PL203917B1 - Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie - Google Patents

Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie

Info

Publication number
PL203917B1
PL203917B1 PL355264A PL35526400A PL203917B1 PL 203917 B1 PL203917 B1 PL 203917B1 PL 355264 A PL355264 A PL 355264A PL 35526400 A PL35526400 A PL 35526400A PL 203917 B1 PL203917 B1 PL 203917B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
polysaccharide
mpl
vaccine
pneumococcal
Prior art date
Application number
PL355264A
Other languages
English (en)
Other versions
PL355264A1 (pl
Inventor
Carine Capiau
Marguerite Deschamps
Pierre Michel Desmons
Craig Antony Joseph Laferriere
Jan Poolman
Jean-Paul Prieels
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9906437.0A external-priority patent/GB9906437D0/en
Priority claimed from GBGB9909077.1A external-priority patent/GB9909077D0/en
Priority claimed from GBGB9909466.6A external-priority patent/GB9909466D0/en
Priority claimed from GBGB9916677.9A external-priority patent/GB9916677D0/en
Application filed by Glaxosmithkline Biolog Sa filed Critical Glaxosmithkline Biolog Sa
Publication of PL355264A1 publication Critical patent/PL355264A1/pl
Publication of PL203917B1 publication Critical patent/PL203917B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie antygenów polisacharydowych oraz białkowych ze Streptococcus pneumoniae.
Streptococcus pneumoniae jest Gram-dodatnią bakterią odpowiedzialną za znaczną zachorowalność i śmiertelność (w szczególności u osób młodych i w podeszłym wieku) powodującą inwazyjne choroby, takie jak zapalenie płuc, bakteriemię i zapalenie opon mózgowych, oraz choroby związane z kolonizacją takie jak ostre zapalenie ucha ś rodkowego. Czę stość zapalenia pł uc powodowanego przez pneumokoki w USA dla osób w wieku ponad 60 lat ocenia się na 3 do 8 na 100000. W 20% przypadków prowadzi to do bakteriemii i innych objawów, takich jak zapalenie opon mózgowych, ze śmiertelnością bliską 30% nawet przy leczeniu antybiotykami.
Pneumokoki są otoczone związanym chemicznie polisacharydem, który nadaje specyficzność serotypu. Znanych jest 90 serotypów pneumokoków i otoczka jest główną determinantą wirulencji pneumokoków, jako że otoczka chroni nie tylko wewnętrzną powierzchnię bakterii przed dopełniaczem, ale sama jest słabo immunogenna. Polisacharydy są antygenami T-niezależnymi i nie mogą być przetwarzane lub prezentowane na cząsteczkach MHC, aby reagowały z komórkami T. Mogą one jednak stymulować układ odpornościowy przez alternatywny mechanizm, który obejmuje krzyżowe połączenie receptorów powierzchniowych na komórkach B.
Wykazano w kilku doświadczeniach, że ochrona przed inwazyjną chorobą pneumokokową jest najsilniej skorelowana z przeciwciałem specyficznym dla otoczki i ochrona jest specyficzna wobec serotypu.
Szczepionki oparte na polisacharydach są dobrze znane w dziedzinie. Cztery, które zostały dopuszczone do stosowania u ludzi obejmują polisacharyd Vi Salmonella typhi, polisacharyd PRP z Haemophilus influenzae, tetrawalentną szczepionkę przeciw meningokokom złożoną z serotypów A, C, W135 i Y oraz 23-walentną szczepionkę pneumokokową złożoną z polisacharydów odpowiadających serotypom 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33 (co obejmuje przynajmniej 90% izolatów pneumokoków z krwi).
Trzy ostatnie szczepionki dają ochronę przeciw bakteriom wywołującym zakażenia dróg oddechowych, powodującym poważną zachorowalność i śmiertelność u niemowląt. Jednak szczepionki te nie zostały dopuszczone do stosowania u dzieci poniżej dwóch lat, ponieważ nie są dostatecznie immunogenne w tej grupie wiekowej (Peltola i wsp. (1984) N. Engl. J. Med. 310: 1561-1566). Streptococcus pneumoniae jest najczęstszą przyczyną inwazyjnej choroby bakteryjnej i zapalenia ucha środkowego u niemowląt i małych dzieci. Podobnie, odpowiedzi odpornościowe u osób starszych na szczepionki pneumokokowe są słabe (Roughmann i wsp., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270), stąd też w populacji tej występuje zwiększona zachorowalność na bakteryjne zapalenie płuc (Verghese i Berk, (1993) Medicine (Baltimore) 62: 271-285).
Strategie, które zaprojektowano by pokonać ten brak immunogenności u niemowląt obejmują łączenie polisacharydu z dużymi immunogennymi białkami, które dostarczają pomocy obecnych komórek T i wpływają na pamięć immunologiczną w stosunku do polisacharydowego antygenu, z którym są koniugowane. Szczepionki koniugatów glikoprotein pneumokoków są obecnie oceniane pod kątem bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności w różnych grupach wiekowych.
A) Pneumokokowe szczepionki polisacharydowe
23-walentna niekoniugowana szczepionka pneumokokowa wykazała znaczną zmienność skuteczności klinicznej, od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154: 2531-2535). Skuteczność wydaje się być związana z poddawaną szczepieniu grupą ryzyka, taką jak osoby starsze, osoby z chorobą Hodgkina, po usunięciu śledziony, z anemią sierpowatą i agammaglobulinemią (Fine i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154: 2666-2677), a także z przejawami choroby. 23-walentna szczepionka nie dostarcza ochrony przed powodowanym przez pneumokoki zapaleniem płuc (w niektórych grupach wysokiego ryzyka, takich jak osoby starsze) i chorobami ucha środkowego.
Istnieje więc zapotrzebowanie na ulepszone kompozycje szczepionek przeciwko pneumokokom, szczególnie takich, które będą bardziej skuteczne w zapobieganiu lub łagodzeniu choroby pneumokokowej (w szczególności zapalenia płuc) u osób starszych i małych dzieci.
B) Wybrane kompozycje pneumokokowy koniugat polisacharydów + 3D-MPL
Ogólnie przyjmuje się, że efekt ochronny handlowo dostępnej szczepionki przeciwko pneumokokom jest mniej lub bardziej związany ze stężeniem przeciwciała indukowanym po szczepieniu; faktycznie 23 polisacharydy były zaakceptowane do stosowania wyłącznie na podstawie immunogenności
PL 203 917 B1 każdego składowego polisacharydu (red. Williams i wsp. New York Academy of Sciences 1995 str. 241-249). Tak więc dalsze zwiększenie odpowiedzi przeciwciał na polisacharydy pneumokokowe mogłoby zwiększyć procent niemowląt i osób starszych odpowiadających ochronnymi poziomami przeciwciał na pierwszy zastrzyk polisacharydu lub koniugatu polisacharydu i mogłoby zmniejszyć dawkę i ilość zastrzyków wymaganych do indukcji ochronnej oporności na choroby powodowane przez Streptococcus pneumoniae.
Od wczesnych lat dwudziestego wieku naukowcy eksperymentowali z dużą liczbą związków, które mogą być dodawane do antygenów, aby poprawić ich immunogenność w kompozycjach szczepionek (przegląd w M.F. Powell i M. J. Newman, Plenum Press NY, „Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach (1995). Rozdział 7: „A compendium of vaccine adjuvants and excipients”). Wiele z nich jest bardzo skutecznych, ale powoduje znaczące miejscowe i ogólnoustrojowe niekorzystne reakcje, które wykluczają ich stosowanie w kompozycjach szczepionek dla ludzi. Adiuwanty na bazie glinu (takie jak alum, wodorotlenek glinu lub fosforan glinu) opisane po raz pierwszy w 1926 r. pozostają jedynymi adiuwantami dopuszczonymi do stosowania w Stanach Zjednoczonych w szczepionkach ludzkich.
Adiuwanty na bazie glinu są przykładem nośnikowej klasy adiuwantów działającej tylko przez efekt typu „depot”, który indukują. Antygen jest absorbowany na jego powierzchni i gdy kompozycja jest wstrzyknięta adiuwant i antygen nie są natychmiast rozproszone w krwiobiegu - zamiast tego kompozycja pozostaje w lokalnym otoczeniu wstrzyknięcia i powstaje bardziej wyraźna odpowiedź immunologiczna. Takie nośnikowe adiuwanty mają dodatkową znaną korzyść - są odpowiednimi do stabilizacji antygenów, które są podatne na rozkład, na przykład niektórych antygenów polisacharydowych.
3D-MPL jest przykładem adiuwanta nienośnikowego. Jego pełna nazwa to 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (lub 3-De-O-acylowany monofosforylolipid A lub 3-O-dezacylo-4'-monofosforylolipid A) i jest określany jako 3D-MPL, aby wskazać, że pozycja 3 glukozoaminy na redukującym końcu jest de-O-acylowana. Jego preparatyka została opisana w GB 2220211. 3D-MPL chemicznie jest mieszaniną 3-deacylowanego monofosforylo lipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami. Został oryginalnie wytworzony we wczesnych latach 1990-tych, gdy metoda 3-O-deacylacji 4'-monofosforylo pochodnej lipidu A (MPL) doprowadziła do uzyskania cząsteczki z dodatkowo zmniejszoną toksycznością i bez zmiany aktywności immunostymulującej.
3D-MPL był stosowany jako adiuwant albo sam albo korzystnie w kombinacji z adiuwantem typu depot, takim jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu lub w emulsjach olej-w-wodzie. W takich kompozycjach antygen i 3D-MPL są zawarte w tych samych strukturach w postaci cząstek, pozwalając na bardziej skuteczne dostarczania antygenowych i immunostymulujących sygnałów. Badania wykazały, że 3D-MPL jest zdolny do dalszego zwiększenia immunogenności antygenu zaadsorbowanego na alumie (Thoelm i wsp. Vaccine (1998) 16: 708-14; EP 689454-B1). Takie kombinacje są także korzystne w dziedzinie dla antygenów podatnych na adsorpcję (na przykład, koniugatów polisacharydów bakteryjnych), przy czym adsorpcja na alumie zazwyczaj stabilizuje antygen. Strącone adiuwanty na bazie glinu są zazwyczaj stosowane jako, że są jedynymi adiuwantami, które są obecnie stosowane w dopuszczonych ludzkich szczepionkach. Tak więc szczepionki zawierające 3D-MPL w kombinacji z adiuwantami na bazie alum są preferowane w dziedzinie ze wzglę du na ł atwość ich opracowania i tempo wprowadzania na rynek.
MPL (nie 3-deacylowany) był oceniany jako adiuwant z kilkoma monowalentnymi szczepionkowymi antygenami koniugatów polisacharydowych. Wspólne wstrzyknięcie MPL w roztworze soli zwiększało odpowiedź przeciwciał surowicy dla czterech monowalentnych koniugatów polisacharydów: PS 6B pneumokoków - toksoid tężca, PS 12 pneumokoków - toksoid dyfterytu, S. aureus typ 5 i S. aureus typ 8 skoniugowane z egzotoksyną A Pseudomonas aeruginosa (Schneerson i wsp. J. Immunology (1991) 147: 2136-2140). Stwierdzono, że zwiększone odpowiedzi są specyficzne wobec antygenu. MPL w emulsji olej-w-wodzie (adiuwant typu nośnika) powtarzalnie zwiększał działanie MPL w soli fizjologicznej ze wzglę du na obecność MPL i antygenu w tej samej strukturze w postaci czą stek, i uważ ano, ż e jest to odpowiedni ukł ad adiuwantowy do optymalnego dostarczania innych szczepionek koniugatów polisacharydów.
Devi i wsp. (Infect. Immun. (1991) 59: 3700-7) oceniali wpływ adiuwanta MPL (nie 3-deacylowanego) w soli fizjologicznej na odpowiedź przeciwciał myszy na koniugat TT polisacharydu otoczki Cryptococcus neoformans. Gdy stosowano MPL równocześnie z koniugatem istniał tylko marginalny przyrost specyficznej odpowiedzi zarówno IgM i IgG wobec PS. Jednakże MPL miał znacznie większy
PL 203 917 B1 efekt, gdy był podany 2 dni po koniugacie. Wątpliwa jest praktyczność stosowania schematu szczepień, szczególnie u niemowląt, który wymaga opóźnienia w podawaniu MPL w stosunku do antygenu. Efekt adiuwantowy MPL z polisacharydami i koniugatami polisacharyd-białko wydaje się być zależny od składu. Ponownie, włączenie MPL do odpowiednich układów powolnego uwalniania (na przykład stosując adiuwant nośnikowy) dostarcza bardziej trwałego efektu adiuwantowego i obchodzi problem zgrania w czasie i opóźnionego podawania.
Podsumowując, obecny stan techniki wykazuje, że dla danego antygenu będącego polisacharydem lub koniugatem polisacharyd-białko, gdy MPL lub 3D-MPL jest stosowany jako adiuwant jest on korzystnie stosowany razem z adiuwantem nośnikowym (na przykład adiuwantami na bazie glinu), aby zmaksymalizować działanie immunostymulujące.
Zadziwiające jest, że obecni twórcy stwierdzili, że dla pewnych pneumokokowych koniugatów polisacharydu immunogenność kompozycji szczepionki jest znacząco większa gdy antygen jest formułowany z samym 3D-MPL, raczej niż z 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem nośnikowym (takim jak adiuwant na bazie glinu). Ponadto zaobserwowana poprawa jest niezależna od stosowanego stężenia 3D-MPL i od tego czy dane koniugaty są w kompozycji monowalentnej lub kombinowane z wytworzeniem kompozycji poliwalentnej.
C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D
Jak wskazano powyżej szczepionki oparte na antygenach polisacharydowych są dobrze znane w dziedzinie. Dopuszczone szczepionki polisacharydowe wymienione powyż ej maj ą róż ne wykazane skuteczności kliniczne. Szacowano, że polisacharydowa szczepionka Vi ma potwierdzoną w hodowli skuteczność między 55% i 77% w zapobieganiu durowi brzusznemu (Plotkin i Cam (1995) Arch. Intern. Med. 155: 2293-2299). Wykazano, że polisacharydowa szczepionka menongokoków C ma skuteczność 79% w warunkach epidemii (De Wals P. i wsp. (1996) Bull World Health Organ. 74: 407-411). 23-walentna szczepionka pneumokokowa wykazała szeroki zakres skuteczności klinicznej od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154: 2531-2535). Jak wskazano powyżej, przyjmuje się że ochronna skuteczność szczepionki pneumokokowej jest mniej lub bardziej zależna od stężenia przeciwciała indukowanego podczas szczepienia.
Wśród problemów związanych z wykorzystaniem polisacharydów do szczepień, jest fakt że polisacharydy jako takie są słabymi immunogenami. Strategie zaprojektowane by przezwyciężyć ten brak immunogenności obejmują podłączenie polisacharydu do dużych, wysoce immunogennych nośników białkowych, które zapewniają pomoc obecnych komórek T.
Przykłady tych wysoce immunogennych nośników, które są obecnie często stosowane do wytwarzania immunogenów polisacharydowych obejmują toksoid dyfterytu (DT lub mutant CRM197), toksoid tężca (TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD).
Problemy związane z często stosowanymi nośnikami
Z każdym z tych powszechnie stosowanych nośników związane są problemy, w tym podczas wytwarzania koniugatów GMP, a także w immunologicznych właściwościach koniugatów.
Mimo powszechnego stosowania tych nośników i ich skuteczności w indukowaniu odpowiedzi przeciwciał przeciwko polisacharydom, są one obarczone kilkoma wadami. Na przykład wiadomo, że specyficzne w stosunku do antygenu odpowiedzi odpornościowe mogą ulec supresji (supresja epitopu) przez obecność już istniejących przeciwciał skierowanych wobec nośnika, w tym przypadku toksynę tężca (Di John i wsp. (1989) Lancet 2: 1415-8). W ogólnej populacji bardzo wysoki procent ludzi będzie mieć uprzednio istniejącą odporność zarówno na DT i TT, jako że ludzie są rutynowo szczepieni tymi antygenami. W Wielkiej Brytanii na przykład 95% dzieci otrzymuje szczepionkę DTP zawierającą zarówno DT i TT. Inni autorzy opisali problem supresji epitopu na szczepionki peptydowe w modelach zwierzęcych (Sad i wsp. Immunology, 1991; 74: 223-227; Schutze i wsp. J. Immunol. 133: 4, 1985; 2319-2322).
Ponadto, dla szczepionek, które wymagają regularnych dawek przypominających stosowanie wysoko immunogennych nośników, takich jak TT i DT prawdopodobnie zniesie odpowiedź przeciwciał na polisacharydy po kilku zastrzykach. Tym wielokrotnym szczepieniom mogą także towarzyszyć niepożądane odpowiedzi, takie jak nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH).
Wiadomo, że KLH jest silnym immunogenem i był już stosowany jako nośnik dla peptydów IgE w próbach klinicznych u ludzi. Jednak pewne niekorzystne reakcje (reakcje DTH-podobne lub uczulenie na IgE), jak i odpowiedzi przeciwciał przeciwko przeciwciałom były obserwowane.
Tak więc wybór białka nośnikowego dla szczepionki opartej na polisacharydzie będzie wymagał zrównoważenia konieczności stosowania nośnika działającego u wszystkich pacjentów (szerokie
PL 203 917 B1 rozpoznawanie MHC), indukowania wysokich poziomów odpowiedzi przeciwciał przeciw polisacharydom oraz niskiej odpowiedzi przeciwciał przeciw nośnikowi.
Uprzednio stosowane nośniki do szczepionek polisacharydowych mają więc wiele wad. Jest tak szczególnie w przypadku szczepionek kombinowanych, w których supresja epitopu jest szczególnym problemem, jeśli ten sam nośnik jest stosowany do różnych antygenów polisacharydowych. W WO 98/51339 podjęto próby obejścia tego zjawiska przez stosowanie wielokrotnych nośników w szczepionkach kombinowanych.
Białko D (EP 0 594 610 B1) z Haemophilus influenzae lub jego fragmenty może być stosowane jako nośnik dla opartych na polisacharydach kompozycji immunogennych, w tym szczepionek. Stosowanie tego nośnika jest szczególnie korzystne w szczepionkach kombinowanych.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna zawierająca przynajmniej cztery antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae pochodzące od co najmniej czterech serotypów i przynajmniej dwa antygeny białkowe Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalne ekwiwalenty. Korzystnie co najmniej jeden antygen białkowy w kompozycji według wynalazku jest białkiem zewnętrznej powierzchni lub wydzielanym białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego immunologicznie funkcjonalnymi ekwiwalentami, korzystniej toksyną, adhezyną lub lipoproteiną Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalnymi ekwiwalentami, przy czym najkorzystniej co najmniej jeden antygen białkowy lub jego immunologicznie funkcjonalny ekwiwalent jest wybrany z grupy obejmującej pneumolizynę, PspA lub jego transbłonowe warianty delecyjne, PspC lub jego transbłonowe warianty delecyjne, PsaA lub jego transbłonowe warianty delecyjne, dehydrogenazę gliceroaldehydo-3-fosforanową i CbpA lub jego transbłonowe warianty delecyjne.
Również korzystnie w kompozycji według wynalazku polisacharydowe antygeny są prezentowane w postaci koniugatu polisacharyd-nośnik białkowy, przy czym korzystniej białko nośnikowe jest wybrane z grupy składającej się z: anatoksyny błonicy, anatoksyny tężca, CRM197, hemocyjaniny skałoczepu (KLH), pochodnej białkowej tuberkuliny (PPD) i białka D z H. influenzae.
Kompozycja immunogenna według wynalazku korzystnie dodatkowo zawiera adiuwant. Korzystniej adiuwantem w kompozycji według wynalazku jest sól glinu lub preferencyjny induktor odpowiedzi TH1 obejmujący przynajmniej jedno z następujących: 3D-MPL lub jego pochodną saponinowy czynnik immunostymulujący, lub immunostymulujący oligonukleotyd CpG. Korzystnie adiuwantem jest też emulsja olej w wodzie i tokoferol. Najkorzystniej adiuwant w kompozycji według wynalazku obejmuje nośnik wybrany z grupy zawierającej: emulsję olej w wodzie, liposomy i sól glinu.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna do zastosowania jako lek oraz szczepionka zawierająca kompozycję immunogenną według wynalazku.
Wynalazek dostarcza również zastosowania co najmniej czerech antygenów polisacharydowych pneumokoków pochodzących od co najmniej czterech serotypów w kombinacji z co najmniej dwoma antygenami białkowymi Streptococcus pneumoniae i ewentualnie adiuwantem indukującym TH1, który obejmuje co najmniej jeden spośród 3D-MPL lub jego pochodnej, saponinowego czynnika immunostymulującego, lub immunostymulującego oligonukleotydu CpG, do wytwarzania leku do zapobiegania zapaleniu płuc u pacjentów w wieku powyżej 55 lat.
Ponato przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji immunogennej według wynalazku obejmujący etapy:
- wybierania czterech lub wię cej polisacharydowych antygenów pneumokoków;
- wybierania dwóch lub wię cej biał kowych antygenów pneumokoków; i
- zmieszania tych antygenów polisacharydowych i biał kowych z odpowiednią zaróbką .
W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania co najmniej czerech antygenów polisacharydowych pneumokoków pochodzących od co najmniej czterech serotypów w kombinacji z co najmniej dwoma antygenami białkowymi Streptococcus pneumoniae do wytwarzania leku do zapobiegania lub łagodzenia zapalenia ucha środkowego u niemowląt lub młodszych dzieci.
A) Szczepionki polisacharydowe pneumokoków
Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji obejmującej antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae (korzystnie skoniugowane) i antygeny białkowe Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalne ekwiwalenty, ewentualnie z adiuwantem Th1 (adiuwantem indukującym odpowiedź immunologiczną Th1).
Kompozycje według wynalazku są szczególnie odpowiednie do leczenia zapalenia płuc u osób starszych.
PL 203 917 B1
Szczepionki polisacharydowe pneumokoków (skoniugowane lub nie) mogą nie być skuteczne jako ochrona przed zapaleniem płuc w populacji osób starszych, w której częstość występowania tej choroby jest bardzo wysoka. Kluczowym mechanizmem obrony przeciwko pneumokokom jest opsonofagocytoza (zdarzenie humoralne z udziałem komórki B/granulocytu obojętnochłonnego powodowane przez wytwarzanie przeciwciał przeciwko polisacharydowi pneumokoków, w którym ostatecznie bakteria ulega fagocytozie), jednak części zaangażowanych mechanizmów opsonizacji są upośledzone u osób starszych np. wytwarzanie nadtlenku przez PMN (granulocyty, ang. polymorphonuclear cells), wytwarzanie innych reaktywnych typów tlenu, mobilizacja PMN, apoptoza PMN, odkształcalność PMN. U osób starszych również odpowiedzi przeciwciał mogą być upoś ledzone.
Przeciwnie do normalnie akceptowanego dogmatu, normalne poziomy przeciwciał przeciwko polisacharydom otoczki mogą być nieskuteczne w całkowitym usuwaniu bakterii, jako że pneumokoki mogą wnikać do komórek gospodarza tym samym unikając tej gałęzi układu odpornościowego.
Twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że przez równoczesną stymulację gałęzi komórkowej układu odpornościowego (na przykład odporności opartej na komórkach T) i humoralnej gałęzi układu odpornościowego (z udziałem komórek B), powstaje synergizm (lub kooperacja), która jest zdolna do zwiększania klirensu pneumokoków z gospodarza. Ujawnienie to pomoże w ogólności w zapobieganiu (lub leczeniu) zakażeń pneumokokami, oraz będzie szczególnie ważne dla zapobiegania (lub terapii) zapalenia płuc u osób starszych, u których szczepionki oparte na polisacharydach nie wykazują skuteczności.
Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że oba ramiona układu odpornościowego mogą działać synergistycznie w ten sposób, jeśli polisacharyd pneumokoków (korzystnie skoniugowany) jest podawany z białkiem pneumokoków (korzystnie białkiem wyrażanym na powierzchni pneumokoków, lub wydzielanym lub uwalnianym, które może być przetwarzane i prezentowane w kontekście klasy II i klasy I MHC na powierzchni zakaż onych komórek ssaków). Choć biał ko pneumokoków moż e samo wywołać odporność komorkową. Twórcy stwierdzili także, że obecność adiuwanta indukującego Th1 w preparacie szczepionki wspomaga to ramię układu odpornościowego i zwiększa dalej w sposób zaskakujący synergizm pomiędzy obydwoma ramionami układu odpornościowego.
B) Wybrane kompozycje polisacharyd pneumokoków + 3D-MPL
Niniejszym opisano kompozycje antygenowe zawierające jeden lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokokowych z adiuwantem 3D-MPL i zasadniczo wolne od adiuwantów na bazie glinu, przy czym przynajmniej jeden z koniugatów polisacharydów pneumokokowych jest znacząco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w kombinacji z adiuwantem na bazie glinu.
Kompozycje antygenowe mogą zawierać koniugaty jednego lub więcej z następujących polisacharydów otoczki pneumokoków: serotyp 4, 6B, 18C, 19F i 23F. W takich kompozycjach każdy z polisacharydów jest zadziwiająco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu.
Tak więc kompozycja antygenowa zawierająca polisacharyd otoczki Streptococcus pneumoniae, serotyp 4, 6B, 18C, 19F lub 23F, skoniugowany z białkiem immunogennym i adiuwantem 3D-MPL może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu.
Kompozycja może być kombinowaną kompozycją antygenową zasadniczo pozbawioną adiuwantów na bazie glinu i zawierającą adiuwant 3D-MPL i dwa lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokokowych wybranych z grupy składającej się z serotypu 4, serotypu 6B, serotypu 18C, serotypu 19F, i serotypu 23F.
C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D
Polisacharydowy antygen może być skoniugowany z białkiem D Haemophilus influenzae lub fragmentem tego białka D. W poliwalentnych kompozycjach szczepionek jeden lub więcej z antygenów polisacharydowych może być skoniugowanych z białkiem D.
Szczegółowy opis wynalazku
A) Szczepionki z polisacharydów pneumokokowych
Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję szczególnie użyteczną do zapobiegania lub łagodzenia zakażeń pneumokokowych u osób starszych (i/lub niemowląt i małych dzieci).
W kontekście niniejszego opisu pacjent jest uważany za osobę starszą jeś li ma ponad 55 lat, zazwyczaj ponad 60 lat, a bardziej ogólnie ponad 65 lat.
PL 203 917 B1
Tak więc dostarczona niniejszym kompozycja jest odpowiednia do stosowania u osób starszych (i/lub niemowląt i małych dzieci) i zawiera antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae i antygeny białkowe Streptococcus pneumoniae.
Kompozycja według wynalazku (odpowiednia do zapobiegania zapaleniu płuc u osób starszych) oprócz antygenów polisacharydowych Streptococcus pneumoniae i antygenów białkowych Streptococcus pneumoniae zawiera adiuwant Th1.
Przewiduje się, że taka szczepionka będzie także użyteczna w leczeniu zakażeń pneumokokami (na przykład w zapaleniu ucha środkowego) w innych grupach wysokiego ryzyka w populacji, takich jak niemowlęta i małe dzieci.
Zatem kompozycja szczepionki zawierająca polisacharydowy antygen pneumokokokowy może zawierać adiuwant Th1.
Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae
Antygeny polisacharydowe (korzystnie skoniugowane) w szczepionce Streptococcus pneumoniae pochodzą z przynajmniej czterech serotypów pneumokoków. Korzystnie cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. Bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 7 serotypów, na przykład 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. Jeszcze bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 11 serotypów, na przykład te polisacharydy otoczki pochodzące z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (korzystnie skoniugowanych). W kompozycji według wynalazku może być włączonych przynajmniej 13 antygenów polisacharydowych (korzystnie skoniugowanych) choć kolejne polisacharydowe antygeny, takie jak na przykład w 23-walentnej kompozycji (takie serotypy jak 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F) są również rozważane.
Do szczepienia osób starszych (na przykład w celu zapobiegania zapaleniu płuc) jest korzystne włączenie serotypów 8 i 12F (i najbardziej korzystnie także 15 i 22) do opisanej powyżej 11 walentnej kompozycji antygenowej, podczas gdy dla niemowląt i małych dzieci (u których większy problem stanowi zapalenie ucha środkowego) korzystnie włącza się serotypy 6A i 19A, aby wytworzyć szczepionkę 13-walentną.
Aby zapobiegać/łagodzić zapalenie płuc w populacji osób starszych (ponad 55 lat) i zapalenie ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesięcy) i małych dzieci (typowo 18 miesięcy do 5 lat) należy multiwalentny polisacharyd Streptococcus pneumoniae, jak tu opisano, łączyć z białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego funkcjonalnym immunologicznie ekwiwalentem.
Białka pneumokokowe
Dla celów niniejszego opisu „immunologicznie funkcjonalny ekwiwalent” jest określony jako peptyd lub białko zawierające przynajmniej jeden ochronny epitop z białek pneumokokowych. Takie epitopy są typowo eksponowane na powierzchni, wysoce konserwatywne i mogą wywołać bakteriobójczą odpowiedź przeciwciał u gospodarza lub zapobiegać efektom toksycznym. Korzystnie ekwiwalent funkcjonalny ma przynajmniej 15, a korzystnie 30 lub więcej kolejnych aminokwasów z białka pneumokokowego. Bardziej korzystnie fragmenty, delecje białka, takie jak jego transbłonowe warianty delecyjne (tj. stosowanie zewnątrzkomórkowej domeny białek), fuzje, chemicznie lub genetycznie detoksyfikowane pochodne, i tym podobne, mogą być stosowane pod warunkiem, że są zdolne do wywołania zasadniczo takiej samej odpowiedzi immunologicznej jak natywne białko.
Korzystnymi białkami są te białka pneumokoków, które są eksponowane na zewnętrznej powierzchni pneumokoka (zdolne do bycia rozpoznawanymi przez układ odpornościowy gospodarza przez przynajmniej część cyklu życiowego pneumokoka) lub te, które są wydzielane lub uwalniane przez pneumokoki. Najbardziej korzystnie białko jest toksyną, adhezyną, 2-składnikowym przekaźnikiem sygnału lub lipoproteiną Streptococcus pneumoniae, lub jego immunologicznie funkcjonalnym ekwiwalentem.
Szczególnie korzystne białka do włączenia w takiej szczepionce kombinowanej obejmują nieograniczająco pneumolizynę (korzystnie detoksyfikowaną za pomocą działania chemicznego lub mutagenezy) (Mitchell i wsp. Nucleic Acids Res. 1900 Jul 11; 18(13): 4010 „Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2”. Mitchell i wsp. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 „Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties” WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton i wsp.), WO 99/03884 (NAVA)); PspA i jego transbłonowe warianty delecyjne (US 5804193 - Briles i wsp.); PspC i jego transbł onowe warianty delecyjne (WO 97/09994 - Briles i wsp.); PsaA i jego transbł onowe warianty delecyjne (Berry i Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12): 5255-62 „Sequence heterogeneity of
PL 203 917 B1
PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence in Streptococcus pneumoniae”); pneumokokowe białka wiążące cholinę i ich transbłonowe wiarianty delecyjne; CbpA i jego transmembranowe warianty delecyjne (WO 97/41151; WO 99/51226); dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa (Infect. Immun. 1996 64: 3533); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato i wsp. FEMS Mirobiol Lett 1998, 164: 207-14); białko podobne do M, zgłoszenie patentowe SB nr EP 0837130 i adhezyna 18627, zgł oszenie patentowe SB nr EP 0834568.
Białka stosowane w rozwiązaniach według wynalazku są korzystnie wybrane z grupy obejmującej pneumolizynę, PsaA, PspA, PspC, CbpA lub kombinację dwóch lub więcej takich białek. Niniejszy wynalazek także obejmuje immunologicznie funkcjonalne ekwiwalenty takich białek (jak zdefiniowano powyżej).
W kompozycji białko może pomagać w indukowaniu odpowiedzi zachodzącej za pośrednictwem komórek T przeciwko chorobie pneumokokowej - szczególnie potrzebnej do ochrony przed zapaleniem płuc - która współpracuje z ramieniem humoralnym układu odpornościowego, aby zahamować inwazję pneumokoków i stymulować opsonofagocytozę.
Kolejną korzyścią włączenia antygenu białkowego jest prezentacja dodatkowych antygenów w procesie opsonofagocytozy i zahamowanie adhezji bakteryjnej (jeś li stosowana jest adhezyna) lub zobojętnienie toksyny (o ile stosowana jest toksyna).
Tak więc, w wykonaniu wynalazku dostarczona jest szczepionka Streptococcus pneumoniae zawierająca skoniugowaną szczepionkę polisacharydów pneumokokowych zawierającą antygeny polisacharydowe pochodzące od przynajmniej czterech serotypów, korzystnie przynajmniej siedmiu serotypów, bardziej korzystnie przynajmniej jedenastu serotypów, i przynajmniej dwóch białek Streptococcus pneumoniae. Korzystnie jedno z białek jest pneumolizyną lub PsaA lub PspA lub CbpA (najbardziej korzystnie detoksyfikowaną pneumolizyną). Korzystna kombinacja zawiera przynajmniej pneumolizynę lub jej pochodną i PspA.
Jak wskazano powyżej, problemem związanym z zastosowaniem polisacharydów do szczepień jest to, że polisacharydy jako takie są słabymi immunogenami. Aby to przezwyciężyć, polisacharydy mogą być koniugowane do nośników białkowych, co dostarcza pomocy od otaczających komórek T. Jest więc korzystne by polisacharydy stosowane w rozwiązaniach według wynalazku były połączone z takim nośnikiem białkowym. Przykłady takich nośników, które są obecnie powszechnie stosowane do wytwarzania immunogenów polisacharydowych obejmują toksoidy (anatoksyny) dyfterytu i tężca (odpowiednio DT, DT CRM197 i TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH), OMPC z N. meningitidis i oczyszczoną pochodną białkową tuberkuliny (PPD).
Jednak z każdym z tych powszechnie stosowanych nośników są związane problemy (patrz „Problemy związane z często stosowanymi nośnikami” powyżej).
Niniejszym przedstawiono nośnik do stosowania w konstruktach immunogenów opartych na polisacharydach, który nie ma takich wad. Korzystnym nośnikiem do immunogennych kompozycji (lub szczepionek) na bazie polisacharydów jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 594610-B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują fragmenty obejmujące epitopy pomocniczych komórek T. W szczególności fragment białka D będzie korzystnie zawierał N-końcową 1/3 białka.
Dalszym korzystnym nośnikiem polisacharydów pneumokoków jest samo białko pneumokokokowe (jak określono powyżej w części pt. „Białka pneumokokowe”).
Szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie zawierają adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinu, taką jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, ale mogą też być solą wapnia, żelaza lub cynku, lub nierozpuszczalną zawiesiną acylowanej tyrozyny, lub acylowanych cukrów, kationowymi lub anionowymi pochodnymi polisacharydów, lub polifosfazenami.
Korzystnie adiuwant jest wybrany tak, aby był preferencyjnym induktorem odpowiedzi typu TH1 i wspomagał komórkową odpowiedź odpornościową.
Adiuwanty TH1
Wysokie poziomy cytokin typu TH1 sprzyjają zazwyczaj indukcji komórkowych odpowiedzi odpornościowych na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 zazwyczaj sprzyjają indukcji humoralnych odpowiedzi odpornościowych na antygen.
Należy pamiętać, że różnica między odpowiedzią odpornościową typu Th1 i Th2 nie jest bezwzględna. W rzeczywistości u danej osoby wystąpi odpowiedź odpornościowa, którą można opisać jako przede wszystkim Th1 lub przede wszystkim Th2. Jednak jest często wygodnie rozważać rodziny cytokin na zasadach opisanych dla mysich klonów komórek T CD4 +ve przez Mosmanna i Coffmana (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion
PL 203 917 B1 lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowiedzi typu Th1 są związane z wytwarzaniem INFy i cytokin IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi odpornościowej typu Th1 nie są wytwarzane przez komórki T, takie jak IL-12. Przeciwnie, odpowiedzi typu Th2 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Odpowiednie układy adiuwantowe, które sprzyjają przede wszystkim odpowiedzi Th1 obejmują monofosforylolipid A lub jego pochodną, szczególnie 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A, i kombinację monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL), razem z solą glinu.
Wzmocniony układ obejmuje kombinację monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, szczególnie kombinację QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w WO 94/00153, lub kompozycję o zmniejszonej reaktywności, w której QS21 jest wygaszony cholesterolem jak ujawniono w WO 96/33739.
Szczególnie silny preparat adiuwanta obejmujący QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej-w-wodzie opisano w WO 95/17210 i stanowi on korzystny preparat.
Korzystnie szczepionka dodatkowo zawiera saponinę, korzystniej QS21. Preparat może też zawierać emulsję olej-w-wodzie i tokoferol (WO 95/17210).
Niniejszy wynalazek także dostarcza sposobu wytwarzania komozycji immunogennej według wynalazku obejmującego zmieszanie antygenów białkowych i polisacharydowych razem z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, taką jak 3D-MPL.
Oligonukleotydy zawierające niemetylowany CpG (WO 96/02555) są także korzystnymi induktorami odpowiedzi TH1 i są odpowiednie do stosowania w rozwiązaniach według wynalazku.
Szczególnie korzystne kompozycje według wynalazku obejmują skoniugowane polisacharydy pneumokoków, białka pneumokoków i adiuwant Th1. Indukcja odpowiedzi komórkowej za pomocą biała pneumokoków (jak opisano powyżej) i współpraca pomiędzy obydwoma ramionami układu odpornościowego może być wspomagana przez dodanie adiuwanta Th-1, w wyniku czego otrzymywana jest szczególnie skuteczna szczepionka przeciwko chorobom pneumokokowym, a co jest ważne przeciwko pneumokokowemu zapaleniu płuc u osób starszych.
W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczona jest kompozycja immunogenna do zastosowania w medycynie.
Dostarczona kompozycja zawierająca koniugat polisacharydu pneumokoków i adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL) jest zdolna do serokonwersji lub indukcji odpowiedzi humoralnej przeciwciał przeciwko antygenowi polisacharydowemu w populacji osobników nie-odpowiadających.
Wiadomo, że 10-30% populacji nie reaguje na immunizację polisacharydami (nie odpowiada na ponad 50% serotypów w szczepionce) (Konradsen i wsp., Scand. J. Immun 40: 251 (1994); Rodriguez i wsp., JID, 173: 1347 (1996)). Może też być tak w przypadku szczepionek koniugowanych (Musher i wsp. Clin. Inf. Dis. 27: 1487 (1998)). Może być to szczególnie poważne w obszarach wysokiego zagrożenia populacji (niemowlęta, małe dzieci i osoby starsze).
Twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że kombinacja koniugowanego polisacharydu pneumokokowego (na które część populacji może mieć niską odpowiedź) z adiuwantem Th1 (patrz „Adiuwanty Th1” powyżej) może zadziwiająco obejść ten brak odpowiedzi. Korzystnie powinien być stosowany 3D-MPL, a najbardziej korzystnie 3D-MPL pozbawiony adiuwanta na bazie glinu (co daje jeszcze lepszą odpowiedź). Zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie osób niereagujących na polisacharydy pneumokokokowe i dostarczają zastosowania adiuwanta Th1 do wytwarzania leku zawierającego skoniugowane antygeny polisacharydowe pneumokoków do leczenia (lub zapobiegania) choroby pneumokokowej u osób, które nie reagują na antygen polisacharydowy.
Możliwe jest zapobieganie lub łagodzenie zapalenia płuc u osób starszych przez podanie starszemu pacjentowi bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki, jak tu opisano, zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae oraz antygen białkowy Streptococcus pneumoniae i ewentualnie adiuwant Th1.
Możliwe jest również zapobieganie lub łagodzenie zapalenia ucha środkowego u niemowląt lub małych dzieci przez podanie temu niemowlęciu lub małemu dziecku bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki, jak tu opisano, zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae oraz antygen białkowy Streptococcus pneumoniae i ewenutalnie adiuwant Th1.
Korzystnie w rozwiązaniach według wynalazku antygen polisacharydowy jest obecny jako koniugat polisacharyd-białko.
PL 203 917 B1
Preparaty szczepionek
Preparaty szczepionek mogą być stosowane do ochrony lub leczenia ssaka podatnego na zakażenie przez podanie szczepionki drogą ogólnoustrojową lub przez śluzówkę. Podawanie może obejmować iniekcje drogą domięśniową dootrzewnową śródskórną lub podskórną oraz podawanie śluzówkowe do ust lub dróg pokarmowych, oddechowych i moczowo-płciowych. Donosowe podanie szczepionek do leczenia zapalenia płuc lub zapalenia ucha środkowego jest korzystne (jako że można bardziej skutecznie zapobiec nosicielstwu pneumokoków w nosogardzieli, w ten sposób osłabiając zakażenie w jego najwcześniejszym stadium).
Ilość skoniugowanego antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybrana jako ilość, która indukuje odpowiedź immunoochronną bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych w typowych szczepionkach. Taka ilość będzie zależała od tego który specyficzny immunogen jest stosowany i jak jest on prezentowany. Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 0,1 - 100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1 - 50 μg, korzystniej 0,1 - 10 μg, z czego 1 do 5 μg stanowi najbardziej korzystny zakres.
Zawartość antygenów białkowych w szczepionce będzie typowo w zakresie 1 - 100 μg, korzystnie 5 - 50 μg, najbardziej typowo w zakresie 5 - 25 μg.
Optymalne ilości składników dla danej szczepionki można ustalić przez standardowe badania obejmujące obserwację odpowiednich odpowiedzi immunologicznych u osobników. Po wstępnym szczepieniu, osobniki mogą otrzymywać jedną lub więcej odpowiednio rozmieszczonych szczepień przypominających.
Przygotowanie szczepionki jest ogólnie opisane w Vaccine Design („The subunit and adjuvant approach” (red. Powell M.F. i Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nowy Jork). Enkapsulacja w liposomach jest opisana przez Fullerton, Patent US 4,235,877.
B) Wybrane kompozycje polisacharyd pneumokoków + 3D-MPL
Dla celów niniejszego opisu określenie „koniugaty polisacharydów pneumokoków” oznacza te koniugaty polisacharydów otoczki Streptococcus pneumoniae, które są bardziej immunogenne w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu (na przykład koniugaty serotypu 4; serotypu 6B; serotypu 18C; serotypu 19F; lub serotypu 23F).
Dla celów niniejszego opisu określenie „zasadniczo wolny od adiuwantów na bazie glinu” oznacza kompozycję, która nie zawiera dostatecznej ilości adiuwanta na bazie glinu (na przykład wodorotlenku glinu i w szczególności fosforanu glinu), aby spowodować jakiekolwiek zmniejszenie immunogenności koniugatu polisacharydu pneumokoków w porównaniu z ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL bez dodanego adiuwanta na bazie glinu. Korzystnie kompozycja antygenowa powinna zawierać adiuwant, który składa się zasadniczo z 3D-MPL. Ilość adiuwanta na bazie glinu dodawana na dawkę powinna korzystnie wynosić mniej niż 50 μg, bardziej korzystnie mniej niż 30 μg, jeszcze bardziej korzystnie mniej niż 10 μg, a najbardziej korzystnie adiuwant na bazie glinu nie jest dodawany do antygenowych kompozycji.
Dla celów niniejszego opisu można określić czy koniugat polisacharydu pneumokokokowego jest znacząco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu sposobem przedstawionym w Przykładzie 2. Jako wskazanie czy kompozycja jest znacząco bardziej immunogenna gdy zawiera sam 3D-MPL stosunek stężenia GMC IgG (określony jak w Przykładzie 2) między kompozycją zawierającą sam 3D-MPL a ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem - fosforanem glinu - powinien być większy niż 2, korzystnie większy niż 5, bardziej korzystnie większy niż 7, jeszcze bardziej korzystnie większy niż 9 i jeszcze bardziej korzystnie większy niż 14.
Fakt, że polisacharydy jako takie są słabo immunogenne stanowi jeden z problemów związanych z zastosowaniem polisacharydów do szczepienia. Strategie zaprojektowane by przezwyciężyć ten brak immunogenności obejmują przyłączenie (koniugowanie) polisacharydu do dużych nośników białkowych, które zapewniają pomoc ze strony obecnych komórek T. Jest korzystne by pneumokokowe polisacharydy były podłączone do nośnika białkowego, który zapewnia pomoc komórek T. Przykłady takich nośników, które mogą być stosowane obejmują toksoid dyfterytu, mutanta dyfterytu i tężca (odpowiednio DT, CRM197 i TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD) i OMPC Neisseria meningitidis.
Najbardziej korzystnie stosowane jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610-B) lub jego fragmenty (patrz część C) jako immunogenne białko nośnikowe dla polisacharydów pneumokoków.
PL 203 917 B1
Kompozycja antygenowa może zawierać polisacharyd pneumokoków serotyp (PS) 4 skoniugowany z białkiem immunogennym i formułowany z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. Kompozycja antygenowa może obejmować PS 6B, 18C, 19F lub 23F, odpowiednio, skoniugowane z białkiem immunogennym i formułowane z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu.
Możliwe jest także dostarczenie kombinowanej kompozycji antygenowej zawierającej dwa lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokoków z grupy PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F, formułowanych z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu.
Na immunogenność koniugatów pneumokokowych polisacharydów nie wpływa znacząco ich dostarczenie wraz z innymi koniugatami polisacharydów pneumokokokowych (Przykład 3). Tak więc można dostarczyć kombinowaną kompozycję antygenową zawierającą jeden lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokoków w kombinacji z jednym lub więcej dodatkowymi koniugatami polisacharydów pneumokoków, przy czym kompozycja może być formułowana z adiuwantem 3D-MPL, a jednocześnie zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu.
Kombinowane kompozycje antygenowe mogą zawierać przynajmniej jeden a korzystnie 2, 3, 4 lub wszystkie 5 z koniugatów polisacharydów pneumokokowych z grupy PS 4, 6B, 18C, 19F lub 23F, a w dodatku dowolną kombinację innych koniugatów polisacharydów pneumokokokowych, formuł owanych z adiuwantem 3D-MPL, ale zasadniczo pozbawionych adiuwantów na bazie glinu.
Typowo kombinowana kompozycja antygenowa Streptococcus pneumoniae będzie zawierała koniugowane antygeny polisacharydowe, przy czym polisacharydy będą pochodziły z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub dwudziestu trzech serotypów (patrz „Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae”, gdzie przedstawiono preferowane kombinacje serotypów w zależności od choroby, która ma być leczona).
Kompozycje antygenowe są korzystnie stosowane w kompozycjach szczepionek do zapobiegania (lub leczenia) zakażenia pneumokokami, szczególnie u osób starszych oraz niemowląt i małych dzieci.
Możliwe jest zastosowanie powyższych kompozycji antygenowych w medycynie. Sposób indukcji odpowiedzi odpornościowej na koniugat polisacharydów otoczki Streptococcus pneumoniae obejmuje etapy podania bezpiecznej i skutecznej ilości jednej z powyższych kompozycji antygenowych pacjentowi i zastosowanie jednej z powyższych kompozycji antygenowych do wytwarzania leku do zapobiegania (lub leczenia) choroby powodowanej przez pneumokoki.
Aby zapobiegać/łagodzić zapalenie płuc w populacji osób starszych (ponad 55 lat) zapalenie ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesięcy) i małych dzieci (typowo 18 miesięcy do 5 lat) multiwalentne koniugaty polisacharydu Streptococcus pneumoniae należy formułować jak tu opisano z białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego funkcjonalnym immunologicznie ekwiwalentem. Korzystne białka/kombinacje białek zostały opisane w „Białka pneumokokowe” powyżej.
Korzystnie kompozycje antygenowe (i szczepionki) opisane tu uprzednio są liofilizowane aż do momentu kiedy będą stosowane, kiedy to są one rekonstytuowane rozcieńczalnikiem. Bardziej korzystnie są one liofilizowane w obecności 3D-MPL i są rekonstytuowane roztworem soli fizjologicznej.
Liofilizacja kompozycji daje w efekcie bardziej stabilną kompozycję (na przykład zapobiega rozpadowi antygenów polisacharydowych). Proces jest też zadziwiająco odpowiedzialny za wyższe miano przeciwciał przeciw polisacharydom pneumokoków. Wykazano, że ma to szczególne znaczenie dla koniugatów PS 6B. Zatem korzystne jest stosowanie liofilizowanej kompozycji antygenowej zawierającej koniugat PS 6B z adiuwantem 3D-MPL i zasadniczo wolnej od adiuwantów na bazie glinu.
Przygotowanie szczepionek zostało opisane w „Preparaty szczepionek” powyżej.
C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D
Tendencja do stosowania szczepionek kombinowanych ma kilka zalet: zmniejsza diskomfort biorcy, ułatwia schemat szczepień i zapewnia ukończenie cyklu szczepień; ale istnieje równoczesne ryzyko zmniejszenia skuteczności szczepionki (patrz omówienie problemu supresji epitopu przez nadużycie białek nośnikowych powyżej). Byłoby więc korzystne przygotowanie kombinacji szczepionek, które spełniają potrzeby populacji, a jednocześnie nie wykazują interferencji immunogennej między składnikami. Te korzyści mogą być uzyskane przez kompozycje immunogenne (lub szczepionki) według wynalazku, które szczególnie korzystnie mogą być podawane grupom wysokiego ryzyka, takim jak niemowlęta, małe dzieci lub osoby starsze.
Białko D z Haemophilus influenzae, lub jego fragmenty, może być stosowany jako nośnik w kompozycjach immunogennych opartych na polisacharydach, w tym również w szczepionkach.
PL 203 917 B1
Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują fragmenty zawierające epitopy komórek pomocniczych T. W szczególności fragmenty białka D będą korzystnie zawierały N-końcową 1/3 białka.
Białko D jest białkiem wiążącym IgD z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1) i jest potencjalnym immunogenem.
Polisacharydy, które mogą być skoniugowane z białkiem D obejmują nieograniczająco antygen polisacharydowy Vi przeciwko Salmonella typhi, polisacharydy meningokoków (w tym typ A, C, W 135 i Y, oraz polisacharyd i modyfikowane polisacharydy meningokoków grupy B), polisacharydy ze Staphylococcus aureus, polisacharydy ze Streptococcus agalactae, polisacharydy z Mycobacterium np. Mycobacterium tuberculosis (takie jak mannofosfoinizytydy trehalozy, kwas mykolinowy, arabinomannany zakończone mannozą, ich otoczka i arabinogalaktany), polisacharyd z Cryptococcus neoformans, lipopolisacharydy nietypowalnego Haemophilus influenzae, polisacharyd otoczki z Haemophilus influenzae b, lipopolisacharydy Moraxella catharralis, lipopolisacharydy Shigella sonnei, lipopeptydofosfoglikan (LPPG) Trypanosoma cruzi, gangliozydy związane z rakiem GD3, GD2, mucyny związane z nowotworami, szczególnie antygen T-F i antygen sialilowy T-F, i polisacharyd zwią zany z HIV, który jest związany strukturalnie z antygenem T-F.
Polisacharyd może być połączony z białkiem nośnikowym za pomocą dowolnego znanego sposobu (na przykład Likhite, Patent US 4,372,945 i Armor i wsp., Patent US 4,474,757). Korzystnie przeprowadza się koniugację CDAP (WO 95/08348).
W CDAP odczynnik do cyjanylowania tetrafluoroboran 1-cjano-dimetyloamonopirydyny (CDAP) jest korzystnie stosowany do syntezy koniugatów polisacharyd-białko. Reakcja cyjanylowania może być przeprowadzona we względnie łagodnych warunkach, co umożliwia uniknięcie hydrolizy polisacharydów wrażliwych na zasady. Ta synteza pozwala na bezpośrednie połączenie z białkiem nośnikowym.
Polisacharyd jest solubilizowany w wodzie lub roztworze soli fizjologicznej. CDAP rozpuszcza się w acetonitrylu i dodaje natychmiast do roztworu polisacharydu. CDAP reaguje z grupami hydroksylowymi polisacharydu tworząc ester cyjanianowy. Po etapie aktywacji dodaje się białko nośnikowe. Grupy aminowe lizyny reagują z aktywowanym polisacharydem z wytworzeniem kowalencyjnego wiązania izomocznikowego.
Po reakcji sprzęgania dodaje się duży nadmiar glicyny by wygasić resztkowe aktywowane ugrupowania. Produkt następnie poddaje się sączeniu w żelu, aby usunąć nieprzereagowane białko nośnikowe i resztkowe odczynniki. Tak więc sposób wytwarzania koniugatów polisacharyd - białko D obejmuje etap aktywacji polisacharydu i połączenia polisacharydu z białkiem D.
Rozwiązania według wynalazku dostarczają kompozycji immunogennej (lub szczepionki) do zapobiegania zakażeniom Streptococcus pneumoniae.
Mechanizmy za pomocą których pneumokoki rozprzestrzeniają się do płuca, płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi są słabo poznane. Wzrost bakterii w prawidłowych pęcherzykach płucnych jest hamowany przez ich stosunkową suchość i aktywność fagocytową makrofagów pęcherzykowych. Każde zmiany anatomiczne lub fizjologiczne tych koordynowanych mechanizmów obronnych zwiększają podatności płuc na zakażenie. Ściana komórkowa Streptococcus pneumoniae odgrywa ważną rolę w generowaniu odpowiedzi zapalnej w pęcherzykach płuca (Gillespie i wsp. (1997), I&I 65: 3936).
Typowo szczepionka Streptococcus pneumoniae według wynalazku będzie zawierała koniugaty polisacharydowe białka D, przy czym polisacharydy pochodzą z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub 23 serotypów. Kombinacje serotypów w zależności od choroby, która ma być leczona opisano w „Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae” powyżej.
Możliwe jest również dostarczenie szczepionki Neisseria meningitidis, w szczególności z serotypów A, B, C W-135 i Y. Neiserria meningitidis jest jednym z najważniejszych źródeł bakteryjnego zapalenia opon mózgowych. Otoczka węglowodanowa tych organizmów może działać jako determinanta wirulencji i cel dla przeciwciała ochronnego. Niemniej jednak wiadomo, że węglowodany są słabymi immunogenami u małych dzieci. Szczególnie odpowiednim nośnikiem białkowym dla tych polisacharydów jest białko D dostarczające epitopów komórek T, które mogą aktywować odpowiedź komórek T, aby wspomóc proliferację i dojrzewanie komórek B specyficznych wobec antygenu polisacharydowego, oraz indukcję pamięci immunologicznej.
Możliwe jest również otrzymanie koniugatu polisacharyd otoczki Haemophilus influenzae b (PRP) - białko D.
Możliwe jest również otrzymanie szczepionek kombinowanych, które dostarczają ochronę przed szeregiem różnych patogenów. Będące nośnikiem białko D jest zadziwiająco użyteczne jako nośnik w szczepionkach kombinowanych, w których są koniugowane wielokrotne antygeny polisacharydowe.
PL 203 917 B1
Jak wskazano powyżej, prawdopodobne jest wystąpienie supresji epitopu, jeśli dla każdego polisacharydu jest stosowany ten sam nośnik. W WO 98/51339 przedstawiono kompozycje, w których taką interferencję próbowano zminimalizować przez koniugację części polisacharydów w kompozycji z DT, a reszty z TT.
Twórcy obecnego wynalazku stwierdzili, że białko D jest szczególnie odpowiednie do minimalizacji zjawiska supresji epitopów w szczepionkach kombinowanych. Jeden lub więcej polisacharydów w kombinacji moż e być korzystnie skoniugowanych z biał kiem D, a korzystnie w obrę bie takich szczepionek kombinowanych wszystkie antygeny mogą być skoniugowane z białkiem D.
Szczepionka, która nadaje ochronę przed zakażeniem Neisseria meningitidis C i Y (i korzystnie A) może zawierać antygen polisacharydowy z jednego lub więcej z serotypów Y i C (i najbardziej korzystnie A) połączony z białkiem D.
Szczepionka oparta na polisacharydzie Haemophilus influenzae (PRP skoniugowany korzystnie z TT, DT lub CRM197, lub najbardziej korzystnie z biał kiem D) moż e być formułowana z powyż szymi szczepionkami kombinowanymi.
Wiele szczepionek pediatrycznych jest obecnie podawanych w postaci szczepionek kombinowanych, tak aby zmniejszyć liczbę zastrzyków, które dziecko musi otrzymać. Zatem dla celów pediatrycznych inne antygeny mogą być formułowane ze szczepionkami według wynalazku. Na przykład szczepionki według wynalazku mogą być formułowane razem z lub podawane oddzielnie, ale w tym samym czasie co znana „triwalentna” szczepionka kombinowana zawierającą toksoid dyfterytu (DT), toksoid tężca (TT) i składniki krztuśca (typowo detoksyfikowany toksoid krztuśca (PT) i filamentalna hemaglutynina (FHA) ewentualnie z pertaktyną (PRN) i/lub aglutyniną 1+2), na przykład dostępna na rynku szczepionka INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals), która zawiera antygeny DT, TT, PT, FHA i PRN, lub sprzedawana przez SmithKlineBeecham Biologicals s.a. jako Tritanrix™ szczepionkia zawierająca całe komórki krztuśca. Kombinowana szczepionka może też zawierać inne antygeny, takie jak antygen powierzchniowy wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBsAg), antygeny wirusa polio (na przykład inaktywowany triwalentny wirus polio - IPV), białka błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białka nietypowalnego Haemophilus influenzae, białka zewnętrznej błony N. meningitidis B.
Przykłady korzystnych antygenów białkowych Moraxella catarrhalis w szczepionce kombinowanej (szczególnie do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) to: OMP106 [WO 97/41731(Amtex) i WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA i LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA i TbpB [WO 97/13785 i WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME i wsp. (1993) Infect Immun, 61: 2003-2010]; UspA1/2 [WO 93/03761 (University of Texas); i OmpCD. Przykłady antygenów nietypowalnego Haemophilus influenzae, które mogą być włączone do szczepionki kombinowanej (szczególnie do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) obejmują: białko fimbryny [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] i fuzje zawierające takie białka [np. fuzje peptydowe LB1(f); US 5843464(OSU) lub WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA i TbpB; Hia; Hmw1,2; Hap i D15.
Korzystne szczepionki pediatryczne mogą zawierać:
a) koniugat polisacharydu N. meningitidis C i koniugat polisacharydu Haemophilus influenzae b, ewentualnie z koniugatem polisacharydu N. meningitidis A i/lub Y, pod warunkiem, że przynajmniej jeden antygen polisacharydowy, a korzystnie wszystkie są skoniugowane z białkiem D.
b) Szczepionka a) z DT, TT, składnikami krztuśca (korzystnie PT, FHA i PRN), antygenem powierzchniowym wirusowego zapalenia wątroby typu B i IPV (inaktywowana triwalentna szczepionka wirusa polio).
c) Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae skoniugowane z białkiem D.
d) Szczepionka c) z jednym lub więcej antygenów Moraxella catarrhalis i/lub nietypowalnego
Haemophilus influenzae.
Wszystkie powyższe szczepionki kombinowane mogą skorzystać na włączeniu białka D jako nośnika. Jest jasne, że im więcej nośników bierze udział w kombinowanej szczepionce (na przykład by zapobiec supresji epitopu), tym droższa i bardziej złożona będzie ostateczna szczepionka. Posiadanie wszystkich lub większości antygenów polisacharydowych koniugowanych z białkiem D daje więc znaczną przewagę.
W celu zapobiegania zapaleniu płuc w populacji osób starszych (ponad 55 lat) i zapaleniu ucha środkowego u niemowląt i małych dzieci korzystne jest tworzenie kombinacji multiwalentnego polisacharydu Streptococcus pneumoniae-bialko D z białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego funkcjonalnym
PL 203 917 B1 immunologicznie ekwiwalentem. Korzystne białka/kombinacje białek, które mogą być włączone do takiej szczepionki opisano w „Białka pneumokokowe” powyżej.
Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza immunogenną kompozycję zawierającą koniugat polisacharydu Streptococcus pneumoniae - białko D i antygen białkowy Streptococcus pneumoniae.
Antygeny koniugat polisacharyd-białko D szczepionki są korzystnie wspomagane przez adiuwant w preparacie szczepionki według wynalazku. Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinu, taką jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, ale mogą też być solą wapnia, żelaza lub cynku, lub mogą być nierozpuszczalną zawiesiną acylowanej tyrozyny, lub acylowanych cukrów, kationowymi lub anionowymi pochodnymi polisacharydów, lub polifosfoazenami.
W szczepionkach dla osób starszych jest korzystne, aby adiuwant był preferencyjnym induktorem odpowiedzi typu TH1.
Konkretne adiuwanty Th1 omówiono w „Adiuwanty Th1” powyżej.
W dalszym aspekcie wynalazku jest dostarczona kompozycja immunogenna lub szczepionka jak tu opisano do stosowania w medycynie.
Przygotowywanie/podawanie szczepionek omówiono w „Preparaty szczepionek” powyżej.
Białko D jest także korzystnie stosowane w szczepionce przeciwko zapaleniu ucha środkowego, jako że samo jest immunogenem zdolnym do generowania ochrony z udziałem komórek B przeciwko nietypowalnym H. influenzae (ntHi). ntHi mogą wnikać do komórek gospodarza i unikać efektów zachodzących z udziałem komórek B indukowanych przez antygen białkowy. Twórcy wynalazku ujawnili sposób zwiększenia skuteczności białka D (albo samego albo jako nośnika dla polisacharydu) jako antygenu w szczepionce przeciwko zapaleniu ucha środkowego. Polega on na dodaniu adiuwanta do białka D tak, że jest indukowana silna odpowiedź Th1 u osobnika, aby zoptymalizować ramię komórkowe układu odpornościowego przeciwko białku D. Efekt taki można otrzymać przez stosowanie liofilizowanej kompozycji zawierającej białko D i adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL), która jest rekonstytuowana krótko przed podaniem. Kompozycje według wynalazku można przygotować przez liofilizację mieszaniny zawierającej białko D i adiuwant Th1 i stosować do leczenia zapalenia ucha środkowego.
W szerszym znaczeniu Twórcy przewidują ż e liofilizacja immunogenu w obecnoś ci adiuwanta Th1 (patrz „Adiuwanty TH1”), korzystnie 3D-MPL, będzie ogólnie wzmagała odpowiedź Th1 przeciwko immunogenowi.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1 - Polisacharyd otoczki S. pneumoniae:
walentny kandydat na szczepionkę obejmuje serotypy polisacharydów otoczki 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F wytworzone zasadniczo jak opisano w EP 72513. Każdy polisacharyd jest aktywowany i derywatyzowany w reakcji z CDAP (WO 95/08348) i koniugowany z nośnikiem białkowym. Wszystkie polisacharydy koniuguje się w ich formie natywnej, oprócz serotypu 3 (któremu zmniejszono rozmiar w celu obniżenia jego lepkości).
Nośnik białkowy: Wybranym nośnikiem białkowym jest zrekombinowane białko D (PD) z nietypowalnego Haemophilus influenzae, wyrażane w E. coli.
Ekspresja białka D
Konstrukty genetyczne do ekspresji białka D
Materiały początkowe
DNA kodujący białko D
Białko D jest silnie konserwowane pośród wszystkich serotypów H. influenze i szczepów nietypowalnych. Wektor pHIC348 zawierający sekwencję DNA kodującą całe białko D otrzymano od dr A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden. Sekwencja DNA białka D została opublikowana przez Janson i wsp. (1991) Infect. Immun. 59: 119-125.
Wektor ekspresyjny pMG1
Wektor ekspresyjny pMG1 jest pochodną pBR322 (Gross i wsp., 1985), do którego wprowadzono elementy pochodzące z bakteriofaga λ kontrolujące transkrypcję i translację wstawionych obcych genów (Shatzman i wsp., 1983). Ponadto, gen oporności na ampicylinę zastąpiono genem oporności na kanamycynę.
Szczep E. coli AR58
Szczep E. coli AR58 stworzono przez transdukcję N99 wyjściową zawiesiną faga P1 wcześniej hodowanego na pochodnej SA500 (galE::TN10, lambdaKil- cI857 ΔΗ1). N99 i SA500 są szczepami E. coli K12 pochodzącymi z laboratorium dr Martina Rosenberga w National Health Institute.
PL 203 917 B1
Wektor ekspresyjny pMG1
Aby wytworzyć białko D, DNA kodujący to białko wklonowano do wektora ekspresyjnego pMG1. Plazmid ten wykorzystuje sygnały z DNA faga lambda do kierowania transkrypcją i translacją wstawionych obcych genów. Wektor zawiera promotor PL, operator OL i dwa miejsca wykorzystywania (NutL i NutL), aby znieść mechanizmy polarności transrypcyjnej po dostarczeniu białka N (Gross i wsp., 1985). Wektory zawierające promotor PL wprowadza się do lizogennego szczepu E. coli, aby stabilizować DNA plazmidowy. Lizogenne szczepy gospodarza zawierają wadliwy pod względem replikacji DNA faga lambda integrowany w genom (Shatzman i wsp., 1983). Chromosomowy DNA faga lambda kieruje syntezą białka represora cl, które wiąże się z represorem OL w wektorze i zapobiega wiązaniu polimerazy RNA z promotorem PL, a więc transkrypcji wstawionego genu. Gen cl szczepu ekspresyjnego AR58 zawiera mutanta termowrażliwego takiego, że transkrypcja kierowana przez PL może być regulowana przez zmianę temperatury, tj. wzrost temperatury hodowli inaktywuje represor i rozpoczyna się synteza obcego białka. System ekspresyjny pozwala na kontrolowaną syntezę obcych białek szczególnie takich, które mogą być toksyczne dla komórki (Shimataka i Rosenberg, 1981).
Szczep E. coli AR58
Lizogenny szczep E. coli wykorzystywany do wytwarzania nośnikowego białka D jest pochodną standardowego szczepu E. coli K12 z NIH - N99 (F- su- galK2, lacZ-, thr-). Zawiera on wadliwego lizogennego faga lambda (galE::TN10, lambdaKil- cI857 ΔΗ1). Fenotyp Kil- zapobiega wyłączeniu syntezy makrocząsteczek gospodarza. Mutacja cI857 niesie termowrażliwość do represora cl. Delecja ΔΜ usuwa prawy operon faga lambda i loci gospodarza bio, uvr3 i chlA. Szczep AR58 wytworzono przez transdukcję N99 wyjściową zawiesiną faga P1 wcześniej hodowanego na pochodnej SA500 (galE::TN10, lambdaKil- cI857 ΔΜ). Wprowadzenie defektywnego lizogenu do N99 selekcjonowano na tetracyklinie dzięki obecności transpozonu TN10 kodującego oporność na tetracyklinę w przylegającym genie galE.
Konstrukcja wektora pMGMDPPrD
Wektor pMG1 zawierający gen kodujący niestrukturalne białko S1 wirusa grypy (pMGNSI) zastosowano do skonstruowania pMGMDPPrD. Gen białka D amplifikowano techniką PCR z wektora pHIC348 (Janson i wsp., 1991) za pomocą starterów do PCR zawierających miejsca restrykcyjne Ncol i Xbal na końcach 5' i 3' odpowiednio. Fragment NcoI/XbaI następnie wprowadzono do pMGNS1 między Ncol i Xbal w ten sposób tworząc fuzję białkową zawierającą 81 N-końcowych aminokwasów białka NS1, po których następuje białko PD. Wektor ten oznaczono jako pMGNSPPrD.
W oparciu o konstrukt opisany powyżej stworzono ostateczny konstrukt do ekspresji białka D. Fragment BamHI/BamHI usunięto z pMGNSPPrD. Taka hydroliza DNA obszar kodujący NS1, oprócz pierwszych trzech N-końcowych aminokwasów. Po ponownej ligacji wektora, stworzono gen kodujący fuzję białkową o następującej sekwencji aminokwasowej na N końcu:
----MDP SSHSSNMANT---NS1 Białko D
Białko D nie zawiera peptydu liderowego lub N-końcowej cysteiny do której normalnie przyłączone są łańcuchy lipidowe. Białko nie jest więc ani wydzielane do periplazmy, ani lipidowane i pozostaje w cytoplazmie w formie rozpuszczalnej.
Końcowy konstrukt pMG-MDPPrD wprowadzono do szczepu gospodarza AR58 przez szok temperaturowy w 37°C. Bakterie zawierające plazmid selekcjonowano w obecności kanamycyny. Obecność wstawki DNA kodującego białko D wykazano przez trawienie wyizolowanego plazmidu wybranymi endonukleazami. Zrekombinowany szczep E. coli określono jako ECD4.
Ekspresja białka D jest prowadzona pod kontrolą promotora PL lambda/operatora OL. Szczep gospodarza AR58 zawiera w genomie termowrażliwy gen cl, który przez wiązanie z OL blokuje ekspresję z PL lambda w niskiej temperaturze. Gdy temperatura się podniesie cl uwalnia się z OL i białko D ulega ekspresji. Pod koniec fermentacji bakterie zagęszcza się i zamraża.
Ekstrakcję z zebranych komórek i oczyszczanie białka D przeprowadzono w następujący sposób. Zamrożony osad hodowli komórek rozmrożono i zawieszono w roztworze do rozrywania komórek (bufor cytrynianowy pH 6,0) do końcowego OD650 = 60. Zawiesinę dwukrotnie przepuszczano przez homogenizator wysokociśnieniowy przy P = 100 barów. Homogenat hodowli komórek klarowano przez wirowanie i szczątki komórek usuwano przez filtrację. W pierwszym etapie oczyszczania filtrowany lizat nanoszono na kolumnę do chromatografii kationowymiennej (SP Sepharose Fast Flow). PD wiąże się z macierzą żelową przez oddziaływania jonowe i jest wypłukiwane przez stopniowy wzrost siły jonowej buforu do wypłukiwania.
PL 203 917 B1
W drugim etapie oczyszczania zanieczyszczenia zatrzymuje się na macierzy anionowymiennej (Q Sepharose Fast Flow). PD nie wiąże się z żelem i można je zebrać z cieczą przepływającą.
W obu etapach chromatografii kolumnowej zbieranie frakcji śledzi się przez OD. Ciecz wypływającą z anionowymiennej chromatografii kolumnowej zawierająca oczyszczone białko D zagęszcza się przez ultrafiltrację.
Frakcję zatrzymaną na kolumnie po ultrafiltracji zawierającą białko D na końcu przepuszcza się przez błonę 0,2 μm.
Chemia
Aktywacja i chemia sprzęgania:
Warunki aktywacji i sprzęgania są specyficzne dla każdego polisacharydu. Podano je w Tabeli 1. Natywne polisacharydy (oprócz PS3) rozpuszczano w 2M NaCl lub w wodzie do wstrzykiwania. Optymalne stężenia polisacharydów ustalono dla wszystkich serotypów.
CDAP dodano z roztworu wyjściowego 100 mg/ml w acetonitrylu, do roztworu polisacharydu (stosunek CDAP/PS 0,75 mg/mg PS). 1,5 minuty później dodano 0,2M trietyloaminę, aby otrzymać specyficzne pH aktywacji. Aktywację polisacharydu przeprowadzano w tym pH w ciągu 2 minut w 25°C. Białko D (ilość zależy od początkowego stosunku PS/PD) dodano do aktywowanego polisacharydu i przeprowadzono reakcję sprzęgania w specyficznym pH przez 1 godzinę. Reakcję następnie tłumiono glicyną przez 30 minut w 25°C i przez noc w 4°C.
Koniugaty oczyszczano przez filtrację żelową używając kolumny do filtracji żelowej Sephacryl 500HR zrównoważonej 0,2M NaCl.
Ustalono zawartość białkową i węglowodanową wypłukanych frakcji. Koniugaty połączono i sterylnie filtrowano na błonie sterylizującej 0,22 μτι. Oznaczono stosunki PS/białko w preparatach koniugatów.
Charakterystyka
Wszystkie koniugaty scharakteryzowano i pasowały do specyfikacji wskazanych w Tabeli 2. Zawartość polisacharydów ^g/ml) zmierzono testem rezorcyny a zawartość białkową ^g/ml) testem Lowry'ego. Końcowy stosunek PS/PD (m/m) ustalono jako stosunek stężeń.
Resztowa zawartość DMAP (ng^g PS):
Aktywacja polisacharydu przez CDAP wprowadza do polisacharydu grupę cyjanianową i uwalniana jest DMAP (4-dimetyloaminopirydyna). Resztową zawartość DMAP ustalono za pomocą specyficznego testu opracowanego w SB.
Zawartość wolnych polisacharydów (%):
Zawartość wolnych polisacharydów w koniugatach przechowywanych w 4°C lub przez 7 dni w 37°C ustalono w nadsączu otrzymanym po wirowaniu po inkubacji z przeciwciałami α-PD i nasyconym siarczanem amonowym.
Do określenia ilości wolnych polisacharydów w nadsączu zastosowano ELISA α-PS/a-PS. Nieobecność koniugatu także kontrolowano przez ELISA α-PD/a-PS. Obniżanie ilości wolnych polisacharydów prowadzi do otrzymania lepszej skoniugowanej szczepionki.
Antygenowość:
Antygenowość analizowano w tym samym koniugacie testem ELISA typu kanapkowego, w którym przeciwciałami wiążącymi i wykrywającymi były odpowiednio α-PS i α-PD.
Zawartość wolnych białek (%):
Poziom resztkowego „wolnego” białka D ustalono stosując metodę z traktowaniem próbki SDS. Koniugat podgrzewano 10 min w 100°C w obecności 0,1% SDS i wstrzykiwano na kolumnę do filtracji żelowej SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). Białko D jest dimerem, stąd istnieje ryzyko przeszacowania poziomu „wolnego” białka D przez dysocjację struktury przez SDS.
Wielkość cząsteczkowa (Kav):
Wielkość cząsteczkową określano na kolumnie do filtracji żelowej SEC-HPLC (TSK 5000-PWXL).
Stabilność:
Stabilność mierzono przez filtrację żelową SEC-HPLC (TSK 6000-PWXL) dla koniugatów trzymanych w 4°C lub przechowywanych przez 7 dni w 37°C.
Charakterystykę 11-walentnej szczepionki podano w Tabeli 2.
Koniugaty białkowe można adsorbować na fosforanie glinu i łączyć, aby uzyskać ostateczną szczepionkę.
Wniosek:
Wytworzono koniugaty immunogenne, które, jak wykazano poniżej, są składnikami obiecującej szczepionki. Ujawniono zoptymalizowane warunki CDAP prowadzące do lepszej jakości końcowego
PL 203 917 B1 sprzęganego polisacharydowego produktu pneumokokowego dla każdego ze składników 11 walentnej szczepionki. Koniugaty tych polisacharydów pneumokokowych, które można otrzymać w powyższym ulepszonym (zoptymalizowanym) procesie CDAP (niezależnie od białka nośnikowego, ale korzystnie będącego białkiem D) stanowią istotny element w realizacji rozwiązań według wynalazku.
P r z y k ł a d 2 - Badanie wpływu zaawansowanych adiuwantów na szczepionkę 11-walentną będącą koniugatem pneumokokowego PS-PD u nowonarodzonych szczurów.
Nowonarodzone szczury immunizowano 11-walentną szczepionką koniugatu pneumokokowego
PS-PD w dawce 0,1 μg każdego polisacharydu (wytworzonego sposobem z przykładu 1) i stosowano następujące preparaty adiuwantów: brak, AlPO4, 3D-MPL, 3D-MPL na AlPO4.
Preparaty oparte jedynie o 3D-MPL były statystycznie (i zadziwiająco) bardziej immunogenne (wyższy GMC IgG) niż dla innych preparatów 5 z 11 antygenów. Było to prawdą zarówno przy dużych jak i przy małych stężeniach 3D-MPL.
Opsonofagocytoza potwierdziła wyniki GMC.
Materiały i metody
Protokół immunizacji
Nowonarodzone szczury OFA losowo przydzielono różnym matkom i gdy miały 7 dni po raz pierwszy poddano immunizacji. Dodatkowo poddano je immunizacji jeszcze 2 razy 14 i 18 dni później. Skrwawianie przeprowadzono 56 dnia (28 dni po III). Wszystkie szczepionki wstrzykiwano podskórnie, a w grupie było 10 szczurów na szczepionkę.
Szczury immunizowano szczepionką 11-walentną będącą koniugatem pneumokokowym obejmującą następujące serotypy polisacharydów sprzężonych z białkiem D: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C,
19F, 23F.
Preparat
By zbadać wpływ różnych zaawansowanych adiuwantów, dawkę koniugatu utrzymywano na stałym poziomie 0,1 μg każdego polisacharydu, a adiuwanty AIPO4 i 3D-MPL formułowano w różnych dawkach i kombinacjach, łącznie z nieuwzględnieniem adiuwanta. Wymieniono je liczbowo w Tabeli 3 w celu odniesienia.
Adsorpcja na AIPO4
Stężone, adsorbowane monowalenty przygotowano zgodnie z następującą procedurą. 50 μg AIPO4 (pH 5,1) mieszano z 5 μg sprzężonego polisacharydu przez 2 godziny. pH doprowadzono do 5,1 i mieszaninę pozostawiono na następne 16 godzin. By doprowadzić stężenie soli do 150 mM dodano 1500 mM NaCl. Po 5 minutach dodano 5 mg/ml 2-fenoksyetanolu. Po kolejnych 30 minutach pH doprowadzono do 6,1 i pozostawiono na więcej niż 3 dni w 4°C.
Przygotowanie rozcieńczalników
Rozcieńczalniki przygotowano w 150 mM NaCl/5 mg/ml fenoksyetanolu
A: AIPO4 o stężeniu 1 mg/ml
B: 3D-MPL na AIPO4 o stężeniach odpowiednio 250 i 1000 μg/ml
Stosunek wagowy 3D-MPL/AIPO4 = 5/20
C: 3D-MPL na AIPO4 o stężeniach odpowiednio 561 i 1000 μg/ml
Stosunek wagowy 3D-MPL/AlPO4 = 50/89
Przygotowanie adsorbowanych undekawalentów
Jedenaście stężonych, zaadsorbowanych monowalentów PS-PD zmieszano w prawidłowym stosunku. Dodatek AIPO4 wprowadzono jako rozcieńczalnik A. Gdy to było potrzebne dodano 3D-MPL, albo jako roztwór wodny (nieadsorbowany, sposób 1 poniżej), albo jako rozcieńczalnik B lub C (3D-MPL zaadsorbowane na AIPO4 w dwóch dawkach, sposób 2 poniżej).
Sposób 1
3D-MPL dodano do zaadsorbowanych w kombinacji koniugatów jako zawiesinę wodną. Mieszano go z undekawalentem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przechowywano w 4°C do czasu podawania.
Sposób 2
3D-MPL wcześniej adsorbowano na AIPO4 przed dodaniem do kombinacji zaadsorbowanych koniugatów (rozcieńczalnik B i C). By przygotować 1 ml rozcieńczalnika, wodną zawiesinę 3D-MPL (250 lub 561 μg) mieszano z 1 mg AlPO4 w NaCl pH 6,1/fenoksy i inkubowano przez noc w 4°C.
Przygotowanie nieadsorbowanego undekawalentu
Jedenaście koniugatów PS-PD zmieszano i rozcieńczono w odpowiednim stosunku w 150 mM NaCl pH 6,1, fenoksy. W razie potrzeby dodano 3D-MPL w postaci roztworu (nie adsorbowany).
PL 203 917 B1
Preparaty do wszystkich wstrzyknięć przygotowywano na 18 dni przed pierwszym podaniem.
ELISA
Przeprowadzono test ELISA, aby zmierzyć szczurze IgG stosując protokół z warsztatów WHO dotyczących procedury ELISA do ustalania ilości przeciwciała IgG przeciw polisacharydom otoczki Streptococcus pneumoniae w surowicy ludzkiej. Pokrótce, oczyszczony polisacharyd otoczki opłaszcza się bezpośrednio na płytce do mikromiareczkowania. Próbki osocza inkubuje się wstępnie z polisacharydem ściany komórkowej powszechnym dla wszystkich pneumokoków (substancja C) i stanowiącym ok. 0,5% polisacharydów pneumokokowych oczyszczonych zgodnie z ujawnieniem (EP 72513 B1). Do wykrywania związanego szczurzego IgG zastosowano odczynniki Jackson ImmunoLaboratories Inc. Krzywe miareczkowania mian odnoszono do standardów wewnętrznych (przeciwciała monoklonalne) modelowanych przez logarytmiczne równanie logistyczne. Obliczenia przeprowadzono stosując oprogramowanie SoftMax Pro. Maksymalny błąd bezwzględny oczekiwany dla tych wyników był w granicach czynnika 2. Względny błąd jest mniejszy niż 30%.
Opsonofagocytoza
Miana opsoniczne ustalono dla serotypów 3, 6B, 7F, 14, 19F i 23F stosując protokół CDC (opsonofagocytoza Streptococcus pneumoniae z zastosowaniem zróżnicowanych komórek HL60, wersja 1.1) z oczyszczonymi ludzkim PMN i dopełniaczem z młodych królików. Modyfikacje obejmowały wykorzystanie własnych szczepów pneumokoków, a komórki fagocytujące HL60 zastąpiono oczyszczonymi ludzkimi komórkami obojętnochłonnymi PMN (istnieje duży stopień korelacji między tymi komórkami fagocytującymi). Dodatkowo dodano 3 mm kulki szklane do studzienek do mikromiareczkowania by zwiększyć mieszanie, co pozwoliło na zmniejszenie stosunku fagocyt:bakterie, który rekomendowany wynosił 400.
Wyniki
Stężenia IgG
Będące średnią geometryczną stężenia IgG ustalone dla każdego serotypu i PD przedstawiono w tabelach 4 do 10. Dla serotypów 6B, 14, 19F i 23F włączono dla porównania pierwotne wyniki otrzymane stosując prepart tetrawalentny.
Najwyższe stężenia IgG podkreślono w Tabelach 4 do 10. Statystyczną wartość p dla kompozycji 3D-MPL względem 3D-MPL/AlPO4 przedstawiono w Tabeli 11. Preparat adiuwanta numer 4 (nieadsorbowane koniugaty z wysoką dawką 3D-MPL) daje najwyższe GMC dla 9 z 11 przypadków. W 5/11 przypadków, MPL w niskiej dawce jest drugim najbardziej immunogennym adiuwantem. Dodatkowo, podawanie adiuwanta daje wyższe GMN niż modyfikacja dawki dla wszystkich serotypów (dane nieprzedstawione) i jest to istotne statystycznie dla serotypów 4, 6B, 7F, 18C i 23F (p<0,05 z 95% CI).
Opsonofagocytoza
Wyniki opsonofagocytozy na podzielonych na pule osoczach pokazano dla serotypów 3, 6B, 7F, 14, 19F i 23F w Tabelach 4 do 8. Dla większości miana opsoniczne potwierdzają GMC IgG. Rzeczywiście, korelacja ze stężeniami IgG jest większa niż 85% dla serotypów 6B, 19F, 23F (dane nieprzedstawione). W przypadku serotypu 3, należy zwrócić, że tylko grupa 3D-MPL indukowała aktywność opsoniczną powyżej wartości granicznej.
Wnioski
W tym eksperymencie nieoczekiwanie wykazano, że zastosowanie samego 3D-MPL będzie indukować najwyższe stężenia IgG.
Maksymalne GMC IgG otrzymane przez modyfikowanie adiuwanta porównano z maksymalnym GMC otrzymanym przez modyfikowanie dawki PS i stwierdzono, że 3D-MPL może indukować znacząco wyższą odpowiedź w 5/11 serotypów.
Tabela 11 pokazuje, że gdy porównuje się kompozycje 3D-MPL i 3D-MPL/AIPO4 (porównując proces wytwarzania i dawkę 3D-MPL), immunogenność 5 z koniugatów polisacharydowych, PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F, jest znacząco większa, gdy są one preparowane tylko z 3D-MPL, niż w przypadku preparatu 3D-MPL plus AIPO4.
P r z y k ł a d 3 - Badanie wpływu kombinacji na immunogenność koniugatów PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F u dorosłych szczurów
Dorosłe szczury immunizowano szczepionkami koniugatu pneumokokowego polisacharydu-białka D indywidualnie, albo w kombinacji w kompozycji wielowalentnej (tetra-, penta-, hepta- albo dekawalentnej). Grupy po 10 szczurów immunizowano dwukrotnie w odstępie 28 dni, a testowe skrwawienie prowadzano dnia 28 i 42 (14 dni po 2 dawce).
PL 203 917 B1
Osocza badano testem ELISA na przeciwciała IgG przeciw polisacharydom pneumokokowym. Wszystkie koniugaty indukowały specyficzne przeciwciała mierzone testem ELISA. Tabela 12 przedstawia wpływ kombinacji monowalentnych koniugatów PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F z białkiem D na ich immunogenność u dorosłych szczurów, co zmierzono przez stężenie IgG 14 dni po drugiej dawce.
Analizę statystyczną przeprowadzono dla wszystkich próbek, aby ustalić czy różnice w stężeniu przeciwciał w zależności od kombinacji były istotne. Kombinacja któregokolwiek z koniugatów serotypów PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F z białkiem D w szczepionce wielowalentnej nie zmieniała znacząco ich immunogenności.
T a b e l a 1
Warunki specyficznej aktywacji/sprzęgania/wygaszania koniugatów PS S. pneumoniae - białko D
Serotyp 1 3 μ płyn 4 5 6B 7F
Stężenie PS (mg/ml) 2,0 3,0 2,0 7,5 5,4 3,0
Rozpuszczalnik dla PS NaCl 2M NaCl 2M H2O H2O NaCl 2M NaCl 2M
Stężenie PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Początkowy stosunek PS/PD (m/m) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
Stężenie CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
Serotyp 9V 14 18C 19F 23F
Stężenie PS (mg/ml) 2,5 2,5 2,0 4,0 3,3
Rozpuszczalnik dla PS NaCl 2M NaCl 2M H2O NaCl 2M NaCl 2M
Stężenie PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Początkowy stosunek PS/PD (m/m) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0,5 1/1
Stężenie CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pHq 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 10/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
T a b e l a 2
Specyfikacje 11 walentnej szczepionki pneumokokowy PS-PD (pierwsze numery kodu serii wskazują serotyp)
Kryteria D01PDJ227 D03PDJ236 D04PDJ228 D05PDJ235 D06PDJ209
1 2 3 4 5 6
Stosunek PS/białko (m/m) 1/0,66 1/1,09 1/0,86 1/0,86 1/0,69
Zawartość wolnych polisacharydów (%) <10% 1 1 7 9 0
Zawartość wolnych białek (%)<15% 8 <1 19 21 9
PL 203 917 B1
c.d. tabeli 2
1 2 3 4 5 6
Zawartość DMAP (ng/jg PS) <0,5 ng/jg PS 0,2 0,6 0,4 1,2 0,3
Wielkość cząsteczkowa (Kav) 0,18 0,13 0,12 0,11 0,13
Stabilność brak przesunięcia brak przesunięcia brak przesunięcia niewielkie przesunięcie brak przesunięcia
Kryteria D07PDJ225 D09PDJ222 D14PDJ202 D18PDJ221 D19PDJ206
Stosunek PS/białko (m/m) 1/0,58 1/0,80 1/0,68 1/0,62 1/0,45
Zawartość wolnych polisacharydów (%) <10% 1 <1 <1 4 4
Zawartość wolnych białek (%) <15% 8 0,3 3 21 10
Zawartość DMAP (ng/jg PS) <0,5 ng/jg PS 0,1 0,6 0,3 0,2 0,1
Wielkość cząsteczkowa (Kav) 0,14 0,14 0,17 0,10 0,12
Stabilność brak przesunięcia brak przesunięcia brak przesunięcia brak przesunięcia przesunięcie
Kryteria D23PDJ212
Stosunek PS/białko (m/m) 1/0,74
Zawartość wolnych polisacharydów (%) <10% 0
Zawartość wolnych białek (%) <15% 12
Zawartość DMAP (ng/jg PS) <0,5 ng/jg PS 0,9
Wielkość cząsteczkowa (Kav) 0,12
Stabilność brak przesunięcia
T a b e l a 3
Tabela podsumowująca preparaty adiuwantów badane z 11 walentną szczepionką pneumokokowy PS-PD u nowonarodzonych szczurów
Grupa AlPO4 MPL Metoda Opis
1 Brak
2 100 AlPO4
3 5 Mało MPL
4 50 Dużo MPL
5 100 5 Sposób 1 Sposób 1 mało
6 100 50 Sposób 1 Sposób 1 dużo
7 100 5 Sposób 2 Sposób 2 mało
8 100 50 Sposób 2 Sposób 2 dużo
PL 203 917 B1
T a b e l a 4
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11 walentną szczepionką PS-PD z zastosowaniem różnych adiuwantów dla serotypu 6B (i porównanie z immunizacją szczepionką tetrawalentną)
Grupa < _ι CL ™ 2 Metoda m Ο Ε α q ™ ra Serokonwersja 6B Miano opsoniczne 6B* m Ο Ε ® q Ρ ra Serokonwersja 6B Miano opsoniczne 6B*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 0,047 2/10 12,5 0,004 1/10 <6,25
2 100 0,048 4/10 65 0,019 4/10 <6,25
3 5 1,345 10/10 43
4 50 4,927 10/10 192
5 100 5 1 0,042 7/10 <6,25
6 100 50 1 0,255 10/10 <6,25
7 100 5 2 0,033 3/10 <6,25 0,048 8/10 <6,25
8 100 50 2 0,057 8/10 <6,25
Tabela 5
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11 walentną szczepionką PS-PD z zastosowaniem różnych adiuwantów dla serotypu 14 (i porównanie z immunizacją szczepionką tetrawalentną)
Grupa ° 2 < _ι CL 2 Metoda 14 GMC IgG (pg/mi) Serokonwersja 14 Miano opso- niczne 14* 6B GMC IgG (pg/mi) Serokonwersja 14 Miano opso- niczne 14*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 0,046 3/10 64 0,022 3/10 <6,25
2 100 0,99 10/10 88 0,237 8/10 27
3 5 0,233 10/10 41
4 50 0,676 10/10 81
5 100 5 1 0,460 9/10 67
6 100 50 1 0,477 10/10 98
7 100 5 2 0,81 10/10 49 0,165 8/10 81
8 100 50 2 1,611 10/10 133
PL 203 917 B1
T a b e l a 6
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11 walentną szczepionką PS-PD z zastosowaniem różnych adiuwantów dla serotypu 19F (i porównanie z immunizacją szczepionką tetrawalentną)
Grupa < _ι CL ™ 2 Metoda 19F GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 19F Miano opsoniczne 19F* 19F GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 19F Miano opso- niczne 19F*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 0,04 2/10 64 0,021 2/10 <6,25
2 100 1,07 9/10 367 0,222 7/10 79
3 5 4,028 10/10 296
4 50 21,411 10/10 1276
5 100 5 1 1,649 10/10 172
6 100 50 1 2,818 10/10 208
7 100 5 2 1,09 10/10 193 0,766 10/10 323
8 100 50 2 3,539 10/10 241
T a b e l a 7
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11 walentną szczepionką PS-PD z zastosowaniem różnych adiuwantów dla serotypu 23F (i porównanie z immunizacją szczepionką tetrawalentną)
Grupa < CL ™ 2 Metoda 23F GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 23F Miano opsoniczne 23F* 23F GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 23F Miano opso- niczne 23F*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 0,06 2/10 <6,25 0,152 3/10 <6,25
2 100 0,29 10/10 70 0,56 8/10 <6,25
3 5 2,296 9/10 389
4 50 4,969 10/10 >1600
5 100 5 1 0,462 5/10 17
6 100 50 1 0,635 8/10 54
7 100 5 2 0,38 10/10 <6,25 0,203 3/10 18
8 100 50 2 0,501 7/10 43
PL 203 917 B1
T a b e l a 8
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11 walentną szczepionką PS-PD z zastosowaniem różnych adiuwantów dla serotypu 3 i 7F
Grupa < _ι CL ™ 2 Metoda 3 GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 3 Miano opsoniczne 3* 7F GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 7F Miano opso- niczne 7F*
1 0,003 1/10 <6,25 0,040 7/10 <6,25
2 100 0,008 6/10 <6,25 0,25 9/10 43
3 5 0,070 10/10 <6,25 2,435 10/10 477
4 50 0,108 10/10 18 2,569 10/10 332
5 100 5 1 0,015 10/10 <6,25 0,579 10/10 54
6 100 50 1 0,027 10/10 <6,25 0,611 9/10 59
7 100 5 2 0,006 10/10 <6,25 0,154 8/10 30
8 100 50 2 0,034 10/10 <6,25 0,638 9/10 140
T a b e l a 9
Średnia geometryczna stężenia IgG i serokonwersja w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11 walentną szczepionką PS-PD z zastosowaniem różnych adiuwantów dla serotypu 1, 4 i 5
Grupa < CL ™ 2 Metoda 1 GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 1 4 GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 4 5 GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 5
1 0,026 4/10 0,005 0/10 0,040 3/10
2 100 0,282 8/10 0,052 5/10 0,774 9/10
3 5 1,614 10/10 3,452 10/10 7,927 10/10
4 50 2,261 10/10 7,102 10/10 13,974 10/10
5 100 5 1 0,568 10/10 0,676 10/10 3,015 10/10
6 100 50 1 1,430 10/10 0,419 9/10 5,755 10/10
7 100 5 2 0,478 10/10 0,267 9/10 2,062 10/10
8 100 50 2 1,458 10/10 0,423 10/10 5,009 10/10
T a b e l a 10
Średnia geometryczna stężenia IgG i serokonwersja w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11 walentną szczepionką PS-PD z zastosowaniem różnych adiuwantów dla serotypu 9V, 18C i PD
Grupa < CL ™ 2 Metoda 9V GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 9V 18C GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 18C q y O E Ł o - S Serokonwersja PD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0,018 0/10 0,013 1/10 0,003 0/10
2 100 0,489 6/10 0,092 5/10 0,993 10/10
3 5 0,482 7/10 6,560 10/10 3,349 10/10
4 50 11,421 10/10 14,023 10/10 5,446 10/10
PL 203 917 B1
c.d. tabeli 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5 100 5 1 2,133 9/10 0,690 10/10 11,407 10/10
6 100 50 1 2,558 10/10 1,771 10/10 1,258 10/10
7 100 5 2 1,536 10/10 0,528 10/10 1,665 8/10
8 100 50 2 2,448 9/10 0,980 10/10 5,665 10/10
T a b e l a 11
Istotność statystyczna (wartość p) poprawionej immunogenności określonych polisacharydów pneumokokowych formułowanych z samym 3D-MPL w odniesieniu do 3D-MPL/AlPO4. Wartość p poniżej 0,01 jest uważana za wysoce znaczącą. Sposób 1 i Sposób 2 oznaczają sposób przygotowania.
serotyp 50 μg 3D-MPL względem 3D-MPL/AlPO4 5 μg 3D-MPL względem 3D-MPL/AlPO4
Sposób 1 Sposób 2 Sposób 1 Sposób 2
1 0,3 0,05 0,079 0,11
3 0,075 0,01 0,27 0,008
4 0,002 0,0003 0,02 0,003
5 0,04 0,002 0,1 0,12
6B 0,001 0,0001 0,001 0,0006
7F 0,13 0,15 0,01 0,005
9V 0,02 0,02 0,1 0,04
14 0,65 0,21 0,3 0,66
18C 0,0008 0,0002 0,006 0,004
19F 0,0009 0,006 0,21 0,04
23F 0,002 0,0004 0,01 0,0004
T a b e l a 12
Średnia geometryczna stężenia IgG ^g/ml) w dniu 14 po drugiej dawce po immunizacji dorosłych szczurów 1,0 μg szczepionki samego koniugatu polisacharyd-białko D lub jako kombinowana szczepionka tetrawalentna, pentawalentna, heptawalentna lub dekawalentna. Dane odpowiadają pięciu oddzielnym eksperymentom
Serotypy Szczepionki 4 H 6B T 18C H 19F T 23F T
Sam 9,3 0,11 15 5,2 2,5
W kombinacji 4 0,23 3,7 3,7 2,8
T: kombinacja szczepionek tetrawalentna (T) (PS 6B, 14, 19F, 23F), pięciowalentna (T plus PS3), siedmiowalentna (H) (T plus PS 4, 9V i 18C) i dziesięciowalentna (H plus PS 1, 5 I 7F). H: kombinacja szczepionek siedmiowalentna (H) (T plus PS 4, 9V i 18C) i dziesięciowalentna (H plus PS 1, 5 i 7F).
P r z y k ł a d 4 - Korzystny wpływ dodatku pneumolizyny i 3D-MPL na wydajność ochronną polisacharydowej 11-walentnej szczepionki skoniugowanej z PD przeciwko pneumokokowej kolonizacji płuc u myszy
Odczyty immunologiczne
Dawkowanie specyficznych dla pneumolizyny IgG osocza w ELISA
Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczano przez 2 godziny w 37°C 100 μl/studzienkę rekombinowanej natywnej pneumolizyny (PLY) o stężeniu 2 μg/ml rozpuszczonej w PBS. Płytki 3 razy płukano buforem 0,9% NaCl, 0,005% Tween-20. Następnie jako krzywą standardową podawano seryjne dwukrotne rozcieńczenia (w PBS/Tween-20 0,005%, 100 μl na studzienkę) referencyjnej surowicy anty-PLY (rozpoczynając od 670 ng/ml IgG) i próbki surowicy (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/10)
PL 203 917 B1 inkubowano przez 30 minut w 20°C poddając wstrząsaniu. Po płukaniu, jak opisano wcześniej skoniugowane z peroksydazą kozie anty-mysie IgG (Jackson) rozcieńczano 5000 x w PBS/Tween-20 0,05% inkubowano (100 l/studzienkę) przez 30 minut w 20°C poddając wstrząsaniu. Po płukaniu, płytki inkubowano przez 15 min. w temperaturze pokojowej z 100 μl/studzienkę buforu wywołującego (4 mg/ml OPDA i 0,05% H2O2 w 100 mM buforze cytrynianowym pH 4,5). Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 μl/studzienkę 1N HCl. Gęstości optyczne odczytywano przy 490 i 620 nm za pomocą urządzenia Emax (Molecular Devices). Miano przeciwciał obliczano cztero parametrową metodą matematyczną wykorzystując oprogramowanie SoftMaxPro.
Hamowanie hemolizy
Ten test przeprowadzono by zmierzyć zdolność przeciwciał surowicy do hamowania aktywności hemolitycznej pneumolizyny (PLY). W celu wyeliminowania cholesterolu (podatnego na oddziaływania z PLY), próbki surowicy traktowano 2x w następujący sposób: mieszano je z 1 równą objętością chloroformu i następnie inkubowano przez 45 minut poddając wytrząsaniu. Nadsącze zbierano po wirowaniu przez 10 minut przy 1000 rpm. Oczyszczone z cholesterolu surowice rozcieńczano (seryjne dwukrotne rozcieńczenia w 1 mM ditiotreitolu, 0,01% BSA, 15 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,5) w mikropłytkach o 96 studzienkach (Nunc). Pięćdziesiąt μl roztworu zawierającego 4HU (ang. Hemolisis Unit, jednostka hemolizy) PLY dodano do każdej studzienki i inkubowano przez 15 minut w 37°C. Następnie dodano 100 μl czerwonych krwinek owcy (roztwór 1%) na 30 min w 37°C. Po wirowaniu przez 10 min przy 1000 rpm zebrano nadsącze (150 μΓ> i naniesiono na następną mikropłytkę o 96 studzienkach w celu odczytania gęstości optycznej przy 405 nm. Wyniki wyrażono jako punkt środkowy mian rozcieńczeń.
Chemiczna detoksyfikacja pneumolizyny
Rekombinowaną natywną pseudolizynę (PLY) dializowano wobec 50 mM buforu fosforanowego 500 mM NaCl, pH 7,6. Wszystkie następne etapy przeprowadzano w 39,5°C przy epizodycznym wytrząsaniu. Dnia 1 do roztworu PLY dodano 10% Tween-80 (1/250 obj./obj.), 57,4 mM N-acetylotryptofan pH 7,6 (3/100 obj./obj.), 2,2 M glicynę w buforze fosforanowym (1/100 obj./obj.) i 10% formaldehyd w buforze fosforanowym (3/100 obj./obj.). Dnia 2 i 3 ponownie dodano 10% formaldehyd w stosunkach odpowiednio 3/100 obj./obj. i 2/100 obj./obj. Inkubację w 39,5°C podtrzymywano do dnia 7 przy epizodycznym wytrząsaniu. Na koniec PLY dializowano wobec 50 mM buforu fosforanowego 500 mM NaCl pH 7,6. Całkowitą inaktywację PLY wykazano w teście hemolitycznym.
Pneumokokowa prowokacja wewnątrznosowa u myszy OF1 5
Siedem tygodniowych samic myszy OF1 donosowo inokulowano pod znieczuleniem 5 x 105 CFU zaadaptowanego dla myszy serotypu 6B S. pneumoniae. Płuca usuwano 6 godzin po prowokacji i homogenizowano (Ultramax, 24000 rpm 4°C) w pożywce Todd Hewith Broth (THB, Gibco). Seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia homogenatów płuc opłaszczano przez noc w 37°C na szalki Petriego zawierające agar THB uzupełniony ekstraktem drożdżowym. Infekcję pneumokokową płuc ustalano jako liczbę CFU/mysz, wyrażaną jako logarytmiczna średnia ważona. Granicą detekcji było 2,14 CFU/mysz.
P r z y k ł a d 4A - Wpływ adiuwanta 3D-MPL na odpowiedź immunologiczną przeciwko pneumolizynie
W niniejszym przykładzie oceniliśmy wpływ dodatku adiuwanta 3D-MPL na odpowiedź immunologiczną wobec natywnej rekombinowanej pneumolizynie (PLY, dostarczona przez J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) i jego chemicznie detoksykowany odpowiednik (DPLY). Chemiczną detoksyfikację przeprowadzono jak opisano powyżej.
Grupy 10 6-tygodniowych samic myszy Balb/c immunizowano domięśniowo w dniu 0, 14 i 21 1 μg PLY lub DPLY zawartym w albo A: AlPO4 100 μg lub B: AlPO4 100 μg + 5 μg 3D-MPL (3-de-O-acylowany monofosforylolipid A, dostarczony przez Ribi Immunochem). Figury 1A i 1B przedstawiają miana ELISA IgG i hamowania hemolizy (HLI) mierzonych w surowicach po III szczepieniu.
Niezależnie od antygenu najlepsze odpowiedzi odpornościowe były indukowane u zwierząt szczepionych preparatami uzupełnionymi 3D-MPL. Interesująco DPLY był równie immunogenny jak PLY, gdy był podany z AlPO4 + 3D-MPL, podczas gdy był słabszym immunogenem w preparacie z AlPO4. To wykazało korzystną zdolność 3D-MPL do poprawiania odpowiedzi przeciwciał na detoksyfikowaną pneumolizynę.
W kompozycjach zawierających pneumolizynę może być korzystne stosowanie chemicznie modyfikowanych detoksyfikowanych pneumolizyn raczej niż mutacyjnie detoksyfikowanych pneumolizyn. Jest tak ponieważ detoksyfikowane mutanty nadal wykazują resztkową aktywność toksyny - chemicznie detoksyfikowana pneumolizyna jej nie wykazuje. Zatem korzystne są kompozycje zawierające pneumolizynę (lub
PL 203 917 B1 mutanty pneumolizyny), która była chemicznie detoksyfikowana do stosowania w szczepionce oraz adiuwant Th1, korzystnie 3D-MPL. Takie kompozycje są dostarczone przez wynalazek. Sposób zwiększenia odpowiedzi immunologicznej chemicznie detoksyfikowanej pneumolizyny w obrębie kompozycji immunogennej obejmuje etapy dodania adiuwanta Th1 (korzystnie 3D-MPL).
P r z y k ł a d 4B - Korzystny wpływ dodatku atenuowanego mutanta pneumolizyny i adiuwanta 3D-MPL na ochronną skuteczność skoniugowanej z PD 11-walentnej szczepionki polisacharydowej przeciwko kolonizacji płuc przez pneumokoki u myszy OF1 prowokowanych donosowo serotypem 6B.
W niniejszym przykładzie ocenialiśmy skuteczność profilaktyczną szczepionki zawierającej 11-walentny koniugat polisacharyd-białko D, atenuowany zmutowany antygen pneumolizyny (PdB, WO 90/06951) i adiuwanty AlPO4 + 3D-MPL, w porównaniu z klasycznym adsorbowaną na AlPO4 preparatem koniugatu 11-walentny polisacharyd-białko D.
Grupy 12 samic 4-tygodniowych myszy OF1 immunizowano podskórnie w dniu 0 i 14 preparatami zawierającymi A: 50 μο AlPO4; B: 0,1 μο PS/serotyp skoniugowanej z PD 11-walentnej szczepionki polisacharydowej + 50 μg AlPO4; lub C: 0,1 μg PS/serotyp koniugowanej z PD 11-walentnej szczepionki polisacharydowej + 10 μg PdB (dostarczony przez J. Paton, Children's Hospital, Adelaide, Australia) + 50 μg AlPO4 + 5 μg 3D-MPL (dostarczony przez Ribi Immunochem). Prowokację stosowano w dniu 21 jak opisano powyżej.
Jak przedstawiono na Figurze 1C, bardzo znaczącą ochronę (p < 0,007) nadawała 11-walentna szczepionka koniugowana polisacharydowa uzupełniona PdB i adiuwantem AlPO4 + MPL (czarne paski przedstawiają średnią arytmetyczną). Nie stwierdzono natomiast znaczącej ochrony u zwierząt immunizowanych preparatem 11-walentny koniugat/AlPO4. Wynik udowodnił, że dodatek antygenu pneumolizyny (nawet atenuowanego) i adiuwanta 3D-MPL zwiększał skuteczność 11-walentnej polisacharydowej szczepionki koniugowanej przeciwko zapaleniu płuc.
P r z y k ł a d 4C - Korelacje immunologiczne ochrony wykazanej w Przykładzie 4B
Aby ustalić korelacje immunologiczne ochrony dostarczonej w przykładzie 4B przez 11-walentną szczepionkę koniugatu uzupełnioną atenuowaną zmutowaną pneumolizyną (pdB) i 3D-MPL zmierzono odpowiedzi serologiczne przeciwciał przed prowokacją na polisacharyd 6B i PdB jak opisano powyżej.
Następnie porównano miana przeciwciał do liczb kolonii bakterii mierzonych w płucach odpowiednich zwierząt zebranych 6 godzin po prowokacji. R2 wyznaczona z regresji liniowych log/log.
Wyznaczone R2 były równe 0,18 i 0,02 dla odpowiedzi przeciwciał anty-PdD i anty-6B, odpowiednio. Wykazało to brak korelacji pomiędzy humoralnymi odpowiedziami odpornościowymi i ochroną dla obu antygenów. Miana przeciwciał anty-6B nie były znacząco różne w grupach immunizowanych 11-walentną koniugowaną szczepionką (GMT = 0,318 ng/ml) lub tę samą szczepionką uzupełnioną PdD i 3D MPL (GMT = 0,458 ng/ml). Tak więc ulepszona ochrona obserwowana z preparatem C nie była wyłącznie wynikiem wyższej odpowiedzi przeciwciał na polisacharyd 6B.
Razem wzięte, wyniki sugerują że w ochronie nie pośredniczyły same humoralne odpowiedzi immunologiczne, ale raczej także odporność komórkowa indukowana przez antygen PdB w obecności 3D-MPL. Dało to dodatkowe poparcie dla dodania antygenów białkowych (antygenu białkowego) i silnych adiuwantów (adiuwanta) do koniugowanej szczepionki polisacharydu pneumokoków, tak aby koordynować oba ramiona układu odpornościowego w celu uzyskania optymalnej ochrony.
P r z y k ł a d 5 - Kooperacja obu ramion układu odpornościowego u myszy aktywnie immunizowanych pneumolizyną i pasywnie immunizowanych przeciwciałami przeciwko pneumokokowym PS
P r z y k ł a d 5A - Określanie stężenia pasywnie podawanego przeciwciała anty-6B-polisacharyd (anty PS) chroniącego przed zapaleniem płuc
Metoda
Grupy szczepień: Immunizowano cztery grupy 16 myszy pasywnie (i.p.) w dniu -1 100 μl nierozcieńczonych surowic odpornościowych szczura przeciwko polisacharydom według grup wyszczególnionych poniżej (razem 64 myszy).
Grupa Specyficzność Stężenie IgG w surowicach
G1 a-PS-6B 5 μg/ml
G2 a-PS-6B 2 μg/ml
G3 a-PS-6B 0,75 μg/ml
G4 kontrola 0 μg/ml
PL 203 917 B1
Zwierzęta: 64 myszy samców CD-1 z Charles River, Kanada, ważących około 35 g (około 10-tygodniowe).
Znieczulanie: Myszy znieczulono izofluranem (3%) plus O2 (11/min).
Organizm: S. pneumoniae N1387 (serotyp 6) zebrano z płytek agarowych z tryptykazą sojową (TSA) uzupełnioną 5% krwią końską i zawieszono w 6 ml PBS. Bezpośrednio przed zakażeniem 1 ml zawiesiny bakterii rozcieńczono do 9 ml schłodzonego topionego agaru odżywczego (BBL) i trzymano w 4°C. Myszy otrzymały około 6,0 log 10 cfu/mysz w objętości 50 pl.
Zakażenie: W dniu 0 myszy znieczulono jak opisano powyżej i zakażono S. pneumoniae N1387 (50 pl schłodzonej zawiesiny bakterii) przez dooskrzelowe zaszczepienie za pomocą niechirurgicznej dotchawicowej intubacji. Sposób ten opisali Woodnut i Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Próbki: W dniu 3 po zakażeniu uśmiercono 8 myszy/grupę za pomocą przedawkowania CO2. Płuca wycięto i homogenizowano w 1 ml PBS. Przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w PBS aby wyliczyć liczby żywotnych bakterii. Próbki inkubowano (20 pl) w trzech powtórzeniach na płytkach TSA uzupełnionych 5% krwią końską i inkubowano przez noc w 37°C przed oceną. Kolejne grupy myszy uśmiercano w dniu 7 i pobierano próbki jak opisano powyżej.
Wyniki
Stężenie IgG w surowicach szczura (pg/ml) Liczba bakterii (log 10 cfu/płuca) w dniach po zakażeniu
3 8
5 6,7±0,7 (1/7) 7,2±0,7 (5/8)
2 6,5±0,7 (1/7) 6,9±1,8 (4/7)
0,75 7,7±0,5 (5/8) 4,8±1,4 (2/8)
0 6,7±1,5 (3/6) 6,3±1,5 (3/9)
Liczby w nawiasach odpowiadają liczbie zwierząt, które padły przed czasem pobrania próby.
Wniosek: Ogólnie nie było znaczącej różnicy w liczbie bakterii izolowanych z dowolnej z grup badanych. Oznacza to, że przeciwciała anty-polisacharyd nie dawały mierzalnej ochrony w stężeniach mniejszych i równych 5 pg/ml.
Jest to podobne do tego co obserwuje się w niektórych ludzkich badaniach klinicznych, to znaczy masa antypolisacharydów jest niewystarczająca, aby chronić przez pneumokokowym zapaleniem płuc w pewnych populacjach.
P r z y k ł a d 5B - Określanie ochrony przed zapaleniem płuc nadawanej przez aktywne podanie Ply (pneumolizyny) w obecności lub nieobecności adiuwanta oraz synergism z suboptymalnym przeciwciałem anty-PS
Metoda
Zwierzęta: 128 samców myszy CD-1 (wiek 6 tygodni przy immunizacji, 10 tygodni przy zakażeniu) z Charles River, St. Constant, Quebec, Kanada. Zwierzęta ważyły około 20 g w 6 tygodniu i 38 g w 10 tygodniu.
Immunizacje: Sześć grup 16 myszy immunizowano przez zastrzyk podskórny w dniach -22 i -14 100 pl szczepionki jak wyszczególniono poniżej. (Całość 128 myszy). PdB (WO 90/06951) uzyskano dzięki uprzejmości Dr Jamesa Patona, Australia. 3D-MPL był otrzymany od Ribi/Corixa.
W dniu -1 specyficzne grupy (patrz Tabela poniżej) były immunizowane (i.p. 100 pl) pasywnie stężeniem 4,26 pg/ml (4 ml 5 pg/ml +1,32 pg/ml) mysiego przeciwciała anty-polisacharyd.
Grupa Objętość zastrzyku aktywna Szczepionka dawana dni -22, -14 (dawka pg) Objętość zastrzyku bierna Bierny IgG (dzień -1)
1-1 100 pl s.c. PdB/AlPO4 (10/50) Brak
1-2 100 pl s.c. PdB/MPL/AlPO4 (10/5/50) Brak
1-3 100 pl s.c. PdB/AlPO4 (10/50) 100 pl i.p. α-PS
1-4 100 pl s.c. PdB/MPL/AlPO4 (10/5/50) 100 pl s.c. α-PS
1-5 100 pl s.c. MPL/AlPO4 (5/50) 100 pl s.c. α-PS
1-6 100 pl s.c. MPL/AlPO4 (5/50) Brak
PL 203 917 B1
Zakażenie: W dniu 0 myszy znieczulano (3% izofluran plus 11/min O2). Inokula bakteryjne przygotowano przez zebranie wzrastających S. pneumoniae N1387 (serotyp 6) z płytek agarowych z tryptykazą sojową (TSA) uzupełnioną 5% krwią końską i zawieszono w 6 ml PBS. Bezpośrednio przed zakażeniem przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenie (1 ml plus 9 ml) w schłodzonym topionym agarze odżywczym (trzymanym w 41°C). Myszy zakażono przez dooskrzelowe zaszczepienie za pomocą niechirurgicznej dotchawicowej intubacji (BBL) i otrzymały około 6,0 log10 cfu/mysz w objętości 50 jl. Sposób ten opisali Woodnut i Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Próbki: W dniu 72 po zakażeniu uśmiercano 8 myszy/grupę za pomocą przedawkowania CO2. Płuca wycięto i homogenizowano w 1 ml PBS. Przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w PBS, aby wyliczyć liczby ż ywotnych bakterii. Próbki inkubowano (20 j l) w trzech powtórzeniach na płytkach TSA uzupełnionych 5% krwią końską i inkubowano przez noc w 37°C przed oceną. Kolejne grupy myszy uśmiercano w dniu 8 po zakażeniu i pobierano próbki jak opisano powyżej.
Analiza danych
Miarą wyjściową dla porównania terapii była liczba bakterii w płucach w dniu 3 i 7 po zakażeniu. Wyniki są przedstawione jako średnie grupy z odchyleniami standardowymi. Przeprowadzono analizę statystyczną stosując test t Studenta gdzie wartość P < 0,05 była uznana za znaczącą.
Wyniki godz. po zakażeniu
Zliczenia bakterii z grupy 1-4 były znacząco niższe (p<0,05) niż te z grupy 1-3.
Zliczenia bakterii z grupy 1-4 były znacząco niższe (p<0,05) niż te z grupy 1-5.
168 godz po zakażeniu
Liczby bakterii we wszystkich grupach były około 2 logarytmy niższe po 8 dniach niż po 3 dniach wskazując, że infekcja ustępowała.
Zliczenia bakterii z grupy 1-2 były znacząco niższe (p<0,05) niż te z grupy 1-5.
Grupa Dzień 3 Dzień 8
Log CFU/płuco odchylenie standardowe Log CFU/płuco odchylenie standardowe
1-1 6,93 0,61 5,23 1,28
1-2 6,59 1,25 4,08 1,34
1-3 7,09 0,8 5,32 1,26
1-4 6,09 1,43 4,46 2,32
1-5 7,19 0,89 5,42 1,05
1-6 6,68 1,14 5,01 1,48
Jak wykazano powyżej, samo przeciwciało anty-polisacharyd nie daje ochrony przed wzrostem pneumokoków w płucach. PdB z AlO4 jako adiuwantem także nie daje ochrony, ale w dniu 8 jest skłonność do ochrony gdy PdB jest kombinowany z 3D-MPL (grupa 1-2).
W dniu 3, najbardziej znacząco chroniona grupa 1-4, miała wszystkie cztery elementy PdB, 3D-MPL i pasywnie podane przeciwciało anty-polisacharyd. Ten wniosek jest podtrzymywany przez czę stość śmiertelności. Grupa 1-4 miała tylko 2/8 zgonów w porównaniu dla 5/10 dla grup 1-5 i 1-3.
Wniosek:
Jako że eksperyment przeprowadzono z pasywnie immunizowanymi zwierzętami, efekt synergistyczny także aktywnej immunizacji pneumolizyną i MPL nie może być wynikiem wzrostu poziomu przeciwciał przeciwko antygenowi polisacharydowemu.
Jako że zwierzęta były pasywnie immunizowane przeciwko pneumokokowemu polisacharydowi, przy dniu 8 poziomy takiego przeciwciała w znacznym stopniu uległyby rozproszeniu z gospodarza.
Mimo tego, znacząca ochrona przed pneumokokowym zapaleniem płuc była widoczna w grupach immunizowanych pneumolizyną plus 3D-MPL, a szczególnie w grupach immunizowanych pneumolizyną plus 3D-MPL plus pasywnie podane przeciwciał anty-polisacharyd wskazując na synergię tej kombinacji.
Jeśli immunizacja anty-polisacharyd byłaby przeprowadzana czynnie (korzystnie ze skoniugowanym polisacharydem) efekt byłyby jeszcze bardziej wyraźny, jako efekt pamięci komórek B, i stałe
PL 203 917 B1 poziomy przeciwciał anty-PS brałyby udział w kooperacji odpowiedzi immunologicznej (patrz na przykład Figura 1C, gdzie wiele zwierząt aktywnie immunizowanych polisacharydem i białkiem okazało się nie mieć bakterii w płucach po prowokacji).
P r z y k ł a d 6 - Immunogenność w 1-rocznych myszach Balb/C 11-walentnej szczepionki skoniugowanej polisacharyd-białko D pneumokoków z 3D-MPL jako adiuwantem
Wstęp i cel
W ochronie przed zakażeniem pneumokokami bierze udział przeciwciało specyficzne dla serotypu przez opsonofagocytozę. Można przypuszczać, że zwiększenie stężenia przeciwciał da większą ochronę tak więc włożono wiele wysiłku, aby znaleźć sposoby zwiększenia odpowiedzi humoralnej. Jedną z powodzeniem stosowaną strategią do koniugacji szczepionek w badaniach przedklinicznych jest stosowanie immunostymulujących adiuwantów (przegląd w Poolman i wsp. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. W: Handbook of Experimental Pharmacology, red. P. Perlmann i H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg D).
Dane prezentowane w tej części pokazują wyniki ostatnich doświadczeń stosujących kliniczne partie w protokole zaprojektowanym tak, aby naśladował badania kliniczne.
Protokół
Jednoroczne myszy balb/c immunizowano 1/10 dawki ludzkiej koniugowanej szczepionki polisacharyd pneumokoków-białko D lub 23-walentnej szczepionki polisacharydowej. Stosowano szczepionki będące klinicznymi partiami DSP009, DSP012 lub DSP014 odpowiadające odpowiednio dawce 1 μg serotypów 6B i 23F i 5 μg pozostałych serotypów 11-walentnej koniugowanej szczepionki, dawce 0,11 μg 11-walentnej szczepionki koniugowanej lub dawce 0,1 μg 11-walentnej szczepionki koniugowanej z 5 μg 3D-MPL. Do wszystkich 11-walentnych szczepionek koniugowanych dodawano jako adiuwant 50 μg AlPO4.
Grupy 20 myszy immunizowano domięśniowo. Zastrzyki grupom wyliczonym w następującej tabeli podawano w dniach 0 i 21. Krew do testów pobierano w dniu 35 (14 dni po drugiej dawce).
T a b e l a
Schemat immunizacji dla 1-rocznych myszy Balb/c immunizowanych klinicznymi partiami koniugowanej szczepionki polisacharyd-białko D.
Grupa Dzień 0 Szczepionka Dawka 1 Dzień 21 Szczepionka Dawka 2 Liczba myszy
1 Pneumovax-23 2,5 μcg Bufor 20
2a 11-walentna Pn-PD 0,1 μg Bufor 20
2b 11-walentna Pn-PD 0,1 μg 11-walentna Pn-PD 0,1 μg 20
3a 11-walentna Pn-PD + MPL 0,1 μg + 5 μg Bufor 20
3b 11-walentna Pn-PD + MPL 0,1 μg + 5 μg 11-walentna Pn-PD + MPL 0,1 μg + 5 μg 20
4a 11-walentna Pn-PD 1/0,5 μg Bufor 20
4b 11-walentna Pn-PD 1/0,5 μg 11-walentna Pn-PD 1/0,5 μg 20
Kontrola Bufor Bufor 20
Surowice badano testem ELISA na przeciwciała IgG wobec polisacharydów pneumokokowych według uzgodnionego protokołu CDC/WHO, to znaczy po zobojętnieniu surowic polisacharydem ścian komórkowych. ELISA kalibrowano, aby otrzymać stężenia przeciwciał w μg/ml stosując monoklonalne przeciwciała IgG1 specyficzne wobec serotypu.
PL 203 917 B1
Statystyczne analizy porównań prowadzono stosując UNISTAT wersja 5.0 beta. ANOVA przeprowadzono za pomocą metody Tukey-HSD na stężeniach IgG transformowanych logarytmicznie. Porównania parami szybkości serokonwersji przeprowadzono stosując dokładny test Fischera.
Wyniki
IgG GMC i 95% przedział ufności w stosunku do 11 serotypów i białka D indukowanych 14 dni po drugiej immunizacji (dawka 2) są przedstawione w następującej tabeli. Szybkość serokonwersji przedstawiono tam, gdzie nie było możliwe wyliczenie 95% przedziału ufności.
Grupa 1 wykazuje efekty immunizacji prostymi polisacharydami, które normalnie u zwierząt tylko indukują IgM. Większość poziomów IgG jest poniżej wartości progowej detekcji; jednak myszy balb/c były zdolne do wytwarzania IgG wobec kilku polisacharydów pneumokokowych, szczególnie serotypów 3, 19F i 14.
Immunizacja szczepionkami koniugowanymi indukowała przeciwciało IgG z wysoką szybkością serokonwersji przeciwko wszystkim serotypom z wyjątkiem 23F.
Odpowiedź zależną od dawki (grupa 4 w porównaniu z grupą 2) zaobserwawano tylko dla serotypów 7F i 19F, ale te obserwacje nie były statystycznie znaczące. Większą odpowiedź zaobserwowano po dwóch dawkach (grupy b w stosunku do grup a) dla serotypów 3, 6B, 7F i 19F i PD i te obserwacje były statystycznie znaczące w wielu przypadkach z wszystkimi 3 preparatami.
Najbardziej interesujący jest efekt 3D-MPL. Trzy dawki szczepionki formułowanej z 3D-MPL (grupa 3b) indukowały najwyższą GMC specyficznych IgG i było to statystycznie znaczące dla wszystkich serotypów z wyjątkiem 23F, w którym to przypadku miało znacząco wyższe tempo serokonwersji (p = 0, -2 grupa 3b w porównaniu z 2b, dokładny Fishera).
T a b e l a
Średnia geometryczna [IgG] i przedziały ufności dla wybranych serotypów pneumokoków i białka D u jednorocznych Balb/c 14 dni po II imunizacji 11-walentną szczepionką koniugowaną PS-PD
Grupa 1 2a 2b 3a 3b 4a 4b
Serotyp GM [IgG] GM [IgG] GM [IgG] GM [IgG] GM [IgG] GM [IgG] GM [IgG]
μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml
95% Cl) 95% Cl) 95% Cl) 95% Cl) 95% Cl) 95% Cl) 95% Cl)
3 0,24 0,18 0,84 0,72 4,84 0,22 0,95
(0,16-0,6) (0,11-0,27) (0,47-1,5) (0,51-1,0) (3,0-7,9) (0,14-0,35) (0,19-1,8)
6B 0,02 0,04 0,19 0,14 0,74 0,09 0,11
0/20# 8/19 (0,09-0,41) (0,07-0,27) (0,29-1,9) (0,05-0,16) (0,05-0,23)
7F 0,04 0,07 0,19 0,15 0,97 0,09 0,45
0/20# (0,04-0,12) (0,10-0,39) (0,10-0,22) (0,49-2,0) (0,06-0,14) (0,20-1,02)
14 0,15 4,5 6,2 12,9 13,6 4,0 6,9
3/20# (2,5-8,1) (3,6-10,5) (7,8-21,2) (9,4-19,7) (2,0-8,0) (4,6-10,6)
19F 1,2 6,7 12,1 10,1 58,5 5,9 22,0
(0,56-2,6) (3,6-12,5) (7,6-19,3) (5,5-18,5) (42-81) (3,5-9,9) (16,0-30,2)
23F 0,07 0,08 0,08 0,07 0,17 0,06 0,10
1/20# 3/20# 2/19# 2/10# 9/20# 1/18# 4/20#
PD* 0,25 5,2 11,9 13,5 98,0 10,9 38,7
1/20# (3,3-8,3) (6,9-20,7) (9,5-19,0) (49,1-195) (6,4-18,4) (21,3-70,3)
* w EU/ml; # szybkość serokonwersji, określona jako dwa standardowe odchylenia powyżej średniej kontroli negatywnej. Definicje grup - patrz porzednia tabela.
Wnioski:
Przedstawione tu wyniki pokazują, że dodanie 3D-MPL do 11-walentnej skoniugowanej szczepionki polisacharyd pneumokoków-białko D podnosi odpowiedź odpornościową u myszy balb/c w podeszłym wieku na testowany serotyp.
W większości przypadków, dwie dawki szczepionki indukują wyższą średnią geometryczną stężenia IgG niż dawka pojedyncza. Ponieważ nie obserwuje się tego przy użyciu szczepionki polisacharydowej, nawet u ludzi, uważa się, że wskazuje to na odpowiedź immunologiczną zależną od limfocytów T i indukcję pamięci immunologicznej.
PL 203 917 B1
Wyniki te popierają schemat podawania szczepionki przy użyciu skoniugowanych polisacharydów pneumokokowych w połączeniu z adiuwantami Th1 (korzystnie 3D-MPL), gdzie co najmniej dwie dawki z adiuwantem podawane są, korzystnie w odstępie 1-12 tygodni, bardziej korzystnie w odstępie 3 tygodni.
Myszy użyte w doświadczeniu nie odpowiadały na PS 23 (sam polisacharyd czy skoniugowany). Chociaż poziomy przeciwciał przeciwko polisacharydowi pozostawały niskie niezależnie od użytej kompozycji szczepionkowej o wiele więcej myszy odpowiadało na PS 23 wówczas, gdy jako adiuwant zastosowany był 3D-MPL (serokonwersja była znacząco wyższa). Użycie adiuwantów Th1, w szczególności 3D-MPL, w kompozycjach szczepionkowych obejmujących skoniugowane polisacharydy pneumokoka w celu zmniejszenia braku odpowiedzi na polisacharyd pneumokoka w szczepionce jest kolejnym aspektem wynalazku.
P r z y k ł a d 7 - Koniugat polisacharyd z Neisseria meningitidis C - białko D (PSC-PD)
A: Wytwarzanie białka D
Jak w Przykładzie 1.
B: Wytwarzanie polisacharydu C
Źródłem polisacharydów grupy C jest szczep C11 N. meningiditis. Uzyskuje się je przy użyciu klasycznych technik fermentacji (EP 72513). Polisacharydy w postaci suchego proszku stosowane w procesie sprzęgania są identyczne jak w Mencevax (SB Biologicals s.a.).
Porcję szczepu C11 rozmraża się i 0,1 ml wyszczepia na szalki petriego z pożywką Mueller Hinton uzupełnioną dializowanym ekstraktem drożdżowym (10%, v/v) i inkubuje przez 23 do 25 godz. w 36°C w inkubatorze z powietrzem nasyconym wodą.
Murawka z powierzchni jest ponownie zawieszana w pożywce fermentacyjnej i inkubowana w zawiesinie w butelce Roux'a zawierającej pożywkę Mueller Hinton uzupełnioną dializowanym ekstraktem drożdżowym (10%, v/v) i sterylne szklane kulki. Po inkubacji w butelce Roux'a przez 23 do 25 godz. w 36°C w inkubatorze z powietrzem nasyconym wodą murawka z powierzchni jest ponownie zawieszana w 10 ml sterylnej pożywki do fermentacji i 0,2 do 0,3 ml tej zawiesiny inokuluje się do 12 innych butelek Roux'a z pożywką Mueller Hinton.
Po inkubacji przez 23 do 25 godz. w 36°C w inkubatorze z powietrzem nasyconym wodą murawka z powierzchni jest ponownie zawieszana w 10 ml sterylnej pożywki do fermentacji. Zawiesina bakterii jest zbierana w pulę do kolby stożkowej.
Zawiesina ta jest następnie jałowo przenoszona do fermentora przy użyciu sterylnych pipet.
Fermentację meningokoków przeprowadza się w fermentorach umieszczonych w czystym pomieszczeniu z podciśnieniem. Fermentacja jest zasadniczo zakończona po 10-12 godz., co odpowiada w przybliżeniu 1010 bakterii/ml (tzn. wczesna faza stacjonarna) i określana na podstawie wzrostu pH.
Na tym etapie całe podłoże jest inaktywowane temperaturą (12 min. 56°C) przed wirowaniem. Przed i po inaktywacji, pobierane są próbki podłoża i wyszczepiane na szalki petriego z pożywką Mueller Hinton.
C: Czyszczenie PS
Proces czyszczenia jest procedurą wieloetapową przeprowadzaną na całym podłożu fermentacyjnym. W pierwszym etapie czyszczenia inaktywowana hodowla jest klarowana przez wirowanie, po czym odzyskuje się supernatant.
Czyszczenie polisacharydu opiera się na wytrącaniu czwartorzędową solą amonową (bromek cetylotrimetyloamonowy/CTAB, CETAVLON R). CTAB tworzy nierozpuszczalne kompleksy z polianionami, takimi jak polisacharydy, kwasy nukleinowe i białka w zależności od ich pI. W kontrolowanych warunkach jonowych metodę tę można użyć do wytrącania zanieczyszczeń (niska przewodność) lub polisacharydów (wysoka przewodność).
R
Polisacharydy zawarte w klarowanym supernatancie wytrącane są przy użyciu diatomitu (CELITER 545) jako podłoża, co zapobiega tworzeniu nierozpuszczalnych obojętnych złogów podczas różnicowego wytrącania/oczyszczania.
Schemat czyszczenia polisacharydu C z N. maningitidis:
Etap 1: Przyłączenie kompleksu PSC-CTAB na CELITER 545 i usunięcie resztek komórek, kwasów nukleinowych i białek przez płukanie 0,05% CTAB.
Etap 2: Wypłukanie PS przy użyciu 50% EtOH. Pierwsze frakcje, które są mętne i zawierają zanieczyszczenia i LPS są odrzucane. Obecność PS w kolejnych frakcjach potwierdza się testem flokulacji.
Etap 3: Ponowne przyłączenie kompleksu PSC-CTAB na CELITER 545 i usunięcie mniejszych kwasów nukleinowych i białek przez płukanie 0,05% CTAB.
PL 203 917 B1
Etap 4: Wypłukanie PS przy użyciu 50% EtOH. Pierwsze mętne frakcje są odrzucane. Obecność PS w kolejnych frakcjach potwierdza się testem flokulacji.
Eluat jest filtrowany, a przesącz zawierający surowy polisacharyd jest zbierany. Polisacharyd jest wytrącany z przesączu przez dodanie etanolu do końcowego stężenia 80%. Następnie polisacharyd jest odzyskiwany w postaci białego proszku, suszony w próżni i przechowywany w -20°C.
D: Sprzęganie CDAP
Sprzęganie PSC i PD
Do sprzęgania PSC i PD, zalecana jest technika sprzęgania CDAP zamiast klasycznej aktywacji CNBr i łączenia z białkiem nośnikowym poprzez łącznik. Polisacharyd jest najpierw aktywowany przez cyjanylowanie za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloaminopirymidynowego (CDAP). CDAP jest rozpuszczalnym w wodzie czynnikiem cyjanującym w którym elektrofilowość grupy cyjanowej jest wyższa niż w CNBr, co pozwala na przeprowadzenie reakcji cyjanowania we względnie łagodnych warunkach. Po aktywacji, polisacharyd można bezpośrednio sprzęgać z białkiem nośnikowym przez jego grupy aminowe bez wprowadzania dodatkowej cząsteczki łącznika. Nieprzereagowane grupy cyjanianoestrowe są wyciszane przy użyciu ekstensywnej reakcji z glicyną. Całkowita liczba etapów wymaganych do wytworzenia szczepionek koniugowanych jest zredukowana, a co najważniejsze w końcowym produkcie nie ma potencjalnie immunogennych cząsteczek łącznika.
Aktywacja polisacharydów za pomocą CTAP wprowadza grupę cyjanianową do polisacharydów, a dimetyloaminopirydyna (DMAP) jest uwalniana. Grupa cyjanianowa reaguje z grupami NH2 w białku podczas następującej procedury sprzęgania i jest przekształcana w karbaminian.
Aktywacja PSC i sprzęganie PSC-PD
Aktywacja i sprzęganie przeprowadzane są w +25°C.
120 mg PS rozpuszcza się przez co najmniej 4 godz. w WFI.
Roztwór CDAP (świeżo przygotowany, 100 mg/ml acetonitrylu) dodaje się do uzyskania stosunku CDAP/PS (w/w) 0,75.
Po 1 min. 30, podnosi się pH do pH aktywującego (pH 10) przez dodanie trietyloaminy i stabilizuje do dodania PD.
Po 3 min. 30 dodawany jest NaCl do końcowego stężenia 2M.
Po 4 min., dodawane jest PD do uzyskania stosunku PD/PS 1,5/1; pH jest natychmiast doprowadzane do pH sprzęgania (pH 10). Roztwór jest pozostawiany na 1 godz. przy regulowanym pH.
Wygaszanie
Do mieszaniny PS/PD/CDAP dodaje się 6 ml roztworu 2M glicyny. pH jest doprowadzane do pH wygaszania (pH 8,8). Roztwór miesza się przez 30 min. w temperaturze pracy, a następnie przez noc w +2-8°C z ciągłym, powolnym mieszaniem.
Czyszczenie PS-PD
Po filtracji (5 μm), koniugat PS-PD jest oczyszczany w temp. pokojowej przez sączenie chromatograficzne w żelu typu S400HR Sephacryl w celu usunięcia małych cząsteczek (włączając DMAP) i nieskoniugowanego PD: elucja - NaCl 150 mM pH 6,5; monitorowanie - UV 280 nm, pH i przewodność.
Ze względu na różne wielkości cząsteczek składników reakcji, jako pierwsze wypłukiwane są koniugaty PS-PD a następnie wolne PD i na końcu DMAP. Frakcje zawierające koniugat, co wykrywa się przez DMAB (PS) i μBCA (białko) są zbierane w pule. Frakcje zebrane w pule są sterylnie filtrowane (0,2 μm).
E: Wytwarzanie szczepionki adsorbowanych koniugatów PSC-PD
Płukanie AlPO4
W celu zoptymalizowania adsorpcji koniugatu PSC-PD na AlPO4, AlPO4 jest przepłukiwany w celu zmniejszenia stężenia PO43-:
- AlPO4 jest przepłukiwany NaCl 15 mM i wirowany (4x);
- osad jest następnie zawieszany w NaCl 150 mM a następnie filtrowany (100 μm); oraz
- przesącz jest sterylizowany za pomocą temperatury.
Taki przepłukany AlPO4 oznaczono jako WAP (ang. washed autoclaved phosphate).
Proces wytwarzania
Przed ostatecznym wytworzeniem produktu finalnego koniugat PSC-PD w masie jest adsorbowany na AlPO4 WAP. AlPO4 WAP mieszano z PSC-PD przez 5 min. w temp. pokojowej. Ustawiano pH do 5,1 i mieszaninę mieszano przez dalsze 18 godz. w temp. pokojowej. Dodawano roztwór NaCl do 150 mM i mieszaninę mieszano przez 5 min. w temp. pokojowej. Dodawano 2-fenoksyetanol do 5 mg/ml
PL 203 917 B1 i mieszaninę mieszano przez 15 min. w temp. pokojowej a nastę pnie ustawiano pH do 6,1. Koń cowa kompozycja/dawka
- PSC-PD: 10 j g PS
- AlPO4 WAP: 0,25 mg Al3+
- NaCl: 150 mM
- 2-fenoksy-etanol: 2,5 mg
- woda do zastrzyku: do 0,5 ml
- pH: 6,1.
F: Informacje przedkliniczne
Immunogenność koniugatu polisacharydowego w myszy
Immunogenność koniugatu PSC-PD wyznaczano na 6- do 8-tygodniowych myszach balb/c. Prosty (niezaadsorbowany) koniugat lub koniugat zaadsorbowany na AlPO4 podawano przez wstrzyknięcie jako szczepionkę monowalentną. Indukowane przeciwciała anty-PSC mierzono testem ELISA podczas gdy funkcjonalne przeciwciała analizowano przy użyciu testów na bakteriobójczość, obie metody w oparciu o protokóły CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA). Przedstawione są wyniki dwóch różnych doświadczeń prowadzonych w celu określenia reakcji względem dawki i adiuwanta (AlPO4).
Badanie zakresu dawki
W doświadczeniu tym, PSC-PD podawano myszom Balb/C przez dwukrotne wstrzyknięcie (w odstępie dwóch tygodni). Stosowano cztery różne dawki preparatu koniugatu na AlPO4: 0,1; 0,5; 2,5 oraz 9,6 jg/zwierzę. Myszy (10/grupę) skrwawiano w 14 dniu (14 Post I), 28 (14 Post II) i 42 (28 Post II). Średnią geometryczną stężeń (GMC) przeciwciał swoistych dla polisacharydu C mierzona testem ELISA wyrażano w jg IgG/ml przy użyciu oczyszczonego IgG jako odniesienia. Przeciwciała bakteriobójcze badano na zebranych w pule surowicach, a miana wyrażano jako odwrotność rozcieńczenia zdolnego do zabicia 50% bakterii, przy użyciu szczepu N. meningitidis C11 w obecności komplementu z młodego królika.
Uzyskany zakres dawki pokazuje plateau od 2,5 jg dawki. Wyniki wskazują na to, że istnieje dobra wzmocniona odpowiedź pomiędzy 14 Post I a 14 Post II. Poziomy przeciwciał w 28 Post II są co najmniej równoważne tym z 14 Post II. Miana przeciwciała bakteriobójczego są zgodne ze stężeniami w ELISA i potwierdzają immunogenność koniugatu PSC-PD.
Wpływ adiuwanta
W doświadczeniu tym, badano jedną serię koniugatu PSC-PD przygotowanego na AlPO4, a prosty (bez adiuwanta) koniugat wstrzykiwano dla porównania. 10 myszy/grupę dwukrotnie szczepiono podskórnie, w odstępie dwóch tygodni, 2 jg koniugatu. Myszy skrwawiano w dniach 14 (14 Post I), 28 (14 Post II) oraz 42 (28 Post II) i miana funkcjonalnych przeciwciał mierzono ELISA (tylko dla 14 Post II i 28 Post II testem na bakteriobójczość). Preparat z AlPO4 indukuje przeciwciała do 10-krotnie wyższych mian w porównaniu z preparatami nie zawierającymi adiuwanta.
Wnioski
Na podstawie opisanych powyżej doświadczeń można wyciągnąć następujące ogólne wnioski:
- Koniugat PSC-PD indukuje anamnestyczną odpowiedź pokazując ą , ż e PSC wówczas gdy jest sprzężony staje się antygenem zależnym od limfocytów T.
- Stężenia przeciwciała anty-PSC mierzone testem ELISA dobrze korelują z mianami przeciwciała bakteriobójczego, co wskazuje na to, że przeciwciała indukowane przez koniugat PSC-PD działają przeciwko serogrupie C z N. meningitidis.
- W przybliż eniu 2,5 j g koniugatu zaadsorbowanego na AlPO4 wydaje się wywoł ywać optymalną odpowiedź przeciwciał u myszy.
- Chemia CDAP wydaje się być stosowną metodą wytwarzania immunogennych koniugatów PSC-PD.
P r z y k ł a d 8 - Wytwarzanie koniugatu polisacharyd z N. meningitidis serogrupy A -PD
Suchy sproszkowany polisacharyd A (PSA) jest rozpuszczany przez jedną godz. w roztworze NaCl 0,2 M do końcowego stężenia 8 mg/ml. pH jest doprowadzane do wartości 6 za pomocą HCl albo NaOH i roztwór jest ogrzewany do 25°C. 0,75 mg CDAP/mg PSA (preparat do 100 mg/ml acetonitrylu) dodaje się do roztworu PSA. Po 1,5 min. bez ustawiania pH, dodawany jest NaOH 0,2 M do uzyskania pH 10. 2,5 minuty później dodawane jest białko D (w stężeniu do 5 mg/ml), tak aby uzyskać stosunek PD/PSA w przybliżeniu 1. pH równe 10 jest utrzymywane przez czas trwania reakcji sprzęgania, 1 godz. Następnie dodaje się 10 mg glicyny (2 M, pH 9,0)/mg PSA, a pH doprowadza się do
PL 203 917 B1 wartości 9,0 przez 30 min. w 25°C. Mieszanina jest następnie przechowywana przez noc w 4°C przed oczyszczaniem na kolumnie do chromatografii ekskluzyjnej (Sephacryl S400HR z Pharmacia). Eluaty koniugatu poprzedzone są przez nieprzereagowane PD oraz inne produkty uboczne (DMAP, glicyna, sole). Koniugat jest zbierany i sterylizowany przez filtrację 0,2 pm na filtrze Sartopore firmy Sartorius.
P r z y k ł a d 9 - charakterystyka in vitro produktów z Przykładów 7 i 8 Główne dane zebrano w tabeli poniżej:
Nr Opis koniugatu Zawartość białka i PS (pg/ml) Stosunek PS/białko (w/w) Wolne białko (%) Wolny PS (%)
1 PS C-PD NaOH do ustawiania pH PD: 210 PS: 308 1/0,68 <2 8-9
2 PS C-PD TEA do ustawiania pH PD: 230 PS: 351 1/0,65 <2 5-6
3 PS C-PD NaOH do ustawiania pH PD: 159 PS: 149 1/1,07 5 5-9
Wyniki in vitro
Myszy Balb/C stosowano jako zwierzęcy model do testowania immunogenności koniugatów. Koniugaty były adsorbowane na AlPO4 lub Al(OH)3 (10 pg PS na 500 pg Al3+) lub nie były adsorbowane. Myszy szczepiono przez podanie 2 zastrzyków w dwutygodniowych odstępach (2 pg PS/zastrzyk).
Na podstawie tych wyników po pierwsze możemy stwierdzić, że PS w znacznym stopniu wpływa na odpowiedź immunologiczną. Lepsze wyniki uzyskano z koniugatami posiadającymi mniej niż 10% wolnego PS. Powyższe ulepszenie procesu CDAP jest zatem korzystne.
Istotny jest także preparat. Wydaje się, że AIPO4 jest najodpowiedniejszym adiuwantem w tym modelu. Koniugaty indukują zwiększoną wydajność, której nie obserwuje się wówczas gdy polisacharydy podawane są same.
Koniugaty z N. meningitidis A i C uzyskano z końcowym stosunkiem PS/białko odpowiednio 1 i 0,6-0,7 (w/w). Wolny PS i wolne białko nośnikowe stanowiły odpowiednio 10% i 15%. Odzyskiwanie polisacharydu jest wyższe niż 70%. Koniugaty PSA i PSC uzyskane dzięki udoskonalonemu (optymalnemu) procesowi CDAP (niezależnie od białka nośnikowego, choć korzystnie białka D) są zatem korzystne.
P r z y k ł a d 10 - Wytwarzanie koniugatu polisacharyd z H. influenzae b-PD
H. influenzae jest jedną z głównych przyczyn zapalenia opon mózgowych u dzieci poniżej drugiego roku życia. Dobrze znany jest polisacharyd otoczki z H. influenzae (PRP) jako koniugat z toksoidem tężca (sprzężony w reakcji opracowanej przez J. Robbins'a). CDAP jest reakcją udoskonaloną. Przedstawiono zestaw optymalnych warunków ustalonych dla koniugowania PRP, korzystnie z PD.
Parametry wpływające na reakcję koniugacji są następujące:
• Stężenie początkowe polisacharydu (które może mieć podwójny wpływ na końcowe poziomy wolnego polisacharydu oraz na etap sterylnej filtracji).
• Stężenie początkowe białka nośnikowego.
• Stosunek początkowy polisacharydu do białka (który także może mieć podwójny wpływ na końcowe poziomy wolnego polisacharydu oraz na etap sterylnej filtracji).
• Ilość użytego CDAP (zazwyczaj duży nadmiar).
• Temperatura reakcji (która może wpływać na rozkład polisacharydu, kinetykę reakcji oraz rozkład grup reaktywnych).
• pH aktywacji i sprzęgania.
• pH wygaszania (wpływające na poziom resztek DMAP).
• Czas aktywacji, sprzęgania i wygaszania.
Twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że 3 najbardziej krytycznymi parametrami w optymalizacji jakości produktu końcowego są: stosunek początkowy polisacharyd/białko; stężenie początkowe polisacharydu oraz pH sprzęgania.
PL 203 917 B1
Zatem zaprojektowano sześcian reakcyjny z 3 powyższymi warunkami jako trzema osiami. Punkty centralne (i eksperymentalny zakres wartości) dla tych trzech osi wynosiły: stosunek PS/białko - 1/1 (± 0,3/1); [PS] = 5 mg/ml (± 2 mg/ml) oraz pH sprzęgania = 8,0 (±1,0 jedn. pH).
Mniej istotne parametry były ustalone następująco: użyto 30 mg polisacharydu; temp. 25°C; [CDAP] = 0,75 mg/mg PS; pH miareczkowane 0,2 M NaOH; pH aktywacji = 9,5; temp. aktywacji 1,5 min; temp. sprzęgania - 1 godz.; [białko] = 10 mg/ml; pH wygaszania = 9,0; temp. wygaszania = 1 godz.; temp. rozpuszczania PS w rozpuszczalniku = 1 godz. w 2 M NaCl; czyszczenie na złożu Sephacryl S-400HR wymywanie NaCl 150 mM przy 12 cm/godz. oraz sterylizacja przez filtrację przy użyciu SARTOLAB P20 przy 5 ml/min.
Dane, które brano pod uwagę w celu ustalenia optymalnych warunków do wytwarzania produktów we wspomnianym wcześniej sześcianie reakcyjnym to: dane z procesu - maksymalna wydajność po filtracji, maksymalny poziom wbudowanego białka oraz jakość danych produktu - końcowy stosunek PS/białko, poziom wolnego PS, poziom wolnego białka, minimalne poziomy resztek DMAP (produkt rozłożonego CDAP).
Odzysk po filtracji
Czynnikiem wpływającym na odzysk po filtracji jest oddziaływanie pomiędzy początkowym [PS] i pH sprzęgania oraz stosunkiem początkowym PS/białko. Przy niskim [PS] istnieje małe oddziaływanie z dalszymi 2 czynnikami czego wynikiem jest dobra filtrowalność (w przybliżeniu 95% dla wszystkich produktów). Jednakże przy wysokim stężeniu filtrowalność maleje jeśli wzrastają pH oraz stosunek początkowy (wysokie [PS], niższy stosunek, niższe pH = 99% filtracji; lecz wysokie [PS], wyższy stosunek i pH = 19% filtracji).
Poziom wprowadzenia białka
Stosunek stosunku końcowego PS/białko do stosunku początkowego jest miarą wydajności sprzęgania. Przy wysokim [PS], pH nie wpływa na stosunek stosunków. Chociaż stosunek początkowy wpływa (1,75 przy niskim stosunku początkowym, 1,26 przy wysokich stosunkach początkowych). Przy niskim [PS], stosunek stosunków jest dla większości niższy, chociaż teraz pH ma większy wpływ (niskie pH, niski stosunek = 0,96; niskie pH, wysoki stosunek = 0,8; wysokie pH, niski stosunek = 1,4 oraz wysokie pH, wysoki stosunek = 0,92).
Stosunek końcowy PS/białko
Stosunek końcowy zależy od stosunku początkowego oraz [PS]. Największe stosunki końcowe uzyskuje się przy kombinacji wysokich stosunków początkowych i wysokim [PS]. Wpływ pH na stosunek końcowy nie jest tak znaczący jak niski [PS].
Poziom wolnego białka D
Najmniejsze ilości białka D obserwuje się przy wysokim pH i wysokim [PS] (poziomy zbliżone do 0,0). Wpływ wysokiego [PS] staje się szczególnie widoczny przy niskim pH. Podniesienie stosunku początkowego przyczynia się w niewielkim stopniu do podniesienia ilości wolnego białka D.
Resztkowe DMAP
Stosunek początkowy nie ma znaczącego wpływu. Dla kontrastu poziom DMAP wzrasta wraz z [PS] i maleje kiedy wzrasta pH.
Wnioski
Najbardziej korzystne warunki są następujące: pH sprzęgania = 9,0; [PS] = 3 mg/ml oraz stosunek początkowy = 1/1. Dla takich warunków właściwości produktu końcowego są następujące:
Końcowy stosunek PS/białko Wydajność filtracji PS (%) Współczynnik wydajności Wolne białko D (%) Poziomy DMAP (ng/10 μg PS)
wartość zakres wartość zakres wartość zakres wartość zakres wartość zakres
1,10 0,91-1,30 92,6 50-138 1,16 1,03-1,29 0,71 0-10,40 4,95 2,60-7,80
Koniugaty PRP uzyskane za pomocą udoskonalonego (optymalnego) procesu CDAP (niezależnie od białka nośnikowego, lecz korzystnie dla białka D) są zatem korzystne.
P r z y k ł a d 11 - Białko D jako antygen - jak jego skuteczność ochronną przeciwko dowolnemu H. influenzae można ulepszyć przez wytworzenie preparatu z 3D-MPL
Samice mysz Balb/c (10 na grupę) immunizowano (domięśniowo) jedenastowalentną skoniugowaną szczepionką polisacharyd pneumokoków-białko D po raz pierwszy w wieku 20 tygodni (D0)
PL 203 917 B1 i powtórnie immunizowano dwa tygodnie później (D14). 7 dni po drugiej immunizacji pobierano krew. Miana przeciwciał przeciwko białku D mierzono poziomem przeciwciał typu IgG1, IgG2a i IgG2b.
Liofilizowane undekawalentne szczepionki (bez AlPO4) przygotowywano przez mieszanie koniugatów z 15,75% laktozą mieszając przez 15 min. w temp. pokojowej, doprowadzając pH do 6,1 ± 0,1 i liofilizując (cykl zazwyczaj rozpoczynano w -69°C, stopniowo doprowadzano do -24°C przez ponad 3 godz. i pozostawiano tę temperaturę na 18 godz., następnie stopniowo doprowadzano do -16°C przez ponad 1 godz. i pozostawiano tę temperaturę na 6 godz., następnie stopniowo doprowadzano do +34°C przez ponad 3 godz. i na końcu pozostawiano tę temperaturę na ponad 9 godz.).
Kompozycja preparatów i środków do rekonstytucji liofilizatów przedstawiono w Tabeli 13.
T a b e l a 13
Skład preparatów (na dawkę ludzką) i miana przeciwciał przeciwko białku D u myszy (z 1/10)
Stan fizyczny PS (/500 pl) AlPO4 (/500 pl) Immunostymulant Czynnik zbrylający Środek kon- serwu- jący Środek do rekonstytucji IgG1 IgG2a IgG2b IgG1 IgG2a IgG2b
pg/ml %
płyn 1 pg 500 pg nie nie 2-PE3 nie 76 0,425 0,24 99,1 0,554 0,313
płyn 5 pg 500 pg nie nie 2-PE nie 66 0,284 0,176 99,3 0,427 0,265
płyn 4 pg 0 pg nie nie 2-PE nie 6,6 0,207 0,036 96,4 3,02 0,526
płyn 5 pg 0 pg nie nie 2-PE nie 5,2 0,169 0,043 96,1 3,12 0,795
lifilizowany 4 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie NaCl 150 mM' 5,2 0,147 0,046 96,4 2,73 0,853
liofilizowany 5 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie NaCl 150 mM' 11,1 0,11 0,168 97,6 0,967 1,477
liofilizowany 1 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie AlPO4 500 pg2 45 1,86 0,075 95,9 3,96 0,160
liofilizowany 5 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie AlPO4 500 pg2 19 0,077 0,119 99,0 0,401 0,620
liofilizowany 4 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie MPL 50 pg1 45 2,6 3,5 88,1 5,09 6,849
liofilizowany 5 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie MPL 50 pg1 135 25 5,1 81,8 15,1 3,089
lifilizowany 1 pg 0 pg MPL (50 pg) laktoza 3,15% nie bufor' 43 22 5,7 60,8 31,1 8,062
płyn 1 pg 500 pg MPL (50 pg) nie 2-PE nie 441 7,1 9,1 96,5 1,55 1,990
płyn 5 pg 500 pg MPL (50 pg) nie 2-PE nie 299 1,4 0,899 99,2 0,465 0,298
1 przed zastrzykiem; 2 +/- 2 godziny przed zastrzykiem, 3 2-fenoksyetanol
Najbardziej charakterystyczny pomiar świadczący o tym, że pojawiła się odpowiedź immunologiczna, w której pośredniczą komórki typu Th1 pozostaje w korelacji z poziomem przeciwciała IgG2a. Jak można stwierdzić na podstawie danych zaskakująco duży wzrost IgG2a ma miejsce kiedy białko D jest zliofilizowane z adiuwantem Th1 (w ym przypadku 3D-MPL).

Claims (16)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja immunogenna zawierająca przynajmniej cztery antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae pochodzące od co najmniej czterech serotypów i przynajmniej dwa antygeny białkowe Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalne ekwiwalenty.
  2. 2. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że co najmniej jeden antygen białkowy jest białkiem zewnętrznej powierzchni lub wydzielanym białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego immunologicznie funkcjonalnymi ekwiwalentami.
  3. 3. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1 lub 2, znamienna tym, że co najmniej jeden antygen białkowy jest toksyną, adhezyną lub lipoproteiną Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalnymi ekwiwalentami.
  4. 4. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-3, znamienna tym, że co najmniej jeden antygen białkowy lub jego immunologicznie funkcjonalny ekwiwalent jest wybrany z grupy obejmującej pneumolizynę, PspA lub jego transbłonowe warianty delecyjne, PspC lub jego transbłonowe warianty delecyjne, PsaA lub jego transbłonowe warianty delecyjne, dehydrogenazę gliceroaldehydo-3-fosforanową i CbpA lub jego transbłonowe warianty delecyjne.
  5. 5. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-4, znamienna tym, że polisacharydowe antygeny są prezentowane w postaci koniugatu polisacharyd-nośnik białkowy.
  6. 6. Kompozycja immunogenna według zastrz. 5, znamienna tym, że białko nośnikowe jest wybrane z grupy składającej się z: anatoksyny błonicy, anatoksyny tężca, CRM197, hemocyjaniny skałoczepu (KLH), pochodnej białkowej tuberkuliny (PPD) i białka D z H. influenzae.
  7. 7. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-6, znamienna tym, że dodatkowo zawiera adiuwant.
  8. 8. Kompozycja immunogenna według zastrz. 7, znamienna tym, że adiuwant obejmuje sól glinu.
  9. 9. Kompozycja immunogenna według zastrz. 7, znamienna tym, że adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi TH1 i obejmuje przynajmniej jedno z następujących: 3D-MPL lub jego pochodną, saponinowy czynnik immunostymulujący, lub immunostymulujący oligonukleotyd CpG.
  10. 10. Kompozycja immunogenna według zastrz. 7, znamienna tym, że adiuwant obejmuje emulsję olej w wodzie i tokoferol.
  11. 11. Kompozycja immunogenna według zastrz. 9, znamienna tym, że adiuwant obejmuje nośnik wybrany z grupy zawierającej: emulsję olej w wodzie, liposomy i sól glinu.
  12. 12. Kompozycja immunogenna określona w zastrz. 1-11 do zastosowania jako lek.
  13. 13. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera kompozycję immunogenną określoną w zastrz. 1-11.
  14. 14. Zastosowanie co najmniej czterech antygenów polisacharydowych pneumokoków pochodzących od co najmniej czterech serotypów w kombinacji z co najmniej dwoma antygenami białkowymi Streptococcus pneumoniae i ewentualnie adiuwantem indukującym TH1, który obejmuje co najmniej jeden spośród 3D-MPL lub jego pochodnej, saponinowego czynnika immunostymulującego, lub immunostymulującego oligonukleotydu CpG, do wytwarzania leku do zapobiegania zapaleniu płuc u pacjentów w wieku powyżej 55 lat.
  15. 15. Sposób wytwarzania kompozycji immunogennej określonej w zastrz. 1-11, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    wybierania czterech lub więcej polisacharydowych antygenów pneumokoków; wybierania dwóch lub więcej białkowych antygenów pneumokoków; i zmieszania tych antygenów polisacharydowych i białkowych z odpowiednią zaróbką.
  16. 16. Zastosowanie co najmniej czterech antygenów polisacharydowych pneumokoków pochodzących od co najmniej czterech serotypów w kombinacji z co najmniej dwoma antygenami białkowymi Streptococcus pneumoniae do wytwarzania leku do zapobiegania lub łagodzenia zapalenia ucha środkowego u niemowląt lub młodszych dzieci.
PL355264A 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie PL203917B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9906437.0A GB9906437D0 (en) 1999-03-19 1999-03-19 Vaccine
GBGB9909077.1A GB9909077D0 (en) 1999-04-20 1999-04-20 Novel compositions
GBGB9909466.6A GB9909466D0 (en) 1999-04-23 1999-04-23 Vaccines
GBGB9916677.9A GB9916677D0 (en) 1999-07-15 1999-07-15 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL355264A1 PL355264A1 (pl) 2004-04-05
PL203917B1 true PL203917B1 (pl) 2009-11-30

Family

ID=27451884

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL00355178A PL355178A1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Szczepionka
PL355180A PL204890B1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej
PL355264A PL203917B1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL00355178A PL355178A1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Szczepionka
PL355180A PL204890B1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej

Country Status (32)

Country Link
US (8) US20030147922A1 (pl)
EP (6) EP1163000B1 (pl)
JP (4) JP2002540074A (pl)
KR (3) KR100642044B1 (pl)
CN (3) CN1191852C (pl)
AR (3) AR022965A1 (pl)
AT (3) ATE459373T1 (pl)
AU (3) AU750762B2 (pl)
BE (1) BE1025464I2 (pl)
BR (4) BRPI0009163B8 (pl)
CA (3) CA2365296A1 (pl)
CY (3) CY1107561T1 (pl)
CZ (3) CZ20013378A3 (pl)
DE (4) DE60032120T2 (pl)
DK (2) DK1163000T3 (pl)
ES (3) ES2300255T3 (pl)
FR (1) FR10C0008I2 (pl)
HK (3) HK1043728B (pl)
HU (4) HUP0200664A2 (pl)
IL (5) IL145045A0 (pl)
LU (1) LU91652I2 (pl)
MX (1) MXPA01009452A (pl)
MY (2) MY125202A (pl)
NL (1) NL300415I1 (pl)
NO (4) NO20014322L (pl)
NZ (3) NZ513840A (pl)
PL (3) PL355178A1 (pl)
PT (2) PT1162999E (pl)
SI (2) SI1163000T1 (pl)
TR (3) TR200102739T2 (pl)
TW (3) TWI281403B (pl)
WO (3) WO2000056359A2 (pl)

Families Citing this family (268)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030157129A1 (en) * 1995-06-23 2003-08-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein
US7078042B2 (en) * 1995-09-15 2006-07-18 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
ATE355375T1 (de) 1996-01-04 2006-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Bakterioferritin aus helicobacter pylori
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US20010016200A1 (en) * 1998-04-23 2001-08-23 Briles David E. Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
WO1999061056A2 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Loeb Health Research Institute At The Ottawa Hospital Methods and products for inducing mucosal immunity
US6797275B1 (en) * 1998-12-04 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine
DE60032120T2 (de) 1999-03-19 2007-09-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Impstoff gegen Streptococcus pneumoniae
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP2284181A1 (en) 2000-10-27 2011-02-16 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A and B
GB2370770B (en) * 2001-01-03 2005-06-01 Simon Connolly Uses of Streptococcus Vaccines
US7082569B2 (en) 2001-01-17 2006-07-25 Outlooksoft Corporation Systems and methods providing dynamic spreadsheet functionality
ES2544979T3 (es) 2001-01-23 2015-09-07 Sanofi Pasteur Inc. Vacuna de conjugado de polisacárido-CRM197 meningocócica tri- o tetravalente
DK1361890T3 (da) 2001-02-23 2011-06-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Influenzavaccineformuleringer til intradermal indgift
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0109297D0 (en) * 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US8481043B2 (en) 2001-06-22 2013-07-09 Cpex Pharmaceuticals, Inc. Nasal immunization
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
ES2312649T3 (es) 2001-12-12 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis.
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US7501134B2 (en) 2002-02-20 2009-03-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
GB0302218D0 (en) 2003-01-30 2003-03-05 Chiron Sri Vaccine formulation & Mucosal delivery
DE60328481D1 (de) * 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
RU2378008C2 (ru) * 2002-05-14 2010-01-10 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс С.Р.Л. Комбинированные вакцины против бактериального менингита для введения через слизистую оболочку
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
EP2353608B1 (en) 2002-10-11 2019-12-18 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages
EP2314604A3 (en) * 2002-10-15 2011-05-25 Intercell AG Nucleic acids coding for adhesion factors of group B streptococcus, adhesion factors of group B streptococcus and further uses thereof
AR041881A1 (es) 2002-11-01 2005-06-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Procedimiento de secado para la obtencion de un liquido altamente viscoso que conserva la antigenicidad o actividad de una agente activo y vacuna obtenida a partir de el
BRPI0316018B8 (pt) 2002-11-12 2021-05-25 Brigham & Womens Hospital Inc vacina polissacarídica para infecções estafilocócicas
ATE466875T1 (de) 2002-11-15 2010-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
WO2004053104A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
JP2006520746A (ja) 2002-12-27 2006-09-14 カイロン コーポレイション リン脂質を含む免疫原性組成物
FR2850106B1 (fr) * 2003-01-17 2005-02-25 Aventis Pasteur Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
PT1587537E (pt) * 2003-01-30 2012-05-30 Novartis Ag Vacinas injetáveis contra múltiplos serogrupos meningocócicos
AU2004220590B2 (en) 2003-03-07 2010-02-18 Inhibitex, Inc. Polysaccharide - Staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
NZ541969A (en) * 2003-03-13 2008-01-31 Glaxosmithkline Biolog Sa Purifying pneumolysin from Streptococcus pneumoniae in a single chromatographic step by binding it to a hydrophobic interaction column in the presence of detergent and high salt
ES2423800T3 (es) 2003-03-28 2013-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Uso de compuestos orgánicos para la inmunopotenciación
US9107831B2 (en) 2003-06-02 2015-08-18 Novartis Vaccines And Diagonstics, Inc. Immunogenic compositions containing microparticles comprising adsorbed toxoid and polysaccharide-containing antigens
EP2277538A1 (en) 2003-10-02 2011-01-26 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Combined meningitis vaccines
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
JP5718545B2 (ja) 2004-04-30 2015-05-13 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル 髄膜炎菌結合体ワクチン接種
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
US7444197B2 (en) * 2004-05-06 2008-10-28 Smp Logic Systems Llc Methods, systems, and software program for validation and monitoring of pharmaceutical manufacturing processes
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
GB0411387D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Chiron Srl Analysis of saccharide length
GB0413868D0 (en) 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
CA2571710A1 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Nicholas Valiante Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
US20090317420A1 (en) 2004-07-29 2009-12-24 Chiron Corporation Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
HUE033196T2 (en) 2005-01-27 2017-11-28 Children's Hospital & Res Center At Oakland GNA1870-based vesicle vaccines for broad-spectrum protection against diseases caused by Neisseria meningitidis
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
US8062644B2 (en) 2005-02-18 2011-11-22 Novartis Vaccines & Diagnostics Srl. Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
DK2351772T3 (en) 2005-02-18 2016-09-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteins and nucleic acids from meningitis / sepsis-associated Escherichia coli
GB0505518D0 (en) 2005-03-17 2005-04-27 Chiron Srl Combination vaccines with whole cell pertussis antigen
US20070184072A1 (en) * 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN113198012A (zh) 2005-04-08 2021-08-03 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖－蛋白质缀合物组合物
JP2008536515A (ja) 2005-04-18 2008-09-11 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド ワクチンの調製のためのｂ型肝炎ウイルス表面抗原の発現
EP2201961B1 (en) 2005-06-27 2018-01-24 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
JP5135220B2 (ja) 2005-09-01 2013-02-06 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー 血清群ｃ髄膜炎菌を含む複数ワクチン接種
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
CA2630220C (en) 2005-11-22 2020-10-13 Doris Coit Norovirus and sapovirus antigens
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
NZ569076A (en) * 2005-12-22 2011-08-26 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine comprising capsular polysaccharides conjugates from Streptococcus pneumoniae serotypes 19A and 19F
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
MY150105A (en) * 2006-01-17 2013-11-29 Forsgren Arne A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein e; pe)
CN101024079B (zh) * 2006-02-17 2012-02-01 福州昌晖生物工程有限公司 肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法
KR101411425B1 (ko) * 2006-03-17 2014-06-24 더 거버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 더 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법
US10828361B2 (en) 2006-03-22 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
GB0605757D0 (en) 2006-03-22 2006-05-03 Chiron Srl Separation of conjugated and unconjugated components
ES2383209T3 (es) 2006-03-22 2012-06-19 Novartis Ag Regímenes para la inmunización con conjugados meningococicos
CA2646539A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
TWI494124B (zh) * 2006-03-30 2015-08-01 Glaxosmithkline Biolog Sa 免疫原組合物
MY148405A (en) * 2006-03-30 2013-04-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
WO2009030978A2 (en) * 2006-06-09 2009-03-12 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
GB0612854D0 (en) 2006-06-28 2006-08-09 Novartis Ag Saccharide analysis
CA2659552A1 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Novartis Ag Immunogens from uropathogenic escherichia coli
KR101467002B1 (ko) * 2006-10-10 2014-12-01 와이어쓰 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 다당류의 정제 방법
GB0700136D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Process for manufacturing vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
DK2167121T3 (en) * 2007-06-26 2015-11-23 Glaxosmithkline Biolog Sa A vaccine comprising Streptococcus pneumoniae kapselpolysaccharidkonjugater
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
CN101969992B (zh) 2007-09-12 2014-10-01 诺华股份有限公司 Gas57突变型抗原和gas57抗体
PL2200642T3 (pl) 2007-10-19 2012-09-28 Novartis Ag Preparaty szczepionek meningokokowych
JP2011503104A (ja) 2007-11-09 2011-01-27 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 免疫調節化合物ならびに関連組成物および方法
US8815253B2 (en) 2007-12-07 2014-08-26 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
CA2709927C (en) 2007-12-21 2017-05-16 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o
WO2009094730A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Newcastle Innovation Limited Vaccine compositions
AU2009215364B2 (en) 2008-02-21 2014-09-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Meningococcal fHBP polypeptides
EP2265640B1 (en) 2008-03-10 2015-11-04 Children's Hospital & Research Center at Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) containing a heterologous b domain and methods of use
EP3312158A1 (en) 2008-07-21 2018-04-25 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to synthetic beta-1,6 glucosamine oligosaccharides
DK2349520T3 (en) 2008-10-27 2016-08-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Purification Procedure for Group A Streptococcus Carbohydrate
DK2376108T3 (en) 2008-12-09 2017-04-24 Pfizer Vaccines Llc IgE CH3 peptide vaccine
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
WO2010070453A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
BRPI1005670A8 (pt) 2009-01-05 2017-12-26 Epitogenesis Inc composições adjuvantes e processos de uso.
MX2011007456A (es) 2009-01-12 2011-08-03 Novartis Ag Antigenos del dominio de proteina de superficie de union a colageno tipo b (can_b) en vacunas contra bacteria gram positiva.
RU2555757C2 (ru) 2009-03-24 2015-07-10 Новартис Аг Комбинации менингококкового фактор н-связывающего белка и пневмококковых сахаридных конъюгатов
EP2411048B1 (en) 2009-03-24 2020-05-06 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
ES2565377T3 (es) 2009-04-14 2016-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones para inmunización contra Staphylococcus aureus
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
EP3461496B1 (en) 2009-06-22 2023-08-23 Wyeth LLC Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
SG10201707084SA (en) 2009-06-22 2017-10-30 Wyeth Llc Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens
WO2011017101A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Fina Biosolutions, Llc Method for producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate
WO2011013034A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Pfizer Vaccines Llc Antigenic tau peptides and uses thereof
CA2772104A1 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
RU2538162C2 (ru) 2009-09-03 2015-01-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Вакцина против pcsk9
KR20120081587A (ko) 2009-09-10 2012-07-19 노파르티스 아게 기도 질병에 대한 조합 백신
JP5960055B2 (ja) 2009-10-27 2016-08-02 ノバルティス アーゲー 改変髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド
CN102971009A (zh) 2009-10-30 2013-03-13 诺华有限公司 金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
KR101427862B1 (ko) 2009-12-17 2014-08-07 피나 바이오솔루션스, 엘엘씨 접합 백신 제조시 다당류를 활성화시키기 위한 화학 시약
JP6007105B2 (ja) 2009-12-22 2016-10-12 セルデックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド ワクチン組成物
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
TR201802933T4 (tr) 2010-03-30 2018-03-21 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Özellikleri değiştirilmiş faktör h bağlama proteinleri (fhbp) ve bunların kullanım yöntemi.
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
WO2011127302A2 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Yue Shen Vehicle for delivering a compound to a mucous membrane and related compositions, methods and systems
EP2571982A4 (en) * 2010-05-20 2014-01-01 California Inst Of Techn ANTIGEN-SPECIFIC TREGS AND CORRESPONDING COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS
KR20130121699A (ko) 2010-05-28 2013-11-06 테트리스 온라인, 인코포레이티드 상호작용 혼성 비동기 컴퓨터 게임 기반구조
PT3170508T (pt) * 2010-06-04 2020-01-16 Wyeth Llc Formulações de vacinas
CA2800774A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Vaccines Llc Ige ch3 peptide vaccine
EP2576613A1 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
US10478483B2 (en) 2010-06-25 2019-11-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinations of meningococcal factor H binding proteins
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
WO2012085668A2 (en) 2010-12-24 2012-06-28 Novartis Ag Compounds
EP2667852B1 (en) 2011-01-27 2016-11-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvant nanoemulsions with crystallisation inhibitors
AU2012222883A1 (en) 2011-03-02 2013-10-17 Novartis Ag Combination vaccines with lower doses of antigen and/or adjuvant
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
ES2785108T3 (es) 2011-03-24 2020-10-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nanoemulsiones adyuvantes con fosfolípidos
EP2511295A1 (en) 2011-04-15 2012-10-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Compositions for preventing and/or treating an infection by an HIV-1 virus
US20130203980A1 (en) 2011-05-06 2013-08-08 Petr Gennadievich Aparin Exopolysaccharide of shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and pharmaceutical composition containing same
EP2723378A4 (en) 2011-06-24 2015-01-28 Epitogenesis Inc PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING A COMBINATION OF VECTORS, VITAMINS, TANNINS AND FLAVONOIDS SELECTED AS ANTIGEN-SPECIFIC IMMUNOMODULATORS
JP6088507B2 (ja) 2011-07-08 2017-03-01 ノバルティス アーゲー チロシンライゲーションの方法
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
ES2732708T3 (es) 2011-09-14 2019-11-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de fabricación de glucoconjugados de sacárido-proteína
WO2013043518A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Imidazopyridyl compounds as aldosterone synthase inhibitors
CA2854934A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Novartis Ag Carrier molecule comprising a spr0096 and a spr2021 antigen
EP2592137A1 (en) 2011-11-11 2013-05-15 Novartis AG Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use
DE102011122891B4 (de) 2011-11-11 2014-12-24 Novartis Ag Fermentationsmedium, das frei von tierischen Bestandteilen ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden zur Verwendung bei der Impfung von Menschen
GB2495341B (en) 2011-11-11 2013-09-18 Novartis Ag Fermentation methods and their products
DE102011118371B4 (de) 2011-11-11 2014-02-13 Novartis Ag Zur Impfung von Menschen geeignete Zusammensetzung, die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, sowie Verfahren zu deren Herstellung
BR112014013876A2 (pt) 2011-12-08 2019-09-24 Novartis Ag vacina à base de toxina de clostridium difficile
GB201121301D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Novartis Ag Method
AU2011384634A1 (en) 2011-12-29 2014-06-19 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor H binding proteins
WO2013124473A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Novartis Ag Pilus proteins and compositions
US20150132339A1 (en) 2012-03-07 2015-05-14 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
US20150125486A1 (en) 2012-03-08 2015-05-07 Novartis Ag Adjuvanted formulations of pediatric antigens
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
US10279026B2 (en) 2012-04-26 2019-05-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigens and antigen combinations
EP3804749A3 (en) 2012-04-26 2021-07-28 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigens and antigen combinations
CN104284674A (zh) 2012-05-04 2015-01-14 辉瑞公司 前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法
US10124051B2 (en) 2012-05-22 2018-11-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Meningococcus serogroup X conjugate
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
WO2014037472A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 Novartis Ag Combination vaccines with serogroup b meningococcus and d/t/p
AR092896A1 (es) 2012-10-03 2015-05-06 Novartis Ag Composiciones inmunogenicas
BR112015008040A2 (pt) 2012-10-12 2017-07-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição de vacina, vacina de combinação, e, processos para preparar um componente ap e para a fabricação de uma composição de vacina
CA2888300A1 (en) * 2012-10-17 2014-04-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
US20140193451A1 (en) * 2012-10-17 2014-07-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
BR112015018014A2 (pt) 2013-02-01 2017-07-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa liberação intradérmica de composições imunológicas compreendendo agonistas do receptor do tipo toll
EP2994161B1 (en) 2013-05-10 2020-10-28 California Institute of Technology Probiotic prevention and treatment of colon cancer
EP3689375A1 (en) 2013-05-15 2020-08-05 The Governors Of The University Of Alberta E1e2 hcv vaccines and methods of use
CN103386126B (zh) * 2013-06-25 2015-06-17 北京科兴生物制品有限公司 一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物
KR20180099912A (ko) 2013-09-08 2018-09-05 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
PT3096783T (pt) * 2014-01-21 2021-08-16 Pfizer Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos
ES2820824T3 (es) 2014-01-21 2021-04-22 Pfizer Composiciones inmunogénicas que comprenden antígenos sacáridos capsulares conjugados y usos de las mismas
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3104877B1 (en) 2014-02-11 2020-01-22 The USA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
EA034954B1 (ru) 2014-02-28 2020-04-10 Глаксосмитклайн Байолоджикалс Са МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHbp
EP2921856B1 (en) * 2014-03-18 2016-09-14 Serum Institute Of India Private Limited A quantitative assay for 4-pyrrolidinopyridine (4-ppy) in polysaccharide-protein conjugate vaccines
CN104829711B (zh) * 2014-04-08 2018-04-03 北京天成新脉生物技术有限公司 脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体及其应用
NZ729206A (en) 2014-07-23 2022-07-01 Children’S Hospital & Res Center At Oakland Factor h binding protein variants and methods of use thereof
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3034516A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Novartis AG Purification of streptococcal capsular polysaccharide
US10653764B2 (en) 2015-01-15 2020-05-19 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
CN104548090B (zh) * 2015-01-27 2016-11-30 中国科学院过程工程研究所 一种β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
WO2016184963A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Innavirvax Treatment of hiv-infected individuals
US11331335B2 (en) 2015-06-10 2022-05-17 California Institute Of Technology Sepsis treatment and related compositions methods and systems
EP3109255A1 (en) 2015-06-26 2016-12-28 Institut National De La Recherche Agronomique Immunogenic composition
CN107849119A (zh) 2015-07-07 2018-03-27 阿费里斯股份公司 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗
MX2018000867A (es) 2015-07-21 2018-05-15 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados, kits que las comprenden y sus usos.
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
CU20210061A7 (es) 2015-12-04 2022-02-04 Dana Farber Cancer Inst Inc Composición vacunal que comprende el dominio alfa 3 de mica/b para el tratamiento del cáncer
RU2718663C2 (ru) 2016-01-19 2020-04-13 Пфайзер Инк. Противораковые вакцины
US11612664B2 (en) 2016-04-05 2023-03-28 Gsk Vaccines S.R.L. Immunogenic compositions
WO2017220753A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
JP7001686B2 (ja) 2016-08-05 2022-02-04 サノフィ パスツール インコーポレイティッド 多価肺炎球菌多糖体－タンパク質コンジュゲート組成物
JP7001687B2 (ja) 2016-08-05 2022-02-04 サノフィ パスツール インコーポレイティッド 多価肺炎球菌多糖体－タンパク質コンジュゲート組成物
AU2017321039B2 (en) 2016-09-02 2021-03-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for Neisseria gonorrhoeae
WO2018065625A2 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Enterome Immunogenic compounds for cancer therapy
JP7116278B2 (ja) 2016-10-07 2022-08-10 エンテローム エスエー 癌治療のための免疫原性化合物
BE1025162B9 (fr) 2016-12-06 2019-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procede de purification pour les polysaccharides capsulaires
EP3570879B1 (en) 2017-01-20 2022-03-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
AU2018215585B2 (en) 2017-01-31 2022-03-17 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN110520154B (zh) * 2017-03-15 2023-08-04 株式会社Lg化学 多价肺炎链球菌疫苗组合物
BR112019020209A2 (pt) 2017-03-31 2020-06-02 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Composição imunogênica, uso de uma composição imunogênica, método de tratamento ou prevenção de uma recorrência de uma exacerbação aguda de doença pulmonar obstrutiva crônica, e, terapia de combinação.
WO2018178265A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
AU2018280272C1 (en) 2017-06-10 2021-05-06 Inventprise, Inc. Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity
BR112020001768A2 (pt) 2017-08-14 2020-09-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. método de reforçar uma resposta imune pré-existente contra haemophilus influenzae e moraxella catarrhalis não tipáveis em um indivíduo, e, protocolo de vacinação.
BR122021023687A8 (pt) 2017-12-06 2023-02-07 Merck Sharp & Dohme Usos de composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de proteína carreadora e polissacarídeo de s. pneumoniae
IL276230B2 (en) 2018-02-05 2024-01-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
WO2019152921A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2019173438A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Stc. Unm Compositions and methods for reducing serum triglycerides
CN112118863A (zh) 2018-04-11 2020-12-22 恩特罗姆公司 用于预防和治疗癌症的抗原肽
US20210106652A1 (en) 2018-04-11 2021-04-15 Enterome S.A. Immunogenic Compounds For Treatment Of Fibrosis, Autoimmune Diseases And Inflammation
TW202011985A (zh) 2018-04-18 2020-04-01 韓商Ｓｋ生物科學股份有限公司 肺炎鏈球菌的莢膜多醣類以及其免疫原性接合體
MX2021000548A (es) 2018-07-19 2021-07-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procesos para preparar polisacáridos en seco.
CA3107077A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes and vaccines
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3120922A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
JP2022513458A (ja) 2018-12-12 2022-02-08 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質
US20220296695A1 (en) 2018-12-19 2022-09-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
CA3129425A1 (en) 2019-02-11 2020-08-20 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
US20220184199A1 (en) 2019-04-10 2022-06-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
US20220221455A1 (en) 2019-04-18 2022-07-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigen binding proteins and assays
MX2021013736A (es) 2019-05-10 2021-12-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Produccion de conjugados.
WO2021023692A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for preparing a composition comprising a protein d polypeptide
JP2022543281A (ja) 2019-08-05 2022-10-11 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
EP4034157A1 (en) 2019-09-27 2022-08-03 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2021074389A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of adrenal cancer
IL292494A (en) 2019-11-01 2022-06-01 Pfizer Preparations of Escherichia coli and their methods
FI4021487T3 (fi) 2019-11-15 2024-02-06 Enterome S A Antigeenisiä peptidejä b-solun pahanlaatuisuuden ehkäisyyn ja hoitoon
EP4061412A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Dosage and administration of a bacterial saccharide glycoconjugate vaccine
US20220409539A1 (en) * 2019-12-30 2022-12-29 Fraunhofer Usa Inc. Particles for multi-dose delivery
WO2021165847A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
CA3173729A1 (en) 2020-02-23 2021-08-26 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN111588847B (zh) * 2020-05-18 2023-05-26 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种含有单磷酸化的脂质a与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用
EP4165064A2 (en) 2020-06-12 2023-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Dock tag system
PE20231934A1 (es) 2020-10-27 2023-12-01 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas
MX2023005221A (es) 2020-11-04 2023-05-16 Pfizer Composiciones inmunogenicas para uso en vacunas neumococicas.
EP4243863A2 (en) 2020-11-10 2023-09-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
US20220265805A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Sanofi Pasteur Inc. Meningococcal b recombinant vaccine
JP2024510717A (ja) 2021-02-22 2024-03-11 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物、使用及び方法
EP4070814A1 (en) 2021-04-07 2022-10-12 Lama France Sars-cov-2 polypeptides and uses thereof
US20220387613A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023092090A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Matrivax, Inc. Immunogenic fusion protein compositions and methods of use thereof
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
KR20230116601A (ko) 2022-01-28 2023-08-04 이동민 머신 좌표계와 영상 좌표계의 정합 방법 및 장치
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023187127A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
WO1990006951A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
RU2118164C1 (ru) 1992-06-25 1998-08-27 Смитклайн Бичам Байолоджикалс, С.А. Вакцинная композиция, обладающая свойством вызывать цитолитический т-клеточный ответ у млекопитающих, способ получения цитолитического т-клеточного ответа in vivo, способ получения вакцины
ATE211654T1 (de) * 1992-09-16 2002-01-15 Univ Tennessee Res Corp Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff
AU685443B2 (en) 1993-03-23 1998-01-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
EP0699076B1 (en) 1993-05-18 2002-10-30 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
ES2210262T3 (es) 1993-09-22 2004-07-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Procedimiento que permite activar un glucido soluble con la ayuda de nuevos reactivos cianilantes para producir estructuras inmunogenas.
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
ES2366201T3 (es) 1994-07-15 2011-10-18 University Of Iowa Research Foundation Oligonucleótidos inmunmoduladores.
US5565204A (en) * 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5681570A (en) * 1995-01-12 1997-10-28 Connaught Laboratories Limited Immunogenic conjugate molecules
KR19990007858A (ko) * 1995-04-17 1999-01-25 존 더블유.로우 박테리아의 리포프로테인으로 폴리사카라이드에 대한 면역반응의 유도및 강화
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
DE69637597D1 (de) 1995-06-07 2008-08-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vakzine mit einem Polysaccharide Antigen-Trägerprotein Konjugat und freiem Trägerprotein
AP9701163A0 (en) 1995-06-07 1998-01-31 Biochem Vaccines Inc Streptococcal heat shock proteins members of the HSP70 family.
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
SE9601158D0 (sv) 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
US6245335B1 (en) * 1996-05-01 2001-06-12 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
JP2000511411A (ja) 1996-05-01 2000-09-05 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 抗―肺炎球菌ワクチン用のコリン結合タンパク質
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JPH102001A (ja) * 1996-06-15 1998-01-06 Okajima Kogyo Kk グレーチング
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
ATE380867T1 (de) 1997-06-03 2007-12-15 Sanofi Pasteur Ltd Lactoferrinrezeptorgen von moraxella
WO1999003884A2 (en) 1997-07-21 1999-01-28 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
US20050031638A1 (en) * 1997-12-24 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6709658B1 (en) * 1998-02-12 2004-03-23 Wyeth Holdings Corporation Pneumococcal vaccines formulated with interleukin-12
WO1999051266A2 (en) 1998-04-07 1999-10-14 Medimmune, Inc. Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
NZ509986A (en) 1998-08-19 2003-10-31 Baxter Healthcare S Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines
EP2050464B1 (en) * 1998-12-21 2019-08-07 Medimmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
DE60032120T2 (de) * 1999-03-19 2007-09-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Impstoff gegen Streptococcus pneumoniae
GB9909077D0 (en) * 1999-04-20 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Novel compositions
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN201252175Y (zh) * 2008-08-04 2009-06-03 富士康(昆山)电脑接插件有限公司 线缆连接器组件

Also Published As

Publication number Publication date
NL300415I1 (nl) 2009-12-01
NO330532B1 (no) 2011-05-09
AU750762B2 (en) 2002-07-25
NO20014322D0 (no) 2001-09-05
CZ20013380A3 (cs) 2002-03-13
ES2275499T3 (es) 2007-06-16
EP1163000A2 (en) 2001-12-19
CY1107390T1 (el) 2010-07-28
EP1880735A3 (en) 2008-03-12
MY125387A (en) 2006-07-31
JP2002540075A (ja) 2002-11-26
CY1107561T1 (el) 2013-03-13
WO2000056359A2 (en) 2000-09-28
JP2002539273A (ja) 2002-11-19
HU228499B1 (en) 2013-03-28
KR20020000785A (ko) 2002-01-05
PL355178A1 (pl) 2004-04-05
CA2365296A1 (en) 2000-09-28
IL145045A0 (en) 2002-06-30
AU750913B2 (en) 2002-08-01
HUS1500040I1 (hu) 2018-05-28
CY2009014I2 (el) 2010-07-28
PL204890B1 (pl) 2010-02-26
PT1163000E (pt) 2008-03-20
US20100291138A1 (en) 2010-11-18
HK1043728B (zh) 2007-06-22
AR022963A1 (es) 2002-09-04
MY125202A (en) 2006-07-31
PL355264A1 (pl) 2004-04-05
CN1391481A (zh) 2003-01-15
JP2002540074A (ja) 2002-11-26
ATE387214T1 (de) 2008-03-15
TWI235064B (en) 2005-07-01
TWI286938B (en) 2007-09-21
DE60038166T2 (de) 2009-03-12
CZ301445B6 (cs) 2010-03-03
AU750788B2 (en) 2002-07-25
US20100119544A1 (en) 2010-05-13
WO2000056360A3 (en) 2001-01-25
TR200102736T2 (tr) 2002-04-22
NO20014325D0 (no) 2001-09-05
HUP0200373A2 (en) 2002-06-29
HU229968B1 (hu) 2015-03-30
IL145044A (en) 2007-03-08
US8926985B2 (en) 2015-01-06
CY2009014I1 (el) 2010-07-28
PT1162999E (pt) 2007-02-28
US20060002961A1 (en) 2006-01-05
WO2000056360A2 (en) 2000-09-28
EP1776962A1 (en) 2007-04-25
AU3430700A (en) 2000-10-09
IL145043A (en) 2007-06-17
US20060093626A1 (en) 2006-05-04
BR0009163A (pt) 2001-12-26
CZ303653B6 (cs) 2013-01-30
EP1162998A2 (en) 2001-12-19
EP2277535A2 (en) 2011-01-26
CA2366152A1 (en) 2000-09-28
CN100339130C (zh) 2007-09-26
ATE459373T1 (de) 2010-03-15
CA2366314C (en) 2012-01-10
US20050031646A1 (en) 2005-02-10
JP2011057713A (ja) 2011-03-24
DE60038166D1 (de) 2008-04-10
CN1351503A (zh) 2002-05-29
DE60043930D1 (de) 2010-04-15
US9168313B2 (en) 2015-10-27
NZ513841A (en) 2001-09-28
CA2366314A1 (en) 2000-09-28
AU3813600A (en) 2000-10-09
EP1880735A2 (en) 2008-01-23
NO20014322L (no) 2001-11-14
HK1043728A1 (en) 2002-09-27
NO20014323D0 (no) 2001-09-05
DE122009000054I1 (de) 2009-12-31
LU91652I2 (fr) 2010-10-13
HK1043731A1 (en) 2002-09-27
AR022964A1 (es) 2002-09-04
US20030147922A1 (en) 2003-08-07
CN1192798C (zh) 2005-03-16
TR200102739T2 (tr) 2001-12-21
NO2011014I2 (no) 2011-08-30
ATE346608T1 (de) 2006-12-15
SI1162999T1 (sl) 2007-04-30
US20110217329A1 (en) 2011-09-08
DK1162999T3 (da) 2007-03-26
EP1162998B1 (en) 2010-03-03
ES2300255T3 (es) 2008-06-16
BRPI0009163B8 (pt) 2021-05-25
JP5551579B2 (ja) 2014-07-16
WO2000056358A3 (en) 2001-01-04
NZ513842A (en) 2004-05-28
KR100642044B1 (ko) 2006-11-10
DE60032120T2 (de) 2007-09-20
WO2000056358A2 (en) 2000-09-28
DK1163000T3 (da) 2008-04-28
TWI281403B (en) 2007-05-21
BRPI0009163B1 (pt) 2019-04-09
AR022965A1 (es) 2002-09-04
NO2011014I1 (no) 2011-09-19
EP2277535A3 (en) 2011-03-09
NO330736B1 (no) 2011-06-27
SI1163000T1 (sl) 2008-06-30
IL145043A0 (en) 2002-06-30
EP1162999B1 (en) 2006-11-29
MXPA01009452A (es) 2002-08-06
CN1351501A (zh) 2002-05-29
NL300415I2 (pl) 2016-12-13
KR100798212B1 (ko) 2008-01-24
LU91652I9 (pl) 2019-01-03
BR0009166A (pt) 2001-12-26
WO2000056359A3 (en) 2001-02-01
TR200102735T2 (tr) 2002-04-22
KR20020000549A (ko) 2002-01-05
JP4846906B2 (ja) 2011-12-28
CZ20013378A3 (cs) 2002-03-13
NO20014325L (no) 2001-11-14
HK1043730A1 (zh) 2002-09-27
HK1043731B (zh) 2009-01-23
FR10C0008I2 (fr) 2012-10-26
EP1162999A2 (en) 2001-12-19
IL145044A0 (en) 2002-06-30
AU3291900A (en) 2000-10-09
FR10C0008I1 (fr) 2010-03-26
CZ20013379A3 (cs) 2002-03-13
CN1191852C (zh) 2005-03-09
HUP0200367A2 (en) 2002-05-29
PL355180A1 (pl) 2004-04-05
NO20014323L (no) 2001-11-14
US20150079125A1 (en) 2015-03-19
NZ513840A (en) 2004-02-27
DE60032120D1 (de) 2007-01-11
ES2339737T3 (es) 2010-05-25
EP1163000B1 (en) 2008-02-27
BE1025464I2 (pl) 2019-03-06
BR0009154A (pt) 2001-12-26
KR20020001785A (ko) 2002-01-09
HUP0200664A2 (en) 2002-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9168313B2 (en) Vaccine
US20150079129A1 (en) Vaccine
MXPA01009459A (es) Vacuna
MXPA01009455A (en) Vaccine