MX2007009276A

MX2007009276A - Purificacion de polisacarido capsular estreptococal.

Info

Publication number: MX2007009276A
Application number: MX2007009276A
Authority: MX
Inventors: Paolo Costantino
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2006-02-01
Publication date: 2007-09-19
Also published as: WO2006082527A2; GB0502096D0; EP2270056A3; AU2006211049A1; EP1848746A2; IL184980A0; JP2008528052A; ZA200706968B; CA2596653A1; CN101146829A; AU2006211049B2; EP2270056A2; NZ560928A; US20100063270A1; WO2006082527A3

Abstract

Un proceso de purificacion para el polisacarido capsular de S. agalactiae en el cual se trata inicialmente el sacarido con una mezcla acuosa de un alcohol y una sal de calcio seguido por precipitacion con un detergente cationico. El proceso se puede completar en menos de tres dias y tiene un rendimiento de aproximadamente 60 %. Esto evita la necesidad de un tratamiento con DNasa, RNasa y/o proteasa. Los sacaridos del proceso tienen una muy baja contaminacion de proteinas y una muy baja absorbancia 280 nm.

Description

PURIFICACIÓN DE POLISACARIDO CAPSULAR ESTREPTOCOCAL Campo de la Invención La invención está en el campo de purificación de polisacáridos capsulares bacterianos, particularmente aquéllos de Streptococcus agalactiae, y particularmente para el uso en la preparación de vacunas .

Antecedentes de la Invención Los sacáridos capsulares de bacterias se han usado durante muchos años en vacunas contra bacterias encapsuladas. Puesto que los sacáridos son antígenos T-independientes, sin embargo, son pobremente inmunogénicos. La conjugación a un portador puede convertir a los antígenos T-independientes en antígenos T-dependientes, mejorando de este modo las respuestas de memoria y permitiendo que se desarrolle inmunidad protectora. Las vacunas de sacáridos más efectivas se basan por lo tanto en glicoconjugados, y la vacuna de conjugado de prototipo fue contra el tipo b de Haemophilus influenzae ("Hib") [ver por ejemplo capítulo 14 de referencia 79] . Otra bacteria para la cual se han descrito vacunas conjugadas es Streptococcus agalactiae, también conocida como "estreptococo del grupo B", o simplemente como "GBS". Mucho de este trabajo se ha realizado por Dennos Kasper y REF: 185122 colaboradores, y se describe en los documentos tal como las referencias 1 a 9. El punto de inicio para las vacunas basadas en sacáridos es el sacárido mismo, y en general éste se purifica a partir de la bacteria objetivo. El proceso de Kasper para la purificación del sacárido de GBS se describe en detalle en las referencias 2 y 10, y comprende los siguientes pasos básicos después del cultivo bacteriano: filtración para remover las bacterias; ultrafiltración con una membrana de corte de 10 kDa; adición de etanol a 30 % para precipitar contaminantes; incrementar etanol a 80 % para precipitar durante la noche el sacárido de GBS; recolectar y secar el precipitado; tratar con RNasa, luego DNasa, luego pronasa; tratamiento con hidróxido de sodio; diálisis; cromatografía de intercambio iónico de DEAE-Sephacel; diálisis; liofilización; tratamiento con anhídrido acético; cromatografía de afinidad de conconavilina para remover mannano; cromatografía de exclusión de tamaño con Ultragel; y liofilización final. El proceso es muy lento, con los tratamientos con RNasa, DNasa, pronasa e hidróxido de sodio que duran cada uno durante la noche, y pueden tomar más de una semana para terminarse. Adicionalmente, el rendimiento está bien por abajo de 50 %. De esta manera, existe la necesidad de procesos adicionales y mejorados para purificar polisacáridos capsulares de GBS, y particularmente para procesos más rápidos con mayores rendimientos.

Breve Descripción de la Invención La invención se basa en un proceso de purificación en el cual el sacárido se trata inicialmente con una mezcla acuosa de un alcohol (por ejemplo, etanol) y un catión metálico (por ejemplo, como una sal de calcio) , seguido por precipitación con un detergente catiónico (por ejemplo, CTAB) . El proceso se puede terminar en menos de tres días después de la liberación de sacárido de la bacteria y tiene un rendimiento de aproximadamente 60 %. La invención proporciona un proceso para purificar un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, que comprende los pasos de: (a) tratar una suspensión que comprende proteínas estreptococales, ácidos nucleicos y polisacárido capsular con un catión metálico acuoso y un alcohol a fin de precipitar los ácidos nucleicos y proteínas; (b) separar el material precipitado del material acuoso; y (c) tratar el material acuoso con un detergente catiónico a fin de precipitar el polisacárido capsular. El polisacárido precipitado entonces se puede separar y re-solubilizar para preparación subsiguiente de vacunas. Otros pasos de procesamiento se pueden incluir en el proceso, tal como ultrafiltración para remover contaminantes de bajo peso molecular (tal como fragmentos de carbohidratos específicos del grupo) , pasos adicionales de precipitación y resolubilización, y/o secado. La invención también proporciona un proceso para purificar un polisacárido de Streptococcus agalactiae, que comprende el paso de precipitar el sacárido usando un detergente catiónico. De manera similar, la invención proporciona, en un proceso para purificar el polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, la mejora que consiste del uso de un detergente catiónico para precipitar el sacárido. La precipitación con un detergente catiónico simplifica la separación del sacárido capsular de otros sacáridos que están presentes por ejemplo en sacárido específico del grupo. La invención también proporciona un proceso para purificar un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, que comprende el paso de remover los ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes por el uso de precipitación. De manera similar, la invención proporciona, en un proceso para purificar el polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, la mejora que consiste del uso de precipitación para remover los ácidos nucleicos contaminantes . La precipitación evita la necesidad de tratamientos enzimáticos con DNasa o RNasa. La invención también proporciona un proceso para purificar el polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde el proceso no comprende un paso de tratamiento con DNasa. De manera similar, la invención proporciona un proceso para purificar el polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde, el proceso no comprende el paso de tratamiento de RNasa. De manera similar, la invención proporciona un proceso para purificar el polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde el proceso no comprende un paso de tratamiento con proteasa. De manera preferente, el proceso de la invención no comprende el uso de dos o tres de DNasa, RNasa y/o proteasa, por ejemplo, no usa ninguno de los tres. La invención también proporciona un proceso para purificar el sacárido capsular de la bacteria Streptococcus agalactiae, en donde el rendimiento del proceso (iniciando con la bacteria y terminando con el polisacárido capsular) es al menos 40 % (por ejemplo >50 %, >60 %, >7 0%, >80 %, >90 %) . Las limitaciones prácticas significan que el rendimiento no puede exceder 90 % (por ejemplo, puede ser <90 %, <80 %, <70 %, etc.). La invención también proporciona un proceso para purificar el sacárido capsular de la bacteria Streptococcus agalactiae, en donde el proceso proporciona una composición que comprende el sacárido en el cual la pureza del sacárido es al menos 89 % (por ejemplo, >90 %, >92 %, >94 %, >96 %, >98 %, etc.) con relación al peso total del sacárido, proteína y ácido nucleico en la composición. La invención también proporciona un proceso para purificar el sacárido capsular de la bacteria Streptococcus agalactiae, en donde (a) el rendimiento del proceso es al menos 40 % (como se describe anteriormente) y (b) la pureza del sacárido es al menos 89 % (como se describe anteriormente) . La invención también proporciona un proceso para liberar el polisacárido capsular de la bacteria Streptococcus agalactiae, que comprende el paso de tratar la bacteria con una fosfodiesterasa tipo II. Estas enzimas escinden los mismos fosfatos como el hidróxido de sodio, pero ofrecen la ventaja de no tener reactividad de des-acetilación del hidróxido de sodio. La invención también proporciona una composición que comprende un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde la absorbancia UV a 280 nm es menos de 0.20. Se prefiere una absorbancia de <0.15 o aún <0.10. Los procesos de la invención se han encontrado que da composiciones con muy poca contaminación de proteína, conduciendo a muy poca absorbancia a 280 nm. Ésta es una ventaja particular con respecto a los métodos de la técnica anterior, que da el material que muestra un pico de absorbancia a ~ 280 nm.

La invención también proporciona una composición que comprende un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde la relación de absorbancia UV a 280 nm a la absorbancia UV a 260 nm es mayor de 0.85. Se prefiere una relación de >0.90, >0.95 o aún > 1.0. La relación será típicamente menor que 1.2. Se prefiere una relación de 1.0 ± 0.1. La invención también proporciona una composición que comprende un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde el espectro de absorbancia UV de la composición entre 220 nm y 300 nm exhibe ya sea un resalto o pico a aproximadamente 270 nm. La invención también proporciona una composición que comprende un polisacárido capsular del serotipo la o serotipo III de Streptococcus agalactiae, en donde el espectro de absorbancia UV entre 250 nm y 275 nm no se incrementa. La invención también proporciona una composición que comprende un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde el espectro UV de la composición entre 250 nm y 275 nm no tiene un punto máximo ni un punto de inflexión. La invención también proporciona una composición que comprende el sacárido capsular de Streptococcus agalactiae, en donde la pureza del sacárido es al menos 89 % (por ejemplo, >90 %, >92 %, >94 %, >96 %, >98 %, etc.) con relación al peso total del sacárido, proteína y ácido nucleico en la composición. La invención también proporciona una composición que comprende el sacárido capsular del serotipo la de Streptococcus agalactiae, en donde el sacárido tiene subunidades de monosacárido, y en donde no más de 93% (por ejemplo, <92 %, <90 %, <85 %, <80 %, <75 %, <70 %, <65 %, <60 %, <55 %, <50 %, <45 %, <40 %, etc.) de las subunidades de monosacárido tienen grupos de N-acetilo. La invención también proporciona una composición que comprende el sacárido capsular del serotipo Ib de Streptococcus agalactiae, en donde el sacárido tiene subunidades de monosacárido, y en donde al menos 78 % (por ejemplo, >80 %, >85 %, >90 %, >92 %, >94 %, >96 %, >98 %, etc.) de la subunidades de monosacárido tienen grupos N-acetilo. La invención también proporciona una composición que comprende el sacárido capsular del serotipo III de Streptococcus agalactiae, en donde el sacárido tiene subunidades de monosacárido, y en donde no más de 76 % (por ejemplo, <74 %, <72 %, =70 %, <65 %, <60 %, <55 %, <50 %, <45 %, <40 %, etc.) de las subunidades de monosacárido tienen grupos N-acetilo. La invención también proporciona una composición que comprende el sacárido capsular del serotipo la de Streptococcus agalactiae, en donde el sacárido tiene un peso molecular de al menos 100 kDa. La invención también proporciona una composición que comprende el sacárido capsular del serotipo Ib de Streptococcus agalactiae, en donde el sacárido tiene un peso molecular de al menos 40 kDa. La invención también proporciona una composición que comprende el sacárido capsular del serotipo III de Streptococcus agalactiae, en donde el sacárido tiene un peso molecular de al menos 40 kDa.

El Sacárido Capsular El polisacárido capsular de S. agalactiae está enlazado covalentemente a residuos de GlcNAc en la estructura de peptidoglicano de la bacteria, y es distinto del antígeno del grupo B, que es el sacárido separado que está unido a residuos MurNAc en la misma estructura de peptidoglicano (Figura 1 [12] ) . Los polisacáridos capsulares de diferentes serotipos están químicamente relacionados, pero son antigénicamente muy diferentes. Todos los polisacáridos capsulares de GBS comparten el siguiente núcleo de trisacárido: ß-D-GlcpNAc(l?3)ß-D-Galp(l?4)ß-D-Glcp Los varios serotipos de GBS difieren por la manera en la cual se modifica este núcleo. La diferencia entre los serotipos la y III, por ejemplo, surge del uso de cualquiera de GlcNAc (la) o Gal (III) en este núcleo para enlazar núcleos consecutivos de trisacáridos (Figura 3) . Los serotipos la y Ib tienen ambos un disacárido [a-D-NeupNAc (2?3) ß-D-Galp- (l?] enlazado a GlcNAc en el núcleo, pero el enlace es ya sea 1?4 (la) o l-»3 (Ib) . Las enfermedades relacionadas a GBS surgen principalmente de los serotipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, y VIII, con más de 90 % que se provoca por cinco serotipos: la, Ib, II, III y V. La invención usa de manera preferente un sacárido de uno de estos cinco serotipos. Como se muestra en la Figura 2, los sacárido capsulares de cada uno de estos cinco serotipos incluyen: (a) un residuo terminal de ácido N-acetil-neuramínico (NeuNAc) (comúnmente referido como ácido siálico) , que en todos los casos está enlazado 2-3 a un residuo de galactosa; y (b) un residuo de N-acetil-glucosamina (GlcNAc) dentro del núcleo de trisacárido. Los cinco sacáridos incluyen residuos de galactosa dentro del núcleo de trisacárido, pero los serotipos la, Ib, II y III también contienen residuos adicionales de galactosa en cada unidad de repetición, con el sacárido del serotipo II que contiene tres residuos de galactosa por unidad de repetición. Los sacáridos purificados de acuerdo con la invención estarán en general en su forma nativa, pero pueden haber sido modificados. Por ejemplo, el sacárido puede ser más corto que el sacárido capsular nativo, o puede estar químicamente modificado. De esta manera, el sacárido usado de acuerdo con la invención puede ser un polisacárido capsular sustancialmente de longitud completa, como se encuentra en la naturaleza, o puede ser más corto que la longitud natural. Los polisacáridos de longitud completa se pueden despolimerizar para dar fragmentos más cortos para el uso con la invención, por ejemplo, por hidrólisis en ácido suave, por calentamiento, por cromatografía de exclusión de tamaño, etc. Se ha reportado que la longitud de cadena afecta la inmunogenicidad de los sacáridos de GBS en conejos [4] La despolimerización del sacárido capsular del serotipo III por endo-ß-galactosidasa se ha reportado [referencias 1 y 4-6] . La ozonólisis de los polisacáridos capsulares de los serotipos II, III y VIII de GBS también se ha usado para la despolimerización [13] . Se prefiere usar sacáridos con peso molecular >30 kDa, y se puede usar polisacáridos capsulares de sustancialmente longitud completa. Para el serotipo la, se prefiere usar polisacáridos con un peso molecular de hasta ~145 kDa. Para el serotipo Ib, se prefiere usar polisacáridos con un peso molecular de hasta ~50 kDa. Para el serotipo III, se prefiere usar polisacáridos con un peso molecular de hasta ~50 kDa. Estas masas moleculares se pueden medir por filtración en gel con relación a las normas de dextrano, tal como aquéllas disponibles de Polymer Standard Service [14] . El sacárido se puede modificar químicamente con relación al sacárido capsular como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacárido se puede des-O-acetilar (parcial o completamente) , des-N-acetilar (parcial o completamente, N-propionar (parcial o completamente), etc. Dependiendo del sacárido particular, la des-acetilación puede afectar o no la inmunigenicidad, por ejemplo, la vacuna NeisVac-CMR usa el sacárido des-O-acetilado, en tanto que se acetila el MenjugateMR, pero ambas vacunas son efectivas. La pertinencia de la O-acetilación en los sacáridos de GBS en varios serotipos se analiza en la referencia 15, y se prefiere retener la O-acetilación de los residuos de ácido siálico en las posiciones 7, 8 y/o 9 antes, durante y después de la purificación, por ejemplo, al usar formaldehído para la extracción del sacárido y/o inactivación bacteriana, por protección/desprotección, por re-acetilación, etc. El efecto de la des-acetilación, etc., se puede valorar por ensayos de rutina.

Material de Inicio El proceso de la invención inicia con el sacárido capsular en forma acuosa, típicamente como una suspensión que comprende proteínas estreptococales, ácidos nucleicos y el polisacárido capsular. Se libera una pequeña cantidad de polisacárido capsular en el medio de cultivo durante el crecimiento bacteriano, y de este modo el material de inicio para precipitación alcohólica de proteínas y/o ácidos nucleicos contaminantes de esta manera puede ser el sobrenadante de un cultivo bacteriano centrifugado. De manera más típica, sin embargo, el material de inicio se preparará al tratar las bacterias encapsuladas por sí mismas (o material que contiene el peptidoglicano bacteriano) , tal que se libere el sacárido capsular. La referencia 10 caracteriza los sacáridos preparados de ambas de estas dos fuentes . Se puede liberar el polisacárido capsular de bacterias por varios métodos, incluyendo tratamiento químico, físico o enzimático. De esta manera, se puede tratar una preparación acuosa de polisacárido antes de la reacción inicial de precipitación de proteína/ácido nucleico. Un tratamiento químico típico es la extracción con base [16] (por ejemplo, usando hidróxido de sodio) , que puede escindir el enlace de fosfodiéster entre el sacárido capsular y la estructura del peptidoglicano. La extracción con base es ventajosa debido a que inactiva la bacteria al mismo tiempo como libera el polisacárido capsular. Además, el tratamiento con base libera el polisacárido intacto y provoca escisión extensiva del antígeno del grupo B debido a sus múltiples enlaces de fosfodiéster (Figura 4 [12] ) , facilitando la separación posterior de los antígenos del sacárido específico de grupo y capsular. El tratamiento con hidróxido de sodio por lo tanto es un método preferido para liberar el polisacárido capsular. Conforme el tratamiento con hidróxido des-N-acetila el sacárido capsular, sin embargo, puede ser necesario la re-N-acetilación posterior. Un tratamiento enzimático típico comprende el uso tanto de mutanolisina como de ß-N-acetilglucosaminidasa [12] . Estos actúan en el peptidoglicano de GBS para liberar el sacárido capsular para el uso con la invención, pero también conducen a la liberación del antígeno de carbohidrato específico de grupo. Un tratamiento enzimático alternativo comprende el tratamiento con una fosfodiesterasa del tipo II (PDE2) . Las enzimas de PDE2 pueden escindir los mismos fosfatos como el hidróxido de sodio (ver anteriormente) y pueden liberar el sacárido capsular sin escindir el antígeno de carbohidrato específico del grupo y sin des-N-acetilar el sacárido capsular, simplificando de este modo los pasos de etapas posteriores. Por lo tanto, las enzimas de PDE2 son una opción preferida para preparar sacáridos capsulares de GBS para el uso en los procesos de la invención. Un material de inicio preferido para el proceso de la invención es de esta manera polisacárido capsular des-N-acetilado, que se puede obtener por la extracción con base como se describe en la referencia 16. Otro material preferido de inicio es de esta manera el producto del tratamiento con PDE2 de GBS. Estos materiales se pueden someter a concentración (por ejemplo, ultrafiltración) antes de la precipitación por los procesos de la invención.

Precipitación Alcohólica e Intercambio Catiónico El sacárido capsular de GBS obtenido después del cultivo en general será impuro y estará contaminado con ácidos nucleicos y proteínas bacterianas. La técnica anterior remueve estos contaminantes por tratamientos secuenciales durante la noche con RNasa, DNasa y proteasa. En "contraste, el proceso completo de purificación de la invención se puede realizar en un tiempo más corto que estos tres pasos individuales del proceso de la técnica anterior. En lugar de remover estos contaminantes de forma enzimática, el proceso de la invención utiliza precipitación alcohólica. Si es necesario (por ejemplo, después de la extracción con base) , los materiales usualmente se neutralizarán antes de la precipitación.

El alcohol usado para precipitar los ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes es de manera preferente un alcohol inferior, tal como metanol, etanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc. La selección de un alcohol apropiado se puede probar empíricamente, sin carga indebida, pero se prefieren alcoholes tal como etanol e isopropanol (propan-2-ol) , en lugar de alcoholes tal como fenol . El alcohol se adiciona de manera preferente a la suspensión de polisacárido para dar una concentración final de alcohol de entre 10 % y 50 % (por ejemplo, aproximadamente 30 %) . Las concentraciones más útiles son aquéllas que logran precipitación adecuada de los contaminantes sin también precipitar el polisacárido. La concentración final óptima del alcohol puede depender del serotipo de GBS del cual se obtenga el polisacárido, y se puede determinar por experimentos de rutina sin carga indebida. Se ha observado precipitación de polisacáridos como concentraciones de etanol >50 % . El alcohol se puede adicionar en forma pura o se puede adicionar en una forma diluida con un solvente miscible (por ejemplo, agua) . Las mezclas preferidas de solventes son mezclas de etanol: agua, con una relación preferida de entre aproximadamente 70:30 y aproximadamente 95:5 (por ejemplo, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10). El sacárido también se trata con un catión metálico acuoso. Se prefieren cationes metálicos monovalentes y divalentes, y son particularmente preferidos los cationes divalentes, tal como Mg++, Mn++, Ca++, etc., puesto que son más eficientes en la formación del complejo. Son particularmente útiles los iones de calcio, y de este modo la mezcla de alcohol incluye de manera preferente iones de calcio solubles. Estos se pueden adicionar a una mezcla de sacárido/alcohol en la forma de sales de calcio, ya sea adicionada como un sólido o en una forma acuosa. Los iones de calcio se proporcionan de manera preferente por el uso de cloruro de calcio. Los iones de calcio están preferentemente presentes a una concentración final de entre 10 y 500 mM, por ejemplo, aproximadamente 0.1 M. La concentración óptima final de Ca++ puede depender del serotipo de GBS del cual se obtenga el polisacárido, y se puede determinar por experimentos de rutina sin carga indebida. El alcohol y el catión pueden jugar papeles diferentes (el alcohol se usa para precipitar contaminantes, en tanto que el catión se estabiliza y forma complejos con el sacárido en forma soluble) pero producen un efecto combinado. Aunque la finalidad es preparar una mezcla del sacárido, el alcohol y el catión, estos tres componentes no necesitan ser mezclados conjuntamente de manera simultánea. De esta manera, el alcohol y el catión se pueden usar de manera secuencial o simultánea. Se prefiere el tratamiento secuencial, y un proceso particularmente preferido comprende la adición del catión al sacárido seguido por la adición del alcohol a la mezcla de catión/sacárido, aunque se puede usar el alcohol antes del catión, si se desea. Después de la precipitación alcohólica de las proteínas y/o ácidos nucleicos contaminantes, se deja en solución el polisacárido capsular de GBS. El material precipitado se puede separar del polisacárido por cualquier medio, tal como por centrifugación. El sobrenadante se puede someter a microfiltración, y en particular a filtración de extremo inactivo (filtración perpendicular) a fin de remover las partículas que pueden atascar los filtros en pasos posteriores (por ejemplo, partículas precipitadas con un diámetro mayor de 0.22 µm) . Como una alternativa a la filtración de extremo inactivo, se puede usar microfiltración tangencial.

Diafiltración El proceso de la invención puede comprender un paso de diafiltración después de la precipitación de las proteínas y/o ácidos nucleicos, y antes de la precipitación mediada con detergente. Este paso de diafiltración es particularmente ventajoso y se usó extracción con base o fosfodiesterasa para la liberación del sacárido capsular, puesto que el sacárido específico de grupo también se habrá hidrolizado, para dar fragmentos mucho más pequeños que el sacárido capsular intacto. Estos fragmentos pequeños se pueden remover por el paso de diafiltración. Es típica la diafiltración de flujo tangencial. La membrana de filtración de esta manera debe ser una que permita el paso de productos de hidrólisis del antígeno específico del grupo en tanto que retenga el polisacárido capsular. Un corte en el intervalo de 10 kDa-30 kDa es típico. Se pueden usar tamaños más pequeños de corte, puesto que los fragmentos de hidrólisis del antígeno específico del grupo son en general de aproximadamente 1 kDa (sacáridos de 5-mer, 8-mer y 11-mer) , pero el corte mayor permite de manera ventajosa la remoción de otros contaminantes sin dejar pérdida del sacárido capsular. Usualmente se realizan al menos 5 ciclos de diafiltración de flujo tangencial, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó más.

Tratamiento con Detergente Catiónico En la técnica se conocen muchas técnicas para precipitar polisacáridos solubles. De acuerdo a la invención, el sacárido de GBS se precipita usando uno o más detergente catiónicos. Los inventores han encontrado que el tratamiento de una mezcla del sacárido capsular de GBS y el sacárido específico de grupo con un detergente catiónico conduce a precipitación preferencial del sacárido capsular, reduciendo de este modo de manera ventajosa y conveniente la contaminación por el sacárido específico de grupo. El detergente catiónico tiene de manera preferente la siguiente fórmula general: R? I R4— N+— R2 xr I R3 en donde: Rl r R2 y R3 son los mismos o diferentes y cada uno significa alquilo o arilo; o Ri y R junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo heterocíclico saturado de 5 ó 6 miembros, y R3 significa alquilo o arilo; o R1# R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros, insaturado en el átomo de nitrógeno, R4 significa alquilo o arilo, y X" significa un anión. Los detergentes particularmente preferidos para el uso en el proceso de la invención son sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo, las sales de bromuro) . El bromuro de cetiltrimetilamonio ("CTAB") es particularmente preferido [17]. El CTAB también se conoce como bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de cetrimonio, Cetavlon y centimida. Otros detergentes incluyen bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio. El paso de precipitación mediado con detergente es preferentemente selectivo para el polisacárido capsular. De manera ventajosa, la invención usa un detergente tal como CTAB que interactúa con los residuos de ácido siálico en el sacárido por ejemplo mediante grupos carboxilo en el ácido siálico. El detergente de esta manera precipitará preferencialmente los sacáridos capsulares que contienen ácido siálico, y particularmente sacáridos más largos dentro de una población mezclada, reduciendo de esta manera al mínimo la contaminación por sacáridos cuyos ácidos siálicos antigénicamente importantes pueden haber sido dañados en los pasos tempranos de tratamiento. Para GBS, los sacáridos más largos tienden a ser más inmunogénicos que los más cortos [18] y de esta manera la invención ofrece ventajas con respecto a los métodos de la técnica anterior que conducen a sacáridos despolimerizados más cortos. Después de la precipitación, los sacáridos capsulares se pueden separar por centrifugación. Los inventores han encontrado que la centrifugación después de la precipitación mediada con CTAB no da un sedimento simple, sino en cambio da un sedimento que parece tener dos fases. El fondo de éstas se elige típicamente para uso adicional con la invención.

Re-solubilización Después de la precipitación, el polisacárido (típicamente en la forma de un complejo con el detergente catiónico) se puede re-solubilizar, ya sea en medio acuoso o en medio alcohólico. Para re-solubilización acuosa, el catión de CTA" en el precipitado se reemplazará en general por un catión metálico; para re-solubilización alcohólica, el catión de CTA" en general se retendrá. La elección de la re-solubilización acuosa o alcohólica puede depender del serotipo de GBS del cual se obtiene el polisacárido, y en cualquier contaminante aún presente en esta etapa. Por ejemplo, los pigmentos están algunas veces presentes en el sedimento precipitado, y estos se pueden remover de manera efectiva por re-solubilización alcohólica seguida por filtración en carbón. Un medio acuoso típico para la re-solubilización incluirá un catión metálico. Se prefieren cationes metálicos monovalentes y divalentes, y los cationes divalentes son particularmente preferidos, tal como Mg++, Mn++, Ca++, etc. Son particularmente útiles los iones de calcio, y de este modo la re-solubilización usa de manera preferente Ca++, proporcionada por el uso de cloruro de calcio. Se prefiere una concentración de Ca++ de entre 10 y 500 mM (por ejemplo, aproximadamente 0.1 M) . La concentración final óptima de Ca++ puede depender del serotipo de GBS del cual se obtiene el polisacárido, y se puede determinar por experimentos de rutina sin carga indebida . Un medio alcohólico típico para re-solubilización se basa en etanol. Los mismos alcoholes usados para la precipitación de ácido nucleico y/o proteínas se pueden usar, pero la concentración requerida para la precipitación del sacárido capsular en general será mayor por ejemplo el alcohol se adiciona de manera preferente para dar una concentración final de alcohol de entre 70 % y 95 % (por ejemplo, aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) . La concentración final óptima del alcohol puede depender del serotipo de GBS del cual se obtiene el polisacárido. Para lograr las altas concentraciones de alcohol entonces se prefiere adicionar alcohol con un menor contenido de agua, por ejemplo, etanol al 96 %. La re-solubilización se presentará típicamente a temperatura ambiente. Se evitan de manera preferente las condiciones acidas, y la re-solubilización tomará lugar típicamente a aproximadamente pH 7. El material re-solubilizado se purifica altamente con relación a la suspensión de pre-precipitación.

Tratamiento Adicional del Polisacárido Capsular Después de la re-solubilización, el polisacárido se puede tratar adicionalmente para remover contaminantes.

Esto es particularmente importante en situaciones donde no es aceptable contaminación aún menor (por ejemplo, para producción de vacunas humanas) . Un paso adicional preferido es una precipitación adicional. Donde se realizó una re-solubilización acuosa entonces esta precipitación usará típicamente un alcohol, como se describe en la sección anterior; por el contrario, donde se realizó una re-solubilización alcohólica entonces esta precipitación usará típicamente una solución acuosa de catión, como se describe en la sección anterior. El sacárido precipitado entonces se puede separar de cualquier contaminante acuoso restante, por ejemplo, por centrifugación. El material precipitado es estable y se puede almacenar para uso futuro. El material precipitado se puede someter a secado al vacío. Este tratamiento se usará típicamente para no estabilizar el sacárido para almacenamiento, sino para secar el sacárido para remover cualquier alcohol residual. También se pueden realizar rondas adicionales de precipitación y filtración. También se puede usar filtración profunda por ejemplo como una alternativa a la centrifugación. La filtración profunda se usará típicamente después de la solubilización en alcohol. El polisacárido se puede despolimerizar para formar oligosacáridos. Se pueden preferir los oligosacáridos a los polisacáridos para el uso en vacunas, y se ha reportado que la longitud de cadena afecta la inmunogenicidad de los sacáridos de GBS en conejos [4] . La despolimerización del polisacárido a oligosacárido puede presentarse antes o después de la precipitación mediada con detergente. Si se realiza la despolimerización, los productos serán en general de un tamaño a fin de remover los oligosacáridos de longitud corta. Esto se puede lograr de varias maneras, tal como ultrafiltración seguida por cromatografía de intercambio iónico. En tanto que la composición de la invención incluye un sacárido despolimerizado, se prefiere que la despolimerización preceda cualquier conjugación. Si los residuos de ácido siálico en el sacárido capsular de GBS se han des-N-acetilado entonces los procesos de la invención pueden incluir un paso de re-N-acetilación. La re-N-acetilación controlada se puede realizar de manera conveniente usando reactivos tal como anhídrido acético (CH3CO)20, por ejemplo, en bicarbonato de amonio al 5 % [10] . Estos pasos adicionales se pueden realizar en general a temperatura ambiente .

Conjugación El polisacárido capsular purificado final de la invención se puede usar como un antígeno sin modificación adicional, por ejemplo por el uso en ensayos de diagnóstico in vi tro, para el uso en inmunización, etc. Para propósitos de inmunización, sin embargo, se prefiere conjugar el sacárido a una molécula portadora, tal como una proteína. En general, la conjugación covalente de sacáridos a portadores mejora la inmunigenicidad de los sacáridos puesto que los convierte de antígenos T-independientes a T-dependientes, permitiendo de esta manera el cebado para memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas [por ejemplo, referencia 19] y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisar en referencias 20 a 28] . De esta manera, los procesos de la invención pueden incluir el paso adicional de conjugar el sacárido purificado a una molécula portadora. La conjugación de sacáridos de GBS se ha reportado ampliamente, por ejemplo ver referencias 1 a 9. El proceso típico de la técnica anterior para la conjugación de sacáridos de GBS comprende típicamente la aminación reductiva de un sacárido purificado a una proteína portadora tal como un toxoide de tétano (TT) o CRM197 [2] . La aminación reductiva comprende un grupo amina en la cadena lateral de un aminoácido en el portador y un grupo aldehido en el sacárido. Puesto que los sacáridos capsulares de GBS no incluyen un grupo aldehido en su forma natural entonces éste se genera antes de la conjugación por oxidación con periodato de una porción (por ejemplo, entre 5 y 15 %, de manera preferente cerca de 10 %) de los residuos de ácido siálico del sacárido [2, 29] . Se ha mostrado que las vacunas conjugadas preparadas de esta manera son seguras e inmunogénicas en humanos para cada uno de los serotipos la, Ib, II, III, y V de GBS [30] . Un proceso alternativo de conjugación comprende el uso de grupos de -NH2 en el sacárido (ya sea de des-N-acetilación, o después de la introducción de las aminas) en la conjugación con ligadores bifuncionales, como se describe en referencia 31. Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tal como toxoides de difteria o toxoide de tétano. El mutante CRM197 de la toxina de difteria [32-34] es un portador particularmente preferido, puesto que es un toxoide de difteria. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana exterior de N. meningi tidis [35], péptidos sintéticos [36, 37], proteínas de choque térmico [38, 39], proteínas de tos ferina [40, 41], citocinas [42], linfocinas [42], hormonas [42] , factores de crecimiento [42] , albúmina de suero humano (preferentemente recombinante) , proteínas artificiales que comprenden epitopos de células T CD4+ humanas múltiples de varios antígenos derivados de patógenos [43] tal como N19 [44], proteína D de H. influenzae [45, 46], proteína PspA de superficie pneumococal [47] , pneumolisina [48] , proteínas de captación de hierro [49] , toxina A o B de C. difficile [50] , una proteína de GBS [109] , etc. La unión al portador es preferentemente mediante un grupo -NH2, por ejemplo, en la cadena lateral de un residuo de lisina en una proteína portadora, o de un residuo de arginina. La unión también puede ser mediante un grupo -SH, por ejemplo, en la cadena lateral de un residuo de cisteína. Es posible usar más de una proteína portadora, por ejemplo, para reducir el riesgo de la supresión de portador. De esta manera, se pueden usar diferentes proteínas portadoras para diferentes serotipos de GBS por ejemplo los sacáridos del serotipo la se deben conjugar a CRM197 en tanto que los sacáridos del serotipo Ib se pueden conjugar al toxoide de tétano. También es posible usar más de una proteína portadora para un antígeno de sacárido particular, por ejemplo, los sacáridos de serotipo III pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRM197 y otros conjugados al toxoide de tétano. En general, sin embargo, se prefiere usar la misma proteína portadora para todos los sacáridos . Una proteína portadora individual puede tener más de un antígeno de sacárido [51, 52] . Por ejemplo, una proteína portadora individual puede tener conjugada a la misma, sacáridos de los serotipos la y Ib. Para lograr este objetivo, se pueden mezclar diferentes sacáridos antes de la reacción de conjugación. En general, sin embargo, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo, con los diferentes sacáridos que se mezclan después de la conjugación. Los conjugados se parados se pueden basar en el mismo portador. Los conjugados con una relación de sacárido: proteína (p/v) de entre 1:5 (es decir, proteína en exceso) y 5:1 (es decir, sacárido en exceso) se prefieren. Se prefieren las relaciones entre 1:2 y 5:1, puesto que son relaciones entre 1:1.25 y 1:2.5. Se pueden usar conjugados en unión con el portador libre [53] . Cuando una proteína portadora determinada está presente tanto en la forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es más preferente no más de 5 % de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como una totalidad, y de manera más preferente está presente a menos de 2 % en peso. Después de la conjugación, se pueden separar los sacáridos libres y conjugados. Hay muchos métodos disponibles, incluyendo cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [ver también referencias 54 y 55, etc.] . En general, se pueden hacer dos tipos de conjugado, como se muestra en la Figura 5: (a) un conjugado donde se une un sacárido individual a un portador individual, por ejemplo, a través de su término reductor; y (b) un conjugado donde se une sacárido individual a múltiples portadores, por ejemplo, debido a que son reactivas varias subunidades de monosacáridos. En ambas situaciones, una proteína portadora individual puede enlazarse a múltiples moléculas de sacáridos debido a que puede tener múltiples cadenas laterales expuestas de lisina. Los conjugados del tipo (b) son más típicos en la presente invención, debido a que los residuos modificados de ácido siálico o galactosa de la invención se presentan en múltiples sitios a lo largo de un sacárido individual [56] . En conjugados preferidos, por lo tanto, se acopla una molécula individual de sacárido en promedio a más de una molécula portadora.

Combinaciones de Conjugados y Otros Antígenos Los sacáridos preparados por los métodos de la invención (en particular después de la conjugación como se describe anteriormente) se pueden mezclar por ejemplo entre sí y/o con otros antígenos. De esta manera, los procesos de la invención pueden incluir el paso adicional de mezclar el sacárido con uno o más antígenos adicionales. Donde se mezclan múltiples conjugados diferentes de GBS, entonces estos pueden incluir diferentes tipos de conjugados del mismo serotipo de GBS y/o conjugados de diferentes serotipos de GBS. Por ejemplo, los conjugados pueden ser de dos o tres de los serotipos la, Ib y III. La composición se producirá al preparar conjugados separados (por ejemplo, un conjugado diferente para cada serotipo) y luego al combinar los conjugados. Los antígenos adicionales pueden comprender secuencias de aminoácidos de GBS, como se expone más adelante. Los antígenos adicionales pueden comprender antígenos de patógenos no de GBS. De esta manera, las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente uno o más antígenos no de GBS, incluyendo antígenos adicionales bacterianos, virales o parásitos. Estos se pueden seleccionar de lo siguiente: - Un antígeno de proteína del serogrupo B de N. meningi tidis, tal como aquéllos en las referencias 57 a 63, con la proteína "287" (ver posteriormente) y los derivados (por ejemplo, "?G287") que son particularmente preferidos. Preparación de vesícula de membrana exterior (OMV) del serogrupo B de N. meningi tidis , tal como aquéllos descritos en las referencias 64, 65, 66, 67, etc. - Un antígeno de sacárido del serogrupo A, C, W135 y/o U de N. meningi tidis, tal como el oligosacárido descrito en referencia 68 del serogrupo C o los oligosacáridos de la referencia 69. Un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, referencias 70-72; capítulos 22 y 23 de referencia 79] . - Un antígeno del virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 73, 74; capítulo 15 de referencia 79] . - Un antígeno de virus de hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo, 74, 75; capítulo 16 de referencia 79] . - Un antígeno de virus de hepatitis C [por ejemplo, 76] . - Un antígeno de Bordetella pertussis, tal como toxoide de tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B . pertussis, también opcionalmente en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 77 y 78; capítulo 21 de referencia 79] . - Un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 13 de referencia 79] . - Un antígeno de tétano, tal como un toxoide de tétano [por ejemplo, capítulo 27 de referencia 79] .

Un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, capítulo 14 de referencia 79] . - Un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo, 57, 58, 59] . - Un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86] . Un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 87] . Un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 88] , Antígenos de polio [por ejemplo, 89, 90; capítulo 24 de referencia 79] tal como IPV. - Antígenos de rabia [por ejemplo, 91] tal como virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 92, RabAvertMR] . - Antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, capítulos 19, 20 y 26 de referencia 79] . - Antígenos de influenza [por ejemplo, capítulos 17 y 18 de referencia 79] , tal como las proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa. - Un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 93] . Un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo de grupo A) [por ejemplo, 94, 95, 96] . Donde se usa un antígeno de sacárido o carbohidrato, se conjuga preferentemente un portador a fin de mejorar la inmunogenicidad. Es bien conocida la conjugación de antígenos de H. influenzae B, de sacáridos meningococales y pneumococales . Los antígenos de proteína tóxica se pueden destoxificar donde sea necesario (por ejemplo, destoxificación de toxina de tos ferina por medios químicos y/o genéticos [78] ) . Donde se incluye un antígeno de difteria en la composición, se prefiere también incluir antígeno de tétano y antígenos de tos ferina. De manera similar, donde se incluye un antígeno de tétano se prefiere también incluir antígenos de difteria y tos ferina. De manera similar, donde se incluye un antígeno de tos ferina se prefiere también incluir antígenos de difteria y tétanos. También se adsorben los antígenos a una sal de aluminio. Los antígenos en la composición estarán presentes típicamente a una concentración de al menos 1 µg/ml cada uno.

En general, la concentración de cualquier antígeno determinado será suficiente para producir una respuesta inmunitaria contra ese antígeno. Como una alternativa a usar antígenos de proteínas en la composición de la invención, se puede usar ácido nucleico que codifica para el antígeno [por ejemplo, referencias 97 a 105] . Los componentes de proteína de las composiciones de la invención de esta manera se pueden reemplazar por ácido nucleico (de manera preferente ADN, por ejemplo, en la forma de un plásmido) que codifica para la proteína. En términos prácticos, puede haber un límite superior al número de antígenos incluidos en las composiciones de la invención. El número de antígenos (incluyendo antígenos de GBS) en una composición de la invención puede ser menos de 20, menos de 19, menos de 18, menos de 17, menos de 16, menos de 15, menos de 14, menos de 13, menos de 12, menos de 11, menos de 10, menos de 9, menos de 8 , menos de 7 , menos de 6 , menos de 5 , menos de 4 , o menos de 3. El número de antígenos de GBS en una composición de la invención puede ser menos de 6, menos de 5, o menos de 4.

Composiciones Farmacéuticas y Métodos La invención proporciona procesos para preparar composiciones farmacéuticas, que comprende los pasos de mezclar (a) un sacárido de la invención (opcionalmente en la forma de un conjugado) con (b) un portador farmacéuticamente aceptable. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" típicos incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos peligrosos al individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, lactosa, y agregados de lípidos (tal como gotas de aceite o liposomas) . Estos portadores son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tal como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias adicionales, tal como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras de pH, y similares. La solución salina fisiológica, amortiguada con fosfato, libre de pirógenos, estéril, es un portador típico. Un análisis completo de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 106. Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar en frascos o en jeringas. Las jeringas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis individual de la composición, en tanto que un frasco puede incluir una dosis individual o múltiples dosis. Las composiciones acuosas de los sacáridos de la invención son adecuadas para reconstitución de otras vacunas a partir de una forma liofilizada. Donde se va a usar una composición de la invención para reconstitución extemporánea, la invención proporciona un proceso para reconstituir esta vacuna liofilizada, que comprende el paso de mezclar el material liofilizado con una composición acuosa de la invención. El material reconstituido se puede usar para inyección.

Antígenos de Proteína de GBS Como se menciona anteriormente, las proteínas de GBS se pueden incluir en composiciones de la invención. Éstas se pueden usar como proteínas portadoras para conjugados de la invención, proteínas portadoras para otros conjugados, o como antígenos no conjugados de proteína. Los antígenos de proteína de GBS para el uso con la invención incluyen aquéllos descritos en las referencias 94 y 107-109. Se conocen cinco antígenos preferidos de proteína de GBS para el uso con la invención como: GBS67; GBS80; GBS104; GBS276; y GBS322 [ver referencia 94] . Se dan más adelante los detalles adicionales de estos cinco antígenos . Las secuencias de longitud completa para estas cinco proteínas de GBS son SEQ ID NOs 1 a 5 en la presente. Las composiciones de la invención de esta manera pueden incluir (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs 1 a 5, y/o (b) un polipéptido que comprende (i) una secuencia de aminoácidos que tiene la identidad de secuencia a una o más de SEQ ID NOs 1 a 5 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NOs 1 a 5. Dependiendo del SEQ ID NO particular, el grado de identidad de secuencia en (i) es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) . Estos polipéptidos incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. Típicamente, 50 % de identidad o más entre dos secuencias de polipéptido se considera que es una indicación de equivalencia funcional. De manera preferente se determina la identidad entre los polipéptidos por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de separación de afinidad con parámetros penalidad por abertura de separación = 12 y penalidad por extensión de separación = 1. Dependiendo del SEQ ID NO particular, los fragmentos de (ii) deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias, y dependiendo de la secuencia particular, n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más) . El fragmento puede comprender a menos una célula T, o de manera preferente, un epitopo de célula B de la secuencia. Los epitopos de células T y B se pueden identificar empíricamente (por ejemplo usando PEPSCAN [110, 111] o métodos similares) , o se pueden predecir (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [112] , planteamientos basados en matriz [113] , TEPITOPE [114] , redes neurales [115] , OptiMer y EpiMer [116, 117] , ADEPT [118] , Tsites [119] , hidrofilicidad [120] , índice antigénico [121] o los métodos descritos en la referencia 122, etc.). Otros fragmentos preferidos son SEQ ID NOs 1 a 5 sin su residuo de aminoácido N-terminal o sin su péptido de señal N-terminal. La remoción de uno o más dominios, tal como una región de secuencia de señal o guía, una región transmembrana, una región citoplásmica o una porción de fijación a pared celular se pueden usar. Los fragmentos preferidos se dan a continuación (SEQ ID NOs 6 a 19) . Estos polipéptidos pueden incluir, en comparación a SEQ ID NOs 1 a 5, uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) reemplazos conservadores de aminoácidos, es decir, reemplazos de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en cuatro familias: (1) acida, es decir, aspartato, glutamato; (2) básica, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polar, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar no cargada, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptofano y tirosina algunas veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto mayor en la actividad biológica. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) supresiones individuales de aminoácidos con relación a SEQ ID NOs 1 a 5. Los polipéptidos también pueden incluir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (por ejemplo, cada uno de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos) con relación a SEQ ID NOs 1 a 5. Los polipéptidos de la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo, por síntesis química (en totalidad o en parte) , al digerir los polipéptidos más largos usando proteasas, por traducción de ARN, por purificación del cultivo celular (por ejemplo, de la expresión recombinante) , del organismo mismo (por ejemplo, después del cultivo bacteriano, o directo de pacientes), etc. Un método preferido para la producción de péptidos < 40 aminoácidos de largo comprende la síntesis química in vi tro [123, 124] . La síntesis de péptidos de fase sólida se prefiere de manera particular, tal como métodos basados en la química de tBoc o Fmoc [125] . La síntesis enzimática [126] también se puede usar en parte o en totalidad. Como una alternativa a la síntesis química, se puede usar síntesis biológica, por ejemplo, los polipéptidos se pueden producir por traducción. Esto se puede llevar a cabo in vitro o in vivo . Los métodos biológicos se restringen en general a la producción de polipéptidos en base a L-aminoácidos, pero se puede usar manipulación de maquinaria de traducción (por ejemplo, de moléculas de ARNt de aminoacilo) para permitir la introducción de D-aminoácidos (o de otros aminoácidos no naturales, tal como yodotirosina o metilfenilalanina, azidohomoalanina, etc.) [127]. Donde se incluyen D-aminoácidos, sin embargo, se prefiere usar síntesis química. Los polipéptidos de la invención pueden tener modificaciones covalentes en el C-término y/o N-término. Si estas proteínas de GBS se incluyen en composiciones de la invención entonces pueden tomar varias formar (por ejemplo, nativa, fusiones, glicosiladas, no glicosiladas, lapidadas, no lapidadas, fosforiladas, no fosforiladas, miristoiladas, no miristoiladas, monoméricas, multiméricas, en partículas, desnaturalizadas, etc.). De manera preferente, se usan en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos (por ejemplo, libre de polipéptidos que se presentan de forma natural) , particularmente de otros polipéptidos de GBS o de células hospedadoras) .

GBS67 La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de GBS67 secuenciada de la cepa 2603 V/R del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 3745 y 3746. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 1 en la presente: MRKYQKFSKII.T SLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAE T GEATFDN IPGDYT SEETAPEGYKKTNOT QVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGI?EDTKESYK EHVKGSVPNG SEAKAVNPYSSEGEHlREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDWFVLDN SNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVA VTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYF FPLDSYQTQIISGNLQKLHY DLNL NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLY1NS KQK YDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELM RSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKIN Q GNGQTLQPSDYTLQGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGI1KGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTT NPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVREYPTITIKNEKK GEIEFIKVDKDNNKL LKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKWTGENGKISYK DLKDGKYQ IEAVSPEDYQKITN PILTFEWKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKH ITNTHIPPKGIJP?.TGGKGI S FI IGGAMMSIAGGIYIWKRYKKSSDMS1KKD GBS67 contiene una región transmembrana de C-término que se indica por la región subrayada más cercana al C-término de SEQ ID NO: 1 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región de transmembrana, o el aminoácido se puede truncar antes de la región de transmembrana. Un ejemplo de este fragmento de GBS67 se expone a continuación con SEQ ID NO: 18. MRIYQKFSKILT SLFCLSQIPLNTNV GESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFV KTTAHPESKIEFCVTAELT GEATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKL EHVKGSVPNG SEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGT SKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDWFVLDN SNSMNNDGPNFQRHNKAfCKTU-EA GTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYG QTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAK GSTTNG TPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADD1LSQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFP DSYQTQII?GNLQKLHYLDLNL NYPKGTIYRNGPVKEHGTPT YINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFK SDGEITELM RSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQ GNGQTLQPSDYTLQGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGILKGVKLEYIGNK YVRG NLGEGQ VTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNT R DFPIP IRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLL KGATFELQEFNEDYKLY PIKNNNSKVVTGENGKISYK D KDGKYQ XEAVSPEDYO ITNKPILTFEWKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILS GBS67 contiene un motivo de aminoácidos indicativo de un ancla en pared celular, mostrado en letras itálicas en SEQ ID NO: 1 anterior. En algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible remover este motivo para facilitar la secreción de una proteína recombinante de GBS67 de la célula hospedadora. Por consiguiente, en un fragmento preferido de GBS67 para el uso en la invención, la transmembrana y el motivo de ancla de pared celular se remueven de GBS67. Un ejemplo de este fragmento de GBS67 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 19. MRKYQKFSKILTLS FCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAE T GEATFDNLIPGDYT SEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGK TIQNSGDKNSTIGQNQEE DKQYPPTGIYEDTKESYK EHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKY IE TVSGKTIVKPVDKQKP DVVFVLDN SNSMNNDGP*NFQRHNKAKKAAEALGTAVKDI GANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYG QTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEI IKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKK GYLNKSNFL TDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGN QK HYLDLN NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELM RSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETI TKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQT QPSDYT QGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGILKGVf EYIG-.KLYVRG NLGEGQKVTLTYDVK DDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVFlEYPTITIKNEK GEIEFIKVDKDNNK LLKGATFELQEFNEDYK YLPIKNNNSKWTGENGKISYK DLKDGKYQLIEAVSPEDYQKITNKPI TFEWKGSIK1.I1AVN QISEYHEEGDKH ITNTHIPPKGI GBS80 GBS80 se refiere a una proteína putativa de la familia de ancla de superficie de pared celular. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de GBS80 secuenciadas de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 8779 y 8780. La secuencia de aminoácidos se expone posteriormente como SEQ ID NO: 2. MK SKKL FSAAV TMVAGSTVEPV?QFATGMSIVR?AEVSQERP?KTTVNIYKT,Q?DSYKSEITSHGGIENKDGEVIS NYAKLGDNVKGLQGVQFKRY VKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTI EEGVS PQKTNAQG WDA DSKSNVRYLYV EDLKNSPSNI?KAYAVPFV ELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFK F KSTIP ANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKT NRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELL GMT VK QD ALDKATANTDDAAF EIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT LGGAEFDLLASDGTAVK TDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIK KSHTDGTFEIKG AYAVDANAEGTAVTYKLKETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNKRPSIPWGGGIGTAIFVAIG??VMAFAVKGMKRRTKD GBS80 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica por la secuencia subrayada anterior. Uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS80 se pueden remover. Un ejemplo de este fragmento de GBS80 se expone a continuación como SEQ ID NO: 6: AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKV TDISVDELKKLTTV EAADA VGTILEEGVSLPQKTNAQGLWDA DSKSNVRYLYVED KNSPSNITKAYAVPFV ELPVANSTGTGFLSEIN IYPKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADG TYKSVGKIKIGSKTLNRD EHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTF ELQYDHTPDKADNP PSNPPRKPEVKTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFD LA?DGTAVK TDA IKANTNK YIAGEAV TGQPIKLKSHTDGTFEIKG--AYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPD TIKNNKRPSIPNTGGIGTAIFVAIGAAVMAFAVKGMKRRTKDN GBS80 contiene una región transmembrana C-terminal que se indica por la secuencia subrayada cerca del extremo de SEQ ID NO : 2 anterior . Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región transmembrana y/o una región citoplásmica . Un ej emplo de este fragmento se expone a continuación como SEQ ID NO : 7 . MK SKKLLFSAAV TMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVIS NYA GDNVKGLQGVQFKRYKVKTD1SVDE KKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLWDALDSKSNVRYLYV EDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIP AN GDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNT KITFKPEKFKEIAE KGMTLVK QD A DKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAV GKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT LGGAEFDL ASDGTAVKWTDALIKANTNP YIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKG AYAVDANAEGTAVTYK KETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSIPNGG GBS80 contiene un motivo de aminoácidos indicativo de un ancla de pared celular, mostrado en letras itálicas en SEQ ID NO : 2 anterior . En algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes , puede ser preferible remover este motivo para facilitar la secreción de una proteína recombinante de GBS80 de la célula hospedadora . De esta manera, las regiones transmembrana y/o citoplásmicas y el motivo de ancla de pared celular se pueden remover de GBS80 . un ej emplo de este fragmento se expone a continuación como SEQ ID NO : 8 . MK SKK 1.FSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTV IYK QADSYKSEITSNGG1ENKDGEVIS NYAK GDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKK TTVEAADAKVGTILEEGVS PQK NAQGLVVDA DSKSNVRYLYV EDLKNSPSN1TKAYAVPFV ELPVANSTGTGFLSEINIYPKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFK FL STIP AN GDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTIiVKNQD ALDKATANTDDAAF EIPVASTINEKAV GKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT GGAEFDLLASDGTAVK TDALIKANTNK YIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS De manera alternativa, en algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible usar el motivo de ancla de pared celular para anclar la proteína recombinantemente expresada a la pared celular. El dominio extracelular de la proteína expresada se puede escindir durante la purificación o la proteína recombinante se puede dejar anclada a ya sea las células hospedadoras inactivadas o a las membranas celulares en la composición final . En una modalidad, la región de secuencia de señal o guía, las regiones transmembranas y citoplásmicas y el motivo de ancla de pared celular se remueven de la secuencia de GBS80. Un ejemplo de este fragmento de GBS80 se expone a continuación como SEQ ID NO: 9: AEVSQERPAKTTVNIYK QADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAK GDNVKG QGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTV EAAD?KVGTILEEGVSLPQKTNAQG WDALDSKSNVRY YVED KNSPSNITKAYAVPFVLE PVANSTGTGFLSEIN I PKNVVTDEPKTDKDVKK GQDDAGYTIGEEFKWF KSTIPAN GDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSK?LNRD EHYTIDEPTVDNQNTLKI?FKPEKF EIAEL KGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTF ELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDL ASDGTAVfí TDA IKANTNKNYIAGEAV TGQPIí KSHTDGTFEIKG AYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVlPDKEIEFTVSQTSYNT PTDITVDSADATPD TIKNNKRPS Un fragmento particularmente inmunogénico de GBS80 se indica hacia el N-término de la proteína, y se da en la presente como SEQ ID NO: 10: AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAK GDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTV E?ADAKVGTI EEGVSLPQKTNAQGLWDA DSKSNVRY YVEDLKNSPSNITKAYAVPFV ELPVANSTGTGFLSEIN •I PKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTTGEEFK F KSTIPAN GDYEKFETTDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRD EHYTIDEPTVDNQNT KITFKPEKFKEIAEL KG GBS104 GBS104 se refiere a una proteína putativa de la familia de ancla de superficie de pared celular. Se ha referido como emaA. Las secuencias de nucleótido y de aminoácidos de GBS104 secuenciadas de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NO: 8777 y SEQ ID NO: 8778. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 3 en la presente: MKKRQKI RGLSVTLLILSQIPFGILVOGETODTNQA GKVIVKKTGDNA?PLGKATFVLKNDNDKSE?SHETVEGSGE ATFENIKPGDY LREETAPIGYKKTDKT KVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEVLNAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVE GSKVGF.QYKALNPINGKDGRREI?EGVÍGI.SKKITGVND DKNKYKIELTVEGKTTVETKELNQPI,DVWLLDNSNSMNNE RANNSQRAI.KAGEAVEK IDKITSNKDNRVA VTYASTIFDGTEATVSKGVADQNGKALNDSVSWDYHKTTFTATTHNY SYLN TNDANEVNILKSRIPKEAEHINGDRT YQFGATFTQKALMKANEILETQSSNARKKLIFHVTDGVPTMSYAINF NPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGII.QEDFIINGDDYQIVKGDGESFKLFSDREWPVTGGTTQAAYRVPQ-.Q SVMSNE GYAINSGYIYIYWRDYNWVYPFDPKTKKVSATKQIKTHGEPTTLYFNGNIRPKGYDIF VGIGVNGDPGATP EAEKFM QSISSKTENYTNVDDTNKIYDELNKYFKTIVEEKHSIVDGNVTDPMGEMIEFQ KNGQSFTHDDYVLVGNDGSQL GV A GGPNSDGG1LKDVTVTYDKTSQTIKINH N GSGQKVVLTYDVR KDNYISNKFYNTNNRTT SPKSEKEPNTIRDF PIPKIRDVREFPVLTISNQKKMGEVEFI VNKDKHSESLLGAKFQLQIEKDFSGYKQFVPEGSDVTTKNDGKIYFKAI.Q DGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPWTFTIQNGEVTN KADPNANKNQIGY EGÍ.G H ITNTPKRPPGVFPKTGGIGTIV YILVGSTFM1 TICSFRRKQ GBS104 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica con la secuencia subrayada al comienzo de SEQ ID NO: 3 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS104. Un ejemplo de este fragmento de GBS104 se expone a continuación como SEQ ID NO: 11. GETQDTNQA7JGKVIVKKTGDNATPLG ATFV K DNDKSETSHETVEGSGEATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKT WKVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEVLNAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVEGSKVGEQYKALNPINGKDGRREIAEG SK ITGVND DKNKYKIELTVEGKTGVETKE NQPLDVWLLDNSNSMNNERANNSQRALKAGEAVEKLIDKITSNKDN RVAI.VTYASTIFDGTEATVSKGVADQNGKALNDSVSWDYHKTTFTATTHNYSY NLTNDANEVNILKSRIPKEAEHING DRT YQFGATFTQKALMKANEI ETQS?NARKKLIFHVTDGVPTMSYAINFNPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGILQE DFIINGDDYQIVKGDGESFK FSDRKVPVTGGTTQAAYRVPQNQ SV SNEGYAINSGYIY YWRDYNWVYPFDPKTKK VSATKQIKTHGEPTTLYFNGNIRPKGYDIFTVGIGVNGDPGATPLEAEKF QSISSKTENYTNVDDTNKIYDE NKYFK TIVEEKHSIVDGNVTDPMGEMIEFQLK GQSFTHDDYVLVGNDGSQ KNGVALGGPNSDGG1LKDVTVTYDK SQTIKI NHLN GSGQFVVLTYDVR KDNYISNKFYNTNNRTT SPKSEKEPNTIRDFPIPKIRDVREFPVLTISNQKKMGEVEFI KVNKDKHSES LGAKFQ QIEKDFSGYKQFVPSGSDVTTPNDGKIYFKAT.QDGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPWTFTI QNGEVTNL ADPNANKNQlGYI.EGNGKHLITNTPKRPPGVFPKTGGtGTIVYI VGSTFMII.T.TCSFRRKQL GBS104 contiene una región transmembrana y/o citoplásmica C-terminal que se indica por la región subrayada cerca del extremo de SEQ ID NO: 3 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica. Un ejemplo de este fragmento de GBS104 se expone a continuación como SEQ ID NO: 12: MK RQKIWRG SVT LI SQIPFGI VQGETQDTNQALGKVIVKKTGDNATPLGK?TFV KNDNDKSETSHETVEGSGE ATFENIKPGDYT REETAPIGYKKTDKTWKVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEVLNAQYPKSAIYEDTKE YPLVNVE GSKVGEQYKA NPIMGKDGRREIAEGWLSKKITGVND DKNKY IET.TVSGIO'TVET ELNQP DVVV LDNSNSMNNE RANNSQRA KAGEAVEK IDKITSNKDNRVA VTYASTIFDGTEATVSKGVADQNGKALNDSVSWDYHKTTFTATTHNY SYLNLTNDANEVTSU KSRIPKEAEHINGDRT YQFGATFTQKALMKANEILETQSStSIARKKLIFHVTDGVPTMSYAINF NPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGI QEDFIINGDDYQIVKGDGESFKLFSDR VPVTGGTTQAAYRVPQNQLSVMSNE GYAINSGYIYLYWRDYN VYPFDPKTKKVSATKQIKTIIGEPTTLYFNGNIRPKGYDIFTVGIGVNGDPGATPI.EAEKFM QSIS?KTENYTÍ.VDD NKIYDELNKYFKTIVEEKHSIVDGNVTDPMGEMT.?FQLK1.GQSFTHDDYV VGNDGSQLKNGV ALGGPNSDGGILKDVTVTYDKTSQTIKINH NLGSGQKWLTYDVR KD?.YISNKE?NTNKRTTLSPKSEKEPNTIRDF PIPKIRDVREFPVLTISNQKKMGEVEFIKVNKDKHSESL GAKFQ QIE DFSGYKQFVPEGSDVTTKNDGKIYFKA Q DGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPVVTFTIQNGEVTNLKADP1.ANKNQIGYLSGNGKHLITNT Se puede remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica. Un ejemplo de este fragmento de GBS104 se expone a continuación como SEQ ID NO: 13: GETQDTNQALGKVIVKKTGDNATPLGKATFVI. NDNDKSETSHETVEGSGE?TFENIKPGDYTLREETAPIGY KTDKT WKVKVADNGA IIEG DADKAEKRKEVL AQYPKSAIYEDTKENYPLV VEGSKVGEQYKA.NPINGKDGRREIAEG L SKKITGVND DK?JKYKIE TVEGKTTVETKELNQP DVVVLLDNSNSMNNERANNSQRALKAGEAVEfa.TDKIT.SNKDN RVALVTYASTIFDGTEATVGKGVADQNGKA NDSVS DYHKTTFTATTIINYSYLN TNDANEVNTLKSRIPKEAEHING DR YQFGATFTQK? MKANEILETQSSNARKKLIFHVTDGVPTMSYAINFNPYXSTSYQNQF SFLNKIPDRSGI QE DFIINGDDYQIVKGDGESFK FSDRKVPVTGGTTQAAYRVPQNQLSVMSNEGYAINSGYtY Y RDYNWVYPFDPKTKK VSATKQIKTHGEPTTT-YFNGNIRPKGYDIFTVGIGVNGOPGATP EAEKFMQ?ISSKTENYTNVDDTNKIYDE NKYFK TI EEKHSIVDGNVTDPMGEMIEFQLKNGQSFT11DDYVLVGNDGSQ KNGVALGGPNSDGGILKDVTVTYDKTSQTIKI NHLNLGSGQ!C;VLTYDVRLKDNYISNKFYNTNNRTT SPKSEKEPNT-:RDFPIPKIRDVREFPVI-TISNQKíMGEVEFI KVNKDKHSESLLGAKFQLQIEKDFSGYKQFVPEGSDVTTKNDGKIYFKA QDGNYKLYEISSPDGYtEVKTKPWTFTI QNGEVTNLKADPNANKNQIGYLEGNGKH ITNT Los fragmentos adicionales de GBS104 incluyen un fragmento de 830 aminoácidos de GBS104 de los aminoácidos 28-858 (numerados por SEQ ID NO: 3) , un fragmento de 359 aminoácidos de GBS104 de los aminoácidos 28-387, un fragmento de 581 ácidos nucleicos de GBS104 de los aminoácidos 28-609 o un fragmento de 740 aminoácidos de GBS104 de los aminoácidos 28-768.

GBS276 GBS276 se refiere a una peptidasa de C5a. La descripción adicional de GBS276 se puede encontrar en las referencias 128-131. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de GBS276 secuenciadas de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 8941 y 8942. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 4 en la presente: MRK QKLPFDKLATALISTSI LNAQSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADD AND APQAPAKTADTPATSKATIRDLNDPSHVKT QEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKENLEK AKKEHGITYGE VNDKVAYYHDYSKDGKNAVDQEHGTHVSGILSGNAPSEMKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLAD YARNYAQAIPDAVNLGAKVINMSFGNAA AYANLPDETKKAFDYA SKGVSIVTSAGNDSSFGGKPRLPLADHPDYGVV GTPAAADST TVASYSPDKQLTETATV TDDHQDKEMPVISTNRFEPNK?YDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGD IDF DKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIE PNVDQ PAAFISRRDGLL KDNPPKTITFNATPKV PTASGTKLSRF SSV7G ADGMX PD1AAPGQDILSSVANNKYAK SGTSMSAPLVAGIMG LQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSA TA YDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAAT YVTDKDN?SSKVH NNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQE YYQVTVQTDK VDGKHFALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRG DFGNLSñLE PI?DSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTA TTESNP TIIKAVKEGVENXEDIESSEIT ETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNWVJTSEVTEQWKN YNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVA?SATFSTEDSRLT LASKPKTSQPV-fRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTK EGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKPEQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRA AT AST RDQLPTTNDKDTNR HI-LKLVMTTFF G GBS276 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica por la secuencia subrayada al comienzo de SEQ ID NO : 4 anterior . Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS276. Un ejemplo de este fragmento de GBS276 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 14: QSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADDANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRD LNDPSHVKT--QEKAGKGAGTWAVIDAGFDK HEA RLTDKTKARYQSKENLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSK DGKNAVDQEHGTHVSGILSGNAPSE KEPYR EGAMPEAQ LLMRVEIVNG ADYAR-.YAQAIRDAVNLGAKVINMSFG NAALAYAN PDETKKAFDYAK3KGVSIVTSAGNDSSFGGKPR PLADHPDYGWGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETA TVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQD KGFPIELP VDQMPAAFISRRDGL LKDNPPKTITFNATPKVLPTASGTK SRFSS GLTADGNI PDIAAPGQDI SS VANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAK KASAATMYVTDKDNTSSKVH NNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQE YYQVTVQTDKVDGKHFA APKALYETSWQKITIPA NSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMK GYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGN SALEKPIYDSKDGSSYYHEA NSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNP TIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANG KPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTF RNAKI.LVAEVLDKEGNWWTSEVTEQWK-.YNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKD GKWANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDL PTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVP KMSDFTYWEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKP EQDGSGOTPDF. KETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRA ATKASTRDQ PTTNDKDTNRLHL K VMTTF F G GBS276 contiene una región transmembrana y/o citoplásmica C-terminal que se indica por la secuencia subrayada cerca del extremo de SEQ ID NO: 4 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica de GBS276. Un ejemplo de este fragmento de GBS276 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 15: MRKKQK PFDl-CLAIALISTSILLNAQSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADD ANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRD NDPSHVKTLQEKAGKGAGTWAVIDAGFDKNHEA RLTDKTKARYQSKENLEK AKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKNAVDQEHGTHVSGI SGNAPSEMKEPYR EGAMPEAQL LMRVEIVNG AD YARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAA AYAN PDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKPRLPLADHPDYGW GTPAAAD?TLTVASYSPDKQ TETATVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGD IDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRRDGLLLKDNPPKTITFNATPKVLPTASGTKLSRF SS GLTADGNIKPDIAAPGQDI SSVANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMG LQKQYETQYPD TPSER DLAKKVLMSSA TALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSSKVH NNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQE YYQVTVQTD VDGKHFALAPKALYETS QKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRG DFGN SA EKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQ DGDG QFYAL NNFTALTTESNPWTIIKAVPEGVENIEDIESSEIT ETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKN VAEV DKEGNWWTSEVTEQWK YNND ASTLGSTRFEKTR DGKDKDGKWANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLT LASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTK LEGHSN PEQDGSDQAPDKKPEAKPEQDGSGQTPDKKKETKPE DSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRA ATK Se puede remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica de GBS276. Un ejemplo de este fragmento de GBS276 se expone como SEQ ID NO: 16: QSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADDANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRD LNDPSHVKTLQEKAGKGAGTWAVIDAGFDKNHEA R TDKTKARYQSKENLEKAK EHGITYGE V DKVAYYHDYSK DGK AVDQEHGTHVSGILSGNAPSEMKEPYR EGAMPEAQL MR\rEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFG NAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGG PRLPLADHPDYGWGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETA TVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGV IYDNQD KGFPIE PNVDQMPAAFISRRDG LKDNPPKTITFNATPKV PTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSS VANNKYA LSGTSMSAP VAGIMG LQKQYETQYPDMTPSERLDLAK V SSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAK £ASAATMYVTDKDNTSSBVHLNNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQELYYQVTVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQK1TIPA NSSKQVTVPIDASRFSKD AQM NGYF EGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEA NSDAKDQ DGDG QFYALKNNF ALTTESNP TIIKAVKEGVE1.IEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANG KPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEV D EGNW TSEVTEQVVK YNNDLAST GSTRFEKTRWDGKDKD GKWANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVD"NTTPEVATSATFSTEDS"RLT ASKPKTSQPVYRERIAYTYMDF.D PTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVP MSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKL EGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKP EQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRALATK GBS322 GBS322 se refiere a una proteína inmunogénica de superficie, también referida como "sip". Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de GBS322 secuenciadas de la cepa aislada 2603 V/R del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 8539 y 8540. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 5 en la presente: MNKKVJ-LTSTMA?S LSVASVQAQE'rDTTWTARTVSEVKADLVKQDNKSSY VKYGDTLSVISE? SI DMNVLAKINNI ADINLIYPETT TVTYDQKSH?ATSMKIETPATNAAGQTTATVDLKTNQVSVADQFCVSLNTISEGMTPEAATTIVSPMK TYSSAPALKSKEVL?QEQAVSQAAANEOVSPAPVKSITSEVPAAKEEVKPTQTSVSQSTTVSPASV?A?TPAPVAKVAP VRTVAAPRVASVKWTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSPATDSKLQATEV SVPVAQKAPTA PVAQPASTtNAVAAH PENAGLQPHVAAYKEKVASTYGV EFSTYRAGDPGDHGKG AVDFIVGTNQAI.GNKVAQYSTQNMA?NNISYVIWQQ F YSNTN S I YGPANTWN AMP DRGGVTAN HYDHVHVS FNK GBS322 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica por la secuencia subrayada cerca del comienzo de SEQ ID NO: 5. Se puede remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS322. Un ejemplo de este fragmento de GBS322 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 17: D VKQDNKSSYTVKYGDT SVISEAMS.T DMNVLAKINNIADXNLIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIEtP?TNA?GQTT ?TVDLKTNQVfiVADQKVS NTISEGMTPEAATTIVSPMKTYSSAPALKS EVLAQEQAVSQA?ANEQVSPAPVKSITSE VP?AKEEVKP QTSVSQSTTVSPASVAAETPAPVAKVAPVRTVA?PRVASVKWTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSP ATDSKLQATEVKSVPVAQKAPTATPVAQPASTTNAVAAHPENAGLQPHVAAYKEKVASTYGVNEFSTYRAGDPGDHGKG LAVDFIVGTNQALGNKVAQYSTQNMAANNISYVIWQQKFYSNTNSIYGPANTW AMPDRGGVTANHYDHVHVSFNK General El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10 %. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde es necesario, se puede omitir la palabra "sustancialmente" de la definición de la invención. Donde la invención proporciona un proceso que comprende múltiples pasos secuenciales, la invención también puede proporcionar un proceso que comprende menos del número total de pasos. Por ejemplo, si un sacárido se ha purificado ya parcialmente al remover los ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes, entonces este paso se puede omitir de los procesos de la invención. De manera similar, se puede realizar un paso para remover los contaminantes para dar material listo para precipitación mediada por detergente, pero no se necesita realizar la precipitación. El paso de precipitación no se necesita realizar a fin de caer dentro del alcance de la invención, puesto que el material de pre-precipitación tiene utilidad como un compuesto intermedio en la preparación del sacárido, y se puede usar, almacenar, exportar, etc., para uso posterior, por ejemplo, para precipitación posterior. Estos diferentes pasos se pueden realizar en momentos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes países) . Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en la forma abierta y cerrada y que, en tanto que se muestran las formas cerradas en las fórmulas estructurales en la presente, también se contemplan las formas abiertas por la invención. De manera similar, se apreciará que los azúcares pueden existir en las formas de piranosa y furanosa y que, en tanto que se muestran las formas de piranosa en las fórmulas estructuras en la presente, también se abarcan las formas de furanosa. También se abarcan diferentes formas anoméricas de los azúcares .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra el polisacárido capsular (izquierda) y el polisacárido específico de grupo (derecha) unidos al peptidoglicano de GBS. La Figura 2 muestra las estructuras de repetición de sacáridos capsulares en los serotipos la, Ib, II, III y V de GBS. La Figura 3 muestra la diferencia entre las estructuras de repetición en los serotipos la y III de GBS. La Figura 4 muestra la estructura tetraantenaria del antígeno del grupo B. A-D representan los oligosacáridos del componente principal, y P representa fosfato [12] . La Figura 5 muestra dos tipos de conjugado que se pueden preparar . La Figura 6 es un diagrama de flujo que muestra un proceso completo de la invención. La Figura 7 es un espectro de absorbancia de UV de seis presentaciones de polisacáridos capsulares de GBS. Es visible un pico o resalto en aproximadamente 275 nm. En este punto, los tres espectros superiores son para material purificado por métodos de la técnica anterior, y los tres espectros de fondo son para material purificado de acuerdo a la invención. En orden desde arriba hacia abajo en el punto de aproximadamente 275 nm: Ib; la; III; la; Ib; III. Las figuras 8 a 10 muestran los espectros de RMN para los diferentes serotipos: (8) la; (o) Ib; (10) III.

Descripción Detallada de la Invención Modos para Llevar a Cabo la Invención A. Purificación de Sacárido Capsular de los Serotipos la, Ib y III de GBS El sobrenadante de un cultivo de estreptococo del grupo B se recolectó después de la centrifugación y se trató con hidróxido de sodio (concentración final 0.8 M) a 37°C durante 36 horas. La suspensión resultante se neutralizó por adición de HCl. Se adicionó una mezcla de etanol acuoso (30 %) y CaCl2 (0.1 M) a la mezcla neutralizada. Se formó rápidamente un precipitado, que se removió por centrifugación. Los ensayos con ácido siálico mostraron que el sacárido capsular permaneció en el sobrenadante. El sobrenadante se sometió a microfiltración de extremo inactivo en filtros regenerados de celulosa (corte de 0.22 µm) , y se sometió entonces a diafiltración de flujo tangencial usando una membrana de celulosa con corte de 30 kDa durante aproximadamente 2 horas . El sacárido capsular estaba en el producto retenido de la ultrafiltración. El producto retenido se trató al adicionar detergente de CTAB al 10 % hasta que se formó un precipitado (en el espacio de minutos) . El material precipitado (incluyendo el polisacárido capsular) se separó por centrifugación. El sedimento se re-solubilizó por adición de CaCl2 acuoso 0.1M. Se realizó un paso adicional de precipitación al adicionar etanol al 96 % para dar una concentración final de etanol de 80 %. El precipitado se removió nuevamente por centrifugación, y el sedimento se secó por secado al vacío. El proceso completo (ilustrado en la Figura 6) toma 2-3 días y tiene un rendimiento de aproximadamente 60 %. Para el material seco final, se probaron los siguientes parámetros: peso total; peso del sacárido capsular; y contenido de ácido siálico. Los resultados para los tres serotipos fueron como sigue: * Solución normal obtenida al solubilizar polvo seco en agua La pureza en cada caso fue mejor que lo que se puede lograr por los métodos de la técnica anterior, particularmente para el material del serotipo III (89 % vs . 74 %) . En contraste a la técnica anterior, sin embargo, el proceso toma 2-3 días (en comparación a 15-20 días) y tiene un rendimiento de aproximadamente 60 % (en comparación a aproximadamente 20 %) . Se valoró la contaminación con proteínas y ácidos nucleicos por absorción de UV. También se probaron, por comparación, sacáridos preparados por los procesos de la técnica anterior. Los espectros se muestran en la Figura 7, y el material de la técnica anterior tiene un pico claro a aproximadamente 270 nm para cada uno de los tres serogrupos. En contraste, el material purificado por el proceso de la invención tiene un espectro plano en esta región. La relación de absorbancias a 280 nm y 260 nm fue como sigue: Estas relaciones muestran que el material preparado por los métodos de la invención está menos contaminado que el material preparado por los métodos de la técnica anterior. Se usó RMN para estudiar los sacáridos, y en particular, para valorar el grado de N-acetilación. Los espectros de RMN se muestran en las figuras 8 a 10. Los espectros para el proceso de la técnica anterior y el proceso de la invención están traslapados, con el espectro exterior que es el material de la técnica anterior. El % de N-acetilación calculado fue como sigue: B. Conjugación de Sacáridos Capsulares Purificados Se purificaron y re-acetilaron sacáridos capsulares de cada uno de los serotipos la, Ib y III de GBS. Los sacáridos entonces se conjugaron covalentemente ya sea al toxoide monomérico de tétano (TT) o a las proteínas portadoras CRM197 por aminación reductiva directa. Los resultados fueron como sigue: C. Estudios de Estimulación con Conjugados El sacárido capsular de una cepa del serotipo la se purifico usando ya sea los procesos de la técnica anterior o por los métodos de la invención . Para la conj ugación, se oxidó una fracción de los residuos de ácido siálico en el sacárido , con un obj etivo de entre 5 y 15 % . Dos lotes de material purif icados por los métodos de la técnica anterior tuvieron porcentaj es de oxidación de 54 . 5 % y 17 . 6 % . El material purif icado de acuerdo a la invención estaba 6 . 6 % oxidado . Los sacáridos se conjugaron a toxoide de tétano por aminación reductiva . Se realizaron inmunizaciones de ratones en paralelo con los tres conjugados a 0 y 21 días con 1 µg de sacárido por dosis. Grupos de ratones hembras cruzadas CD-1 de 6-7 semanas de edad (Charles River Laboratories) recibieron el conjugado suspendido en 250 µl de PBS y un volumen igual de PBS que contienen un adyuvante de hidróxido de aluminio (concentración final de 2 mg/ml) por inyección intraperitoneal . Se estimularon entonces los ratones con tres diferentes serotipos . Las proporciones de supervivencia fueron como sigue: De esta manera, los sacáridos purificados por los procesos de la invención son inmunológicamente superiores a aquéllos purificados por los métodos de la técnica anterior.

Estudios de Opsonofagocitosis Los sacáridos de los conjugados TT de los serotipos la, Ib y III se prepararon, ya sea por los métodos de la técnica anterior [1-9] o por los métodos de la invención. Grupos de cuatro ratones hembra cruzadas CD-1 de 6-7 semanas de edad (Charles River Laboratories) se inmunizaron con los conjugados (dosis: 1 µg de sacárido) suspendidos en 250 µl de PBS y un volumen igual de PBS que contiene un adyuvante de hidróxido de aluminio (concentración final de 2 mg/ml) . Cada grupo recibió dos dosis a los días 0 y 21 por inyección intraperitoneal. En cada esquema de inmunización, también se usaron grupos de control negativo y positivo. Se determinaron las respuestas inmunitarias de las muestras de suero tomadas en los días 0 y 36. Los sueros se analizaron como mezclas de cada grupo de ratones, contra 7 diferentes cepas de GBS, incluyendo "515" (tipo la; MLST tipo ST23), "COH1" (tipo III; MLST tipo ST17) y "H36B" (tipo Ib; MLST tipo ST6) . Se midieron tanto la protección como ios títulos opsónicos, y los resultados son como sigue: Los datos muestran que los sacáridos purificados por los métodos de la invención dan eficacia protectora equivalente o mejorada en comparación al material purificado por los métodos de la técnica anterior. Además, donde es comparable la eficacia protectora, el material purificado por los métodos de la invención da títulos opsónicos mejorados . Se entenderá que la invención se ha descrito a manera de ejemplo únicamente y se pueden hacer modificaciones en tanto que permanecen dentro del alcance y espíritu de la invención REFERENCIAS (los contenidos de las cuales se incorporan de este modo en totalidad) [I] Paoletti et al. (1990) J Biol Chem 265:18278-83. [2] Wessels et al. (1990) J Clin Invest 86:1428-33. [3] Paoletti et al. (1992) Infect Immun 60:4009-14. [4] Paoletti et al. (1992) J Clin Invest 89:203-9. [5] Wessels et al. (1987) Proc Nati Acad Sci EUA 84:9170-4. [6] Wang et al. 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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Proceso para purificar un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) tratar una suspensión que comprende proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos capsulares estroptococales con un catión metálico acuoso y un alcohol a fin de precipitar los ácidos nucleicos y proteínas; (b) separar el material precipitado del material acuoso; y (c) tratar el material acuoso con un detergente catiónico a fin de precipitar el polisacárido capsular. 2. Proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polisacárido es del serotipo S . agalactiae seleccionado de la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII o VIII. 3. Proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el serotipo se selecciona de la, Ib, II, III o V. 4. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el polisacárido es un polisacárido capsular de longitud sustancialmente completa. 5. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el polisacárido tiene un peso molecular > 30 kDa. 6. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el sacárido 5 está parcial o completamente des-O-acetilado. 7. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el sacárido está parcial o completamente des-N-acetilado. 8. Proceso de conformidad con cualquier 10 reivindicación anterior, caracterizado porque la suspensión es el sobrenadante de un cultivo centrifugado de S. agalactiae . 9. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la suspensión 15 se prepara al tratar S. agalactiae tal que se libera el sacárido capsular. 10. Proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el sacárido capsular se libera por tratamiento químico o enzimático. 20. 11. Proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el sacárido capsular se libera por extracción con base. 12. Proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el sacárido capsular se libera por 25 tratamiento tanto con mutanolisina y ß-N- acetilglucosaminidasa . 13. Proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el sacárido capsular se libera por tratamiento con una fosfodiesterasa tipo II. 14. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el alcohol es un alcohol inferior. 15. Proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el alcohol es etanol o isopropanol. 16. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el alcohol se adiciona a la suspensión para dar una concentración final de alcohol de entre 10 % y 50 %. 17. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el catión metálico acuoso es monovalente o divalente. 18. Proceso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el catión es Mg++, Mn++ o Ca++. 19. Proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se usan iones de Ca++ y se presentan a una concentración final de entre 10 y 500 mM. 20. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el paso (b) incluye centrifugación. 21. Proceso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sobrenadante después de la centrifugación se somete a microfiltración. 22. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque se realiza un paso de diafiltración después del paso (a) y antes del paso (c) . 23. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el paso catiónico en el paso (c) es sal de tetrabutilamonio o cetiltrimetilamonio, tal como CTAB. 24. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el proceso comprende además re-solubilizar el sacárido en medio acuoso o en medio alcohólico. 25. Proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque se usa un medio acuoso para re-solubilizar el sacárido, y en donde el medio acuoso incluye Mg++, Mn++ o Ca++ . 26. Proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque se usa un medio alcohólico para re-solubilizar el sacárido, y en donde el alcohol tiene una concentración final de entre 70 % y 95 %. 27. Composición, caracterizada porque comprende un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae, obtenible por el proceso de cualquier reivindicación anterior. 28. Composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la composición tiene absorbancia UV a 280 nm de menos de 0.20. 29. Composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la relación de absorbancia UV de la composición a 280 nm a la absorbancia UV a 260 nm es mayor que 0.85. 30. Composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el espectro de absorbancia de UV de la composición entre 220 nm y 300 nm exhibe ya sea un resalto pico a aproximadamente 270 nm. 31. Composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el espectro UV de la composición entre 250 nm y 275 nm no tiene ya sea un punto máximo ni un punto de inflexión. 32. Composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la pureza del sacárido es al menos 89 % con relación al peso total de sacárido, proteína y ácido nucleico en la composición.