fra S. pneumoniae som kan være av villtypen eller være genetisk modifiserte toksiner med lavere nivåer av toksisitet, så som PdA og PdB beskrevet ovenfor.

Med pneumolysin eller Ply menes det: nativt pneumolysin fra pneumokokk eller rekombinant pneumolysin, villtype-pneumolysin eller mutanter av pneumolysin (for eksempel dem beskrevet i WO 90/06951 og WO 99/03884). Eventuelt kan pneumolysin også bety et hvilket som helst fragment av pneumolysin eller en hvilken som helst variant av pneumolysin som deler minst 70, 80, 90 eller 95% aminosyresekvens-identitet med en villtype-pneumolysin-sekvens, som fremdeles har evnen til å bli renset ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, slik det lett kan fastslås av en fagperson.

I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er det samme vaskemidlet til stede i trinn b) og c), b) og d), c) og d), mer foretrukket i trinn b), c) og d), fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,1%-5% (vekt/volum). For formålene ifølge oppfinnelsen er et alifatisk vaskemiddel definert som et i det vesentlige alifatisk vaskemiddel med utilstrekkelig aromatisk karakter til å forhindre binding av cytolysin til kolonnen i trinn c). Fortrinnsvis vil vaskemidlet ha én eller flere aromatiske ringer, mest foretrukket har det ingen aromatiske ringer. I løpet av trinn b) er det fordelaktig at vaskemidlet bryter opp større aggregater av cytolysin til mindre aggregater som danner et løselig aggregat. I løpet av trinnene c) og d) beholder vaskemidlet fordelaktig den løselige, aggregerte tilstanden av cytolysinet, noe som tillater det å binde seg til kolonnen, under betingelser med høyt saltinnhold, med høy affinitet.

Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir uttrykt i en kultur av bakterieceller, fortrinnsvis S. pneumoniae, E. coli, eller alternativt i gjærceller, insektceller, pattedyrceller, eller et hvilket som helst annet ekspresjonssystem som er egnet for dets ekspresjon. I ekspresjonssystemer som gir høye utbytter av pneumolysin, blir pneumolysinet ofte aggregert av seg selv, og prosessen ifølge oppfinnelsen er ideéll for rensing av det. Fortrinnsvis blir pneumolysin uttrykt i høye utbytter, slik at det utgjør mer enn 2, 3, 4, 5, 7 eller 10% av totalt protein i ekspresjonssystemet. Fortrinnsvis er pneumolysinet i aggregert form, og dermed for det meste fritt for hemolytisk aktivitet. For eksempel er ekspresjon av E. coli i en fermentor under en fag X-promoter, eller andre promotere som tillater høy ekspresjon , velkjent for en person med kunnskap på fagområdet.

Fortrinnsvis blir cytolysinet ekstrahert fra ekspresjonssystemet som et aggregat. Alternativt kan et ekspresjonssystem med lavere utbytte gi løselig cytolysin. I dette tilfelle blir ekstrakten som inneholder cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, justert til en pH under 7,5, noe som tillater cytolysinet å aggregeres i løpet av en periode på minst 8 timer, fortrinnsvis minst 24 timer.

Fremstillingen av en ekstrakt i trinn b) innebærer fortrinnsvis ett eller flere trinn med mekanisk ødeleggelse av cellene og/eller behandling av cellene med vaskemiddel. Hvis utført med en fremgangsmåte med høyt utbytte, forblir pneumolysinet i form av aggregater, men aggregatene bør være små nok, slik at de forblir i supernatanten etter sentrifugering av prøven under betingelser som er nødvendig for å pelletere uløselige cellerester. Fortrinnsvis er vaskemidlet anvendt i oppfinnelsen et alifatisk vaskemiddel som ikke inneholder aromatiske ringer, fortrinnsvis et ionisk vaskemiddel, mer foretrukket et kationisk eller anionisk vaskemiddel, og mest foretrukket er vaskemidlet natriumlaurolysarcosinat. Foretrukne vaskemidler er i stand til å solubilisere pneumolysin, samtidig som de etterlater det i form av små aggregater som binder seg til den hydrofobe interaksjonskolonnen uten å forårsake blokkering av filtre festet til kolonnen. Foretrukne vaskemidler er i stand til å redusere størrelsen på pneumolysin-aggregater, noe som tillater pneumolysin-aggregatene å bli tilstrekkelig små slik at de forblir i supernatanten etter sentrifugering av prøven ved 30.000 g i 20 minutter. Slike løselige aggregater kan renses som sådanne på den hydrofobe interaksjonskolonnen. Vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på mellom 0,1% og 5%, fortrinnsvis 0,5% og 3% (vekt/volum), fortrinnsvis mellom 0,75% og 2%, mer foretrukket rundt 1 %. Fortrinnsvis er vaskemidlet dialyserbart.

Etter mekanisk og/eller vaskemiddel-sprengning av kulturen i trinn b), innbefatter prosessen ifølge oppfinnelsen sentrifugering av cellematerialet og oppsamling av supernatanten som ekstrakten som skal påsettes kromatografimaterialet i trinn c). Pneumolysin er fortrinnsvis til stede i supernatanten som et løselig aggregat.

Prosessen ifølge oppfinnelsen anvender hydrofob interaksjons-kromatografi for å rense pneumolysin i ett enkelt trinn. Kolonnematerialet anvendt i trinn c) inneholder fortrinnsvis aromatiske grupper, fortrinnsvis fenylgrupper, og er mer foretrukket fenyl-sepharose.

Løsningen anvendt i trinn c) og/eller trinn d) under påsetting og eluering av kolonnen, omfatter et ionisk vaskemiddel, fortrinnsvis et kationisk eller anionisk vaskemiddel, fortrinnsvis et vaskemiddel som er løselig ved saltkonsentrasjoner over 0,5M, mest foretrukket er vaskemidlet natriumlaurolysarcosinat. Vaskemidlet anvendt er et som vil redusere størrelsen på cytolysin-, fortrinnsvis pneumolysin-, aggregater, noe som tillater at cytolysinet kan være til stede i prøven som et løselig aggregat, slik at det vil binde seg til det hydrofobe interaksjons-kolonnematerialet uten å bli irreversibelt fanget på kolonnen. Vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på fortrinnsvis mellom 0,1% og 5%, fortrinnsvis 0,5% og 3% (vekt/- volum), mer foretrukket mellom 0,75% og 2%, mest foretrukket rundt 1%.

Løsningen anvendt i trinn c) og/eller d) inneholder et salt, fortrinnsvis et salt valgt fra gruppen som består av natriumklorid, magnesiumklorid, ammoniumklorid, natriumsulfat, magnesiumsulfat, ammoniumsulfat, natriumfosfat, magnesiumfosfat, ammoniumfosfat, og er fortrinnsvis bufret til pH 6-8, fortrinnsvis rundt pH 7. Enhver buffer som er i stand til å holde pH mellom pH 5 og 9 kan anvendes.

Løsningen anvendt til å binde pneumolysin til kolonnen i prosessen ifølge oppfinnelsen inneholder en høy saltkonsentrasjon, fortrinnsvis 0,6-2M, mer foretrukket rundt 1M. Saltkonsentrasjonen er valgt slik at pneumolysin er i en løselig, aggregert form og er i stand til å binde seg til det hydrofobe kromatografimaterialet.

Eventuelt kan trinn c) inneholde et ekstra trinn med å vaske kolonnen i mellomliggende saltbetingelser på rundt 0,5M salt, eller en saltkonsentrasjon som er i stand til å fjerne eventuelle urenheter som binder seg dårlig.

Prosessen ifølge oppfinnelsen anvender en synkende saltgradient til å eluere pneumolysin fra kolonnen. Fortrinnsvis inneholder den lave saltløsningen som anvendes til å danne saltgradienten i trinn d) mellom 0 og 0,1 M salt, mer foretrukket 0-40 mM salt. Alternativt kan trinnvis eluering anvendes med den lave saltbufferen anvendt i trinn d), som inneholder mellom 0 og 0,2M salt, mer foretrukket 0-40 mM salt.

Valgfrie trinn kan legges til prosessen ifølge oppfinnelsen hvis det er foretrukket å denaturere pneumolysinet og deretter tilbakefolde det ved fjerning av denatureringsmidlet. Disse valgfrie trinnene sikrer at rent cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, med en nativ struktur, blir oppnådd. Det første valgfrie trinnet e) innebærer fjerning av vaskemiddel ved hjelp av diafiltrering, dialyse eller fortynning. Dette trinnet innebærer fortrinnsvis diafiltrering/dialyse mot en buffer med pH 8-10, fortrinnsvis rundt 9, idet det er mer foretrukket at bufferen er én som er i stand til å bufre til alkaliske pH-verdier, idet det er mest foretrukket at bufferen er DEA. Løsningen har fortrinnsvis lav ionestyrke, fortrinnsvis 10-50 mM, mest foretrukket rundt 25 mM. Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4°C, men blir alternativt utført ved romtemperatur.

I et andre trinn blir cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, denaturert og solubilisert ved tilsetning av et denatureringsmiddel. Fortrinnsvis er denatureringsmidlet anvendt i trinn f) guanidinhydroklorid, mer foretrukket 5-8M guanidinhydroklorid, mest foretrukket rundt 6M guanidinhydroklorid. Pneumolysinet blir inkubert med guanidinhydroklorid i minst 10 minutter, fortrinnsvis minst 1 time, mer foretrukket i omtrent én time.

Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir deretter fortrinnsvis bragt i kontakt med 5-9M urinstoff, fortrinnsvis rundt 8M urinstoff, i trinn f). Dette oppnås ved diafiltrering eller dialyse av cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, mot urinstoff. Fortrinnsvis blir den samme bufferen og pH opprettholdt under utvekslingen av denatureringsmiddel. Fortrinnsvis blir et reduksjonsmiddel (DTT, 2-merkaptoetanol eller glutation tilsatt under utvekslingen av denatureringsmiddel.

Fortrinnsvis innebærer trinn f) å bringe cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, i kontakt med 5-8M guanidinhydroklorid, fulgt av utveksling av guanidinhydrokloridet med 5-9M urinstoff.

For å forhindre at det dannes upassende disulfidbindinger mens cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir denaturert, er det fordelaktig å sikre at et reduksjonsmiddel er til stede under minst noe av trinn f) og g). Et foretrukket reduksjonsmiddel er 0,1-10 mM DTT, fortrinnsvis rundt 1 mM DTT. Alternativt anvendes glutation eller 2-merkaptoetanol. Foretrukket konsentrasjon av glutation er 1-50 mM, mer foretrukket 10-30 mM.

Valgfritt trinn g) innebærer fjerning av denatureringsmidlet for å tilbakefolde cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, fortrinnsvis ved diafiltrering eller dialyse mot en lav saltbuffer på pH 6-11, fortrinnsvis rundt pH 9. Fortrinnsvis blir cytolysin-, fortrinsvis pneumolysin-, konsentrasjonen opprettholdt på minst 100 ug/ml, fortrinnsvis mellom 100 ug/ml og 1000 ug/ml, mer foretrukket på rundt 500 ug/ml. Eventuelt er diafiltrering eller dialyse mot en buffer inneholdende propylenglykol på mellom 10 og 30%, fortrinnsvis på rundt 15%. Fortrinnsvis blir et reduksjonsmiddel som beskrevet ovenfor opprettholdt i trinn g). Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4°C, men blir alternativt utført ved romtemperatur.

Et ytterligere, valgfritt trinn h) innebærer fjerning av reduksjonsmidlet etter at cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, er blitt tilbakefoldet. Dette oppnås fortrinnsvis ved diafiltrering eller dialyse mot en lav saltbuffer på pH 6-11, fortrinnsvis rundt pH 9. Eventuelt er diafiltrering eller dialyse mot en buffer inneholdende propylenglykol på mellom 10 og 30%, fortrinnsvis på rundt 15%. Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4°C, men blir alternativt utført ved romtemperatur.

I foretrukne fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen blir cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, tilbakefoldet, slik at dets hemolytiske aktivitet blir gjenopprettet til over 25%, 50%, 75%, mest foretrukket til over 90% av den til det riktig foldede proteinet. For formålene ifølge oppfinnelsen, er et "foldet" protein et protein som har den tertiære strukturen til proteinet dannet ved en ikke-denatureringsprosess.

I tilfelle av vill-type-pneumolysin vil den forventede hemolytiske aktivitet til tilbakefoldet pneumolysin være 500.000-1.000.000 hemolyse-enheter/mg pneumolysin. I tilfelle av punktmutert pneumolysin med en lavere hemolyseaktivitet, vil hemolyseaktiviteten til det tilbakefoldede pneumolysin være tilsvarende lavere.

Detoksifisering av et toksin.

Cytolysinet renset ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis pneumolysin, kan bli utsatt for et ytterligere, valgfritt trinn med detoksifisering ved

kjemisk behandling. Dette ytterligere trinnet er spesielt fordelaktiv hvis cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, skal administreres til et dyr eller et menneske. Vill-type-pneumolysin er meget toksisk. Flere muterte pneumolysin-proteiner er blitt isolert som har redusert toksisitet, men allikevel har disse fremdeles rest-toksisitet som kan være problematisk når penumolysin blir administrert internt (WO 99/03884, WO 90/06951). Alternativt kan det bli detoksifisert ved konjugering til polysakkarider (WO 96/05859).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan detoksifisere enten villtype- eller mutert cytolysin, for eksempel pneumolysin, ved kjemisk behandling. Foretrukne utførelsesformer anvender et kryssbindingsmiddel, mer foretrukket inneholdende ett eller flere kjemikalier valgt fra gruppen som består av formaldehyd, glutaraldehyd og et kryssbindings-reagens inneholdende en N-hydroksysuksino-midoester og/eller en maleimidgruppe (for eksempel GMBS).

Detoksifiseringsprosessene er i seg selv et aspekt av oppfinnelsen og kan anvendes til å detoksifisere bakterietoksiner, fortrinnsvis pneumolysin fremstilt med andre fremgangsmåter.

I én utførelsesform beskriver detoksifiseringsprosessen ifølge oppfinnelsen detoksifiseringen av et bakterietoksin, som omfatter å behandlet toksinet med en kjemisk forbindelse, fortrinnsvis et kryssbindingsmiddel som er reaktivt, fortrinnsvis preferanse-reaktivt, mest foretrukket spesifikt reaktivt med amingrupper, mer foretrukket primære amingrupper.

For formålene for denne oppfinnelsen er et kryssbindingsmiddel definert som en forbindelse med minst to reaktive grupper, hvorav minst én er i stand til å reagere med minst én gruppe i bakterietoksinet. En ytterligere, reaktiv gruppe er i stand til å reagere med enten en gruppe på bakterietoksinet, eller en separat forbindelse (for eksempel en aminosyre, peptid, polypeptid, sukker eller polysakkarid).

Fortrinnsvis er den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsmidlet reaktivt, mer foretrukket preferanse-reaktivt, mest foretrukket spesifikt reaktivt med amin-og sulhydrylgrupper. Fortrinnsvis reagerer den kjemiske forbindelsen med en primær amingruppe i lysin, mer foretrukket reagerer kryssbindingsmidlet med en primær amingruppe i lysin og sulhydrylgruppen i cystein. Denne fremgangsmåten er spesielt fordelaktig når pneumolysin blir detoksifisert, siden modifisering av både cystein- og lysinrester fører til en synergistisk reduksjon av hemolysenivået, sammenlignet med rest-hemolyseaktiviteten der kryssbindingsreagenset reagerer med bare lysin eller cystein.

Således tilveiebringer en alternativ utførelsesform en fremgangsmåte for detoksifisering av bakterietoksiner, som omfatter å modifisere en cysteinrest (eventuelt nær C-terminus til toksinet) som er involvert i den toksiske aktiviteten til toksinet (fortrinnsvis lyse-aktiviteten), som omfatter å behandle toksinet med et kryssbindingsreagens (fortrinnsvis et heterobifunksjonelt kryssbindingsreagens) som kryssbinder sulfhydrylgruppene med en annen aminosyre av toksinet, fortrinnsvis mer enn 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40 aminosyrer bort fra cysteinet i den primære strukturen. Fortrinnsvis inneholder den andre aminosyren en primær amingruppe, og mer foretrukket er aminosyren lysin.

I noen utførelsesformer beholder over 50%, 60%, 70%, 80%, 90% eller 95% av toksinet en molekylvekt innen 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80% eller 90%, mer foretrukket mellom 1 og 50%, mest foretrukket mellom 5 og 10%, av sin opprinnelige molekylvekt etter behandlingen, som anslått ved hjelp av SDS-PAGE. Fortrinnsvis får toksinet en noe høyere molekylvekt etter detoksifiseringsbehandlingen, på grunn av at flere aminosyrerester blir modifisert ved kovalent binding til den kjemiske forbindelsen. Imidlertid involverer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis ikke omfattende konjugering av toksinet, verken ved kovalent binding av det til andre toksinmolekyler slik at et toksin med en multimer kvaternær struktur blir dannet, eller ved kovalent binding av toksinet til andre store proteiner, polysakkarider eller lipopolysakkarider. Mest foretrukket er fremgangsmåtene, proteinene eller produktene beskrevet i WO 96/05859 ikke dekket av denne oppfinnelsen.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å detoksifisere bakterietoksiner. Foretrukne toksiner innbefatter de tiol-aktiverte cytolysinene pyolysin fra A. pyogenes, cereolysin fra B. cereus, thuringiolysin O fra B. thuhngiensis, laterosporolysin fra B. latersporus, bifermentolysin fra C. bifermentans, botukinolysin fra C. botulinum, chauveolysin fra C. chauvoel, histolyticolysin fra C. histolyticum, oedematolysin fra C. novyi type A, perfringolysin 0 fra C. perfringens, septicolysin 0 fra C. septicum, sordellilysin fra C. sordellii, tetanolysin fra C. tetani, ivanolysin 0 fra L. ivanovi, listeriolysin 0 fra L. monocytogenes, seeligerilysin 0 fra L. seeligeh, alveolysin fra P. alvei, streptolysin 0 fra S. pyogenes, S. ca nis eller S. equisimilis, intermedilysin fra S. intermedius, suilysin fra S. suis eller pneumolysin fra S. pneumoniae som kan være av villtype eller kan være genetisk modifiserte toksiner med lave toksisitetsnivåer, så som PdA og PdB beskrevet ovenfor (WO 90/06951, WO 99/03884).

Fremgangsmåten kan også anvendes til å detoksifisere Neisserial-toksinene FrpA, FrpC (WO 92/01460), FrpB (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)) NM-ADPRT (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al s. 135). FrpA og FrpC inneholder en region som blir konservert mellom disse to proteinene, og et foretrukket fragment av toksinene ville være et polypeptid som inneholder dette konserverte fragmentet, fortrinnsvis omfattende aminosyrer 227-1004 i sekvensen FrpA/C.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til å detoksifisere Bordetella-toksiner, innbefattende adenylat-cyklase (CyaA) (Glaser (1988) Mol. Microbiol. 2; 19-30), dermonekrotisk toksin (Livey (1984) J. Med, Microbiol. 17; 91-103) og pertussis-toksin (PT) (Munoz et al (1981) Infect Immun 33; 820-826). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er også nyttig for detoksifisering av tetanus-toksin (TT) og difteri-toksin (DT) og toksin fra S. aureus og S. epidermidis, innbefattende autolysin og hemolysin (WO 01/98499, WO 02/59148).

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen fører til en reduksjon av mengden av toksisitet og/eller hemolytisk aktivitet av toksinet på minst 90%, fortrinnsvis 95%, 96%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% eller 99,99%. (Hemolytisk aktivitet blir målt ved anvendelse av fremgangsmåten i eksempel 3, og toksisitet kan måles ved fremgangsmåten i eksempel 5). Nativt pneumolysin har en hemolytisk aktivitet på 500.000-1.000.000 enheter pr. mg pneumolysin. Noen punkt-muterte varianter av pneumolysin har redusert toksisitet og hemolytisk aktivitet. Detoksifisering av en variant av pneumolysin er kanskje ikke i stand til å oppnå så stor prosentvis reduksjon av hemolytisk aktivitet, på grunn av det lavere startpunktet som hemolytisk aktivitet blir redusert fra, men man forestiller seg at hoveddelen av den gjenværende hemolytiske aktivitet blir fjernet ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Detoksifiseringstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer fortrinnsvis en kryssbindingsreaksjon som er i det vesentlige ikke-reversibel. Reverserbarhet blir anslått ved overvåkning av nivået av hemolytisk aktivitet av det detoksifiserte toksinet rett etter detoksifisering og etter inkubering ved en temperatur over 25°C, fortrinnsvis over 30°C, mer foretrukket over 35°C, mest foretrukket over 37°C, i minst 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 dager. En i det vesentlige ikke-reverserbar reaksjon resulterer i vesentlig ikke-reversibel detoksifisering, og er definert som en reaksjon hvor nivået av hemolytisk aktivitet stiger med mindre enn 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% etter inkubering ved en forhøyet temperatur som beskrevet ovenfor. Mange fremgangsmåter for detoksifisering, for eksempel ved anvendelse avformaldehydbehandling, resulterer i detoksifisering som ikke er stabil, men øker i toksisitet over tid.

I et foretrukket detoksifiseringstrinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, beholder over 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av toksinene en monomer kvaternær struktur etter kryssbindingsreaksjonen. Mange kryssbindingsreagenser danner intermolekylære kryssbindinger (for eksempel formaldehyd og glutaraldehyd). Dette kan påvirke de immunologiske egenskapene til toksinet, siden noen epitoper vil være skjult inne i aggregatet. Fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen innebærer fortrinnsvis ganske enkelt å modifisere aminosyrerester, fortrinnsvis sulfhydryl- og/eller primære amingrupper av aminosyrer og/eller dannelse av hovedsakelig intramolekylære kryssbindinger. Den resulterende, monomere, kvaternære struktur tillater at epitoper forblir eksponert på overflaten av toksinet.

I en foretrukket utførelsesform av detoksifiseringstrinnet, er kryssbindingsmidlet heterobifunksjonelt. Foretrukne kryssbindingsreagenser inneholder en N-hydroksysuksinimid-estergruppe som reagerer preferensielt, mer foretrukket spesifikt, med primære amingrupper. Fortrinnsvis inneholder kryssbindingsreagenset en maleimidgruppe som reagerer preferensielt, mer foretrukket spesifikt, med sulfhydrylgrupper. Ved en pH rundt 7 reagerer en maleimidgruppe 1000 ganger raskere med sulfhydrylgrupper enn den gjør med aminer. Fortrinnsvis inneholder kryssbindingsreagenset både en N-hydroksysuksinimid-estergruppe og en maleimidgruppe. Kryssbindingsmidlet er fortrinnsvis ikke spaltbart ved anvendelse av et reduksjonsmiddel, siden dette fører til mindre effektiv detoksifisering.

Avstanden mellom de reaktive gruppene i kryssbindingsreagenset er i stand til å påvirke effektiviteten av detoksifiseringen. Fortrinnsvis er avstanden mellom gruppene i kryssbindingsreagenset som er reaktivt med amin- og sulfhydrylgrupper mellom 1,5 og 20 Ångstrøm, mer foretrukket mellom 5 og 15 Ångstrøm, og mest foretrukket rundt 10 Ångstrøm, i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis blir aminosyrerestene på det bakterielle toksinet modifisert ved tilsetning aven gruppe som er over 5, 7, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 500 Ångstrøm lang. Fortrinnsvis er modifiseringsgruppen mellom 5 og 100 Ångstrøm, mer foretrukket mellom 10 og 20 Ångstrøm av størrelse.

Detoksifiseringstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater at tilstrekkelige rester blir modifisert, slik at sterisk interferens og/eller konformasjonelle endringer hemmer funksjonen til bakterietoksinet. Fortrinnsvis blir minst 5, 7, 10, 12, 14, 15, 20 eller 25 aminosyrerester av bakterietoksinet modifisert. Når uomsatte maleimidgrupper er til stede på kryssbindingsreagenset, kan en Ellman-reaksjon anvendes til å anslå (indirekte) antall kryssbindingsmolekyler som er bundet til hvert toksinmolekyl (Ellman 1959 Arch. Biochem. Biophys. 82; 70).

Foretrukne kryssbindingsreagenser er SMPT, Sulfo-LC-SMPT, Sulfo-KMUS, LC-SMCC, KMUA, Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, Sulfo-SMPB, SMPH, Sulfo-SMCC, SMCC, SIAB, Sulfo-SIAB, GMBS (N-(y-maleimidobutyryl-oksy)suksinimidester), Sulfo-GMBS, MBS, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, EMCA, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP og SIA (Pierce).

I en foretrukket fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen blir toksinet behandlet med den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsreagenset under pH-betingelser på mellom 5,0 og 9,0, fortrinnsvis 6,5 til 8,0, mest foretrukket 7,0 til 7,8. I behandlinger hvor omsetningen av en maleimidgruppe til en sulfhydrylgruppe blir befordret, er den foretrukne pH ved omsetningen 6,0 og 8,0, mer foretrukket 6,5 og 7,5. Den foretrukne konsentrasjonen av salter under omsetningen er mellom 100 mM og 1M, mer foretrukket 150 mM og 500 mM, mest foretrukket mellom 200 mM og 300 mM. Imidlertid har oppfinnerne funnet at det noen ganger er foretrukket å utføre omsetningen ved en lav saltkonsentrasjon hvor ikke noe natriumklorid eller annet salt er tilsatt. Når omsetningen blir utført ved en pH på mellom 7,6 og 7,8, kan omsetningen eventuelt bli utført uten tilsetning av salt. Likeledes kan anvendelsen av høyere forhold mellom GMBS og toksin utføres uten tilsetning av salt ved pH-verdier mellom 7,0 og 8,0.

Fortrinnsvis blir et 50-500, mer foretrukket 130-350 eller 350-900, mest foretrukket rundt 250 ganger molart overskudd av den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsreagenset i forhold til hvert toksin anvendt. Pneumokokk-pneumolysin inneholder 31 lysinrester. Derfor er et 248 ganger molart overskudd av kjemisk forbindelse eller kryssbindingsreagens i forhold til pneumolysin ekvivalent med et 8 ganger molart overskudd av kjemisk forbindelse eller kryssbindingsreagens i forhold til hver lysinrest. Fortrinnsvis anvendes et 2-20, mer foretrukket et 4-15 eller 15-30, mest foretrukket rundt 8 ganger molart forhold mellom kjemisk forbindelse eller kryssbindingsmiddel og lysinrester i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Behandlingen med kryssbindingsreagens foregår i minst 15 minutter, fortrinnsvis i minst 30 minutter, mest foretrukket rundt én time, ved mellom 4°C og 40°C, fortrinnsvis mellom 15°C og 25°C, mest foretrukket ved romtemperatur. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte et behandlings-("quenching") trinn ved anvendelse av en forbindelse som inneholder en sulfhydrylgruppe, fortrinnsvis har behandlingsforbindelsen en molekylvekt på over 50, 100 eller 120, og mer foretrukket er behandlingsreagenset en aminosyre, så som cystein. Alternativt kan gruppen bli omsatt med en peptid- eller polysakkarid-enhet som er i stand til å reagere med maleimid, for eksempel et peptid inneholdende en cysteinrest. Dette er spesielt passende der en uomsatt maleimidgruppe er til stede før behandlingstrinnet.

Detoksifiseringstrinnet er egnet for anvendelse på bakterietoksiner som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis er bakterietoksinet fra Streptococcus pneumoniae, mest foretrukket er toksinet pneumolysin. Pneumolysinet er et nativt eller rekombinant protein, eller et protein som er blitt genetisk konstruert for å redusere dets toksisitet (som beskrevet ovenfor). Fusjonsproteiner av toksiner, fortrinnsvis pneumolysin eller fragmenter av toksiner, fortrinnsvis pneumolysin, kan detoksifiseres ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Således, i en foretrukket utførelsesform, blir et toksin (så som pneumolysin) detoksifisert med et kryssbindingsreagens som fortrinnsvis er heterobifunksjonelt og som har grupper som er reaktive med lysin- og cysteinrester og som har en viss størrelse, og har mest foretrukket de reaktive gruppene i en avstand på 10-20 Ångstrøm fra hverandre, slik at ett eller begge av følgende skjer: a) mellom 5 og 30, fortrinnsvis rundt 12-14 aminosyrerester av toksinet blir modifisert ved hjelp av et kryssbindingsmolekyl som kovalent binder seg

fortrinnsvis til en lysin- eller argininrest (fortrinnsvis, som målt indirekte ved en Ellman-reaksjon), idet den andre enden er blitt behandlet (fortrinnsvis

med cystein) og/eller;

b) en cystein-sidekjede involvert i den toksiske aktiviteten til toksinet (fortrinnsvis mot C-terminus av toksinet) blir kryssbundet til en annen

sidekjede av toksinet (fortrinnsvis til en lysin- eller argininrest) som fortrinnsvis er skilt med mer enn 2, 5,10, 20, 30 eller 40 aminosyrer fra cysteinresten i den primære sekvensen av toksinet.

I en ytterligere, foretrukket utførelsesform blir et toksin (fortrinnsvis pneumolysin) detoksifisert med en monofunksjonell, kjemisk forbindelse som fortrinnsvis reagerer med aminosyrer som inneholder en primær amingruppe, mer foretrukket lysin, og som har en viss størrelse, mest foretrukket 10-100 Ångstrøm, slik at toksinet blir dekket med mellom 5 og 30, mer foretrukket rundt 14 kjemiske forbindelser bundet til aminosyrerester.

Polysakkaridkonjugater.

Et problem forbundet med polysakkarid-tilnærming til vaksinering, er det faktum at polysakkarider per se er dårlige immunogener. For å overvinne dette, kan polysakkarider bli konjugert til proteinbærere, som gir tilskuer-T-cellehjelp. Prosessen ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig inneholde et ytterligere trinn med konjugering av cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, til et bakterie-polysakkarid, for eksempel et lipo-oligosakkarid, eller fortrinnsvis et kapsel-polysakkarid.

En foretrukket konjugat ifølge oppfinnelsen omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin oppnådd ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, konjugert til kapsel-polysakkarider avledet fra Streptococcus pneumoniae. Pnemokokk-kapsel-polysakkarid-antigenene er fortrinnsvis valgt fra serotyper 1,2,3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F (mest foretrukket fra serotyper 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F), eller blandinger av to eller flere av de nevnte konjugatene (4, 7, 9, 11, 13 eller 23).

Cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, renset ved prosessen ifølge oppfinnelsen, blir også fortrinnsvis konjugert til kapsel-polysakkarider fra andre stammer av bakterier. Slike polysakkarider kan være isolert fra for eksempel H. influenzae, H. influenzae type B (Hib), N. meningitidis- grupper A, C, W, Y, streptokokker forskjellig fra S. pneumoniae (for eksempel gruppe B-streptokokker, S. pyogenes, etc), stafylokokker (for eksempel S. aureus, S. epidermidis), E. coli, enterokokker (for eksempel E. faecalis og E. facecium), etc. Fortrinnsvis er polysakkaridene fra H. influenzae type B (Hib), og/eller N. meningitidis- grupper A, C, W135 og/eller Y.

Polysakkaridet kan bli bundet til cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, ved en hvilken som helst kjent metode (for eksempel av Likhite, US-patent nr. 4.372.945 og av Armor et al., US-patent nr. 4.474.757). Fortrinnsvis blir CDAP-konjugering utført (WO 95/08348). For å øke immunogenisiteten kan polysakkaridene bli tilsatt adjuvans ("adjuvanted") og/eller lyofilisert. Polysakkaridene ifølge oppfinnelsen kan være i full størrelse, eller få en størrelse etter rensingen som mindre polysakkarider eller oligosakkarider.

Prosessen ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis et ytterligere trinn med å formulere cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, til en vaksine.

Proteiner og immunogene preparater.

Et pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkaridkonjugat kan bli dannet ved prosessen ifølge oppfinnelsen.

Et immunogent preparat som omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin eller pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkarid kan bli oppnådd ved prosessen ifølge oppfinnelsen (som beskrevet ovenfor).

Det immunogene preparatet kan videre omfatte fortrinnsvis ett eller flere medlemmer av pneumokokk-cholinbindingsprotein-familien, fortrinnsvis cholinbindingsprotein A eller et immunogent fragment derav, og/eller ett eller flere medlemmer av polyhistidin-triad-familien (innbefattende fusjonsproteiner derav), fortrinnsvis PhtA, PhtB, PhtD eller PhtE, eller et immunogent fragment derav.

Vedrørende Choline Binding Protein-familien (CbpX), ble medlemmer av denne familien opprinnelig identifisert som pneumokokk-proteiner som kunne renses ved cholin-affinitetskromatografi. Alle cholinbindingsproteinene er ikke-kovalent bundet til fosforylcholin-enheter av cellevegg-"teichoic"-syre og membranbundet lipo-"teichoic"-syre. Strukturelt har de flere regioner felles i hele familien, selv om den nøyaktige naturen til proteinene (aminosyresekvens, lengde, etc.) kan variere. Generelt omfatter cholinbindingsproteiner en N-terminal region (N), konserverte repetisjonsregioner (R1 og/eller R2), en prolin-rik region (P) og en konservert cholinbindingsregion (C), som utgjøres av multiple repetisjoner, som omfatter tilnærmet den ene halvparten av proteinet. Som anvendt i denne søknaden, er betegnelsen "Choline Binding Protein-familie (CbpX)" valgt fra gruppen som består av Choline Binding Protein'er som identifisert i WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD og CbpG. CbpA er beskrevet i WO 97/41151. CbpD og CbpG er beskrevet i WO 00/29434. PspC er beskrevet i WO 97/09994. PbcA er beskrevet i WO 98/21337. SpsA er et Choline-bindingsprotein beskrevet i WO 98/39450. Fortrinnsvis er Choline Binding Protein'er valgt fra gruppen som består av CbpA, PbcA, SpsA og PspC.

En annen, foretrukket utførelsesform er CbpX-trunkater hvor "CbpX" er definert ovenfor og "trunkater" refererer til CbpX-proteiner som mangler 50% eller mer av Choline-bindingsregionen (C). Fortrinnsvis mangler slike proteiner hele cholinbindingsregionen. Mer foretrukket mangler slike protein-trunkater (i) cholinbindingsregionen og (ii) en del av den N-terminale halvparten av proteinet også, men bibeholder likevel minst én repetisjonsregion (R1 eller R2). Enda mer foretrukket har trunkatet 2 repetisjonsregioner (R1 og R2), mer foretrukket bibeholder trunkatet den prolinrike regionen (P). Eksempler på slike foretrukne utførelsesformer er NR1xR2 og R1xR2, som illustrert i WO 99/51266 eller WO 99/51188 og NR1XR2P, men andre cholinbindingsproteiner som mangler en lik cholinbindingsregion er også beskrevet.

LytX-familien er membranbunde proteiner forbundet med cellelyse. Det N-terminale domenet omfatter cholinbindingsdomene(r), men LytX-familien har ikke alle trekkene som er å finne hos CbpA-familien angitt ovenfor, og således anses LytX-familien som forskjellig fra CbpX-familien. I motsetning til CbpX-familien, inneholder det C-terminale domenet det katalytiske domenet til LytX-protein-familien. Familien omfatter LytA, B og C. Med hensyn til LytX-familien, er LytA beskrevet i Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB er beskrevet i WO 98/18930, og er også referert til som Sp46. LytC er også beskrevet i WO 98/18930, og er også referert til som Sp91. Et foretrukket medlem av denne familien er LytC.

En annen, foretrukket utførelsesform er LytX-trunkater hvor "LytX" er definert ovenfor og "trunkater" refererer til LytX-proteiner som mangler 50% eller mer av Choline-bindingsregionen. Fortrinnsvis mangler slike proteiner hele cholinbindingsregionen. Et eksempel på slike trunkater er å finne i eksempeldelen i denne oppfinnelsen.

Videre er CbpX-trunkat-LytX-trunkat-kimære proteiner (eller fusjoner) beskrevet. Fortrinnsvis omfatter dette NR1xR2 (eller R1xR2, eller NR1XR2P) av CbpX og den C-terminale delen (Cterm, dvs. mangler cholinbindingsdomenene) i LytX (for eksempel LytCCterm eller Sp91 Cterm). Mer foretrukket er CbpX valgt fra gruppen som består av CbpA, PbcA, SpsA og PspC. Enda mer foretrukket er det CbpA. Fortrinnsvis er LytX LytC (også referert til som Sp91).

Videre er et PspA eller PsaA, eller trunkater som mangler cholinbindingsdomenet (C), eventuelt uttrykt som et fusjonsprotein med LytX beskrevet. Fortrinnsvis er LytX LytC.

Pht- (Poly Histidine Triad) familien omfatter proteiner PhtA, PhtB, PhtD og PhtE. Familien er kjennetegnet ved en lipidasjonssekvens, to domener adskilt av en prolinrik region og flere histidin-triader, muligens involvert i metall- eller nukleosidbinding eller enzymatisk aktivitet, (3-5)-kveilede kveile-regioner, en konservert N-terminus og en heterogen C-terminus. Den er til stede i alle stammer av pneumokokker som er testet. Homologe proteiner er også blitt funnet i andre Streptococci og Neisseria. Foretrukne medlemmer av familien omfatter PhtA, PhtB og PhtD. Mer foretrukket omfatter den PhtA eller PhtD. Det skal imidlertid forstås at betegnelsene Pht A, B, D og E refererer til proteiner som har sekvenser beskrevet i publikasjonene nedenfor, så vel som naturlig forekommende (og menneskelagde) varianter derav som har en sekvenshomologi som er minst 90% identisk med de refererte proteinene. Fortrinnsvis er den minst 95% identisk, og mest foretrukket er den minst 97% identisk.

De immunogene preparatene beskrevet kan innlemme fusjonsproteiner av histidin-triad-proteiner. Foretrukne fusjonsproteiner inneholder i) PhtD eller et fragment derav bundet til PhtE eller et fragment derav, eller ii) PhtB eller et fragment derav bundet til PhtE eller et fragment derav.

Med hensyn til PhtX-proteiner, er PhtA beskrevet i WO 98/18930, og er også referert til Sp36. Som angitt ovenfor, er det et protein fra polyhistidin-triad-familien, og har type ll-signalmotivet til LXXC.

PhtD er beskrevet i WO 00/37105, og er også referert til Sp036D. Som angitt ovenfor, er det også et protein fra polyhistidin-triad-familien, og har type II LXXC-signalmotivet. PhtB er beskrevet i WO 00/37105, og er også referert til Sp036B. Et annen medlem av PhtB-familien er C3-Degrading Polypeptidet, som beskrevet i WO 00/17370. Dette proteinet er også fra polyhistidin-triad-familien, og har type II LXXC-signalmotivet. En foretrukket, immunologisk, funksjonell ekvivalent er proteinet SP42 beskrevet i WO 98/18930. Et PhtB-trunkat (tilnærmet 79 kD) er beskrevet i WO 99/15675, som også betraktes som et medlem av PhtX-familien.

PhtE er beskrevet i WO 00/30299, og er referert til som BVH-3.

For å frembringe et immunogent preparat som er i stand til å utløse en immunrespons mot mer enn ett patogen involvert i otitis media, er det fordelaktig for immunogene preparater å ytterligere omfatte et antigen fra én eller flere (2, 3, 4, 5, 6) av S. pneumoniae, ikke-typbar ("non-typable") Haemophilus influenzae " Moraxella catarrhalis, RSV, parainfluensa-virus og/eller influensavirus. Kombinasjonsvaksiner som gir beskyttelse mot en rekke forskjellige patogener kan dannes. Mange pediatriske vaksiner gis nå som en kombinasjonsvaksine, for å redusere antall injeksjoner som et barn må få. Således kan, for pediatriske vaksiner, andre antigener fra andre patogener bli formulert med vaksinene. For eksempel kan vaksinene bli formulert med (eller administrert separat, men samtidig) den velkjente "treverdige" kombinasjonsvaksinen som omfatter Diphtheria toxoid (DT), tetanus-toxoid (TT), og pertussis-bestanddeler [typisk detoksifisert Pertussis-toxoid (PT) og filamentært hemagglutinin (FHA) med valgfritt pertactin (PRN) og/eller agglutinin 1+2], for eksempel den markedsførte vaksinen INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals) som inneholder DT-, TT-, PT-, FHA- og PRN-antigener, eller med en helcelle-pertussis-bestanddel, for eksempel som markedsført av SmithKlineBeecham Biologicals s.a., som Tritanrix™. Den kombinerte vaksinen kan også inneholde et annet antigen, så som Hepatitt B-overflate-antigen (HBsAg), Poliovirus-antigener (for eksempel inaktivert, treverdig poliovirus- I PV), ytre Moraxella catarrhalis-membranproteiner, ikke-typbar Haemophilus influenzae-<p>roiemer, ytre N. meningitidis B-membranproteiner.

Eksempler på foretrukne Moraxella cafarr/)a//s-protein-antigener som kan innbefattes i en kombinasjonsvaksine (spesielt for å forhindre otitis media) er: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA &/eller LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA &/ellerTbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1 og/eller UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); Iip06 (GB 9917977.2); Iipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplAI (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); og OmpE. Eksempler på ikke-typ-bare Haemophilus influenzae- antigener som kan innbefattes i en kombinasjonsvaksine (spesielt for å forebygge otitis media) innbefatter: Fimbrin-protein [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] og fusjoner som omfatter peptider derfra [for eksempel LB1(f)-peptidfusjoner; US 5843464 (OSU) eller WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA og/eller TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); protein D (EP 594610); P2; og P5 (WO 94/26304).

Andre kombinasjoner som er omfattet er cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med virus-antigener, for eksempel fra influensa (svekket, splittet, eller delenhet [for eksempel overflate-glykoproteiner-neuraminidase (NA) og hemagglutinin (HA). Se for eksempel Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15:121-127]; RSV (for eksempel F- og G-antigener eller F/G-fusjoner, se for eksempel Schmidt A. C. et al, J Virol, mai 2001, s. 4594-4603), parainfluensa-virus 3 (PIV3) (for eksempel HN- og F-proteiner, se Schmidt et al. ovenfor), Varicella (for eksempel svekket, glykoproteiner I-V, etc.) og en hvilken som helst (eller alle) bestanddel(er) av MMR (meslinger, kusma, røde hunder).

Vaksiner.

En vaksine kan dannes som omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin eller et pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkaridkonjugat, oppnådd ved prosessen ifølge oppfinnelsen, og en farmasøytisk akseptabel eksipient og eventuelt et adjuvans.

Vaksinen kan omfatte de immunogene preparatene beskrevet ovenfor, og en farmasøytisk akseptabel eksipient.

Vaksinene er i stand til å frembringe en beskyttende immunrespons mot S. pneumoniae-\ nfeks\ on og/eller otitis media.

Det er mulig å behandle eller forhindre en bakterieinfeksjon, fortrinnsvis en Streptococcus pneumoniae-\ n1eks\ on eller otitis media, som omfatter å administrere vaksinen eller det immunogene preparatet heri.

Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin og/eller pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkarid-konjugat, kan anvendes ved fremstillingen av en vaksine for å behandle eller forhindre en bakterieinfeksjon, fortrinnsvis en Strepcococcus pneumoniae-infeksjon eller otitis media.

Vaksinene blir fortrinnsvis tilsatt adjuvans. Egnede adjuvanser innbefatter et aluminiumsalt, så som aluminiumhydroksydgel (alum) eller aluminiumfosfat, men kan også være et salt av kalsium, magnesium, jern eller sink, eller kan være en uløselig suspensjon av acylert tyrosin, eller acylerte sukkertyper, kationisk eller anionisk derivatiserte polysakkarider, eller polyfosfazener.

Det er foretrukket at adjuvanset er valgt slik at det blir en prefensiell befordrer av en TH1-type-respons. Slike høye nivåer av Th1-type-cytokiner har en tendens til å favorisere befordringen av celle-medierte immunresponser på et gitt antigen, mens høye nivåer av Th2-type-cytokiner har en tendens til å favorisere befordringen av humorale immunresponser på antigenet.

Det er viktig å huske at skillet mellom Th1- og Th2-type-immunrespons ikke er absolutt. I realiteten vil et individ støtte en immunrespons som er beskrevet å være overveiende Th1- eller overveiende Th2. Imidlertid er det ofte bekvemt å betrakte familiene av cytokiner uttrykt slik som beskrevet i musedyr-CD4 + ve T-cellekloner av Mosmann og Coffman (Mosmann, T.R. og Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, s. 145-173). Tradisjonelt blir Th1-type-responser forbundet med produksjonen av INF-y- og IL-2-cytokiner av T-lymfocytter. Andre cytokiner som ofte blir direkte forbundet med befordringen av Th1-type-immunresponser er ikke produsert av T-celler, så som IL-12. I motsetning til dette blir Th2-type-responser forbundet med sekresjon av II-4, IL-5, IL-6, IL-10. Egnede adjuvanssystemer som fremmer en overveiende Th1-response innbefatter: Monofosforyl-lipid A, eller et derivat derav, spesielt 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL) (for fremstilling av det, se GB 2220211 A); og en kombinasjon av monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A, sammen med enten et aluminiumsalt (for eksempel aluminiumfosfat eller aluminiumhydroksyd), eller en olje-i-vann-emulsjon. I slike kombinasjoner finnes antigen og 3D-MPL i de samme partikkelformige strukturene, noe som tillater mer effektiv levering av antigene og immunstimulerende signaler. Studier har vist at 3D-MPL er i stand til ytterligere å øke immunogenisiteten til et alum-adsorbert antigen [Thoelen et al. Vaccine

(1998) 16:708-14; EP 689454-B1].

Et forbedret system innebærer kombinasjonen av et monofosforyl-lipid A og et saponin-derivat, spesielt kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL, som beskrevet i WO 94/00153, eller et mindre reaktogent preparat hvor QS21 blir behandlet med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739.

En spesielt kraftig adjuvansformulering som involverer QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje-i-vann-emulsjon, er beskrevet i WO 95/17210, og er en foretrukket formulering.

Fortrinnsvis omfatter vaksinen i tillegg et saponin, mer foretrukket QS21. Formuleringen kan også omfatte en olje-i-vann-emulsjon og tokoferol (WO 95/17210).

Det er også mulig å produsere en vaksineformulering som omfatter å blande et cytolysin med en farmasøytisk akseptabel eksipient, så som 3D-MPL.

Umetylert CpG-holdige oligonukleotider (WO 96/02555) er også preferensielle befordrere av en TH 1-respons, og er egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse.

Det er mulig å forhindre eller lindre pneumoni hos et eldre menneske (over 55 år gammel), ved å administrere en trygg og effektiv mengde av vaksinen, og eventuelt et Th 1-adjuvans, til nevnte eldre pasient.

Det er videre mulig å forhindre eller lindre otitis media hos spedbarn (opptil 24 måneder) eller småbarn (typisk 24 måneder til 5 år), som omfatter å administrere en trygg og effektiv mengde av en vaksine som omfatter et cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin heri, eventuelt med ett eller flere av de ytterligere antigenene beskrevet ovenfor, og eventuelt et Th1-adjuvans, til nevnte spedbarn eller småbarn.

Vaksinepreparatene kan anvendes til å beskytte eller behandle et pattedyr (fortrinnsvis en menneske-pasient) som er mottagelig for infeksjon, ved hjelp av å administrere nevnte vaksine på systemisk måte eller via mukosa. Disse administreringene kan innbefatte injeksjon på intramuskulær, intraperitoneal, intradermal eller subkutan måte; eller via mukosa-administrering til munn/fordøyelses-, respirasjons-, genitourin-kanalene. Intranasal administrering av vaksiner for behandling av pneumoni eller otitis media er foretrukket (siden pneumokokker i nasofaryngeal-rommet kan bli mer effektivt forhindret, og således svekke infeksjonen i sin tidligste fase). Selv om vaksinen kan administreres som én enkelt dose, kan bestanddeler derav også administreres samtidig på samme tid, eller til forskjellig tid (for eksempel hvis polysakkarider er til stede i en vaksine, kan disse administreres separat på samme tid eller 1-2 uker etter administrering av bakterieprotein-kombinasjonen for optimal koordinering av immunresponsene med hensyn til hverandre). I tillegg til en administrering på én enkelt måte, kan 2 forskjellige måter for administrering anvendes. For eksempel kan virus-antigener administreres ID (intradermalt), mens bakterieproteiner kan administreres IM (intramuskulært) eller IN (intranasalt). Hvis polysakkarider er til stede, kan de administreres IM (eller ID), og bakterieproteiner kan administreres IN (eller ID). I tillegg kan vaksinene ifølge oppfinnelsen administreres IM for igangssettingsdoser og IN for forsterkningsdoser.

Mengden av konjugat-antigen i hver vaksinedose blir valgt som en mengde som bevirker et immunbeskyttende respons uten betydelige, ugunstige bivirkninger i typiske vaksiner. En slik mengde vil variere, avhengig av hvilket spesifikt immunogen som anvendes og hvordan det presenteres. Inneholdet av protein-antigener i vaksinen vil typisk være i området 1-100ug, fortrinnsvis 5-50ug, mest typisk i området 5-25ug. Hvis polysakkarider er innbefattet, vil det generelt forventes at hver dose vil omfatte 0,1-100ug polysakkarid, fortrinnsvis 0,1-50 jig, mer foretrukket 0,1-10ug, av hvilke 1 til 5ug er det mest foretrukne området.

Optimale mengder av bestanddeler for en spesiell vaksine kan konstateres ved standard studier som innebærer observasjon av passende immunresponser hos individer. Etter en innledende vaksinasjon kan individer få én eller flere forsterknings-immuniseringer med passende mellomrom. Typisk vil en vaksine omfatte antigen (proteiner), et adjuvans, og eksipienter eller en farmasøytisk akseptabel bærer.

Vaksinefremstilling er generelt beskrevet i Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (redaktører Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Innkapsling i liposomer er beskrevet av Fullerton, US-patent nr. 4.235.877.

Selv om vaksinene kan administreres på en hvilken som helst måte, utgjør administrering av de beskrevne vaksinene i huden (ID) en viktig form. Menneskehud omfatter et ytre, "hornaktig" hornlag, kalt stratum corneum, som ligger over epidermis. Under dette epidermis er et lag kalt dermis, som i sin tur ligger over det subkutane vevet. Forskere har vist at injeksjon av en vaksine i huden, og særlig dermis, stimulerer en immunrespons som også kan forbindes med mange ytterligere fordeler. Intradermal vaksinering med vaksinene beskrevet her er beskrevet.

Den konvensjonelle teknikken for intradermal injeksjon, "mantoux-prose-dyren", omfatter trinn med å rengjøre huden og deretter strekke den ut med én hånd, og med skråkanten på en smal-dimensjonert nål (26-31 gauge) rettet oppover blir nålen satt inn i en vinkel på mellom 10 og 15°. Så snart skråkanten på nålen er satt inn, blir beholderen på nålen senket og ytterligere skjøvet fremover, mens det utøves et lett trykk for å heve den under huden. Væsken blir deretter injisert meget sakte, og danner dermed en blære eller hevelse på hudoverflaten, fulgt av sakte uttrekking av nålen.

Mer nylig er det blitt beskrevet anordninger som er spesifikt utformet til å administrere flytende midler inn i eller gjennom huden, for eksempel anordningene beskrevet i WO 99/34850 og EP 1092444, også blekkinjeksjons-anordningene beskrevet for eksempel i WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520.639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 og WO 97/13537. Alternative fremgangsmåter for intradermal administrering av vaksinepreparater kan innbefatte konvensjonelle sprøyter og nåler, eller anordninger utformet for ballistisk levering av faste vaksiner (WO 99/27961), eller transdermale plastere (WO 97/48440; WO 98/28037); eller påført på overflaten av huden (transdermal eller transkutan levering WO 98/20734; WO 98/28037).

Når vaksinene skal administreres til huden, eller mer spesifikt inn i dermis, er vaksinen i et lite væskevolum, spesielt et volum på mellom omtrent 0,05 ml og 0,2 ml.

Innholdet av antigener i huden eller intradermale vaksiner kan være lik konvensjonelle doser, slik de er å finne i intramuskulære vaksiner. Følgelige kan protein-antigenene som er til stede i de intradermale vaksinene være i området 1-100 jig, fortrinnsvis 5-50ug. Likeledes, hvis til stede, er mengden av polysakkarid-konjugat-antigen i hver vaksinedose generelt forventet å omfatte 0,1-100ug polysakkarid, fortrinnsvis 0,1-50ug, fortrinnsvis 0,1-10ug, og kan være mellom 1 og 5ug. Imidlertid er det et trekk ved hud- eller intradermale vaksiner at formuleringene kan være "lav-dose". Følgelige er protein-antigenene i "lav-dose"-vaksinene fortrinnsvis til stede i så lite som 0,1 til 10ug, fortrinnsvis 0,1 til 5ug pr. dose; og, hvis til stede, kan polysakkaridkonjugat-antigenene være til stede i området 0,01-1ug, og fortrinnsvis mellom 0,01 og 0,5ug polysakkarid pr. dose.

Slik det benyttes her, betyr uttrykket "intradermal levering" levering av vaksinen til området av dermis i huden. Imidlertid vil vaksinen ikke nødvendigvis være lokalisert utelukkende i dermis. Dermis er det laget i huden som er lokalisert mellom omtrent 1,0 og omtrent 2,0 mm fra overflaten av menneskehud, men det er en viss mengde variasjon mellom individer, og i forskjellige deler av kroppen. Generelt kan det forventes å nå dermis ved å gå 1,5 mm under hudoverflaten. Dermis er lokalisert mellom stratum corneum og epidermis på overflaten og subkutanlaget under. Avhengig av leveringsmåten, kan vaksinen til slutt være lokalisert kun eller primært inne i dermis, eller den kan til slutt være fordelt innen epidermis og dermis.

De immunogene preparatene og vaksinene heri kan vurderes i forskjellige dyremodeller eller med humant serum. Som en illustrasjon kan følgende dyremodeller anvendes til å vurdere en pneumokokk-infeksjon. C3H/HeJ-mus (6 til 8 uker gamle) kan bli immunisert s.c. med 15ug protein med tilsatt adjuvans 50 ul CFA, 3-4 uker senere fulgt av forsterkning med 15ug protein med IFA. For å demonstrere passiv og aktiv beskyttelse mot systemisk infeksjon, kan mus få administrert intraperitonealt immunsera eller proteiner før utfordring med intraperitoneal injeksjon med 15 til 90 LD50-pneumokokker i uke 8-10. I tillegg kan proteiner testes i en muse-nasofaryngs-koloniseringsmodell av (Wu et al Microbial Pathogenesis 1997; 23:127-137).

I tillegg til mus er rotteunger mottagelig for kolonisering og infeksjon med S. pneumoniae. I passive beskyttelsesstudier kan administrering av muse-immunsera (100 ul i.p. eller 10 ul i.n.) gjøres før utfordring med intranasal administrering av S. pneumonia (10 ul) i 2-5 dager gamle rotteunger. Kolonisering kan bestemmes ved å plate neseutvaskinger (20-40 ul dryppet inn, 10 ul tatt ut).

Fordelaktige interaksjoner mellom protein- (eller protein og polysakkarid) bestanddelene i kombinasjonsvaksinen kan vises ved å administrere en dose av hvert protein (eller protein og polysakkarid) i vaksinen som ville være sub-beskyttende i en énverdig vaksine. Økt beskyttelseseffekt av kombinasjonsvaksinen, sammenlignet med énverdige vaksiner, kan tilskrives en fordelaktig interaksjon mellom bestanddelene.

Oppfinnelsen er illustrert i de medfølgende eksempler. Eksemplene er utført ved anvendelse av standard teknikker, som er velkjente og rutinemessige for dem med kunnskap på fagområdet, unntatt der hvor noe annet er beskrevet i detalj. Eksemplene er ment å illustrere oppfinnelsen.

Eksempler.

Eksempel 1. Rensing av pneumolysin.

Etetr 18 timers induksjon av £. co//-kulturen ved å øke temperaturen til 39,5°C, ble E. coli pelletert ved sentrifugering ved 17.000 g i 1 time. Pelleten ble gjenoppslemmet i 25 mM dietanolamin, pH 9,0, og £. coli ble mekanisk brutt opp ved anvendelse av en passering ved 500 PSI i et Rannie-apparat. 1% natriumlaurolysarcosinat (SLS) ble tilsatt til det oppbrutte £ coli og blandingen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur før sentrifugering ved 30.000 g i 20 minutter, slik at cellulært avfall ble pelletert. Supernatanten ble fortynnet 2,5 ganger for å ende opp i 20 mM fosfat, pH 7,0, inneholdende 1M NaCI og 1% SLS, og ble deretter påsatt en fenyl-sepharose HP-kolonne likevektsinnstilt i samme buffer (20 mM fosfat, pH 7,0, inneholdende 1M NaCI og 1% SLS =

likevektsinnstillingsbuffer). Kolonnen ble vasket med 4 kolonnevolumer av

likevektsinnstillingsbuffer, fulgt av 2 kolonnevolumer av 20 mM fosfatbuffer, pH 7,0, inneholdende 0,5M NaCI og 1% SLS. Pneumolysin ble eluertfra kolonnen ved å påføre en lav saltbuffer inneholdende 20 mM fosfatbuffer, pH 7,0, inneholdende 1% SLS. Fraksjoner inneholdende pneumolysin ble identifisert ved anvendelse av SDS-PAGE-analyse, ble slått sammen, og bufferen ble byttet ut med 25 mM dietanolamin, pH 9,0, ved anvendelse av diafiltrering.

Pneumolysinet ble solubilisert ved denaturering ved å tilsette fast guanidinhydroklorid opp til 6M endelig konsentrasjon og inkubering i én time. Det ble deretter diafiltrert mot 8M urinstoff i 25 mM dietanolamin, pH 9,0, inneholdende 1 mM DTT. Pneumolysin ble tilbakefoldet ved diafiltrering mot 20 mM boratbuffer, pH 9,0, inneholdende 1mM DTT. Etter renaturering ble DTT fjernet ved diafiltrering mot 20 mM boratbuffer, pH 9,0.

Renheten av pneumolysin oppnådd ble analysert ved kjøring på et SDS-PAGE og farging med Coomassie-brilliantblå. En separat gel ble analysert ved hjelp av Western blotting ved anvendelse av et antistoff mot E. coli for å påvise nivået av £. co//'-proteiner som er igjen i det rensede pneumolysin-preparatet. Den biologiske aktiviteten til det rensede pneumolysinet ble anslått ved anvendelse av en in vitro-hemolyse-analyse.

Resultater.

Som vist på figur 1, var fremgangsmåten ovenfor i stand til å gi en meget effektiv rensing av pneumolysin etter ett enkelt kromatografitrinn. Coomassie-blå-farget gel i panel A viser at eluering av kolonnen med en lav saltbuffer som ikke inneholder noe tilsatt natriumklorid var i stand til å eluere et 53 kDa-bånd tilsvarende pneumolysin fra kolonnen i en meget renset form. Det mye svakere båndet på tilnærmet 45 kDa antas også å være pneumolysin, siden dette andre båndet binder seg til anti-pneumolysin-antistoffer (resultater ikke vist), og binder seg heller ikke til anti-E. co//'-antistoffene, som vist i panel B. Western blot av panel B er en meget følsom metode for å påvise eventuelle forurensende proteiner som er igjen i det rensede pneumolysinet. Denne fremgangsmåten var i stand til å påvise meget få forurensende stoffer, og de som var til stede var på et lavt nivå som var under påvisningsnivået for Coomassie-farging. Pneumolysinet er derfor renset til et nivå på 98-100% renhet.

Utbyttet fra rensemetoden er også godt med en typisk kjøring som gir rundt 1900 mg pneumolysin pr. liter fermentering. Tilnærmet 10% av proteinet fra fermenteringskulturen ble gjenvunnet som renset pneumolysin.

Aktiviteten til pneumolysinet i en hemolyse-analyse ble anslått etter at pneumolysinet var blitt behandlet med guanidiniumhydroklorid /urinstoff og var blitt tilbakefoldet ved fjerning av denatureringsmidlet. Hemolytisk aktivitet ble påvist i fortynninger av det rensede pneumolysinet ned til konsentrasjoner på 1,3 ng/ml, noe som viser at hemolytisk aktivitet var blitt gjenetablert. Dette tilsvarer mellom 500.000 og 1.000.000 hemolytiske enheter pr. mg villtype-pneumolysin.

Eksempel 2 - Detoksifisering av S. pnetymon/ ae- pneumolysin ved anvendelse av GMBS.

Renset pneumolysin ble detoksifisert ved modifisering av sulfhydryl- og primære amingrupper ved anvendelse av NHS-ester-maleimid-kryssbindingsreagenset GMBS (N-(y-maleimidobutyryloksy)suksinimidester). Pneumolysin i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml ble dialysert mot 50 mM fosfatbuffer, pH 7,0. GMBS ble innledningsvis oppløst i DMSO og ble tilsatt til pneumolysin i et 248 ganger molart overskudd av GMBS. Behandlingen fortsatte i én time ved romtemperatur. Overskudd av GMBS og biprodukter ble fjernet ved dialyse mot 100 mM natriumfosfat, pH 6,8. Ytterligere maleimidgrupper ble behandlet ved omsetning med 0,6 mg/ml cystein i to timer ved romtemperatur. For å fjerne overskudd av cystein, ble prøven dialysert mot 2 mM natriumfosfat, pH 7,15.

Eksempel 3 - Karakterisering av detoksifisert pneumolysin.

Hemolytisk aktivitet.

Et hemolyse-assay ble anvendt til å anslå den gjenværende toksisiteten til detoksifisert pneumolysin. Serielle 2-gangers fortynninger av pneumolysin ble inkubert med røde blodceller fra sau. Etter sentrifugering ble supernatanten overført til immunoplater og frigjort hemoglobin ble målt ved anvendelse av optisk densitets-avlesning ved 405 nm. Resultatene ble uttrykt som ng/ml pneumolysin tilsvarende midtpunktet på OD-grafen. Assayet ble gjentatt etter inkubering av det detoksifiserte pneumolysinet ved 37°C i 7 dager, for å overvåke reverserbarheten av detoksifiseringen.

Som vist i tabell 1, var behandling med GMBS i stand til i det vesentlige å redusere den hemolytiske aktiviteten til PLY, idet en opptil 3.000 gangers reduksjon av hemolytisk aktivitet ble oppnådd. Høyere molforhold mellom GMBS og lysin var i stand til å gi bedre fjerning av hemolytisk aktivitet, idet forhold på 4:1 og 5:1 var optimale i dette forsøket. Denne behandlingen ble anslått å resultere i modifisering på 14 lysinrester. Der færre lysinrester ble modifisert, var reduksjonen av hemolytisk aktivitet mindre.

ELISA.

Antigenisiteten til det detoksifiserte pneumolysinet ble anslått med ELISA. ELISA-platene ble belagt med et marsvin-anti-pneumolysin-antistoff. Prøver inneholdende fortynninger av pneumolysin ble inkubert i platene i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble det bundne pneumolysinet påvist ved anvendelse av polyklonale kanin-antistoffer mot pneumolysin, konjugert til pepperrot-peroksydase. Etter vasking av platene ble en substratreaksjon anvendt til å anslå mengden av pneumolysin bundet til hver brønn.

Som vist i tabell 1, førte behandling med GMBS til noe tap av antigenisitet, som anslått med ELISA. Imidlertid kunne det oppnås ELISA-avlesninger på tilnærmet 66% av den gitt ved ubehandlet PLY, noe som viser at mange antistoffer fremdeles kunne gjenkjenne det modifiserte pneumolysinet.

SDS- PAGE- analvse.

De detoksifiserte pneumolysin-proteinene ble kjørt på et SDS-PAGE (Novex 4-20% polyakrylamidgel-lnvitrogen) og Coomassie-brilliantblå ble anvendt til å visualisere proteinene. Som vist på figur 2, førte behandling med GMBS til en lett økning av molekylvekten til PLY fra 53 kDA til tilnærmet 56 kDa. Denne økningen skyldes modifiseringen av multiple aminosyre-rester med GMBS. En liten prosentandel av PLY blir omdannet til multimere former, slik det kan sees ved tilsynekomsten av svake bånd med molekylvekt på tilnærmet 110 kDa og 170 kDa, men mesteparten av PLY forblir i en i det vesentlige monomer form. Inkubering av PLY ved 37°C i 7 dager resulterte ikke i noen vesentlig endring i tilsynekomsten av PLY på et SDS-PAGE, noe som viser at det modifiserte PLY ikke utsettes for

nedbrytning eller påfølgende kovalent-bundet multimer-dannelse.

Forsøk ble realisert på 1 mg PLY (1 mg/ml) med unntak av det siste assayet, hvor 3 mg ble behandlet (PLY i 0,68 mg/ml).

Eksempel 4: Reaktogenisitets- vurdering av detoksifisert pneumolysin i rotter.

Grupper på tre OFA-rotter ble immunisert én gang ved intramuskulær (tibia) inokulering med saltoppløsning, tilsatt adjuvans QS21 (US 5.057.540), pneumolysing, adjuvans-tilsatt pneumolysin, formaldehyd-detoksifisert pneumolysin, adjuvans-tilsatt formaldehyd-detoksifisert pneumolysin, GMBS-detoksifisert pneumolysin, adjuvans-tilsatt GMBS-detoksifisert pneumolysin, NHS-acetat-detoksifisert pneumolysin eller adjuvans-tilsatt NHS-acetat-detoksifisert pneumolysin. Tre dager etter immunisering ble alle rottene drept og tibia ble preparert for histologisk undersøkelse. Tibia ble fiksert i formalin og skåret opp i 2 mm skiver som ble dehydratisert og paraffin-innleiret. 7 um-deler ble skåret til og farget ved anvendelse av Trichrome Masson-metoden, før de ble undersøkt mikroskopisk.

Reaktogenisitet ble vurdert ved anvendelse av fire kriterier; nedbrytning/- nekrose, endomysial inflammasjon, blødning og aponeurose-inflammasjon. For hvert histologiske kriterium ble et poeng tildelt hver muskel i hver gruppe, og et gjennomsnittlig lesjonspoeng ble deretter beregnet for hver gruppe. Et poeng på 0 = normal, 1 = minimal, 2 = lett, 3 = moderat, 4 = markert og 5 = kraftig.

Resultater.

Histologien til delene ble undersøkt. De gjennomsnittlige poengene for degenerasjon/nekrose, endomysial inflammasjon, blødning og aponeurose-inflammasjon er vist i tabell 2.

En sammenligning av histologiske poeng for ikke adjuvans-tilsatt nativt og detoksifisert pneumolysin viser at GMBS er et særlig effektivt kryssbindingsreagens å anvende for detoksifisering av pneumolysin, noe som gir en stor reduksjon av nedbrytning/nekrose, endomysial inflammasjon, blødning og aponeurose-inflammasjon.

Tilsetningen av adjuvans (50 ug aluminiumfosfat og 5 ug MPL) til inokulasjonene øker mengden reaktogenisitet som en bivirkning ved stimulering av immunsystemet. Detoksifisering av pneumolysin med GMBS tillot nivået av nedbrytning/nekrose å bli redusert til det produsert av adjuvanset alene, som var lavere enn nivået produsert ved inokulering med nativt pneumolysin. GMBS-detoksifisert pneumolysin ga et lavere blødningsnivå enn det produsert av nativt pneumolysin. Nivåer av endomysial inflammasjon ble forhøyet av adjuvanset, og dette nivået var fremdeles til stede i nærvær av adjuvans-tilsatt nativt eller GMBS-detoksifisert pneumolysin. Aponeurose-inflammasjon ble imidlertid redusert fra nivået produsert av adjuvans alene, med nativt eller GMBS-detoksifisert pneumolysin, idet nivået av aponeurose er noe lavere der hvor pneumolysinet var blitt behandlet med GMBS.

Eksempel 5 - Evaluering av toksisitet av GMBS- behandlet pneumolysin i mus.

Grupper på 20 OF1-mus ble utfordret intranasalt med enten nativt pneumolysin eller GMBS-behandlet pneumolysin, og musene ble overvåket i de følgende 9 dagene.

Som vist på figur 3 førte utfordring med 2 ug nativt pneumolysin meget raskt til død av alle musene i den gruppen. Pneumolysinet ga lesjoner i hele respirasjonssystemet, noe som førte til respirasjonsproblemer og død. I motsetning til dette hadde det GMBS-behandlede pneumolysinet vesentlig redusert toksisitet, der alle musene inokulert med 2 ug, 5 ug eller 10 ug av det GMBS-behandlede pneumolysinet overlevde utfordringen.

Eksempel 6 - beskyttelsesstudier ved anvendelse av detoksifisert pneumolysin.

Grupper på 20 OF1-mus ble immunisert 3 ganger intramuskulært, på dag 0, 14 og 24 med 5 ug pneumolysin og 50 ug aluminiumfosfat og 5 ug MPL som adjuvans. Kontrollmus ble immunisert med adjuvans alene. Pneumolysinet var enten ubehandlet eller detoksifisert ved anvendelse av GMBS-behandlingen beskrevet ovenfor.

På dag 42 ble musene gitt en intranasal, dødelig utfordring med 2 ug nativt pneumolysin. Overlevelsen av musene i løpet av de følgende 9 dagene ble overvåket.

Resultater.

Den dødelige utfordringsmodellen førte til 90% dødelighet hos kontrollmus (figur 4). Immunisering med GMBS-detoksifisert pneumolysin ga meget god beskyttelse, der kun 5% av musene dør i løpet av de følgende 9 dagene. Dette var sammenlignbart med beskyttelse gitt etter inokulering med nativt pneumolysin, hvoretter 10% av musene døde.

Eksempel 7 - Vurdering av detoksifisert pneumolysin i kombinasjon med PhtD i en dødelig utfordringsmodell for mus.

Grupper på 20 OF1-mus ble immunisert intramuskulært med a) adjuvans alene, eller b) 1 ug PhtD og adjuvans, eller c) 1 ug PhtD og 5 ug GMBS-detoksifisert pneumolysin og adjuvans. Adjuvanset anvendt var sammensatt av 50 ug aluminiumfosfat og 5 ug MPL og immuniseringene fant sted på dag 0 og dag 14. Musene ble utfordret med en intranasal, dødelig dose på 5,10<5>CFU av serotype 2 S. pneumoniae stamme D39, og overlevelse ble overvåket i løpet av de neste 10 dagene.

Resultater.

Som vist på figur 5 førte utfordring med stamme D39 til 75% dødelighet etter 10 dager hos kontrollmus. Immunisering med PhtD alene ga ikke signifikant beskyttelse, idet 70% av musene i denne gruppen dør etter 10 dager (p = 0,29). Immunisering med PhtD sammen med GMBS-detoksifisert pneumolysin ga signifikant bedre beskyttelse, der dødeligheten ble redusert til 50% (p = 0,04).

Eksempel 8 - Detoksifisering av pneimolysin ved anvendelse av formaldehyd.

Et forråd av renset pneumolysin i en konsentrasjon på tilnærmet 0,4 mg/ml ble i 25 mM kaliumfosfat-buffer, pH 7,0 wa, behandlet med 50 mM L-lysin og 0,1% formaldehyd (vekt/volum) i 21 dager ved 40°C.

Claims (41)

1. Prosess for rensing av et bakterielt cytolysin,karakterisert vedat den omfatter trinnene: a) å dyrke en cellekultur som uttrykker bakterielt cytolysin; b) å fremstille et ekstrakt fra kulturen som inneholder bakterielt cytolysin; c) å binde løselig aggregert bakterielt cytolysin som finnes i ekstraktet i nærvær av et vaskemiddel til et hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale under betingelser med høyt saltinnhold på 0,6-2 M salt; d) å eluere bakterielt cytolysin i nærvær av et vaskemiddel under betingelser med lavt saltinnhold på 0-0,2 M salt.

2. Prosess ifølge krav 1, som videre omfatter trinnene: e) å fjerne vaskemiddel fra det bakterielle cytolysinet; f) å solubilisere det bakterielle cytolysinet ved å tilsette et denatureringsmiddel; g) å fjerne denatureringsmidlet fra det bakterielle cytolysinet.

3. Prosess ifølge krav 1 eller 2, hvor det bakterielle cytolysinet er pneumokokk-pneumolysin.

4. Prosess ifølge krav 1-3, hvor trinn b) innebærer å bryte opp cellene mekanisk.

5. Prosess ifølge krav 1-4, hvor trinn b) innebærer å behandle med et vaskemiddel.

6. Prosess ifølge krav 1-5, hvor det samme vaskemidlet er til stede i trinn c) og d).

7. Prosess ifølge krav 5, hvor det samme vaskemidlet er til stede i trinn b), c) og d).

8. Prosess ifølge krav 1-7, hvor vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på mellom 0,1 og 5% (vekt/volum).

9. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor trinn b) innebærer å sentrifugere oppbrutt cellemateriale og oppsamle en supernatant som ekstrakten fra trinn c).

10. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det hydrofobe interaksjons-kromatografimaterialet anvendt i trinn c) inneholder aromatiske grupper.

11. Prosess ifølge krav 10, hvor det hydrofobe kromatografimaterialet er fenyl-sepharose.

12. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor vaskemidlet som er til stede i løsningen anvendt i trinn c) og/eller trinn d) er et alifatisk vaskemiddel.

13. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor vaskemidlet er natriumlaurolysarcosinat.

14. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor betingelsene med høyt saltinnhold i trinn c) inneholder 1M salt.

15. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor løsningen anvendt i trinn c) og/eller d) inneholder et salt valgt fra gruppen som består av natriumklorid, magnesiumklorid, ammoniumklorid, natriumsulfat, magnesiumsulfat, ammoniumsulfat, natriumfosfat, magnesiumfosfat, ammoniumfosfat.

16. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor betingelsene anvendt i trinn c) og/eller trinn d) er mellom pH 6 og 8, fortrinnsvis rundt pH 7.

17. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor betingelsene anvendt i trinn d) inneholder 0-0,1M salt.

18. Prosess ifølge krav 17, hvor betingelsene anvendt i trinn d) inneholder 0-40 mM salt.

19. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor trinn e) innebærer å fjerne vaskemidlet ved diafiltrering eller dialyse.

20. Prosess ifølge krav 19, hvor diafiltreringen/dialysen er mot en lav saltbuffer inneholdende 0-0,2M salt og med en pH på pH 8-10, fortrinnsvis pH 9.

21. Prosess ifølge krav 2-20, hvor trinn f) innebærer å denaturere det bakterielle cytolysinet ved å tilsette et denatureringsmiddel og trinn g) innebærer å tilbakefolde det bakterielle cytolysinet ved gradvis å fjerne denatureringsmidlet.

22. Prosess ifølge krav 2-21, hvor denatureringsmidlet anvendt i trinn f) er guanidinhydroklorid.

23. Prosess ifølge krav 22, hvor 5-8M guanidinhydroklorid anvendes.

24. Prosess ifølge krav 22-23, hvor det bakterielle cytolysinet blir bragt i kontakt med 5-9M urinstoff i trinn f).

25. Prosess ifølge krav 24, hvor trinn f) innebærer å bringe bakterielt cytolysin i kontakt med 5-8M guanidinhydroklorid, fulgt av å utveksle guanidinhydrokloridet med 5-9M urinstoff.

26. Prosess ifølge krav 21 -25, hvor et reduksjonsmiddel er til stede under minst en del av trinnene f) og g).

27. Prosess ifølge krav 26, hvor reduksjonsmidlet er 0,1-10 mM DTT, fortrinnsvis 1 mM DTT.

28. Prosess ifølge krav 2-27, hvor trinn g) innebærer å fjerne denatureringsmidlet ved diafiltrering eller dialyse.

29. Prosess ifølge krav 28, hvor diafiltrering eller dialyse er mot en løsning med pH 7-9.

30. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, som omfatter et ytterligere trinn med å detoksifisere det bakterielle cytolysinet ved hjelp av kjemisk behandling med et kryssbindingsmiddel.

31. Prosess ifølge krav 30, hvor kryssbindingsmidlet inneholder ett eller flere kjemikalier valgt fra gruppen som består av: formaldehyd, glutaraldehyd, N-hydroksysuksin-omidoestere og GMBS.

32. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, som omfatter et ytterligere trinn med å konjugere det bakterielle cytolysinet til et bakteriekapsel-polysakkarid.

33. Prosess ifølge krav 32, hvor bakteriekapsel polysakkaridet er avledet fra Streptococcus pneumoniae.

34. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, som omfatter et ytterligere trinn med å formulere bakterielt cytolysin til et vaksinepreparat med en farmasøytisk akseptabel eksipient.

35. Prosess ifølge krav 34, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med cholinbindende protein A eller et immunogent fragment derav.

36. Prosess ifølge krav 34 eller 35, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med ett eller flere av PhtA, PhtB, PhtD eller PhtE eller et immunogent fragment derav.

37. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-36, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra ikke-typbar Haemophilus influenzae (NtHi).

38. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-37, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra Moraxella catarrhalis.

39. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-38, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra RSV.

40. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-39, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra parainfluensavirus.

41. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-40, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra influensavirus.