CN102971009A

CN102971009A - 金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化

Info

Publication number: CN102971009A
Application number: CN2010800605540A
Authority: CN
Inventors: P·科斯塔蒂诺; M·R·罗马诺; F·伯尔蒂
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-11-01
Publication date: 2013-03-13
Also published as: RU2579900C2; LT2493498T; US20150315225A1; RS56000B1; US20190169216A1; EP3199177A1; HUE034251T2; PT2493498T; DK2493498T3; US20160376301A1; RU2012122237A; US20220089627A1; CA2779578A1; AU2010310919A1; EP2493498B1; AU2010310919B2; US20120282295A1; PL2493498T3; CY1118905T1; ES2626416T3

Abstract

发明提供一种从金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型或8型细胞中释放荚膜多糖的方法，包括酸处理细胞的步骤。发明还提供包含该方法的从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞中纯化荚膜多糖的工艺。其他的加工步骤可能也包括在该工艺中，例如酶处理，如除去核酸，蛋白和/或肽聚糖污染物；渗滤，如除去小分子量污染物；阴离子交换色谱，如除去残余蛋白；和浓缩。

Description

金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化

本申请要求2009年10月30日提交的美国临时专利申请序列号61/256,905的优先权，其通过引用全文纳入本文。

技术领域

本发明属于纯化细菌荚膜多糖领域，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的5型和8型荚膜多糖，并且具体用于制备疫苗。

技术背景

在抵御有荚膜细菌的疫苗中使用细菌的荚膜糖已有多年历史。然而，由于糖是不依赖于T细胞的抗原，它们的免疫原性很弱。与载体偶联可将T-非依赖性抗原转化成T-依赖性抗原，从而增强记忆应答，并产生保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶联物，原型偶联疫苗针对流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(‘Hib’)[例如见参考文献96的第14章]。

已经记载另一偶联疫苗的细菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。已经从金黄色葡萄球菌中分离到多种多糖用于糖偶联物。两种特别感兴趣的多糖是5型和8型荚膜多糖。大约60％的人金黄色葡萄球菌菌株是8型，大约30％是5型。有关5型和8型偶联物的大量工作是由Fattom等进行的，可参见文献如参考文献1-9。

基于多糖的疫苗的出发点是多糖本身，通常纯化自目标细菌。Fattom等开发了一个纯化5型和8型荚膜多糖的复杂工艺，该方法在参考文献1中有详细描述，并且包括下列细菌培养后的关键步骤：在缓冲液中悬浮细菌细胞，溶葡球菌酶处理，DNase和RNase处理，离心，缓冲液透析，蛋白酶处理，进一步透析，过滤，加入乙醇到25％和氯化钙来沉淀污染物；进一步加入乙醇到75％来沉淀多糖；收集和干燥沉淀物；阴离子交换色谱；透析；冻干；大小排阻层析；透析和最后冻干。

Fattom工艺涉及到使用溶葡球菌酶来裂解细菌细胞壁并从而释放荚膜多糖。然而，该步骤耗费时间并使得该工艺难以扩大到工业生产。它也增加了整体成本和工艺的复杂性。其他研究者试图省略这个步骤并开发一个更简单且更高效的多糖纯化方法。例如，参考文献[10]描述另一工艺，包括高压灭菌金黄色葡萄球菌细胞，超滤含多糖的上清液，浓缩，冻干，用偏过碘酸钠处理，进一步超滤，渗滤，高效大小排阻液相色谱，透析和冻干。作者指出该方提供了高产率并且适合多糖的大规模生产。该方法中溶葡球菌酶处理被高压灭菌取代以释放荚膜多糖。该方法在文献[10]中进一步发展。在这些替代方法中的一个重要步骤是偏过碘酸钠处理。该步骤用于去除荚膜多糖中的磷壁酸污染物。然而，该步骤又一次增加了该工艺的持续性，复杂性和整体成本。参考文献[12]描述了一个相似的工艺，该方法也涉及到高压灭菌释放荚膜多糖和偏过碘酸钠处理除去磷壁酸。相反，大部分其他小组使用保留溶葡球菌酶处理的工艺(例如，见参考文献13，14，15，16，17和18)，有时包括偏过碘酸钠处理(例如，参考文献13和14)。

上述方法复杂，并且可能在所得多糖中遗留污染物。因此，需要进一步改善工艺来纯化金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖，并且特别是产生较少污染物的较简单的工艺。

发明内容

本发明是基于最初通过酸处理从细菌细胞中释放多糖的纯化工艺。该步骤无需溶葡球菌酶处理，并且能用于替代上述工艺中的高压灭菌。发明人发现该工艺产生磷壁酸污染较低的纯化多糖。这意味着偏过碘酸钠处理多糖不是必须的。纯化多糖也有低肽聚糖污染，使其特别适合医学应用。因为前面工艺的费力步骤不是必须的，所以发明者的工艺迅速而简单。

本发明提供了一种从金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型或8型细胞中释放荚膜多糖的方法，包括酸处理细胞的步骤。发明还提供了包含这种工艺的从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞中纯化荚膜多糖的过程。其他加工步骤也可包括在此工艺中，例如酶处理，如移除核酸、蛋白和/或肽聚糖污染物；渗滤，如移除小分子量污染物；阴离子交换色谱，如移除剩余蛋白；和浓缩。

因此，本发明提供了一种包含酸处理金黄色葡萄球菌5型或8型细胞以释放多糖的纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺。相似的，本发明提供在纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺中，由使用酸处理金黄色葡萄球菌5型或者8型细胞释放多糖组成的改良。酸处理释放无需溶葡球菌酶处理或者高压灭菌释放多糖。

本发明也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺，其中，该工艺不包括溶葡球菌酶处理的步骤。相似的，本发明提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺，其中，该工艺不包括偏过碘酸钠处理的步骤。通常，该工艺不包括上述步骤中的一个或者两个。

本发明也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺，其中，该工艺提供了包含多糖和肽聚糖污染水平相对于多糖总重小于5％重量(例如≤4％，≤3％，≤2％，≤1％等)的组合物。通常，该组合物包括小于4％重量的肽聚糖，特别是小于3％。发明者发现使用发明方法得到大约2％或者甚至大约1％的水平。发明者发现具有此肽聚糖水平的组合物可用于疫苗生产。相反，参考文献17教授了高于5％的水平即可用于该目的。肽聚糖污染水平可以用本文所述方法测量。

相似的，本发明提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺，其中，该工艺提供了包含多糖和蛋白质污染重量水平相对于多糖总重小于5％(例如≤4％，≤3％，≤2％，≤1％等)的组合物。通常，该组合物包括小于3％重量的蛋白质，特别是小于约2.4％蛋白质污染水平可以用MicroBCA分析(皮尔斯公司(Pierce))来测量。

该发明也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺，其中，该工艺提供了包含多糖和核酸污染水平相对于多糖总重小于1％重量(例如≤0.75％，≤0.50％，≤0.25％，≤0.10％，≤0.01％等)的组合物。通常，该组合物包括小于0.25％重量的核酸，特别是小于约0.09％核酸污染水平可以用分光光度计的260纳米吸收值来测量。

本发明也提供了纯化金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的工艺，其中，(a)肽聚糖污染水平小于5％(如上所述)；(b)蛋白质污染水平小于5％(如上所述)；(c)核酸污染水平小于1％(如上所述)。

本发明也提供了含可由发明任何工艺获得的金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物。

具体地，本发明提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物，其中，该组合物包括肽聚糖重量相对于多糖总重小于5％(例如≤4％，≤3％，≤2％，≤1％等)的肽聚糖污染水平。通常，该组合物包括小于3％重量的肽聚糖，特别是小于2％。本发明可特定提供大约2％或者甚至大约1％水平的组合物。

相似的，本发明提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物，其中，该组合物包括蛋白质重量相对于多糖总重小于5％(例如≤4％，≤3％，≤2％，≤1％，≤05％，等)的蛋白质污染水平。通常，该组合物包括小于3％重量的蛋白质，特别是小于约2.4％。

本发明也提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物，其中，该组合物包括核酸重量相对于多糖总重小于1％(例如≤0.75％，≤0.50％，≤0.25％，≤0.10％，≤0.01％，等)的核酸污染水平。通常，该组合物包括小于0.25％重量的核酸，特别是小于约0.09％。

本发明也提供了含有金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的组合物，其中，(a)肽聚糖污染水平小于5％(如上所述)；(b)蛋白质污染水平小于5％(如上所述)；(c)核酸污染水平小于1％(如上所述)。

荚膜多糖

本发明基于金黄色葡萄球菌5型和8型的荚膜多糖。5型和8型荚膜多糖的结构参见参考文献19和20，例如：

5型

→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→4)-β-D-FucNAc-(1→

8型

→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→

近期的NMR谱图数据[21]将这些结构修正为：

5型

→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→

8型

→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→

多糖从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞中释放后，其相对于自然界存在的荚膜多糖，所述多糖可以被化学修饰。例如，多糖可去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等。可在其他加工步骤之前、期间或之后进行去乙酰化，但通常在偶联步骤前进行。根据具体多糖，去乙酰化可能或可能不影响其免疫原性，如NeisVac-C^TM疫苗采用去-O-乙酰化的多糖，而Menjugate^TM是乙酰化的，但这两种疫苗都有效。可用常规实验评价去乙酰化等的影响。例如，金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖上O-乙酰化的相关性可参见参考文献6。据该文献描述，天然多糖具有75％O-乙酰化。这些多糖将抗体诱导至多糖主链和O-乙酰基上。具有0％O-乙酰化的多糖仍然引发针对该多糖主链的抗体。两种抗体类型对O-乙酰基含量不同的金黄色葡萄球菌菌株有调理活性。因此，本发明所用的5型或8型荚膜多糖可具有0-100％的O-乙酰化。例如，5型荚膜多糖的O-乙酰化程度可以是10-100％、10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或80-90％。或者，可采用0％O乙酰化的5型荚膜多糖。相似地，8型荚膜多糖的O乙酰化程度可以是10-100％，10-100％，20-100％，30-100％，40-100％，50-100％，60-100％，70-100％，80-100％，90-100％，50-90％，60-90％，70-90％或80-90％。或者，可采用0％O-乙酰化的8型荚膜多糖。在一个实施方式中，5型和8型荚膜多糖的O-乙酰化程度可以是10-100％，20-100％，30-100％，40-100％，50-100％，60-100％，70-100％，80-100％，90-100％，50-90％，60-90％，70-90％或80-90％。在其它实施方式中，使用0％O-乙酰化的5型和8型荚膜多糖。本发明所用5型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100％，50-100％，75-100％，80-100％，90-100％或95-100％。通常5型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100％。相似地，本发明所用8型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100％，50-100％，75-100％，80-100％，90-100％或95-100％。通常8型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100％。在一个实施方式中，5型和8型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100％，50-100％，75-100％，80-100％，90-100％或95-100％。通常，5型和8型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100％。

多糖的O-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法测定，例如质子NMR(如参考文献22、23、24或25所述)。参考文献26中记载了另一种方法。可采用类似方法测定多糖的N-乙酰化程度。可通过水解去除O-乙酰基，例如用碱如无水肼[27]或NaOH[6]处理。可使用类似方法去除N-乙酰基。为了维持5型和/或8荚膜多糖上的高水平O-乙酰化，最大程度减少导致O-乙酰基水解的处理，例如在极端pH下的处理。

原料

本发明工艺从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞开始。通常，细胞在释放荚膜多糖前通过发酵生长。培养金黄色葡萄球菌5型或8型细胞的合适方法对于技术人员是熟知的且公开于例如参考文献1-21和其中所引用的参考文献。细胞生长之后，通常灭活细胞。适当的灭活方是用苯酚：乙醇处理，例如参考文献1所述。

在释放荚膜多糖前可离心细胞。因此该工艺可能以湿细胞体形式的细胞开始。然而，通常，细胞在适合该工艺下一步的液体培养基中重新悬浮，例如缓冲液或者蒸馏水。细胞重新悬浮前可以用该培养液清洗。在另一实施方式中，细胞可以在其初始培养基中悬浮处理。或者，细胞以干燥形式处理。

酸处理

本发明的方法中，金黄色葡萄球菌5型或8型细胞用酸处理。这个步骤造成细胞释放荚膜多糖。相反，原来的方法使用溶葡球菌酶处理或者高压灭菌来释放多糖。本发明的酸处理优选使用温和酸来降低对多糖的损害，例如乙酸。本领域技术人员能够鉴定适用于多糖释放的酸和条件(如浓度、温度和/或时间)。例如，本发明人发现细胞以约0.5mg/ml悬浮于蒸馏水，用1％乙酸(v/v)在100℃处理2小时是合适的。也可能适合用其它酸，如三氟乙酸或其它有机酸进行处理。

不同酸处理的功效可以用常规方法测试。例如，酸处理后，细胞可以分离并且用已知金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖释放方法处理(例如，参考文献1中的溶葡球菌酶方法)来检查是否能释放额外的荚膜多糖。如果释放额外的荚膜多糖，则可以改变酸处理条件使得酸处理过程释放更高比例的荚膜多糖。这个方法中，可以优化酸处理条件使得释放最优量的荚膜多糖。例如，本发明人发现细胞以约0.5mg/ml悬浮于蒸馏水，用1％乙酸(v/v)在100℃处理2小时之后，随后溶葡球菌酶处理细胞释放极少的额外荚膜多糖。

发明人发现经过酸处理，5型荚膜多糖O-乙酰化程度可以是60-100％。具体地，O-乙酰化程度可以是65-95％，特别是70-90％。通常，O-乙酰化程度是75-85％，例如大约80％。8型荚膜多糖可以获得相似的值。如果需要，荚膜多糖的O-乙酰化程度可以用上述进一步加工步骤改变。

酸处理后，反应混合物通常被中和。这可以通过加入一种碱例如NaOH来完成。细胞可离心，并且可以收集含多糖的上清液用于贮存和/或其他工艺。

酶处理

酸处理后得到的多糖可能不纯，并且有细菌核酸和蛋白质污染物。这些污染物可以用酶处理除去。例如，RNA可以用RNase，DNA用DNase，蛋白质用蛋白酶(例如链霉蛋白酶)处理除去。技术人员能够确定除去污染物的合适酶和条件。例如，发明者发现用50μg/ml的DNase和RNase在37℃处理含多糖上清液6-8小时是合适的。文献中公开了其他合适的条件，例如参考文献1。

酸处理后获得的多糖也可以，或者另外被肽聚糖污染。这些污染物也可以用酶处理除去。发明者发现变溶菌素处理对除去肽聚糖污染是有效的。技术人员能够确定用变溶菌素除去肽聚糖的合适条件。例如，发明者发现用180U/ml变溶菌素在37℃处理含多糖上清液16小时是合适的。处理后，悬浮液可用离心来澄清，并且可以收集含多糖上清液用于贮存和/或其他工艺。

渗滤

本发明工艺可以包括一个渗滤步骤。该步骤一般在上述酸处理和/或酶处理后进行。发明者发现渗滤步骤具体是切向流过滤，对于除去多糖中的杂质特别有效。杂质一般为小分子量污染物，如磷壁酸和/或肽聚糖片段。切向流过滤适合对1M NaCl(例如对约10体积)，然后对NaPi 10mM pH 7.2缓冲液(例如对另一10体积)进行。因此，滤膜应该可以通过小分子量污染物，而保留荚膜多糖。通常，截留范围是10-30kDa。本发明人发现使用30kDa截留膜的切向流过滤特别适合大规模工艺。

一般使用至少5个切向流过滤循环，例如，6、7、8、9、10、11或更多。

可以收集来自渗滤的含多糖滞留物用于贮存和/或其他工艺。

阴离子交换色谱

多糖可以用阴离子交换色谱步骤来进一步纯化。发明人已发现，阴离子交换色谱对于除去多糖中的残余蛋白质和核酸污染且同时维持多糖的良好产率特别有效。

可在上述酸处理，酶处理和/或渗滤步骤后进行阴离子交换色谱步骤。

可用任何合适的阴离子交换基质进行阴离子交换色谱。常用的阴离子交换基质是树脂，例如Q-树脂(基于季铵)和DAEA树脂(基于二乙基氨基乙烷)。发明人已发现尽管其他树脂也可以使用，但是DEAE树脂(例如琼脂糖^TM快速流动树脂(通用电气医疗集团(GE Health))特别合适。

阴离子交换色谱的合适起始缓冲液和流动相缓冲液也可通过常规实验确定而没有过多负担。用于阴离子交换色谱的典型缓冲液包括N-甲基哌嗪、哌嗪、L-组氨酸、双Tris、双Tris丙烷、三乙醇胺、Tris、N-甲基二乙醇胺、二乙醇胺、1，3-二氨基丙烷、乙醇胺、哌啶、氯化钠和磷酸缓冲盐。发明人已发现磷酸缓冲液例如硫酸钠缓冲液，适合作为阴离子交换色谱的起始缓冲液。缓冲液可以是任何合适的浓度。例如，发现10mM磷酸钠是合适的。结合阴离子交换树脂的物质可用合适的缓冲液洗脱。发明人已发现NaCl1M梯度是合适的。

可通过测定215nm处的UV吸光度测定含多糖的洗脱部分。含有多糖的部分通常合并在一起，可以收集用于贮存和/或其他工艺。

可重复阴离子交换色谱步骤，例如1、2、3、4或5次。一般阴离子交换色谱步骤进行一次。

凝胶过滤

本发明的工艺可涉及一个或多个凝胶过滤步骤。采用该凝胶过滤选择特定长度的多糖分子，并进一步减少污染，特别是蛋白质的污染。然而，发明人已发现与前面如参考文献1-9的方法相反，凝胶过滤步骤对获得高纯多糖不是必须的。因此，该步骤从本发明的工艺中省略。省略此步骤有利，因为它简化了工艺并且降低了总体成本。

使用时，可在上述酸处理、酶处理、渗滤和/或阴离子交换色谱步骤后进行凝胶过滤步骤。一般，可在上述阴离子交换色谱步骤后进行任何凝胶过滤步骤。

可用任何合适的凝胶过滤基质进行凝胶过滤步骤。常用的凝胶过滤基质是基于葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰吗啉凝胶和聚苯乙烯凝胶等。还可使用交联的葡聚糖凝胶和混合的聚丙烯酰胺/琼脂糖凝胶。发明人发现了葡聚糖凝胶(例如Sephacryl^TM S300凝胶(通用电气医疗集团))特别合适，虽然也可用其它凝胶。

可用常规实验不受过多负担地测定合适的凝胶过滤的流动相缓冲液。用于凝胶过滤的典型缓冲液包括N-甲基哌嗪、哌嗪、L-组氨酸、双Tris、双Tris丙烷、三乙醇胺、Tris、N-甲基二乙醇胺、二乙醇胺、1，3-二氨基丙烷、乙醇胺、哌啶、氯化钠和磷酸缓冲盐。例如，适用氯化钠缓冲液。缓冲液可以是任何合适的浓度。例如，50mM氯化钠可用于流动相。

浓缩

除了凝胶过滤的一个或多个步骤以外，或作为替代，本发明的工艺可涉及一个或多个浓缩多糖的步骤。此浓缩用于获得正确浓度的样品以随后如下所述偶联多糖与载体分子。然而，本发明人发现了该浓缩步骤对于获得高纯度多糖类不是必需的。因此，该步骤从本发明的工艺中省略。

使用时，可在上述酸处理、酶处理、渗滤、阴离子交换色谱和/或凝胶过滤步骤后进行浓缩步骤。一般，可在上述阴离子交换色谱步骤后进行任何浓缩步骤。如果在上述凝胶过滤步骤外使用，浓缩步骤可以在上述凝胶过滤步骤之前或之后进行。然而，通常使用浓缩步骤代替凝胶过滤步骤。

可用任何合适的方法进行浓缩步骤。例如，发明人发现了浓缩步骤可以是上述渗滤步骤，例如使用30kDa截留膜的切向流过滤。例如，可用Hydrosart^TM(赛多利斯(Sartorius))30kDa截留膜(具有200cm²膜面积)。

收集浓缩的多糖样品以用于贮存和/或其他工艺。

荚膜多糖的其他处理

纯化后，可进一步处理糖以除去污染物。这在甚至非常微量的污染也不能接受(例如对于人疫苗生产)的情况下特别重要。

纯化的金黄色葡萄球菌5型或者8型荚膜多糖的分子量可以用凝胶过滤相对支链淀粉标准测定，例如来自PSS公司(Polymer Standard Service)的那些[28]。通常，纯化多糖是质量在一定范围值之内的多糖混合物。就5型荚膜多糖而言，纯化多糖的分子量通常为2-3500kDa，例如10-2000kDa，具体是20-1000kDa，更具体是100-600kDa。相似的，就8型荚膜多糖而言，纯化多糖的分子量通常为2-3500kDa，例如10-2000kDa，具体是20-1000kDa，更具体是100-600kDa。

该纯化多糖可解聚形成寡糖。优选将寡糖用于疫苗。解聚形成寡糖可以在上述任何步骤之前或者之后发生。通常，解聚在上述阴离子交换色谱后发生。如果多糖在此色谱后浓缩，则解聚一般在浓缩后发生。本发明组合物包含解聚多糖时，优选在任何偶联前进行解聚。

可通过各种方法解聚全长多糖，以得到较短片段用于本发明。优选采用参考文献29所述的方法。或者，可采用其它多糖解聚方法。例如，多糖可以加热或者接受微流化[30]或声辐射[3]。或者，可采用通过氧化还原[31]或臭氧分解[32]的解聚。

可通过色谱如大小排阻色谱来鉴定寡糖。产物可以依大小排列来去除长度较短的寡糖。该步骤可以用多种方法完成，比如凝胶过滤。具体的分子量可通过凝胶过滤相对于支链淀粉标准测定，如来自PSS公司(PolymerStandard Service)的那些[33]。

如果天然荚膜多糖的N-乙酰基被去N-乙酰化，则本发明的工艺还可包括重N-乙酰化的步骤。可用试剂例如乙酸酐(CH₃CO)₂O，例如5％碳酸氢铵中，方便地进行受控的重N-乙酰化[34]。

还可进行更多轮的过滤，例如无菌过滤。

这些额外的步骤通常可在室温下进行。

储存

金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖制品可冻干，例如通过真空下冷冻干燥或在溶液中冷冻(例如要是包含的话，作为最终浓缩步骤的洗脱物)用于在纯化工艺的任何阶段储存。因此，不需要将制品从工艺的一个步骤立即转移到另一步骤。例如，如果多糖制品待通过渗滤纯化，则可以在该纯化前冻干或在溶液中冷冻。类似的，多糖可在阴离子交换色谱步骤前冻干或在溶液中冷冻。如果多糖制品待通过凝胶过滤纯化，则可以在该步骤前冻干或在溶液中冷冻。类似的，如果多糖制品待浓缩，则可以在该步骤前冻干或在溶液中冷冻。在进一步处理前，在合适的溶液中重建冻干制品。类似的，在进一步处理前解冻冷冻的溶液。

本发明工艺获得的纯化多糖可以任何合适的方式加工用于储存。例如，可以如上所述冻干多糖。或者，可在水溶液中，通常在低温下，例如在-20℃储存多糖。多糖可以作为来自阴离子交换色谱、凝胶过滤或浓缩步骤的洗脱物方便地储藏。

偶联

本发明最终纯化的荚膜多糖可用作抗原而不经进一步修饰，例如用于体外诊断实验，用于免疫接种等。

然而，为了免疫接种目的优选将多糖与载体分子例如蛋白质偶联。通常，共价偶联多糖与载体分子提高了多糖的免疫原性，因为偶联可以将多糖由T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，由此可引发免疫记忆。偶联对于儿科疫苗特别有用[例如参考文献35]，而且是公知技术[例如在参考文献36-44中综述]。因此，本发明的工艺还可以包括将纯化的多糖与载体分子偶联的步骤。

金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的偶联被广泛报道，例如参见参考文献1-9。参考文献中使用的偶联的典型工艺包括使用胱胺把纯化多糖巯基化。该反应依赖荚膜多糖中存在羧基基团。这些基团在碳二亚胺如EDAC存在下与胱胺发生反应。然后，将衍生多糖偶联于运载体蛋白如绿脓假单胞菌(Pseudomononas aeruginosa)内毒素A(ETA)，通常通过接头偶联[2]。用该方法制备的偶联疫苗在人体上显示是安全的且有免疫原性[5]。其它研究者已通过还原胺化[45和12]；戊二醛偶联[45]；或多糖上的羟基与氰化剂如CDAP[46]或三聚氰酰氯的反应[11]来完成纯化的5型和8型荚膜多糖的偶联。优选采用参考文献29所述的工艺。

优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、其类毒素或突变体。本发明人发现CRM197白喉毒素突变体[47]适用。绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(ETA)和其无毒突变体重组外蛋白A(rEPA)已用作金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖的运载体蛋白([1]和[2])。也使用了金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-毒素)([45]和[48])、卵清蛋白[11]和人血清白蛋白[12]。这些运载体可用于本发明。

其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合物[49]、合成肽[50，51]、热激蛋白[52，53]、百日咳蛋白[54，55]、细胞因子[56]、淋巴因子[56]、激素[56]、生长因子[56]、人血清白蛋白(通常是重组的)、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[57]例如N19[58]、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[59-61]、肺炎球菌表面蛋白PspA[62]、肺炎球菌溶血素[63]或其无毒衍生物[64]、摄铁蛋白[65]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[66]、GBS蛋白[67]、GAS蛋白[68]等等。

其它合适的运载体蛋白包括金黄色葡萄球菌蛋白质抗原，例如下述金黄色葡萄球菌蛋白质抗原。

优选通过-NH₂基团，例如载体蛋白中赖氨酸残基侧链或精氨酸残基侧链中的-NH₂基团与载体结合。也可通过-SH基团，如半胱氨酸残基侧链中的-SH基团连接。

可以使用一种以上的载体蛋白，例如用于减少载体抑制的风险。因此，不同的运载体蛋白可用于5型和8型荚膜多糖，例如，5型多糖可偶联于CRM197而8型多糖可偶联于rEPA。也可能对某种特定多糖抗原使用超过一种运载体蛋白，例如5型多糖可以分为两组，一组偶联于CRM197且另一组偶联于rEPA。然而，通常对所有多糖使用相同的运载体蛋白。

一种载体蛋白可携带一种以上多糖抗原[69，70]。例如，一种运载体蛋白可偶联于5型和8型荚膜多糖。为了实现这一目的，可以在偶联过程之前混合不同多糖。然而，通常各多糖形成不同偶联物，偶联后混合不同多糖。单独的偶联物可基于同一载体。

通常使用多糖∶蛋白质比(w/w)为1∶20(即蛋白质过量)-20∶1(即多糖过量)的偶联物。优选比例为1∶10-1∶1，特别是1∶5-1∶2的比例，最优选约1∶3。相反，在参考文献中使用的5型和8型荚膜多糖偶联物倾向更高的比例，例如在参考文献1、2和3中的0.73-1.08。在本发明的具体实施方式中，5型荚膜多糖偶联物的多糖∶蛋白质比例(w/w)为1∶10-1∶2；和/或8型荚膜多糖偶联物的多糖∶蛋白质比例(w/w)为1∶5-7∶10。

偶联物可与游离载体联用[71]。当本发明组合物中给定载体蛋白存在游离和偶联形式时，未偶联形式优选整体上不多于组合物中载体蛋白总量的5％，更优选少于2％重量。

偶联后，可分离游离和偶联的多糖。有许多合适的方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等[也参见参考文献72和73等]。

偶联物与其它抗原的组合

本发明方法制备(特别是如上所述偶联后)的多糖可以例如彼此和/或与其它抗原混合。因此，本发明的工艺可包括额外的将多糖与一种或多种其它抗原混合的步骤。因此，本发明提供含有本发明方法所制备多糖和一种或多种额外抗原的组合物。该组合物通常是免疫原性组合物。

其它抗原可包括本发明方法制备的其它多糖，因此本发明提供包含一种以上本发明多糖的组合物。具体地，本发明提供包含本发明5型荚膜多糖和本发明8型荚膜多糖的组合物。或者，其它抗原可以是用本发明方法以外的方法，例如上述参考文献1-18的方法制备的5型或8型荚膜多糖。因此，本发明提供包含5型荚膜多糖和8型荚膜多糖的组合物，其中多糖之一(5型多糖或8型多糖)是本发明多糖，另一种多糖不是本发明多糖。

多种不同金黄色葡萄球菌偶联物混合时，这些可以包括来自同一金黄色葡萄球菌血清型和/或不同金黄色葡萄球菌血清型的不同类型的偶联物。例如，偶联物可以来自金黄色葡萄球菌5型和8型。生成组合物可以通过制备单独偶联物(例如，对于各血清型不同的偶联物)和然后结合这些偶联物。

其它抗原可包括其它金黄色葡萄球菌抗原，包括糖和蛋白质抗原，如下所述。

额外的抗原可包含来自非金黄色葡萄球菌病原体的抗原。因此，本发明的组合物还可包含一种或多种非金黄色葡萄球菌抗原，包括其它细菌、病毒或寄生虫抗原。这些抗原可选自下列：

-来自脑膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白质抗原，例如参考文献74-80中所述的那些，特别优选蛋白质‘287’(见下文)及其衍生物(例如‘ΔG287’)。

-来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群B的外膜囊泡(OMV)制品，如参考文献82、83、84、85等中所述。

-来自脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献85所述的血清群C的寡糖或参考文献86所述的寡糖。

-来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如文献87-89；文献96的第22和23章]。

-甲型肝炎病毒的抗原，如灭活病毒的抗原[如91，92；参考文献96的第15章]。

-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如91，92；参考文献96的第16章]。

-丙型肝炎病毒的抗原[如93]。

-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合[例如参考文献94和95；文献96的第21章]。

-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献96的第13章]。

-破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献96的第27章]。

-流感嗜血杆菌B的糖抗原[如文献96的第14章]。

-淋病奈瑟球菌(N.gonorrheae)的抗原[例如74，75，76]。

-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如97，98，99，100，101，102，103]。

-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[例如，104]。

-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[例如，105]。

-脊髓灰质炎病毒抗原[例如106、107；文献96的第24章]，如IPV。

-狂犬病抗原[如108]如冻干的灭活病毒[如109，RabAvert^TM]。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献96的第19、20和26章]。

-流感抗原[如参考文献96的第17和18章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如110]。

-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(型链球菌)的抗原[如111、112、113]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)的抗原[如68、114-116]。

-表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的抗原[如可由菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10获得的I、II和/或III型荚膜多糖，如参考文献118、119和120所述]。

在采用糖或糖类抗原时，优选与载体偶联以增强免疫原性。流感嗜血菌B、脑膜炎球菌和肺炎球菌的糖抗原的偶联是熟知的。

必要时，可以使有毒的蛋白质抗原脱毒(例如，通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[95])。

所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。

抗原可以吸附于铝盐。

一种类型的优选组合物包含影响免疫受损对象的其它抗原，因此本发明的金黄色葡萄球菌多糖可与来自下述非金黄色葡萄球菌病原体的一种或多种抗原组合：无乳链球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、流感病毒、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、绿脓假单胞菌、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和副流感病毒。

另一类型的优选组合物包含医院感染相关细菌的其它抗原，因此本发明金黄色葡萄球菌多糖可与来自下述非金黄色葡萄球菌病原体的一种或多种抗原组合：艰难梭菌(Clostridium difficile)；绿脓假单胞菌；白色念珠菌(Candida albicans)；和肠外致病性大肠杆菌(Escherichia coli)。

所述组合物中各抗原的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。

作为本发明组合物中使用蛋白质抗原的替代方式，可使用编码该抗原的核酸[例如参考文献120-128]。本发明组合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸(优选DNA，如质粒形式的DNA)取代。

在实践层面上，本发明组合物中包含的抗原数可能有上限。本发明组合物中抗原(包括金黄色葡萄球菌抗原)数可以少于20、少于19、少于18、少于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10、少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、或少于3。本发明组合物中金黄色葡萄球菌抗原数可能少于6、少于5或少于4。

药物组合物和方法

本发明提供了制备药物组合物的工艺，包括步骤：将(a)本发明的多糖(任选以偶联物形式)与(b)药学上可接受的载体混合。通常，‘药学上可接受的载体’包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体一般是代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物，乳糖和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。这类载体为本领域普通技术人员熟知。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助剂，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是一种典型载体。关于药学上可接受的赋形剂的全面讨论参见参考文献129。

本发明组合物可以是水性形式(即溶液或悬浮液)或干燥形式(如冻干)。如果使用干燥的疫苗，则在注射前将其重建成液体介质。偶联疫苗的冻干是本领域已知的，例如Menjugate^TM产品以冻干形式提供，而NeisVac-C^TM和Meningitec^TM以水性形式提供。为了在冻干过程中稳定偶联物，通常可以在组合物中包含例如1mg/ml-30mg/ml(如约25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)。

药物组合物可包装入小瓶或针筒内。注射器可装有或未装有针头。注射器可包含一个组合物剂量，而药瓶可包含一个剂量或多个剂量。

本发明多糖的水性组合物适用于从冻干形式重建其它疫苗。当本发明的组合物用于这种临用前重建时，本发明提供了一种重建这类冻干疫苗的工艺，包括将冻干物质与本发明的水性组合物混合的步骤。重建的物质可用于注射。

金黄色葡萄球菌抗原

如上所述，本发明组合物可包含一种或多种其它金黄色葡萄球菌抗原。所述抗原可以是蛋白质或糖抗原。金黄色葡萄球菌蛋白质抗原可用作本发明偶联物的运载体蛋白、其它偶联物的运载体蛋白或非偶联蛋白质抗原。金黄色葡萄球菌糖抗原可用作其它偶联物的糖或用作非偶联糖抗原。

合适的金黄色葡萄球菌糖抗原包括金黄色葡萄球菌的表多糖，它是聚N乙酰基葡糖胺(PNAG)。这种多糖存在于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)上，可由任一来源分离[130，131]。例如，PNAG可由金黄色葡萄球菌菌株MN8m分离[132]。糖抗原可以是具有细菌表多糖纯化过程中所产生大小的多糖，或者可以是这类多糖片段化产生的多糖，例如大小可以是从400kDa以上到75-400kDa，或者10-75kDa，或者至多30个重复单位。糖抗原可具有各种N乙酰化程度，如参考文献133所述，PNAG可小于40％N乙酰化(如小于35、30、20、15、10或5％N-乙酰化；脱乙酰化的PNAG也称为dPNAG)。PNAG的脱乙酰化表位可引发能够介导调理杀伤作用的抗体。参考文献134中描述了dPNAG的制备。PNAG可以是或不是O-琥珀酰化的，例如它可能是在少于25、20、15、10、5、2、1或0.1％残基上O-琥珀酰化的。PNAG可偶联于上述运载体分子，或者是未偶联的。

另一合适的金黄色葡萄球菌糖抗原是336型抗原，它是无O-乙酰化的β连接的己糖胺[135，136]。336型抗原与针对336菌株(ATCC 55804)产生的抗体能发生交叉反应。336型抗原可偶联于上述运载体分子，或者是未偶联的。

合适的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原包括以下金黄色葡萄球菌抗原(或包含其免疫原性片段的抗原)[例如，参见参考文献137-144]：AhpC、AhpF、自溶素酰胺酶、自溶素氨基葡糖苷酶、胶原结合蛋白CAN、EbhB、GehD脂肪酶、肝素结合蛋白HBP(17kDa)、层粘连蛋白受体、MAP、MntC(也称为SitC)、MRPII、NP酶(Npase)、ORF0594、ORF0657n、ORF0826、PBP4、RAP(RNA III激活蛋白)、Sai-1、SasK、SBI、SdrG、SdrH、SSP-1、SSP-2和玻连蛋白结合蛋白。

其他合适的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原包括clfA抗原；clfB抗原；sdrE2抗原；sdrC抗原；sasF抗原，emp抗原；sdrD抗原；spa抗原；esaC抗原；esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；isdC抗原；Hla抗原；sta011抗原；isdA抗原；isdB抗原；和sta073抗原，如下所述。本发明组合物中可存在这些抗原中的一种或多种(即1、2、3、4、5、6或更多种)。这些抗原中，特别考虑到使用esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；Hla抗原；sta011抗原；和/或sta073抗原中的一种或多种(即1、2、3、4、5、6或更多种)。

例如，本发明组合物可包含金黄色葡萄球菌蛋白质抗原的下述组合之一：

(1)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和Hla抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如具有esxA抗原下游的esxB抗原的EsxAB杂交体。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(2)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和sta011抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(3)esxA抗原、esxB抗原和sta011抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(4)esxA抗原、esxB抗原、Hla抗原、sta006抗原和sta011抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(5)esxA抗原、esxB抗原和Hla抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(6)Hla抗原、sta006抗原和sta011抗原。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(7)esxA抗原和esxB抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(8)esxA抗原、esxB抗原和sta006抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(9)esxA抗原、esxB抗原、sta011抗原和sta073抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(10)sta006抗原和sta011抗原。

其他金黄色葡萄球菌抗原可参见参考文献145。

clfA

′clfA′抗原标注为′凝聚因子A′。在NCTC 8325菌株中，clfA是SAOUHSC_00812且具有氨基酸序列SEQ ID NO：1(GI：88194572)。在Newman菌株中，它是nwmn_0756(GI：151220968)。

有用的clfA抗原可引发识别SEQ ID NO：1的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：1有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：1的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些clfA蛋白包括SEQ ID NO：1的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：1的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：1C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：1的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：1的最后368个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：1的前39个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1的有用片段(‘ClfA_40-559’)。该片段省去接近SEQ ID NO：1的C末端的长重复区。

clfB

′clfB′抗原标注为′聚集因子B′。在NCTC 8325菌株中，clfB是SAOUHSC_02963且具有氨基酸序列SEQ ID NO：3(GI：88196585)。在Newman菌株中，它是nwmn_2529(GI：151222741)。

有用的clfB抗原可引发识别SEQ ID NO：3的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：3有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：3的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些clfB蛋白包括SEQ ID NO：3的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：3的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：3C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如3、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：3的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：3的最后40个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：3的前44个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，ClfB是长蛋白质，因此使用片段有助于例如纯化、处理、融合、表达等。

SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：3的有用片段(‘ClfB_45-552’)。该片段包括ClfB的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。基于ClfB的3结构域模型的其他有用片段包括：ClfB_45-360(也称为CLfB N12；SEQ ID NO：5)；ClfB_212-542(也称为CLfB N23；SEQ ID NO：6)；和ClfB_360-542(也称为CLfB N3；SEQ ID NO：7)。

sdrE2

′sdrE2′抗原标注为′富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白SdrE′。在Newman菌株中，sdrE2是NWMN_0525且具有氨基酸序列SEQ ID NO：8(GI：151220737)。

有用的sdrE2抗原可引发识别SEQ ID NO：8的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：8有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：8的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sdrE2蛋白包括SEQ ID NO：8的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：8的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：8C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：8的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：8的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：8的前52个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，SdrE2是长蛋白质，因此使用片段非常有助于例如纯化、处理、融合、表达等。

SEQ ID NO：9是SEQ ID NO：8的有用片段(‘SdrE_53-632’)。该片段包括SdrE2的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。

sdrC

′sdrC′抗原标注为′sdrC蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sdrC是SAOUHSC_00544且具有氨基酸序列SEQ ID NO：10(GI：88194324)。

有用的sdrC抗原可引发识别SEQ ID NO：10的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：10有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：10的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sdrC蛋白包括SEQ ID NO：10的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：10的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：1C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：10的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：10的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：10的前50个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，SdrC是长蛋白质，因此使用片段有助于例如纯化、处理、融合、表达等。

SEQ ID NO：11是SEQ ID NO：10的有用片段(‘SdrC_51-518’)。该片段包括SdrC的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。

sasF

′sasF′抗原标注为′sasF蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sasF是SAOUHSC_02982且具有氨基酸序列SEQ ID NO：12(GI：88196601)。

有用的sasF抗原可引发识别SEQ ID NO：12的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：12有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：12的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sasF蛋白包括SEQ ID NO：12的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：12的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：12C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：12的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：12的最后39个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：12的前37个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

emp

′emp′抗原标注为′胞外基质和血浆结合蛋白′。在NCTC 8325菌株中，emp是SAOUHSC_00816且具有氨基酸序列SEQ ID NO：13(GI：88194575)。在Newman菌株中，它是nwmn_0758(GI：151220970)。

有用的emp抗原可引发识别SEQ ID NO：13的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：13有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ IDNO：13的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些emp蛋白包括SEQ ID NO：13的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：13的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：13C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：13的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：13的前26个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

SEQ ID NO：14、15、16和17是SEQ ID NO：13的有用片段(分别是‘Emp_35-340’、‘Emp_27-334’、‘Emp_35-334’和‘Emp_27-147’)。

sdrD

′sdrD′抗原标注为′sdrD蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sdrD是SAOUHSC_00545且具有氨基酸序列SEQ ID NO：18(GI：88194325)。

有用的sdrD抗原可引发识别SEQ ID NO：18的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：18有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：18的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sdrD蛋白包括SEQ ID NO：18的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：18的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：18C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：18的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：18的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：18的前52个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，SdrD是长蛋白质，因此使用片段非常有助于例如纯化、处理、融合、表达等。

SEQ ID NO：19是SEQ ID NO：18的有用片段(‘SdrD_53-592’)。该片段包括SdrD的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。另一具有相同C末端残基的有用片段是SdrD_394-592(也称为SdrD-N3；SEQ ID NO：20)。

spa

′spa′抗原标注为‘蛋白A’或‘SpA’。在NCTC 8325菌株中，spa是SAOUHSC_00069且具有氨基酸序列SEQ ID NO：21(GI：88193885)。在Newman菌株中，它是nwmn_0055(GI：151220267)。所有金黄色葡萄球菌菌株均表达良好表征的毒力因子spa的结构基因，其细胞壁锚定的表面蛋白产物具有五个高度同源的免疫球蛋白结合域，称为E、D、A、B和C[146]。这些结构域在氨基酸水平显示～80％相同性，长度为56-61个残基，并组织成串联重复[147]。SpA合成为具有N末端信号肽和C末端分选信号的前体蛋白[148，149]。细胞壁锚定的spa在葡萄球菌表面高丰度展示[150，151]。其免疫球蛋白结合域各自由抗-平行α-螺旋构成，它们组装成三个螺旋束并可结合免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域[152，153]、IgM的VH3重链(Fab)(即B细胞受体)[154]、血管假性血友病因子的A1结构域[155]和/或TNF-α受体I(TNFRI)[156]，其出现在呼吸道上皮表面上。

有用的spa抗原可引发识别SEQ ID NO：21的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：21有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：21的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些spa蛋白包括SEQ ID NO：21的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：21的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：21C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：21的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：21的最后35个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：21的前36个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。参考文献157提示单个IgG结合域可能是有用的免疫原，可单用或联用。

SEQ ID NO：22是SEQ ID NO：21的有用片段(‘Spa_37-325’)。此片段含有所有五个SpA Ig-结合域，并包括SpA的最暴露结构域。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。其他有用片段可省去天然A、B、C、D和/或E结构域中的1、2、3或4个。如参考文献157所报道，其他有用片段可仅包括天然A、B、C、D和/或E结构域中的1、2、3或4个，例如仅包括SpA(A)结构域但不包括B-E，或者仅包括SpA(D)结构域但不包括A、B、C或E等。因此，本发明所用的spa抗原可包括1、2、3、4或5个IgG结合域，但理想情况下具有4个或更少。如果抗原仅包括一种类型的spa结构域(如只有Spa(A)或SpA(D)结构域)，它可包括一个以上拷贝的该结构域，例如在一条多肽链中包括多个SpA(D)结构域。该抗原内的单独结构域可相对于SEQ ID NO：21在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸上发生突变(例如，参见参考文献157，公开了在结构域D的残基3和/或24上的突变，在结构域A的残基46和/或53上的突变等)。这类突变体不应消除抗原引发识别SEQ ID NO：21的抗体的能力，但可消除抗原结合IgG的能力。在某些方面，spa抗原包括(a)结合IgG Fc的SpA结构域A、B、C、D和/或E的亚结构域中一个或多个氨基酸取代，其破坏或降低与IgG Fc结合，和(b)结合VH3的SpA结构域A、B、C、D和/或E的亚结构域中一个或多个氨基酸取代，其破坏或降低与VH3结合。在某些实施方式中，变体SpA包括至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种变异SpA结构域D肽。

esaC

′esaC′抗原标注为′esaC′。在NCTC 8325菌株中，esaC是SAOUHSC_00264且具有氨基酸序列SEQ ID NO：23(GI：88194069)。

有用的esaC抗原可引发识别SEQ ID NO：23的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：23有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：23的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或更高)。这些esaC蛋白包括SEQ ID NO：23的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：23的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：23C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：23的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

esxA

′esxA′抗原标注为′蛋白质′。在NCTC 8325菌株中，esxA是SAOUHSC_00257且具有氨基酸序列SEQ ID NO：24(GI：88194063)。

有用的esxA抗原可引发识别SEQ ID NO：24的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：24有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：24的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更高)。这些esxA蛋白包括SEQ ID NO：24的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：24的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：24C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：24的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

esxB

′esxB′抗原标注为′esxB′。在NCTC 8325菌株中，esxB是SAOUHSC_00265且具有氨基酸序列SEQ ID NO：25(GI：88194070)。

有用的esxB抗原可引发识别SEQ ID NO：25的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：25有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：25的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或更高)。这些esxB蛋白包括SEQ ID NO：25的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：25的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：25C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：25的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

sta006

′sta006′抗原标注为′铁色素结合蛋白′，在文献中也称为‘FhuD2’[158]。在NCTC 8325菌株中，sta006是SAOUHSC_02554且具有氨基酸序列SEQ IDNO：26(GI：88196199)。在Newman菌株中，它是nwmn_2185(GI：151222397)。

有用的sta006抗原可引发识别SEQ ID NO：26的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：26有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：26的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sta006蛋白包括SEQ ID NO：26的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：26的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：26C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、26、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：26的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：26的前17个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。sta006的突变形式可参见参考文献159。sta006抗原可脂化，例如用酰化N末端半胱氨酸脂化。

isdC

′isdC′抗原标注为′蛋白质′。在NCTC 8325菌株中，isdC是SAOUHSC_01082且具有氨基酸序列SEQ ID NO：27(GI：88194830)。

有用的isdC抗原可引发识别SEQ ID NO：27的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：27有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：27的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更高)。这些isdC蛋白包括SEQ ID NO：27的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：27的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：27C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：27的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：27的最后39个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：27的前28个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。IsdB的有用片段可参见参考文献165。

参考文献160公开了有用地包含来自IsdB和IsdH的表位的抗原。

Hla

′Hla′抗原是′α-溶血素前体′，也称为′α毒素′或′溶血素′。在NCTC 8325菌株中，Hla是SAOUHSC_01121且具有氨基酸序列SEQ ID NO：28(GI：88194865)。在Newman菌株中，它是nwmn_1073(GI：151221285)。Hla是大部分金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定因子，具有成孔活性和溶血活性。在动物模型中抗-Hla抗体可中和毒素的有害作用，Hla在保护对抗肺炎方面特别有用。

有用的Hla抗原可引发识别SEQ ID NO：28的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：28有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：28的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些Hla蛋白包括SEQ ID NO：28的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：28的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：28C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：28的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：28的前26个N末端氨基酸。也可使用C末端截短，例如只留下50个氨基酸(SEQ ID NO：28的残基27-76)[161]。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

本发明组合物可通过化学灭活(如使用甲醛、戊二醛或其他交联试剂)避免Hla的毒性。然而取而代之的是，优选使用Hla的突变形式，其消除了毒性活性但保持了免疫原性。这类脱毒突变体是本领域已知的。一种有用的Hla抗原在SEQ ID NO：28的残基61上有突变，该残基是成熟抗原的残基35(即省去前26个N末端氨基酸)。因此，残基61可能不是组氨酸，而可能是，例如Ile、Val或优选的Leu。该位置上也可使用His-Arg突变。例如，SEQ ID NO：29是成熟突变体Hla-H35L序列，有用的Hla抗原包括SEQ ID NO：29。另一有用突变用短序列代替长环，例如用四聚体如PSGS(SEQ ID NO：30)代替SEQ ID NO：28的残基136-174的39聚体，例如在SEQ ID NO：31(还包括H35L突变)和SEQ ID NO：32(不包括H35L突变)中。

其它有用的Hla抗原可参见参考文献162和163。

SEQ ID NO：33、34和35分别是SEQ ID NO：28的三个有用片段(分别为‘Hla_27-76’、‘Hla_27-89’和‘Hla_27-79’)。SEQ ID NO：36、37和38是来自SEQ ID NO：29的相应片段。

sta011

′sta011′抗原标注为′脂蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sta011是SAOUHSC_00052且具有氨基酸序列SEQ ID NO：39(GI：88193872)。

有用的sta011抗原可引发识别SEQ ID NO：39的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：39有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：39的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sta011蛋白包括SEQ ID NO：39的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：39的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：39C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、39、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：39的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：39的前23个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。sta006抗原可脂化，例如用酰化N末端半胱氨酸脂化。

可用于制备sta011抗原的SEQ ID NO：39的变体形式包括但不限于具有各种Ile/Val/Leu取代的SEQ ID NO：40、41和42。

isdA

′isdA′抗原标注为′IsdA蛋白′。在NCTC 8325菌株中，isdA是SAOUHSC_01081且具有氨基酸序列SEQ ID NO：43(GI：88194829)。在Newman菌株中，它是nwmn_1041(GI：151221253)。

有用的isdA抗原可引发识别SEQ ID NO：43的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：43有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：43的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些isdA蛋白包括SEQ ID NO：43的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：43的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：43C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：43的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：43的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：43的前46个N末端氨基酸。截短以排除SEQ ID NO：43的C末端38聚体(从LPKTG基序开始)也是有用的。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

SEQ ID NO：44是SEQ ID NO：43的有用片段(SEQ ID NO：43的氨基酸40-184；‘IsdA_40-184’)，其包括天然蛋白的血红素结合位点并包括抗原的最暴露结构域。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。其它有用片段可参见参考文献164和165。

IsdA不能良好地吸附于氢氧化铝佐剂，因此组合物中的IsdA可能不吸附或吸附于另选佐剂如磷酸铝。

isdB

′isdB′抗原标注为′神经丝蛋白isdB′。在NCTC 8325菌株中，isdB是SAOUHSC_01079且具有氨基酸序列SEQ ID NO：45(GI：88194828)。已有人提出将IsdB自身用作疫苗抗原[166]，但这可能无法预防肺炎。

有用的isdB抗原可引发识别SEQ ID NO：45的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：45有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ IDNO：45的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些isdB蛋白包括SEQ ID NO：45的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：45的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：45C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：45的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：45的最后36个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：45的前40个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。IsdB的有用片段可参见参考文献165和167，例如缺少SEQ ID NO：45的37个内部氨基酸。

在一些实施方式中，本发明组合物不包括isdB抗原。

sta073

′sta073′抗原标注为′双官能自溶素前体′。在NCTC 8325菌株中，sta073是SAOUHSC_00994且具有氨基酸序列SEQ ID NO：46(GI：88194750)。在Newman菌株中，它是nwmn_0922(GI：151221134)。蛋白组学分析揭示出这种蛋白质是分泌型或表面暴露型。

有用的sta073抗原可引发识别SEQ ID NO：46的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：46有50％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：46的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sta073蛋白包括SEQ ID NO：46的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：46的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：46C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、46、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：46的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO：46的前24个N末端氨基酸。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。

Sta073不能良好地吸附于氢氧化铝佐剂，因此组合物中的Sta073可能不吸附或吸附于另选佐剂如磷酸铝。

杂交多肽

本发明所用的金黄色葡萄球菌蛋白抗原可以单独多肽的形式存在于组合物中。然而，使用一种以上抗原时，它们不必须以单独多肽的形式存在。取而代之的是，至少两种(如2、3、4、5或更多种)抗原可表达成一条多肽链(‘杂交’多肽)。杂交多肽提供以下两个主要优点：首先，本身不稳定或者表达较差的多肽可以通过加入能够克服该问题的合适杂交伴侣得到改善；其次，商业生产得以简化，因为只需利用一次表达和纯化以生产可作抗原应用的两种多肽。

杂交多肽可包含来自上述各抗原的两种或多种多肽序列，或在该序列在菌株之间有部分变化的情况下，可包含相同抗原的两种或多种变体。

可使用由两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种抗原的氨基酸序列组成的杂交体。具体地，优选由两种、三种、四种或五种抗原，如两种或三种抗原的氨基酸序列组成的杂交体。

不同的杂交多肽可以在单一制剂中混合在一起。杂交体可与选自第一、第二或第三抗原组的非杂交抗原组合。在这类组合中，抗原可以一种以上杂交多肽和/或非杂交多肽的形式存在。然而，抗原优选以杂交体或者作为非杂交体存在，但不同时以两种形式存在。

杂交多肽可以通式NH₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH表示，其中：X是金黄色葡萄球菌抗原的氨基酸序列，如上所述；L是任选接头的氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整数(如2、3、4、5、6等)。n通常是2或3。

如果-X-部分具有野生型形式中的前导肽序列，则在杂交蛋白中可以包含或者略去该序列。在一些实施方式中，前导肽可缺失，除非-X-部分位于杂交蛋白的N-末端，即保留X₁的前导肽，但略去X₂…X_n的前导肽。这相当于删除所有前导肽并使用X₁的前导肽作为-A-部分。

在{-X-L-}的各个n值的情况下，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当n＝2时，杂交体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即包含Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，组氨酸标签(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本领域技术人员显然了解其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：47)或GSGSGGGG(SEQ ID NO：48)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)₄四肽是常用的多聚甘氨酸接头。其它合适接头，特别是用作最后L_n的是ASGGGS(SEQID NO：49，例如由SEQ ID NO：50编码)或Leu-Glu二肽。

-A-是任选的N末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适的N-末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。如果X₁缺少其自身的N末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，如Met-Ala-Ser或单个Met残基。

-B-是任选的C末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多，如SEQ ID NO：51)，或能提高蛋白质稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。

一种本发明杂交多肽可包括EsxA和EsxB抗原。它们从N至C末端的顺序任意。SEQ ID NO：52(‘EsxAB’；由SEQ ID NO：53编码)和54(‘EsxBA’)是这类杂交体的例子，它们均具有六肽接头ASGGGS(SEQ ID NO：49)。

概述

除非另有说明，本发明的实施将采用常规的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法，这些方法在所述领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，参考文献158-175等。

上文使用“GI”编号。GI号码，或者“基因信息识别号”(GenInfo Identifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献176的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法进行比对，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献177中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。

当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。本发明涉及“表位”，所述表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位。这些表位可凭经验确定(如利用PEPSCAN[178，179]或相似方法)，或它们可被预测(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[180]、基于矩阵的方法[181]、MAPITOPE[182]、TEPITOPE[183，184]、神经网络[185]、OptiMer和EpiMer[186，187]、ADEPT[188]、Tsites[189]、亲水性[190]、抗原性指数[191]或参考文献192-196公开的方法等)。表位是抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并结合的抗原的某部分，它们也称作“抗原决定簇”。

当抗原“结构域”被省略时，可以包括省略信号肽、胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域等。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10％。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可以从本发明的定义中省略。

当本发明提供一种涉及多个连续步骤的工艺时，本发明还可以提供涉及比步骤总数少的工艺。可在不同时间由不同人员在不同地点(例如在不同国家)进行这些不同的步骤。

应理解糖环可以是开放或闭合形式，而且虽然本文结构式中显示的是闭合形式，但本发明也包括开放形式。类似的，应理解糖可以吡喃糖和呋喃糖形式存在，而且虽然本文的结构式中显示的是吡喃糖形式，但也包括呋喃糖形式。还可包含糖的不同异头形式。

附图简要说明

图1显示了基于参考文献13的方法纯化金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的工艺。

图2显示根据图1的方法准备的荚膜多糖的DEAE琼脂糖凝胶色谱图和含荚膜多糖组分(组分68-80)的¹H NMR谱。

图3显示根据图1的方法准备的荚膜多糖的S300丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)色谱图和含荚膜多糖组分(组分22-44)的¹H NMR谱。

图4显示本发明纯化金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的一个示例工艺。

图5显示根据本发明方法准备的荚膜多糖的DEAE琼脂糖凝胶色谱图。

图6显示纯化的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的¹H NMR谱。

图7显示根据参考文献197，198，199和200的金黄色葡萄球菌肽聚糖的化学结构。重复单位被标出。

具体实施方式

A.金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的纯化(比较试验)

根据图1所示方案，基于参考文献13的方法纯化金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖。表1描述了该方法多个步骤的条件和原理：

表1

细菌团离心和酶反应(溶葡球菌酶和RNase/DNase)

金黄色葡萄球菌在固体培养基中生长以提供600-800ml的细菌悬浮液。用8000rpm离心收集的湿细胞体质量为约30-50g。收集的团块用50mMTris-2mM MgSO₄ pH7.5清洗3次，然后用50mM Tris-2mM MgSO₄ pH7.5悬浮至每ml 0.25-0.5g，再用0.1-0.13mg/ml溶葡球菌酶(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))处理。反应混合物在37℃温和搅拌孵育16小时(ON)。悬浮液中加入0.05mg/ml DNase/RNase(西格玛奥德里奇公司)，并且37℃孵育5-7小时。然后离心澄清悬浮液。

与NaIO ₄ 反应

材料与50mM NaIO₄(西格玛奥德里奇公司)避光孵育5-7小时。加入过量甘油光下搅拌30分钟来除去NaIO₄。

30kDa切向流过滤

切向流过滤根据表2所示操作：

表2

切向流过滤用WatsonMarlon^TM软管泵在Sartorius^TM固定器的0.1m²盒中进行。然后，膜用1M NaOH清洗并用0.1M NaOH在+2-8℃保存。

DEAE琼脂糖快速流动色谱

剩余蛋白质，核酸和其他杂质用根据表3操作的阴离子交换色谱除去。

表3

使用Akta^TM体系(通用电气医疗集团)进行色谱，使用UV 215nm吸收值来检测荚膜多糖。荚膜多糖溶液先加入100mM NaPi pH7.2缓冲液以获得10mM NaPi pH7.2最终缓冲液浓度。DEAE树脂先用100mM NaPipH7.2缓冲液平衡到pH7.2，然后用10mM NaPi pH7.2缓冲液平衡达到指定的传导率(10mM NaPi pH7.2缓冲液传导率)。所得组分用NMR分析，那些含有荚膜多糖的组分合并在一起(图2)。

S300丙烯葡聚糖凝胶层析

多糖进一步用根据表4操作的凝胶过滤色谱纯化。

表4

使用Akta^TM体系(通用电气医疗集团)进行色谱，使用UV 215nm吸收值来检测荚膜多糖。所得组分用NMR分析，那些含有荚膜多糖的组分合并在一起(图3)。

B.金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化(示例)

根据图4所示方案纯化金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖。表5描述了该方法多个步骤的条件和原理。

表5

细菌团离心和酸与酶反应(乙酸，RNase/DNase和变溶菌素)

金黄色葡萄球菌在固体培养基中生长来提供600-800ml的细菌悬浮液。用8000rpm离心收集的湿细胞体质量为约30-50g。收集的团块用50mMTris-2mM MgSO₄ pH7.5清洗3次，然后在蒸馏水中悬浮至每ml 0.25-0.5g，剧烈搅拌且同时温度上升到100℃。然后加入乙酸到1％终浓度并且混合物100℃保持2小时。混合物用1M NaOH中和并且8000rpm离心。

上清液从团块中倒出，并与0.05mg/ml的DNase/RNase(西格玛奥德里奇公司)合并。混合物然后在37℃孵育5-7小时，之后离心澄清。然后加入180U/ml变溶菌素(西格玛奥德里奇公司)到悬浮液，并且混合物在37℃温和搅拌孵育过夜(16小时)。再用离心澄清悬浮液。

30kDa切向流过滤

切向流过滤如表6所示操作：

表6

切向流过滤用WatsonMarlon^TM软管泵在Sartorius^TM固定器的0.2m²盒中进行。然后，膜用1M NaOH清洗并用0.1M NaOH在+2-8℃保存。

DEAE琼脂糖快速流动色谱

剩余蛋白质，核酸和其他杂质用根据表7操作的阴离子交换色谱除去：

表7

使用Akta^TM体系(通用电气医疗集团)进行色谱，使用UV 215nm吸收值来检测荚膜多糖。荚膜多糖溶液先加入100mM NaPi pH7.2缓冲液以获得10mM NaPi pH7.2最终缓冲液浓度。DEAE树脂先用100mM NaPipH7.2缓冲液平衡到pH7.2，然后10mM NaPi pH7.2缓冲液平衡达到指定的传导率(10mM NaPi pH7.2缓冲液传导率)。所得组分用NMR分析，那些含有荚膜多糖的组分合并在一起(图5)。

30kDa切向流过滤

完成切向流过滤以移除阴离子交换色谱留下的NaCl，并且浓缩纯化的多糖。过滤根据表8所示操作：

表8

切向流过滤用WatsonMarlon^TM软管泵在Sartorius^TM固定器的0.2m²盒中进行。然后，膜用1M NaOH清洗并用0.1M NaOH在+2-8℃保存。纯化多糖用NMR分析(例如图6是5型荚膜多糖)。

C.纯化多糖中肽聚糖污染物的检测

根据A和B部分方法得到的纯化5型多糖的肽聚糖(图7)含量用氨基酸分析检测，根据生产上说明使用戴安(Dionex)AAA-Direct^TM体系(AminoPac^TM PA10AAA-Direct^TM，戴安公司(Dionex))的HPAEC-PAD。简单说，20μL的100μM正亮氨酸在400℃处理的玻璃管中加入到含200μL多糖的250μg/mL水，并且使用Speedvac体系干燥。正亮氨酸作为内标。样品在使用煮沸的盐酸/苯酚蒸汽的真空中水解，以从剩余蛋白质和肽聚糖污染物中产生游离氨基酸。在装配有AminoPac^TM PA10保护柱(2x50mm)的AminoPac^TM PA10柱(2x250mm)上，使用根据生产商推荐的氨基酸和糖类的梯度条件分离游离氨基酸。表9概括这些梯度条件：

洗脱液E1：脱离子水；洗脱液E2：0.250M氢氧化纳；洗脱液E3：1.0M乙酸纳和流速0.25mL/分钟。

表9

使用AAA-Direct波形电压(表10)来检测。

表10

使用在2.5-50μM范围内不水解的17氨基酸标准液(Fluka P/N 09428)进行定量。标准样品在同一样品浓度，在有和没有正亮氨酸情况下分析。样品中正亮氨酸峰值面积除以标准品中正亮氨酸平均峰值面积之比用作水解步骤中可能的氨基酸丢失的校正因子。BSA样品用作对照样品。

肽聚糖含量估计

肽聚糖含量用两种不同方来估计。第一种方法(方法1)基于参考文献17使用的方法，涉及赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸含量的总和。第二种方法(方法2)中，根据下式计算每一个氨基酸的转化因子：

(氨基酸分子量)X(肽聚糖结构中的残基数目)/

(肽聚糖重复单位分子量)

肽聚糖重复单位的分子量是1233.27Da(图7)。然后肽聚糖含量计算为通过氨基酸浓度和转化因子比率得出的平均肽聚糖浓度。

表11给出阴离子交换色谱后纯化5型荚膜多糖的肽聚糖含量：

Table 11

本发明的方法提供了纯化多糖中非常低的肽聚糖含量。

D.纯化多糖的偶联和免疫原性

从上面A和B部分方法中获得的纯化5型多糖与CRM197根据参考文献29的方法偶联。偶联物中的总糖通过HPAEC-PAD分析测定，蛋白质含量通过MicroBCA实验测定(表12)。

纯化方法	批号	蛋白质(μg/ml)	糖(μg/ml)	糖/蛋白质(w/w)
					A	1	51.52	1.72	0.03
A	2	161.80	17.10	0.11
					A	3	34.42	4.22	0.12
B	4	444.0	139.0	0.31
					B	5	40.56	12.70	0.31

表12

用本发明方法(批号4和5)纯化的多糖制备的偶联物有更高的多糖：蛋白质比例。

批次5的免疫原性用金黄色葡萄球菌感染的小鼠致死模型来检测。简要地，通过腹膜内注射2μg剂量抗原免疫CD1小鼠，注射体积为200μl。在12只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫，然后用5x10⁸CFU的5型金黄色葡萄球菌悬浮液腹膜内注射进行刺激：在刺激前将金黄色葡萄球菌培养物离心、洗涤两次并用PBS稀释。所需接种体需要进一步稀释，通过琼脂板培养和菌落形成进行试验验证。监测动物14天，记录致死疾病。

第1组-PBS加明矾

第2组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次5)加明矾

第4组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次5)加EsxAB、Sta006和

Sta011蛋白和明矾

第5组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次5)加HlaH35L、Sta006

和Sta011蛋白和明矾

存活数据见表13：

表13

用本发明方法纯化多糖制备的偶联物有高水品存活率。加入金黄色葡萄球菌蛋白质抗原能提高存活率。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。

参考文献

[1]Fattom等，(1990)Infect Immun.58(7)：2367-74.

[2]Fattom等，(1992)Infect Immun.60(2)：584-9.

[3]Fattom等，(1993)Infect Immun.61(3)：1023-32.

[4]Fattom等，(1996)Infect Immun.64(5)：1659-65.

[5]Welch等，(1996)J Am Soc Nephrol.7(2)：247-53.

[6]Fattom等，(1998)Infect Immun.66(10)：4588-92.

[7]Fattom等，(1993)Vaccine 17(2)：126-33.

[8]Fattom等，(2002)N Engl J Med.346(7)：491-6.

[9]Robbins等，(2005)Ann N Y Acad Sci.754：68-82.

[10]Gilbert等，(1994)J.Microb.Meth.20：39-46.

[11]Gilbert等，(1994)Vaccine 12(4)：369-74.

[12]Tollersrud等，(2001)Vaccine 19(28-29)：3896-903.

[13]Lee等，(1993)Infect Immun.61：1853-8.

[14]WO2004/080490.

[15]WO2006/032475.

[16]WO2006/032500.

[17]WO2006/065553.

[18]WO2006/114500.

[19]Moreau等(1990)Carbohydrate Res.339(5)：285-91

[20]Fournier等，(1984)Infect Immun.45(1)：87-93.

[21]Jones(2005)Carbohydrate Res.340(6)：1097-106.

[22]Lemercinier和Jones(1996)Carbohydrate Res.296：83-96.

[23]Jones和Lemercinier(2002)J Pharm Biomed Anal.30(4)：1233-47.

[24]WO05/033148

[25]WO 97/56357.

[26]Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180：249-261。

[27]Konadu等，(1994)Infect Immun.62：5048-5054.

[28]www.polymer.de

[29]美国专利申请61/247,518，‘CONJUGATION OF STAPHYLOCOCCUSAUREUS TYPE 5AND TYPE 8CAPSULAR POLYSACCHARIDES(金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的偶联)’(诺华公司(NOVARTIS AG))。代理人编号53594-US-PSP和PCT申请号PCT/IB2010/002565(诺华公司)。

[30]WO2009/113222.

[31]美国专利6,045,805

[32]美国专利6,027,733和6,274,144。

[33]www.polymer.de

[34]Wessels等，(1989)Infect Immun.57：1089-94.

[35]Ramsay等，(2001)Lancet 357(9251)：195-196.

[36]Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36.

[37]Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-68.

[38]Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-33，vii.

[39]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-7.

[40]欧洲专利0477508.

[41]美国专利5,306,492.

[42]WO98/42721.

[43]Dick等，于Conjugate Vaccines(《偶联疫苗》，Cruse等编)巴塞尔的卡尔格(Karger)，1989，10：48-114.

[44]Hermanson Bioconjugae Techniques(《生物偶联技术》)，圣地亚哥的学术出版社(Academic Press)，(1996)ISBN：0123423368。

[45]Reynaud-Rondier等(1991)FEMS Microbiology Immunology 76：193-200.

[46]WO03/035836.

[47]Research Disclosure(《研究公开》)，453077(2002年1月)

[48]Herbelin等.(1997)J Dairy Sci.80(9)：2025-34.

[49]EP-A-0372501.

[50]EP-A-0378881.

[51]EP-A 0427347.

[52]WO93/17712

[53]WO94/03208.

[54]WO98/58668.

[55]EP-A-0471177.

[56]WO91/01146

[57]Falugi等(2001)Eur J Immunol 31：3816-3824.

[58]Baraldo等，(2004)Infect Immun.72(8)：4884-7.

[59]EP-A-0594610.

[60]Ruan等(1990)J Immunol 145：3379-3384.

[61]WO00/56360.

[62]WO02/091998.

[63]Kuo等，(1995)Infect Immun.63：2706-13.

[64]Michon等，(1998)Vaccine 16(1732)：1732-41.

[65]WO01/72337

[66]WO00/61761.

[67]WO2004/041157.

[68]WO02/34771.

[69]WO99/42130.

[70]WO2004/011027.

[71]WO96/40242.

[72]Lei等，(2000)Dev Biol(Basel)103：259-264.

[73]WO00/38711；美国专利6,146,902.

[74]WO99/24578.

[75]WO99/36544.

[76]WO99/57280.

[77]WO00/22430.

[78]Tettelin等(2000)Science 287：1809-1815

[79]WO96/29412.

[80]Pizza等(2000)Science 287：1816-1820.

[81]WO01/52885.

[82]Bjune等，(1991)Lancet 338(8775)：1093-1096.

[83]Fukasawa等，(1999)Vaccine 17：2951-2958.

[84]Rosenqvist等，(1998)Dev.Biol.Stand.92：323-333.

[85]Costantino等，(1992)Vaccine 10：691-698.

[86]WO03/007985.

[87]Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19：331-332.

[88]Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47：269-285，v.

[89]Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65：187-207.

[90]Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 19：1187-1188.

[91]Iwarson(1995)APMIS 103：321-326.

[92]Gerlich等，(1990)Vaccine 8增刊：S63-68&79-80.

[93]Hsu等，(1999)Clin Liver Dis 3：901-915.

[94]Gustafsson等，(1996)N.Engl.J.Med.334：349-355.

[95]Rappuoli等，(1991)TIBTECH 9：232-238.

[96]Vaccines(《疫苗》)(2004)，Plotkin和Orenstein编.ISBN 0-7216-9688-0.

[97]WO02/02606.

[98]Kalman等，(1999)Nature Genetics 21：385-389.

[99]Read等，(2000)Nucleic Acids Res 28：1397-406.

[100]Shirai等，(2000)J.Infect.Dis.181(增刊3)：S524-S527.

[101]WO99/27105.

[102]WO00/27994.

[103]WO00/37494.

[104]WO99/28475.

[105]Ross等，(2001)Vaccine 19：4135-4142.

[106]Sutter等，(2000)Pediatr Clin North Am 47：287-308.

[107]Zimmerman和Spann(1999)Am Fam Physician 59：113-118，125-126.

[108]Dreesen(1997)Vaccine 15增刊：S2-6.

[109]MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998年1月16日；47(1)：12，19.

[110]McMichael(2000)Vaccine 19增刊1：S101-107.

[111]WO02/34771.

[112]Dale(1999)Infect Dis Clin North Am 13：227-43，viii.

[113]Ferretti等，(2001)PNAS USA 98：4658-4663.

[114]WO03/093306.

[115]WO2004/018646.

[116]WO2004/041157.

[117]lchiman和Yoshida(1981)J.Appl.Bacteriol.51：229.

[118]US4197290

[119]lchiman等，(1991)J.Appl.Bacteriol.71：176.

[120]Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology(《免疫学研讨文辑》)9：271-283.

[121]Donnelly等，(1997)Annu Rev Immunol 15：617-648.

[122]Scott-Taylor和Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs 9：471-480.

[123]Apostolopoulos和Plebanski(2000)Curr Opin Mol Ther 2：441-447.

[124]Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther 1：116-120.

[125]Dubensky等，(2000)Mol Med 6：723-732.

[126]Robinson和Pertmer(2000)Adv Virus Res 55：1-74.

[127]Donnelly等，(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2)：S190-193.

[128]Davis(1999)Mt.Sinai J.Med.66：84-90.

[129]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学和实践》)，第二十版，ISBN：0683306472。

[130]Joyce等，(2003)Carbohydrate Research 338：903.

[131]Maira-Litran等，(2002)Infect Immun.70：4433.

[132]WO2004/043407

[133]WO2009/113224.

[134]WO2004/043405

[135]WO98/10788.

[136]WO2007/053176

[137]WO2007/113222.

[138]WO2005/009379.

[139]WO2009/029132.

[140]WO2008/079315.

[141]WO2005/086663.

[142]WO2005/115113.

[143]WO2006/033918.

[144]WO2006/078680.

[145]Kuroda等，(2001)Lancet 357(9264)：1225-1240；另见第1218-1219页.

[146]Sjodahl(1977)J.Biochem.73：343-351

[147]Uhlen等(1984)J.Biol.Chem.259：1695-1702&13628(Corr.)。

[148]Schneewind等，(1992)Cell 70：267-281

[149]DeDent等(2008)EMBO J 27：2656-2668.

[150]Sjoquist等(1972)Eur J Immunol 30：190-194.

[151]DeDent等(2007)J.Bacteriol 189：4473-4484.

[152]Deisenhofer等，(1978)Hoppe-Seyh Zeitsch.Physiol.Chem.359：975-985.

[153]Deisenhofer(1981)Biochemistry 20：2361-2370.

[154]Graille等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5399-5404。

[155]O’Seaghdha等，(2006)FEBS J.273：4831-41.

[156]Gomez等(2006)J.Biol.Chem.281：20190-20196。

[157]WO2007/071692.

[158]Sebulsky和Heinrichs(2001)J Bacteriol 183：4994-5000.

[159]Sebulsky等，(2003)J.Biol.Chem.278：49890-900。

[160]WO2005/009379.

[161]Rable和Wardenburg(2009)Infect Immun 77：2712-8.

[162]WO2007/145689.

[163]WO2009/029831.

[164]WO2005/079315.

[165]WO2005/152447.

[166]Kuklin等，(2006)Infect Immun.74(2)：2215-23.

[167]WO2005/009379.

[168]Gennaro(2000)《雷明顿：药物科学和实践》，第二十版，ISBN：0683306472.

[169]Methods In Enzymology(《酶学方法》)(S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.))

[170]Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，布莱克威尔科学出版公司(BlackwellScientific Publications))

[171]Sambrook等，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第三版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))

[172]Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(《表面和胶体化学手册》)(Birdi，K.S.编，CRC出版社(CRC Press)，1997)

[173]Ausubel等(编)(2002)Short protocols in molecular biology(《精编分子生物学实验指南》)，第5版(《实验室指南》(Current Protocols))

[174]Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course(《分子生物学技术：详细实验室课程》)(Ream等编，1998，学术出版社)

[175]PCR(Introduction to Biotechniques Series)(《PCR(生物技术入门丛书)》)，第2版(Newton和Graham编，1997，施普林格出版公司(SpringerVerlag))

[176]Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(F.M.Ausubel等编，1987)增刊30

[177]Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489.

[178]Geysen等(1984)PNAS USA 81：3998-4002

[179]Carter(1994)Methods Mol Biol 36：207-23.

[180]Jameson，BA等，1988，CABIOS 4(1)：181-186.

[181]Raddrizzani&Hammer(2000)Brief Bioinform 1(2)：179-89

[182]Bublil等，(2007)Proteins 68(1)：294-304.

[183]De Lalla等(1999)J.Immunol.163：1725-29

[184]Kwok等(2001)Trends Immunol 22：583-88.

[185]Brusic等，(1998)Bioinformatics 14(2)：121-30.

[186]Meister等，(1995)Vaccine 13(6)：581-91.

[187]Roberts等，(1996)AIDS Res Hum Retroviruses 12(7)：593-610.

[188]Maksyutov和Zagrebelnaya(1993)Comput Appl Biosci 9(3)：291-7.

[189]Feller和de la Cruz(1991)Nature 349(6311)：720-1.

[190]Hopp(1993)Peptide Research 6：183-190.

[191]Welling等，(1985)FEBS Lett.188：215-218.

[192]Davenport等，(1995)Immunogenetics 42：392-297.

[193]Tsurui和Takahashi(2007)J Pharmacol Sci.105(4)：299-316.

[194]Tong等，(2007)Brief Bioinform.8(2)：96-108.

[195]Schirle等，(2001)J Immunol Methods.257(1-2)：1-16.

[196]Chen等，(2007)Amino Acids 33(3)：423-8.

[197]Kim等，(2008)Biochemistry 47(12)：3822-3831.

[198]Patti等，(2008)Biochemistry 47(32)：8378-8385.

[199]Kim和Schaefer，(2008)Biochemistry 47(38)：10155-10161.

[200]Biswas(2006)博士论文：Characterization of Staphylococcus aureuspeptidoglycan hydrolaes and isolation of defined peptidoglycan structures(鉴定金黄色葡萄球菌肽聚糖水解酶的特性和分离明确的肽聚糖结构)，蒂宾根大学(derEberhard Karls

Tübingen)

Claims

1.一种从金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型和8型细胞中释放荚膜多糖的方法，所述方法包括酸处理细胞步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是金黄色葡萄球菌5型细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是金黄色葡萄球菌8型细胞。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞采用湿细胞体的形式或者悬浮在液体培养基中。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述酸处理用用乙酸进行。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述酸处理产生O-乙酰化程度为60-100％的荚膜多糖。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括中和步骤。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括细胞离心和收集含多糖上清液的步骤。

9.一种从金黄色葡萄球菌5型或8型细胞中纯化荚膜多糖的工艺，所述方法包括权利要求1-8中任一项所述的方法。

10.如权利要求9所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括用DNase和/或RNase处理荚膜多糖的步骤。

11.如根据权利要求9或10所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括用变溶菌素处理荚膜多糖的步骤。

12.如权利要求9-11中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括渗滤步骤。

13.如权利要求12的工艺，其特征在于，所述渗滤是切向流过滤。

14.如权利要求9-13中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括阴离子交换色谱步骤。

15.如权利要求9-14中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括凝胶过滤步骤。

16.如权利要求9-15中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括多糖浓缩步骤。

17.如权利要求9-16中任一项所述的工艺，其特征在于，所述纯化的多糖分子量是2-3500kDa。

18.如权利要求9-17中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括解聚纯化的多糖形成寡糖的步骤。

19.如权利要求9-18中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括无菌过滤步骤。

20.如权利要求9-19中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺提供一种包含多糖和肽聚糖污染水平相对于多糖总重小于5％重量的组合物。

21.如权利要求20的工艺，其特征在于，所述肽聚糖污染水平是大约2％。

22.如权利要求9-21中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺提供一个包含多糖和蛋白质污染水平相对于多糖总重小于5％重量的组合物。

23.如权利要求9-22中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺提供一个包含多糖和核酸污染水平相对于多糖总重小于1％重量的组合物。

24.如权利要求9-23中任一项所述的工艺，其特征在于，所述工艺还包括与载体分子偶联的步骤。

25.一个包含金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖、可根据权利要求9-23中任一项所述工艺获得的组合物，或者可根据权利要求24所述工艺获得的偶联物。

26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种选自下组的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原：clfA抗原；clfB抗原；sdrE2抗原；sdrC抗原；sasF抗原；emp抗原；sdrD抗原；spa抗原；esaC抗原；esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；isdC抗原；Hla抗原；sta011抗原；isdA抗原；isdB抗原；和sta073抗原。

27.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述一种或多种金黄色葡萄球菌蛋白质抗原选自：esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；Hla抗原；sta011抗原；和sta073抗原。

28.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含下述组合(1)-(10)之一所述的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原：

(1)esxA抗原，esxB抗原，sta006抗原和Hla抗原；

(2)esxA抗原，esxB抗原，sta006抗原和sta011抗原；

(3)esxA抗原，esxB抗原和sta011抗原；

(4)esxA抗原，esxB抗原，Hla抗原，sta006抗原和sta011抗原；

(5)esxA抗原，esxB抗原和Hla抗原；

(6)Hla抗原，sta006抗原和sta011抗原；

(7)esxA抗原和esxB抗原；

(8)esxA抗原，esxB抗原和sta006抗原；

(9)esxA抗原，esxB抗原，sta011抗原和sta073抗原；和

(10)sta006抗原和sta011抗原。