JP2016047852A - Staphylococcusaureus5型および8型の莢膜糖の精製 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、S.aureus5型および8型の莢膜多糖に基づく。5型および8型莢膜多糖の構造は、参考文献19および20に:
5型→4)−β−D−ManNAcA(3OAc)−(1→4)−α−L−FucNAc(1→3)−β−D−FucNAc−(1→8型→3)−β−D−ManNAcA(4OAc)−(1→3)−α−L−FucNAc(1→3)−β−D−FucNAc−(1→のように記載された。
5型→4)−β−D−ManNAcA−(1→4)−α−L−FucNAc(3OAc)−(1→3)−β−D−FucNAc−(1→8型→3)−β−D−ManNAcA(4OAc)−(1→3)−α−L−FucNAc(1→3)−α−D−FucNAc(1→のように改訂している。
本発明のプロセスは、S.aureus5型細胞またはS.aureus8型細胞を用いて開始する。典型的に、細胞は、発酵により成長した後に莢膜多糖を放出する。S.aureus5型細胞またはS.aureus8型細胞を培養する適切な方法は、当業者に周知であり、例えば参考文献1〜21およびそこで引用される参考文献に開示される。細胞成長の後に、細胞は、通常、不活性化される。不活性化のための適切な方法は、例えば参考文献1に記載されるようなフェノール:エタノールでの処理である。
本発明の方法では、S.aureus5型細胞またはS.aureus8型細胞を酸で処理する。このステップは、細胞からの莢膜多糖の放出をもたらす。対照的に、以前の方法は、多糖を放出させるためにリソスタフィン処理またはオートクレーブ処理を用いていた。本発明の酸処理は、多糖に対する損傷を最小限にするために、穏やかな酸、例えば酢酸を用いて行うことが好ましい。当業者は、多糖の放出のための適切な酸および(例えば濃度、温度および/または時間の)条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、蒸留水中に約0.5mg/mlにて懸濁された細胞を、1%酢酸(v/v)で100℃にて2時間処理することが適切であることを見出した。その他の酸、例えばトリフルオロ酢酸またはその他の有機酸での処理も適切であり得る。
酸処理の後に得られる多糖は、純粋でなく、細菌の核酸およびタンパク質が混入していることがある。これらの混入物は、酵素処理により除去できる。例えば、RNAはRNアーゼでの、DNAはDNアーゼでの、そしてタンパク質はプロテアーゼ(例えばプロナーゼ)での処理により除去できる。当業者は、混入物の除去のための適切な酵素および条件を同定することが可能である。例えば、本発明者らは、多糖含有上清を、各50μg/mlのDNアーゼおよびRNアーゼで、37℃にて6〜8時間処理することが適切であることを見出した。その他の適切な条件は、文献、例えば参考文献1に開示されている。
本発明のプロセスは、ダイアフィルトレーションのステップを含んでよい。このステップは、典型的には、上で論じた酸処理および/または酵素処理の後に行われる。本発明者らは、特にタンジェンシャルフローろ過によるダイアフィルトレーションステップが、多糖から不純物を除去するために特に有効であることを見出した。不純物は、典型的には、テイコ酸および/またはペプチドグリカンの断片のような低分子量混入物である。タンジェンシャルフローろ過は、1M NaCl(例えば約10容量に対して)、および次いでNaPi 10mM pH7.2緩衝液(例えば別の10容量に対して)に対して適切に行われる。ろ過膜は、よって、莢膜多糖を保持しながら小分子量混入物の通過を可能にするものであるべきである。10kDa〜30kDaの範囲のカットオフが典型的である。本発明者らは、30kDaカットオフ膜を用いるタンジェンシャルフローろ過が、大規模プロセスのために特に適切であることを見出した。
多糖は、アニオン交換クロマトグラフィーのステップによりさらに精製してよい。本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィーが、多糖の良好な収率を維持しながら残存タンパク質および核酸の混入を除去するのに特に有効であることを見出した。
本発明のプロセスは、ゲルろ過の1またはそれより多いステップ(複数可)を含み得る。このゲルろ過は、特定の長さの多糖分子を選択し、特にタンパク質による混入をさらに低減するために用いる。しかし、本発明者らは、参考文献1〜9のもののような以前の方法とは対照的に、ゲルろ過ステップが、高純度の多糖を得るために要求されないことを見出した。したがって、このステップは、本発明のプロセスから省いてよい。このステップを省くことは、プロセスを単純化し、全体的な費用を低減するので、有利である。
ゲルろ過の1もしくは複数のステップ(複数可)に加えてまたはその代わりに、本発明のプロセスは、多糖を濃縮する1またはそれより多いステップを含んでよい。この濃縮は、以下に記載するような担体分子への多糖の任意の後続のコンジュゲーションのための正確な濃度の試料を得るために有用である。しかし、本発明者らは、この濃縮ステップが、高純度の多糖を得るために要求されないことを見出した。したがって、このステップは、本発明のプロセスから省いてよい。
精製の後に、多糖は、混入物を除去するためにさらに処理してよい。これは、わずかな混入さえ許容できない(例えばヒトワクチン生成のため)状況において特に重要である。
S.aureus5型または8型莢膜多糖調製物は、精製プロセス中の任意の段階での貯蔵のために、例えば真空下での凍結乾燥または溶液中での凍結(例えば、含まれるならば最終濃縮ステップからの溶離液として)により凍結乾燥してよい。したがって、調製物は、プロセスのあるステップから別のステップへすぐに移す必要がない。例えば、多糖調製物をダイアフィルトレーションにより精製する場合、これは、この精製の前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。同様に、多糖は、アニオン交換クロマトグラフィーステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。多糖調製物がゲルろ過により精製されるならば、これは、このステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。同様に、多糖調製物が濃縮されるならば、これは、このステップの前に凍結乾燥または溶液中で凍結させてよい。凍結乾燥調製物は、適当な溶液中で、さらなる処理の前に再構成される。同様に、凍結溶液は、さらなる処理の前に解凍される。
本発明の最終的な精製莢膜多糖は、さらなる改変なしで、例えばin vitro診断アッセイで用いるため、免疫化で用いるためなどの抗原として用いることができる。
本発明の方法により調製された多糖(特に上記のコンジュゲーションの後)は、例えば互いにおよび/またはその他の抗原と混合できる。よって、本発明のプロセスは、多糖を、1またはそれより多いさらなる抗原と混合するさらなるステップを含み得る。本発明は、よって、本発明の方法により調製された多糖と、1またはそれより多いさらなる抗原とを含む組成物を提供する。組成物は、典型的に、免疫原性組成物である。
− ref.74〜80におけるもののようなN.meningitidis血清群Bからのタンパク質抗原、タンパク質「287」(以下を参照されたい)および誘導体(例えば「ΔG287」)が特に好ましい。
− ref.81、82、83、84などに開示されるもののようなN.meningitidis血清群Bからの外膜小胞(OMV)調製物。
− 血清群Cからのref.85に開示されるオリゴ糖またはref.86のオリゴ糖のようなN.meningitidis血清群A、C、W135および/またはYからの糖抗原。
− Streptococcus pneumoniaeからの糖抗原[例えばref.87〜89;ref.96の第22および23章]。
− 不活化ウイルス[例えば90、91;ref.96の第15章]のようなA型肝炎ウイルスからの抗原。
− 表面および/またはコア抗原[例えば91、92;ref.96の第16章]のようなB型肝炎ウイルスからの抗原。
− C型肝炎ウイルスからの抗原[例えば93]。
− パータクチンならびに/または凝集原2および3とも場合によって組み合わされた[例えばref.94および95;ref.96の第21章]B.pertussisからの百日咳ホロ毒素(PT)および繊維状ヘマグルチニン(FHA)のようなBordetella pertussisからの抗原。
− ジフテリアトキソイド[例えばref.96の第13章]のようなジフテリア抗原。− 破傷風トキソイド[例えばref.96の第27章]のような破傷風抗原。
− Haemophilus influenzae Bからの糖抗原[例えばref.96の第14章]。
− N.gonorrhoeaeからの抗原[例えば74、75、76]。
− Chlamydia pneumoniaeからの抗原[例えば97、98、99、100、101、102、103]。
− Chlamydia trachomatisからの抗原[例えば104]。
− Porphyromonas gingivalisからの抗原[例えば105]。− IPVのようなポリオ抗原(複数可)[例えば106、107;ref.96の第24章]。
− 凍結乾燥不活化ウイルス[例えば109、RabAvert(商標)]のような狂犬病抗原(複数可)[例えば108]。
− 麻疹、耳下腺炎および/または風疹抗原[例えばref.96の第19、20および26章]。
− ヘマグルチニンおよび/またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原(複数可)[例えばref.96の第17および18章]。
− Moraxella catarrhalisからの抗原[例えば110]。
− Streptococcus pyogenes(A群連鎖球菌)からの抗原[例えば111、112、113]。
− Streptococcus agalactiae(B群連鎖球菌)からの抗原[例えば68、114〜116]。
− S.epidermidisからの抗原[例えばref.117、118および119に記載されるようなATCC−31432株、SE−360株およびSE−10株から得ることができるI、IIおよび/またはIII型莢膜多糖]。
本発明は、(a)本発明の多糖(場合によってコンジュゲートの形)を(b)薬学的に許容される担体と混合するステップを含む、薬学的組成物を調製するためのプロセスを提供する。典型的な「薬学的に許容される担体」は、それ自体が、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意の担体を含む。適切な担体は、典型的に、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ラクトースおよび脂質凝集体(例えば油滴またはリポソーム)のような大きく、緩慢に代謝される高分子である。このような担体は、当業者に周知である。ワクチンは、水、食塩水、グリセロールなどのような希釈剤も含有してよい。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝物質などのような補助物質が存在してよい。発熱物質を含まない滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水が典型的な担体である。薬学的に許容される賦形剤についての詳細な議論は、参考文献129で入手可能である。
上記のように、1またはそれより多いさらなるS.aureus抗原を、本発明の組成物に含めることができる。抗原は、タンパク質または糖抗原であってよい。S.aureusタンパク質抗原は、本発明のコンジュゲートのための担体タンパク質、他のコンジュゲートのための担体タンパク質、またはコンジュゲートしていないタンパク質抗原として用いてよい。S.aureus糖抗原は、他のコンジュゲートのための糖として、またはコンジュゲートしていない糖抗原として用いてよい。
MN8m株から単離できる[132]。糖抗原は、細菌からの菌体外多糖の精製中に現れるサイズを有する多糖であってよいか、またはこれは、このような多糖の断片化により達成される多糖であってよく、例えばサイズは400kDaを超えるものから、75から400kDaまでの間または10から75kDaまでの間または30反復単位まで変動し得る。糖抗原は、様々なN−アセチル化の程度を有することができ、参考文献133に記載されるように、PNAGは、40%より少なくN−アセチル化されていることがある(例えば35、30、20、15、10または5%未満のN−アセチル化;脱アセチル化PNAGは、dPNAGとしても公知である)。PNAGの脱アセチル化されたエピトープは、オプソニン性の殺傷を媒介できる抗体を誘発できる。dPNAGの調製は、参考文献134に記載されている。PNAGは、O−スクシニル化されていることがあるかまたはされていないことがあり、例えば、これは、25、20、15、10、5、2、1または0.1%未満の残基でO−スクシニル化されてよい。PNAGは、上記の担体分子にコンジュゲートしているか、または代わりにコンジュゲートしていないことがある。
(1)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原およびHla抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばesxB抗原がesxA抗原の下流にあるEsxABハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。Hla抗原は、例えばH35L変異を含む解毒化変異体であってよい。
(2)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原およびsta011抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばEsxABハイブリッドとして組み合わせてよい。
(3)esxA抗原、esxB抗原およびsta011抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばEsxABハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
(4)esxA抗原、esxB抗原、Hla抗原、sta006抗原およびsta011抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばEsxABハイブリッドとして組み合わせてよい。Hla抗原は、例えばH35L変異を含む解毒化変異体であってよい。
(5)esxA抗原、esxB抗原およびHla抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばEsxABハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。Hla抗原は、例えばH35L変異を含む解毒化変異体であってよい。
(6)Hla抗原、sta006抗原およびsta011抗原。Hla抗原は、例えばH35L変異を含む解毒化変異体であってよい。
(7)esxA抗原およびesxB抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばEsxABハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
(8)esxA抗原、esxB抗原およびsta006抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばEsxABハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
(9)esxA抗原、esxB抗原、sta011抗原およびsta073抗原。esxAおよびesxB抗原は、以下で論じるハイブリッドポリペプチド、例えばEsxABハイブリッドとして組み合わせてよい。
(10)sta006抗原およびsta011抗原。
「clfA」抗原は、「凝集因子(clumping factor)A」と注釈されている。NCTC8325株では、clfAはSAOUHSC_00812であり、配列番号1のアミノ酸配列(GI:88194572)を有する。Newman株では、これはnwmn_0756(GI:151220968)である。
「clfB」抗原は、「凝集因子B」と注釈されている。NCTC8325株では、clfBはSAOUHSC_02963であり、配列番号3のアミノ酸配列(GI:88196585)を有する。Newman株では、これはnwmn_2529(GI:151222741)である。
「sdrE2」抗原は、「Ser−Aspリッチフィブリノゲン/骨シアロタンパク質結合タンパク質SdrE」と注釈されている。Newman株では、sdrE2はNWMN_0525であり、配列番号8のアミノ酸配列(GI:151220737)を有する。
「sdrC」抗原は、「sdrCタンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、sdrCはSAOUHSC_00544であり、配列番号10のアミノ酸配列(GI:88194324)を有する。
「sasF」抗原は、「sasFタンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、sasFはSAOUHSC_02982であり、配列番号12のアミノ酸配列(GI:88196601)を有する。
「emp」抗原は、「細胞外基質および血漿結合タンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、empはSAOUHSC_00816であり、配列番号13のアミノ酸配列(GI:88194575)を有する。Newman株では、これはnwmn_0758(GI:151220970)である。
「sdrD」抗原は、「sdrDタンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、sdrDはSAOUHSC_00545であり、配列番号18のアミノ酸配列(GI:88194325)を有する。
「spa」抗原は、「プロテインA」または「SpA」と注釈されている。NCTC8325株では、spaはSAOUHSC_00069であり、配列番号21のアミノ酸配列(GI:88193885)を有する。Newman株では、これはnwmn_0055(GI:151220267)である。全てのS.aureus株は、その細胞壁に繋留された表面タンパク質生成物がE、D、A、BおよびCとよばれる5つの高度に相同性の免疫グロブリン結合ドメインを有する[146]、詳細に特徴づけられた毒性因子(virulence factor)であるspaについての構造遺伝子を発現する。これらのドメインは、アミノ酸レベルで約80%の同一性を示し、56〜61残基の長さであり、タンデムリピートとして組織化されている[147]。SpAは、N末端シグナルペプチドとC末端局在化シグナル(sorting signal)とを有する前駆体タンパク質として合成される[148、149]。細胞壁に繋留されたspaは、ブドウ球菌表面上で非常に豊富に提示される[150、151]。その免疫グロブリン結合ドメインのそれぞれは、3ヘリックスの束に組み立てられる逆平行α−ヘリックスで構成され、免疫グロブリンG(IgG)のFcドメイン[152、153]、IgMのVH3重鎖(Fab)(すなわちB細胞受容体)[154]、そのA1ドメインにてフォンウィルブランド因子[155]および/または気道上皮の表面上に提示されるTNF−α受容体I(TNFRI)[156]と結合できる。
「esaC」抗原は、「esaC」と注釈されている。NCTC8325株では、esaCはSAOUHSC_00264であり、配列番号23のアミノ酸配列(GI:88194069)を有する。
「esxA」抗原は、「タンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、esxAはSAOUHSC_00257であり、配列番号24のアミノ酸配列(GI:88194063)を有する。
「esxB」抗原は、「esxB」と注釈されている。NCTC8325株では、esxBはSAOUHSC_00265であり、配列番号25のアミノ酸配列(GI:88194070)を有する。
「sta006」抗原は、「フェリクローム結合タンパク質」と注釈され、文献中で「FhuD2」ともよばれている[158]。NCTC8325株では、sta006はSAOUHSC_02554であり、配列番号26のアミノ酸配列(GI:88196199)を有する。Newman株では、これはnwmn_2185(GI:151222397)である。
「isdC」抗原は、「タンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、isdCはSAOUHSC_01082であり、配列番号27のアミノ酸配列(GI:88194830)を有する。
「Hla」抗原は、「アルファ毒素」または単に「溶血素」としても公知の「アルファ溶血素前駆体」である。NCTC8325株では、HlaはSAOUHSC_01121であり、配列番号28のアミノ酸配列(GI:88194865)を有する。Newman株では、これはnwmn_1073(GI:151221285)である。Hlaは、S.aureusのほとんどの株により生成される重要な病毒性決定基であり、孔形成および溶血活性を有する。抗Hla抗体は、動物モデルにおける毒素の有害な影響を中和でき、Hlaは、肺炎に対する防御のために特に有用である。
「sta011」抗原は、「リポタンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、sta011はSAOUHSC_00052であり、配列番号39のアミノ酸配列(GI:88193872)を有する。
「isdA」抗原は、「IsdAタンパク質」と注釈されている。NCTC8325株では、isdAはSAOUHSC_01081であり、配列番号43のアミノ酸配列(GI:88194829)を有する。Newman株では、これはnwmn_1041(GI:151221253)である。
「isdB」抗原は、「神経フィラメントタンパク質isdB」と注釈されている。NCTC8325株では、isdBはSAOUHSC_01079であり、配列番号45のアミノ酸配列(GI:88194828)を有する。IsdBは、それ自体でワクチン抗原として用いることが提案されているが[166]、これは、肺炎を予防しないことがある。
「sta073」抗原は、「二機能性自己溶解素前駆体」と注釈されている。NCTC8325株では、sta073はSAOUHSC_00994であり、配列番号46のアミノ酸配列(GI:88194750)を有する。Newman株では、これはnwmn_0922(GI:151221134)である。プロテオミクス解析により、このタンパク質は、分泌されるかまたは表面に曝露されることが明らかになっている。
本発明で用いられるS.aureusタンパク質抗原は、個別の分離したポリペプチドとして組成物に存在してよい。1より多い抗原を用いる場合、しかし、これらは、分離したポリペプチドとして提示される必要はない。代わりに、少なくとも2(例えば2、3、4、5またはそれより多い)の抗原は、単一ポリペプチド鎖として発現され得る(「ハイブリッド」ポリペプチド)。ハイブリッドポリペプチドは、2つの主な利点を提供する。第1に、それ自体では不安定または発現が乏しいことがあるポリペプチドが、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することにより援助され得る。第2に、商業的な製造が単純化される。なぜなら、ともに抗原的に有用な2つのポリペプチドを生成するために、1回だけの発現および精製の使用しか必要としないからである。
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術の技量内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば参考文献168〜175などを参照されたい。
index)[180]、行列に基づくアプローチ[181]、MAPITOPE[182]、TEPITOPE[183、184]、ニューラルネットワーク(neural
network)[185]、OptiMer&EpiMer[186、187]、ADEPT[188]、Tsites[189]、親水性[190]、抗原インデックス[191]または参考文献192〜196に開示される方法などを用いて)。エピトープは、抗体またはT細胞受容体の抗原結合部位により認識され、それと結合する抗原の部分であり、これらは、「抗原決定基」とよぶこともできる。
本願は一実施形態において以下の項目を提供する:
(項目1)
S.aureus5型細胞またはS.aureus8型細胞から莢膜多糖を放出させるための方法であって、前記細胞を酸で処理するステップを含む方法。
(項目2)
前記細胞が、S.aureus5型細胞である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記細胞が、S.aureus8型細胞である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記細胞が、湿潤細胞ペーストの形であるか、または水性媒体に懸濁されている、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記酸処理が、酢酸を用いて行われる、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記酸処理が、O−アセチル化の程度が60%〜100%の間である前記莢膜多糖をもたらす、項目1〜5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
中和するステップをさらに含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記細胞を遠心分離し、前記多糖を含有する上清を回収するステップをさらに含む、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
項目1〜8のいずれか一項に記載の方法を含む、S.aureus5型細胞またはS.aureus8型細胞から莢膜多糖を精製するためのプロセス。
(項目10)
前記莢膜多糖をDNアーゼおよび/またはRNアーゼで処理するステップをさらに含む、項目9に記載のプロセス。
(項目11)
前記莢膜多糖をムタノリシンで処理するステップをさらに含む、項目9または項目10に記載のプロセス。
(項目12)
ダイアフィルトレーションのステップをさらに含む、項目9〜11のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目13)
前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローろ過である、項目12に記載のプロセス。
(項目14)
アニオン交換クロマトグラフィーのステップをさらに含む、項目9〜13のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目15)
ゲルろ過のステップをさらに含む、項目9〜14のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目16)
前記多糖を濃縮するステップをさらに含む、項目9〜15のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目17)
精製された前記多糖の分子質量が、2〜3500kDaの間である、項目9〜16のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目18)
前記精製多糖を解重合してオリゴ糖を形成するステップをさらに含む、項目9〜17のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目19)
滅菌ろ過のステップをさらに含む、項目9〜18のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目20)
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して5重量%未満のペプチドグリカンであるレベルのペプチドグリカン混入とを含む組成物を提供する、項目9〜19のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目21)
ペプチドグリカン混入の前記レベルが、約2%である、項目20に記載のプロセス。
(項目22)
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して5重量%未満のタンパク質であるレベルのタンパク質混入とを含む組成物を提供する、項目9〜21のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目23)
前記多糖と、前記多糖の全重量に対して1重量%未満の核酸であるレベルの核酸混入とを含む組成物を提供する、項目9〜22のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目24)
担体分子へのコンジュゲーションのステップをさらに含む、項目9〜23のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目25)
項目9〜23のいずれか一項に記載のプロセスにより得ることができるS.aureus5型莢膜多糖もしくはS.aureus8型莢膜多糖または項目24に記載のプロセスにより得ることができるコンジュゲートを含む組成物。
(項目26)
clfA抗原;clfB抗原;sdrE2抗原;sdrC抗原;sasF抗原;emp抗原;sdrD抗原;spa抗原;esaC抗原;esxA抗原;esxB抗原;sta006抗原;isdC抗原;Hla抗原;sta011抗原;isdA抗原;isdB抗原;およびsta073抗原からなる群より選択される1またはそれより多いS.aureusタンパク質抗原(複数可)をさらに含む、項目25に記載の組成物。
(項目27)
1またはそれより多い前記S.aureusタンパク質抗原(複数可)が、esxA抗原;esxB抗原;sta006抗原;Hla抗原;sta011抗原;およびsta073抗原からなる群より選択される、項目26に記載の組成物。
(項目28)
以下:
(1)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原およびHla抗原;
(2)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原およびsta011抗原;
(3)esxA抗原、esxB抗原およびsta011抗原;
(4)esxA抗原、esxB抗原、Hla抗原、sta006抗原およびsta011抗原;
(5)esxA抗原、esxB抗原およびHla抗原;
(6)Hla抗原、sta006抗原およびsta011抗原;
(7)esxA抗原およびesxB抗原;
(8)esxA抗原、esxB抗原およびsta006抗原;
(9)esxA抗原、esxB抗原、sta011抗原およびsta073抗原;ならびに
(10)sta006抗原およびsta011抗原
の(1)〜(10)の組み合わせの1つに従うS.aureusタンパク質抗原を含む、項目27に記載の組成物。
S.aureus5型莢膜多糖を、参考文献13の方法に基づく図1に示すスキームに従って精製した。この方法の様々なステップについての条件および原理的説明を、表1に記載する。
S.aureusを固体培地で成長させて、600〜800mlの細菌懸濁物を得た。8000rpmにて遠心分離することにより採集した湿潤細胞ペレットは、約30〜50gの質量を有した。採集したペレットを50mM Tris−2mM MgSO4 pH7.5で3回洗浄し、次いで、1mlあたり0.25〜0.5gにて50mM Tris−2mM MgSO4 pH7.5に懸濁し、0.1〜0.13mg/mlのリソスタフィン(Sigma−Aldrich)で処理した。反応混合物は、37℃にて16時間(ON)穏やかに撹拌しながらインキュベートした。0.05mg/mlのDNアーゼ/RNアーゼ(Sigma−Aldrich)を懸濁物に加え、37℃にて5〜7時間インキュベートした。懸濁物を、次いで、遠心分離により清澄化した。
物質を、50mM NaIO4(Sigma−Aldrich)と、暗所にて5〜7時間インキュベートした。NaIO4を、次いで、過剰のグリセロールを明所にて撹拌しながら30分間加えることにより除去した。
タンジェンシャルフローろ過を、表2に示すようにして行った。
残存タンパク質、核酸およびその他の不純物を、表3に従って行ったアニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。
多糖を、表4に従って行ったゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製した。
S.aureus5型および8型莢膜多糖を、図4に示すスキームに従って精製した。この方法の様々なステップについての条件および原理的説明を、表5に記載する。
S.aureusを固体培地で成長させて、600〜800mlの細菌懸濁物を得た。8000rpmにて遠心分離することにより採集した湿潤細胞ペレットは、約30〜50gの質量を有した。採集したペレットを50mM Tris−2mM MgSO4 pH7.5で3回洗浄し、次いで、1mlあたり0.5〜0.6gにて蒸留水に懸濁し、激しく撹拌しながら温度を100℃まで上昇させた。次いで、酢酸を1%の最終濃度まで加え、混合物を100℃にて2時間保った。混合物をNaOH 1Mで中和し、8000rpmにて遠心分離した。
タンジェンシャルフローろ過を、表6に示すようにして行った。
残存タンパク質、核酸およびその他の不純物を、表7に従って行ったアニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。
タンジェンシャルフローろ過を、アニオン交換クロマトグラフィーから残されたNaClを除去し、精製多糖を濃縮するために行った。ろ過は、表8に示すようにして行った。
上記のAおよびB節における方法に従って得られた精製5型多糖のペプチドグリカン(図7)含量を、製造者の使用説明に従ってDionex AAA−Direct(商標)システム(AminoPac(商標)PA10 AAA−Direct(商標)、Dionex)によりHPAEC−PADを用いるアミノ酸分析により決定した。簡単に述べると、20μLの100μMノルロイシンを、水中で250μg/mLの200μLの多糖に、400℃処理ガラスチューブ中で加え、Speedvacシステムを用いて乾燥した。ノルロイシンは、内部標準として役立つ。残存タンパク質およびペプチドグリカン混入からの遊離アミノ酸を得るために、試料を、減圧下で沸騰塩化水素酸/フェノールの蒸気を用いて加水分解した。遊離アミノ酸の分離は、AminoPac(商標)PA10ガードカラム(2×50mm)を備えたAminoPac(商標)PA10カラム(2×250mm)で、製造者の推奨に従うアミノ酸および炭水化物の勾配条件を用いて行った。これらの勾配条件を、表9にまとめる。
ペプチドグリカン含量は、2つの異なる方法を用いて見積もった。第1の方法(方法1)は、参考文献17で用いられた方法に基づき、これは、リシン、アラニン、グリシンおよびグルタミン酸含量の総和を含む。第2の方法(方法2)では、以下の式に従って各アミノ酸についての変換係数を計算する。
(アミノ酸の分子質量)×(ペプチドグリカン構造における残基の数)/(ペプチドグリカンの反復単位の分子質量) 。
上記のAおよびB節の方法から得られた精製5型多糖を、CRM197に、参考文献29の方法に従ってコンジュゲートした。コンジュゲート中の糖の合計を、HPAEC−PAD分析により、そしてタンパク質含量をMicroBCAアッセイにより決定した(表12)。
群1−PBSとミョウバン
群2−5型莢膜多糖−CRMコンジュゲート(ロット5)とミョウバン
群4−5型莢膜多糖−CRMコンジュゲート(ロット5)とEsxAB、Sta006およびSta011タンパク質ならびにミョウバン
群5−5型莢膜多糖−CRMコンジュゲート(ロット5)とHlaH35L、Sta006およびSta011タンパク質ならびにミョウバン 。
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