ES2626416T3 - Purificación de sacáridos capsulares de Staphilococcus aureus de tipo 5 y de tipo 8 - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de preparación de una composición inmunogénica que comprende un polisacárido capsular de S.aureus de tipo 5 conjugado con una molécula de vehículo y un polisacárido capsular de S.aureus de tipo 8 conjugado con una molécula de vehículo, comprendiendo dicho procedimiento: (a) un procedimiento de purificación de polisacárido capsular de células de S.aureus de tipo que comprende una etapa de liberación de polisacárido capsular a partir de las células mediante tratamiento de las células con ácido, en el que las células están en la forma de una pasta celular húmeda o están suspendidas en un medio acuoso, y la masa molecular del polisacárido purificado está entre 2-3500 kDa; (b) conjugación del polisacárido capsular con una molécula de vehículo para preparar un conjugado; y (c) mezclar el conjugado con un polisacárido capsular de S.aureus de tipo 8 conjugado con una molécula de vehículo.

Description

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La masa molecular del polisacárido capsular purificado de S. aureus de tipo 5 o de tipo 8 se puede medir mediante filtración con gel en relación con los estándares de pululano, tales como aquellos disponibles del Servicio Estándar de Polímeros [28]. Típicamente, el polisacárido purificado es una mezcla de polisacáridos con masas dentro de un intervalo de valores. Para el polisacárido capsular de tipo 5, la masa molecular del polisacárido purificado típicamente está entre 2-3500 kDa, por ejemplo, entre 10-2000 kDa, particularmente entre 20-1000 kDa y más particularmente entre 100-600 kDa. De manera similar, para el polisacárido capsular de tipo 8, la masa molecular del polisacárido purificado está entre 2-3500 kDa, por ejemplo, entre 10-2000 kDa, particularmente entre 20-1000 kDa y más particularmente entre 100-600 kDa.

El polisacárido purificado se puede despolimerizar para formar un oligosacárido. Los oligosacáridos pueden ser preferentes para su uso en vacunas. La despolimerización a oligosacárido puede tener lugar antes o después de cualquiera de las etapas mencionadas anteriormente. Típicamente, la despolimerización tiene lugar tras la cromatografía de intercambio aniónico descrita anteriormente. Si se concentra el polisacárido tras esta cromatografía, entonces la despolimerización típicamente tiene lugar tras esta concentración. Cuando la composición de la invención incluye un polisacárido despolimerizado, es preferente que la despolimerización preceda a cualquier conjugación. Los polisacáridos de longitud completa se pueden despolimerizar para dar fragmentos más cortos para su uso en la invención mediante diversos procedimientos. Preferentemente, se usa el procedimiento descrito en la referencia 29. Como alternativa, se pueden usar otros procedimientos para la despolimerización del polisacárido. Por ejemplo, el polisacárido se puede calentar o someter a microfluidización [30]

o radiación de ultrasonido [3]. Como alternativa, se puede usar la despolimerización por oxidación-reducción [31] u ozonólisis [32].

Los oligosacáridos se pueden identificar mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño. Los productos se pueden dimensionar con objeto de eliminar oligosacáridos de longitud corta. Esto se puede lograr de diversas maneras, tales como filtración con gel. Las masas moleculares específicas se pueden medir por filtración con gel en relación con patrones de pululano, tales como aquellos disponibles del Servicio Estándar de Polímeros [33].

Si los grupos N-acetilo en el polisacárido capsular natural han sido de-N-acetilados, entonces los procedimientos de la invención pueden incluir una etapa de re-N-acetilación. La re-N-acetilación controlada se puede realizar de manera conveniente usando un reactivo tal como anhídrido acético (CH3CO)2O por ejemplo, en bicarbonato de amonio al 5 % [34].

También se pueden realizar rondas adicionales de filtración, por ejemplo, filtración estéril.

Estas etapas adicionales se pueden realizar generalmente a temperatura ambiente.

Almacenamiento

La preparación del polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 o de tipo 8 se puede liofilizar, por ejemplo, mediante secado por congelación al vacío, o congelación en solución (por ejemplo, como el eluato de la etapa final de concentración, si se incluye) para el almacenamiento en cualquier etapa durante el procedimiento de purificación. Por lo tanto, no es necesario para la preparación que se transfiera inmediatamente de una etapa del procedimiento a otra. Por ejemplo, si se va a purificar la preparación de polisacáridos mediante diafiltración, entonces se puede liofilizar o congelar en solución antes de esta purificación. De manera similar, el polisacárido se puede liofilizar o congelar en solución antes de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Si la preparación de polisacáridos se va a purificar mediante filtración con gel, entonces se puede liofilizar o congelar en solución antes de esta etapa. De manera similar, si se va a concentrar la preparación de polisacáridos, entonces se puede liofilizar o congelar en solución antes de esta etapa. La preparación liofilizada se reconstituye en una solución apropiada antes del tratamiento adicional. De manera similar, la solución congelada se descongela antes del tratamiento adicional.

El polisacárido purificado obtenido mediante el procedimiento de la invención se puede procesar para el almacenamiento de cualquier forma adecuada. Por ejemplo, el polisacárido se puede liofilizar tal como se describe anteriormente. Como alternativa, el polisacárido se puede almacenar en solución acuosa, típicamente a baja temperatura, por ejemplo, a 20 °C. Convenientemente, el polisacárido se puede almacenar como el eluato de las etapas de cromatografía de intercambio aniónico, filtración con gel o concentración.

Conjugación

El polisacárido capsular purificado final de la invención se puede usar como un antígeno sin modificación adicional, por ejemplo, para su uso en ensayos de diagnóstico in vitro, para su uso en inmunización, etc.

Para propósitos de inmunización, sin embargo, es preferente conjugar el polisacárido con una molécula de vehículo, tal como una proteína. En general, la conjugación covalente de polisacáridos con los vehículos mejora la inmunogenicidad de los polisacáridos ya que los convierte de antígenos T-independientes a antígenos Tdependientes, permitiendo, por lo tanto, cebar la memoria inmunológica. La conjugación es especialmente útil para vacunas pediátricas [por ejemplo, ref. 35] y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisada en las refs. 36 a 44]. Por lo tanto, los procedimientos de la invención pueden incluir la etapa adicional de conjugar el polisacárido

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purificado con una molécula de vehículo.

La conjugación de polisacáridos capsulares de S.aureus de tipo 5 y de tipo 8 se ha publicado ampliamente por ejemplo, ver referencias 1 a 9. El procedimiento típico usado en la literatura para la conjugación implica la tiolación de un polisacárido purificado usando cistamina. La reacción se basa en la presencia de grupos carboxilato en el polisacárido capsular. Estos grupos reaccionan con cistamina en presencia de una carbodiimida, por ejemplo, EDAC. El polisacárido derivado después se conjuga con una proteína de vehículo tal como la endotoxina A (ETA) de Pseudomonas aeruginosa, típicamente mediante un enlazador [2]. Las vacunas de conjugados preparadas de este modo, han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [5]. Otros investigadores han llevado a cabo la conjugación de los polisacáridos capsulares purificados de tipo 5 y de tipo 8 mediante aminación reductora [45 y 12]; acoplamiento con glutaraldehído [45]; o reacción de los grupos hidroxilo en los polisacáridos con agentes de cianilación como CDAP [46] o tricloruro cianúrico [11]. Preferentemente, se usa el procedimiento descrito en la referencia 29.

Las proteínas de vehículos preferentes son toxinas bacterianas, tales como toxinas de la difteria o tétanos, o toxoides o mutantes de las mismas. Los inventores han descubierto que es adecuado el mutante de la toxina de la difteria CRM197 [47]. La exotoxina A (ETA) de Pseudomononas aeruginosa y su exoproteína A recombinante (rEPA) mutante no tóxica se han usado como proteínas de vehículos para polisacáridos capsulares de S.aureus de tipo 5 o de tipo 8 ([1] y [2]). La α-hemolisina de S.aureus (α-toxina) ([45] y [48]), la ovoalbúmina [11] y la albúmina de suero humana [12] también se han usado. Estos vehículos se pueden usar en la presente invención.

Otras proteínas de vehículos adecuadas incluyen el complejo de proteína de membrana exterior de N.meningitidis [49], péptidos sintéticos [50, 51], proteínas de choque térmico [52, 53], proteínas de tosferina [54, 55], citocinas [56], linfocinas [56], hormonas [56], factores de crecimiento [56], albúmina de suero humana (típicamente recombinante), proteínas artificiales que comprenden epítopos múltiples de linfocitos T CD4+ humanos a partir de diversos antígenos derivados de patógenos [57] tales como N19 [58], proteína D de H.influenzae [59-61], proteína PspA de superficie de neumococos [62], neumolisina [63] o sus derivados no tóxicos [64], proteínas de absorción de hierro [65], toxina A o B de C.difficile [66], una proteína GBS [67], una proteína GAS [68] etc.

Otras proteínas de vehículos adecuadas incluyen antígenos de proteínas de S.aureus, por ejemplo los antígenos de proteínas de S.aureus que se indican a continuación.

La unión al vehículo es preferentemente mediante un grupo -NH2 por ejemplo, en la cadena lateral de un resto de lisina en una proteína de vehículo, o de un resto de arginina. La unión también puede ser mediante un grupo -SH por ejemplo, en la cadena lateral de un resto de cisteína.

Es posible usar más de una proteína de vehículo, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión del vehículo. Por lo tanto, se pueden usar diferentes proteínas de vehículos para los polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8, por ejemplo, el polisacárido de tipo 5 podría conjugarse con CRM197 mientras que el polisacárido de tipo 8 podría conjugarse con rEPA. También es posible usar más de una proteína de vehículo para un antígeno de polisacárido particular, por ejemplo, el polisacárido tipo 5 podría estar en dos grupos, con un grupo conjugado con CRM197 y el otro conjugado con rEPA. Típicamente, sin embargo, la misma proteína de vehículo se usa para todos los polisacáridos.

Una única proteína de vehículo podría llevar más de un antígeno de polisacárido [69, 70]. Por ejemplo, una única proteína de vehículo podría tener conjugada con ella los polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8. Para alcanzar esta meta, se pueden mezclar diferentes polisacáridos antes del procedimiento de conjugación. Típicamente, sin embargo, existen conjugados separados para cada polisacárido, con los diferentes polisacáridos que se mezclan tras la conjugación. Los conjugados separados se pueden basar en el mismo vehículo.

Los conjugados con una proporción polisacárido:proteína (p/p) de entre 1:20 (es decir, proteína en exceso) y 20:1 (es decir, polisacárido en exceso) se usan típicamente. Las proporciones de 1:10 a 1:1 son preferentes, particularmente las proporciones entre 1:5 y 1:2 y, lo más preferentemente, alrededor de 1:3. En contraste, los conjugados del polisacárido capsular de tipo 5 y de tipo 8 usados en la bibliografía tienden a tener proporciones mayores, por ejemplo, entre 0,73 y 1,08 en las referencias 1, 2 y 3. En ralizaciones particulares de la invención, la proporción polisacárido:proteína (p/p) para el conjugado del polisacárido capsular de tipo 5 está entre 1:10 y 1:2; y/o la proporción polisacárido:proteína (p/p) para el conjugado del polisacárido capsular de tipo 8 está entre 1:5 y 7:10.

Los conjugados se pueden usar en conjunto con un vehículo libre [71]. Cuando una proteína de vehículo dada está presente tanto en forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferentemente no más del 5 % de la cantidad total de la proteína de vehículo en la composición como un todo, y más preferiblemente presente a menos del 2 % en peso.

Tras la conjugación, se pueden separar los polisacáridos libres y conjugados. Existen muchos procedimientos adecuados, incluyendo cromatografía hidrofóbica, ultrafiltración tangencial, diafiltración etc. [ver también las refs. 72 y 73, etc.].

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Las composiciones farmacéuticas se pueden empaquetar en viales o en jeringas. Las jeringas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una única dosis de la composición, mientras que un vial puede incluir una única dosis o múltiples dosis.

Las composiciones acuosas de polisacáridos de la invención o tal como se desvela en el presente documento son adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada. Cuando se va a usar una composición de la invención o tal como la que se desvela en el presente documento para tal reconstitución extemporánea, se proporciona o desvela un procedimiento para reconstituir tal vacuna liofilizada, que comprende la etapa de mezclar el material liofilizado con una composición acuosa de la invención. El material reconstituido se puede usar para inyección.

Antígenos de S.aureus

Tal como se mencionó anteriormente, se pueden incluir uno o más antígenos de S.aureus adicionales en las composiciones de la invención o tal como las que se desvelan. Los antígenos pueden ser antígenos de sacáridos o proteínas. Los antígenos de proteínas de S.aureus se pueden usar como proteínas de vehículos para los conjugados de la invención o tal como se desvela, proteínas de vehículos para otros conjugados, o como antígenos de proteínas no conjugadas. Los antígenos de sacáridos de S.aureus se pueden usar como los sacáridos para otros conjugados o como antígenos de sacáridos no conjugados.

Los antígenos de sacáridos de S.aureus adecuados incluyen el exopolisacárido de S.aureus, el cual es una poli-Nacetilglucosamina (PNAG). Este polisacárido está presente tanto en S.aureus como en S.epidermidis y se puede aislar de cualquier fuente [130, 131]. Por ejemplo, se puede aislar la PNAG de la cepa de S.aureus MN8m [132]. El antígeno de sacárido puede ser un polisacárido que tiene el tamaño que surge durante la purificación del exopolisacárido a partir de bacterias, o puede ser un polisacárido logrado por fragmentación de tal polisacárido por ejemplo, el tamaño puede variar de más de 400 kDa hasta entre 75 y 400 kDa, o entre 10 y 75 kDa, o hasta 30 unidades de repetición. El antígeno de sacárido puede tener diversos grados de N-acetilación y, tal como se describe en la referencia 133, la PNAG puede estar N-acetilada a menos del 40 % (por ejemplo, N-acetilada a menos del 35, 30, 20, 15, 10 o 5 %; la PNAG deacetilada también se conoce como dPNAG). Los epítopos deacetilados de PNAG pueden producir anticuerpos que sean capaces de mediar la eliminación por opsonización. La preparación de dPNAG se describe en la referencia 134. El PNAG puede o no estar O-succinilado por ejemplo, puede estar O-succinilado en menos del 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 o 0,1 % de restos. El PNAG se puede conjugar con una molécula de vehículo tal como se describe anteriormente o como alternativa puede no conjugarse.

Otro antígeno de sacárido de S.aureus adecuado es el antígeno tipo 336, el cual es una hexosamina ligada a β sin O-acetilación [135, 136]. El antígeno tipo 336 tiene reacción cruzada con anticuerpos contra la cepa 336 (ATCC 55804). El antígeno tipo 336 se puede conjugar con una molécula de vehículo tal como se describe anteriormente o como alternativa puede no conjugarse.

Los antígenos de proteínas de S.aureus adecuados incluyen los siguientes antígenos de S.aureus (o antígenos que comprenden fragmentos inmunogénicos de los mismos) [por ejemplo, véase las referencias 137-144]: AhpC, AhpF, autolisinamidasa, autolisinglucosaminidasa, proteína de unión a colágenoCAN, EbhB, GehD lipasa, proteína de unión a heparina HBP (17 kDa), receptor de laminina, MAP, MntC (también conocido como SitC), MRPII, Npasa, ORF0594, ORF0657n, ORF0826, PBP4, RAP (proteína activadora de RNA III), Sai-1, SasK, SBI, SdrG, SdrH, SSP1, SSP-2 y proteína de unión a vitronectina.

Los antígenos de proteínas de S.aureus adicionales adecuados incluyen un antígeno clfA; un antígeno clfB; un antígeno sdrE2; un antígeno sdrC; un antígeno sasF, un antígeno emp; un antígeno sdrD; un antígeno spa; un antígeno esaC; un antígeno esxA; un antígeno esxB; un antígeno sta006; un antígeno isdC; un antígeno Hla; un antígeno sta011; un antígeno isdA; un antígeno isdB; y un antígeno sta073, tal como se describe a continuación. Uno o más (es decir 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) de estos antígenos puede estar presente en una composición de la invención. De estos antígenos, el uso de uno o más (es decir 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) de un antígeno esxA; un antígeno esxB; un antígeno sta006; un antígeno Hla; un antígeno sta011; y/o un antígeno sta073 está específicamente previsto.

Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender una de las siguientes combinaciones de antígenos de proteínas de S.aureus:

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Un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta006 y un antígeno Hla. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar de manera útil como un polipéptido híbrido, tal como se trata a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB con un antígeno esxB aguas abajo de un antígeno esxA. El antígeno Hla puede ser un mutante destoxificado por ejemplo, que incluye una mutación H35L.

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Un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta006 y un antígeno sta011. Los antígenos esxA y esxB pueden combinarse como un polipéptido híbrido, tal como se trata a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB.

(3)

Un antígeno esxA, un antígeno esxB y un antígeno sta011. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar útilmente como un polipéptido híbrido, tal como se trata a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB.

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Un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno Hla, un antígeno sta006 y un antígeno sta011. Los

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El antígeno 'sdrE2' se señala como un proteína SdrE de unión a sialoproteínas de fibrinógeno/hueso ricas en Ser-Asp’. En la cepa Newman sdrE2 es NWMN_0525 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 (GI:151220737).

Los antígenos sdrE2 útiles pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un humano) que reconoce la SEQ ID NO: 8 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 8; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 8, la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sdrE2 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 8. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 8 mientras conserva al menos un epítopo de SEQ ID NO: 8. Los 38 aminoácidos finales en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 8 se pueden omitir de manera útil. Los primeros 52 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 8 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas. SdrE2 es naturalmente una proteína larga y por tanto es muy útil el uso de fragmentos por ejemplo, para purificación, manejo, fusión, expresión, etc.

La SEQ ID NO: 9 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 8 (‘SdrE53-632’). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de SdrE2 y se usa más fácilmente a una escala industrial. También reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas.

sdrC

El antígeno 'sdrC' se señala como “proteína sdrC”. En la cepa NCTC 8325, sdrC es SAOUHSC_00544 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 (GI:88194324).

Los antígenos útiles sdrC pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 10 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 10, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sdrC incluyen variantes de la SEQ ID NO: 10. Los fragmentos preferents de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 10 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Los 38 aminoácidos finales en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 10 se pueden omitir de manera útil. Los primeros 50 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 10 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas. SdrC es naturalmente una proteína larga y, por tanto, el uso de fragmentos es útil por ejemplo, para purificación, manejo, fusión, expresión, etc.

La SEQ ID NO: 11 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 10 (‘SdrC51-518’). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de SdrC y se usa más fácilmente a una escala industrial. También reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas.

sasF

El antígeno 'sasF' se señala como 'proteína sasF'. En la cepa NCTC 8325, sasF es SAOUHSC_02982 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 (GI:88196601).

Los antígenos útiles sasF pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 12 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 12; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 12, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sasF incluyen variantes de la SEQ ID NO: 12. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno

o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 12 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Los 39 aminoácidos finales en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 12 se pueden omitir de manera útil. Los primeros 37 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 12 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas.

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El antígeno 'emp' se señala como 'matriz extracelular y proteína de unión a plasma'. En la cepa NCTC 8325, emp es SAOUHSC_00816 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 (GI:88194575). En la cepa Newman es nwmn_0758 (GI:151220970).

Los antígenos útiles emp pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 13 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50% o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 13; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 13, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas emp incluyen variantes de la SEQ ID NO: 13. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno

o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 13 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Los primeros 26 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 13 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas.

Las SEQ ID NOs: 14, 15, 16 y 17 son fragmentos útiles de la SEQ ID NO: 13 (‘Emp35-340’, ‘Emp27-334’, ‘Emp35-334’ y ‘Emp27-147’, respectivamente).

sdrD

El antígeno 'sdrD' se señala como 'proteína sdrD'. En la cepa NCTC 8325, sdrD es SAOUHSC_00545 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 (GI:88194325).

Los antígenos útiles sdrD pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 18 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 18; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sdrD incluyen variantes de la SEQ ID NO: 18. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 18 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Los 38 aminoácidos finales en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 18 se pueden omitir de manera útil. Los primeros 52 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 18 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas. SdrD es naturalmente una proteína larga y así es muy útil el uso de fragmentos por ejemplo, para purificación, manejo, fusión, expresión, etc.

La SEQ ID NO: 19 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 18 (‘SdrD53-592’). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de SdrD y se usa más fácilmente a una escala industrial. También reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas. Otro fragmento útil, con el mismo residuo en el extremo C-terminal, es SdrD394-592 (también conocido como SdrD-N3; SEQ ID NO: 20).

spa

El antígeno 'spa' se señala como ‘proteína A’ o ‘SpA’. En la cepa NCTC 8325, spa es SAOUHSC_00069 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 (GI:88193885). En la cepa Newman es nwmn_0055 (GI:151220267). Todas las cepas de S.aureus expresan el gen estructural para spa, un factor de virulencia bien caracterizado cuyo producto de proteína de superficie de anclaje a la pared celular tiene cinco dominios de enlace a inmunoglobulina altamente homólogos denominados E, D, A, B, y C [146]. Estos dominios presentan aproximadamente el 80 % de identidad a nivel de aminoácidos, tienen de 56 a 61 residuos de longitud, y están organizados como repeticiones en tándem [147]. SpA se sintetiza como una proteína precursora con un péptido de señal en el extremo N-terminal y una señal de clasificación en el extremo C-terminal [148, 149]. El spa anclado a la pared cellular se presenta en mayor abundancia en la superficie del estafilococo [150, 151]. Cada uno de sus dominios de unión a inmunoglobulina está compuesto de hélices α antiparalelas que se ensamblan en un haz de tres hélices y puede unir el dominio Fc de inmunoglobulina G (IgG) [152, 153], la cadena pesada VH3 (Fab) de IgM (es decir, el receptor de linfocito B) [154], el factor von Willebrand en su dominio A1 [155] y/o el receptor I de TNF-α (TNFRI) [156], que se presenta en las superficies del epitelio de las vías respiratorias.

Los antígenos spa útiles pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 21 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 21; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 21, en donde 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas spa incluyen variantes de la SEQ ID NO: 21. Los

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fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 21 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Los 35 aminoácidos finales en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 21 se pueden omitir de manera útil. Los primeros 36 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 21 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas. La referencia 157 sugiere que los dominios unidos a IgG pueden ser inmunógenos útiles, solos o en combinación.

La SEQ ID NO: 22 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 21 (‘Spa37-325’). Este fragmento contiene los cinco dominios de unión a Ig de SpA e incluye el dominio más expuesto de SpA. También reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas. Otros fragmentos útiles pueden omitir 1, 2, 3 o 4 de los dominios A, B, C, D y/o E naturales. Tal como se comunica en la referencia 157, otros fragmentos útiles pueden incluir sólo 1, 2, 3 o 4 de los dominios A, B, C, D y/o E naturales por ejemplo, que sólo comprenden el dominio SpA(A) pero no B a E, o sólo comprende el dominio SpA(D) pero no A, B, C o E, etc. Por lo tanto, el antígeno spa útil con la invención puede incluir 1, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión a IgG, pero idealmente tiene 4 o menos. Si un antígeno sólo incluye un tipo de dominio spa (por ejemplo, sólo el dominio Spa(A) o SpA(D)), puede incluir más de una copia de este dominio por ejemplo, dominios SpA(D) múltiples en una única cadena de polipéptido. Un dominio individual dentro del antígeno puede mutarse en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 21 (por ejemplo, véase la ref. 157, que desvela mutaciones en los restos 3 y/o 24 del dominio D, en el resto 46 y/o 53 del dominio A, etc.). Tales mutantes no deberían eliminar la capacidad del antígeno para producir un anticuerpo que reconoce la SEQ ID NO: 21, pero pueden eliminar la unión del antígeno a IgG. En ciertos aspectos un antígeno spa incluye una sustitución en (a) una o más sustitución de aminoácido en un dub-dominio unido a IgG Fc del dominio SpA A, B, C, D y/o E que rompe o reduce la unión a IgG Fc, y (b) una o más sustitución de aminoácido en un sub dominio unido a VH3 del dominio SpA A, B, C, D, y/o E que rompe o reduce la unión a VH3. En ciertas realizaciones, una variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos D del dominio SpA variante.

esaC

El antígeno 'esaC' se señala como 'esaC'. En la cepa NCTC 8325 esaC es SAOUHSC_00264 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 (GI:88194069).

Los antígenos esaC útiles pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 23 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 23; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 23, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más). Estas proteínas esaC incluyen variantes de la SEQ ID NO: 23. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 23. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 23 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 23. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas.

esxA

El antígeno 'esxA' se señala como 'proteína'. En la cepa NCTC 8325 esxA es SAOUHSC_00257 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 (GI:88194063).

Los antígenos esxA útiles pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 24 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 24; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 24, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más). Estas proteínas esxA incluyen variantes de la SEQ ID NO: 24. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 24. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 24 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 24. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas.

esxB

El antígeno 'esxB' se señala como 'esxB'. En la cepa NCTC 8325 esxB es SAOUHSC_00265 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 (GI:88194070).

Los antígenos esxB útiles pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 25 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de

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reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas. Otros fragmentos útiles se desvelan en las referencias 164 y

165.

IsdA no adsorbe bien a los adyuvantes de hidróxido de aluminio, de manera que IsdA presente en una composición puede estar no adsorbido o puede adsorberse a un adyuvante alternativo, por ejemplo, a fosfato de aluminio.

isdB

El antígeno 'isdB' se señala como 'proteína isdB de neurofilamento'. En la cepa NCTC 8325 isdB es SAOUHSC_01079 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45 (GI:88194828). IsdB se ha propuesto para su uso como un antígeno de vacuna en sí mismo [166], pero esto puede no prevenir la pneumonia.

Los antígenos isdB útiles pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 45 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 45; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 45, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas isdB incluyen variantes de la SEQ ID NO: 45. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 45. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno

o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 45 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 45. Los 36 aminoácidos finales en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 45 se pueden omitir de manera útil. Los primeros 40 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 45 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas. Los fragmentos útiles de IsdB se desvelan en las referencias 165 y 167 por ejemplo, que carecen de los 37 aminoácidos internos de la SEQ ID NO: 45.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención no incluyen un antígeno isdB.

sta073

El antígeno 'sta073' se señala como 'precursor de autolisina bifuncional'. En la cepa NCTC 8325 sta073 es SAOUHSC_00994 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 46 (GI:88194750). En la cepa Newman es nwmn_0922 (GI:151221134). El análisis proteómico ha revelado que esta proteína se secreta o se expone en la superficie.

Los antígenos sta073 útiles pueden producir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 46 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 46; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos “n” aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 46, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sta073 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 46. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 46. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) a partir del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 46 mientras conserva al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 46. Los primeros 24 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 46 se pueden omitir de manera útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas.

Sta073 no se adsorbe bien a adyuvantes de hidróxido de aliminio, de manera que Sta073 presente en una composición puede no adsorberse o puede adsorberse a un adyuvante alternativo por ejemplo, a un fosfato de aluminio.

Polipéptidos híbridos

Los antígenos de proteína de S.aureus usados en la invención se pueden presentar en la composición como polipéptidos separados individuales. Cuando se usa más de un antígeno, sin embargo, no se tienen que presentar como polipéptidos separados. En cambio, se pueden expresar al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) antígenos como una única cadena de polipéptido (un polipéptido ‘híbrido’). Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales: en primer lugar, un polipéptido que puede ser inestable o mal expresado por sí solo puede ser ayudado al agregar un compañero híbrido apropiado que supera el problema; segundo lugar, la fabricación comercial se simplifica ya que sólo se necesita emplear una expresión y purificación para producir dos polipéptidos que son ambos antigénicamente útiles.

El polipéptido híbrido puede comprender dos o más secuencias de polipéptido de cada uno de los antígenos enumerados anteriormente, o dos o más variantes del mismo antígeno en los casos en los que la secuencia tenga cepas de variabilidad cruzada parcial.

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Los híbridos que consisten en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez antígenos son útiles. En particular, son preferentes los híbridos que consisten en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro, o cinco antígenos, tal como dos o tres antígenos.

Se pueden mezclar diferentes polipéptidos híbridos juntos en una única formulación. Los híbridos se pueden combinar con antígenos no híbridos seleccionados del primer, segundo o tercer grupo de antígeno. E tales combinaciones, un antígeno se puede presentar en más de un polipéptido híbrido y/o como un polipéptido no híbrido. Es preferente, sin embargo, que un antígeno se presente como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambos.

Los polipéptidos híbridos se pueden representar mediante la fórmula NH2-A-{-X-L}n-B-COOH, en la que: X es una secuencia de aminoácidos de un antígeno de S.aureus, tal como se describe anteriormente; L es una secuencia de aminoácidos de enlazador opcional; A es una secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal opcional; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.). Normalmente, n es 2 o 3.

Si un resto -X-tiene una secuencia de péptido líder en su forma de tipo silvestre, se puede incluir u omitir en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, los péptidos líderes se eliminarán excepto para el del resto –X-localizado en el extremo N-terminal de la proteína híbrida, es decir, el péptido líder de X1 se mantendrá, pero los péptidos líderes de X2 … Xn se omitirán. Esto equivale a eliminar todos los péptidos líderes y usar el péptido líder de X1 como un resto -A-.

Para cada n casos de {-X-L-}, la secuencia de aminoácido enlazadora -L-puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 el híbrido puede ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. Las secuencias de aminoácidos enlazadoras -L-típicamente serán cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias de péptido cortas que facilitan la clonación, ligadores poli-glicina (es decir que comprenden Glyn en los que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y marcadores de histidina (es decir Hisn en los que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos enlazadoras adecuadas serán aparentes para aquellos expertos en la materia. Un enlazador útil es GSGGGG (SEQ ID NO: 47) o GSGSGGGG (SEQ ID NO: 48), con el dipéptido Gly-Ser formándose a partir de un sitio de restricción BamHI, ayudando por tanto, a la clonación y manipulación, y siendo el tetrapéptido (Gly)4 un enlazador de poli-glicina típico. Otros enlazadores adecuados, particularmente para su uso como el Ln final son ASGGGS (SEQ ID NO: 49 por ejemplo, codificada por SEQ ID NO: 50) o un dipéptido Leu-Glu.

-A-es una secuencia de aminoácido opcional del extremo N-terminal. Típicamente será corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos es decir 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líderes para dirigir el tráfico de proteína, o secuencias de péptido cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, marcadores de histidina, es decir, Hisn en las que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos del extremo Nterminal apropiadas serán aparentes para aquellos expertos en la materia. Si X1 carece en sí mismo de metionina del extremo N-terminal, A es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 aminoácidos) que proporciona una metionina del extremo N-terminal por ejemplo, Met-Ala-Ser, o un único resto Met.

-B-es una secuencia opcional de aminoácidos del extremo C-terminal. Esta será típicamente corta (por ejemplo, 40

o menos aminoácidos es decir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteína, secuencias de péptido cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden marcadores de histidina es decir Hisn en las que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, tal como la SEQ ID NO: 51), o secuencias que aumentan la estabilidad de la proteína. Otras secuencias de aminoácido del extremo C-terminal serán aparentes para aquellos expertos en la materia.

Un polipéptido híbrido de la invención puede incluir antígenos tanto EsxA como EsxB. Estos pueden estar en cualquier orden, extremos N-terminal a C-terminal. Las SEQ ID NOs: 52 (‘EsxAB’; codificada por la SEQ ID NO: 53) y 54 (‘EsxBA’) son ejemplos de tales híbridos, ambas teniendo enlazadores de hexapéptido ASGGGS (SEQ ID NO: 49).

General

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunobiología y farmacología, dentro de la experiencia de la materia. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, las referencias 168-175, etc.

Se usa anteriormente la numeración “GI”. Un número GI, o “Identificador GenInfo”, es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por el NCBI cuando se agregan las secuencias a las bases de datos. El número GI no tiene ninguna semejanza con el número de acceso al registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para corrección, o para agregar más anotaciones o información) entonces recibe un nuevo número GI. Por tanto, la secuencia asociada con un número GI nunca cambia.

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Las referencias al porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácido significa que, cuando se alinean, tal porcentaje de aminoácidos es el mismo en comparación con las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o la identidad de secuencia puede determinarse usando programas de software conocidos en la materia, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 176. Una alineación preferente se determina por el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman usando una búsqueda de espacio afín con una penalización de abertura de espacio de 12 y una penalización de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de

62. El algoritmo de búqueda de homología Smith-Waterman se desvela en la ref. 177.

Cuando la invención concierne a un “epítopo”, este epítopo puede ser un epítopo de linfocito B y/o un epítopo de linfocito T. Tales epítopos pueden identificarse empíricamente (por ejemplo, usando PEPSCAN [178, 179] o procedimientos similares), o pueden predecirse (por ejemplo, usando el índice antigénico Jameson-Wolf [180], enfoques basados en matrices [181], MAPITOPE [182], TEPITOPE [183, 184], redes neurales [185], OptiMer y EpiMer [186, 187], ADEPT [188], Tsites [189], hidrofilicidad [190], índice antigénico [191] o los procedimientos desvelados en las referencias 192-196, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que se reconocen mediante y se unen a los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos o receptores de linfocitos T, y también pueden denominarse “determinantes antigénicos”.

Cuando se omite un “dominio” de antígeno, esto puede implicar la omisión de un péptido de señal, de un dominio citoplasmático, de un dominio transmembrana, de un dominio extracelular, etc.

La expresión “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste” por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo, X + Y.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, como ejemplo, x±10 %.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente” por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

Cuando la invención proporciona un procedimiento que implica múltiples secuenciales, la invención también puede proporcionar un procedimiento que implica menos del número total de etapas. Se pueden realizar diferentes etapas en tiempos muy diferentes por personas diferentes en lugares diferentes (por ejemplo, en países diferentes).

Se apreciará que los anillos de azúcar puedan existir en forma abierta y cerrada y que, aunque se muestran formas cerradas en las fórmulas estructurales en el presente documento, también se abarcan formas abiertas por la invención. De manera similar, se apreciará que los azúcares puedan existir en formas de piranosa y furanosa y que, aunque se muestran formas de piranosa en las fórmulas estructurales en el presente documento, también se abarcan formas de furanosa. También se abarcan formas anoméricas diferentes de azúcares.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra un procedimiento para la purificación de polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 de S.aureus basado en en el procedimiento de la referencia 13.

La Figura 2 muestra un cromatograma de DEAE Sepharose de polisacárido capsular y un espectro de RMN de 1H de fracciones que contienen polisacárido capsular (fracciones 68-80) preparado según el procedimiento de la Figura 1.

La Figura 3 muestra un cromatograma S300 Sephacryl de polisacárido capsular y un espectro de RMN de 1H de fracciones que contienen polisacárido capsular (fracciones 22-44) preparado según el procedimiento de la Figura

1.

La Figura 4 ilustra un procedimiento ejemplar de la invención para purificar polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 de S.aureus.

La Figura 5 muestra un cromatograma de DEAE Sepharose de polisacárido capsular preparado según un procedimiento de la invención.

La Figura 6 muestra un espectro de RMN de 1H para polisacárido capsular de tipo 5 de S.aureus purificado.

La Figura 7 muestra la estructura química del péptidoglicano de S.aureus basada en las referencias 197, 198, 199 y 200. Se resalta la unidad de repetición.

Modos de llevar a cabo la invención

A. Purificación de polisacárido capsular de S.aureus de tipo 5 (ejemplo comparativo)

Se purificó el polisacárido capsular de tipo 5 de S.aureus según el esquema ilustrado en la Figura 1, basado en el procedimiento de la referencia 13. Las condiciones y fundamento para las diversas etapas de este procedimiento se describen en la Tabla 1:

Tabla 1

Etapa

Condiciones Fundamento

Crecimiento bacteriano en placas

Centrifugación de sedimento bacteriano

Recolección de células

Reacción con Lisostafina

100 µg/ml de Lisostafina durante la noche a 37 ºC Lisis de pared celular y liberación de polisacárido capsular

Reacción con DNasa/RNasa

50 µg/ml de DNasa y RNasa a 37 ºC durante 6-8 horas Hidrólisis de ácido nucleico

Reacción con NaIO4

NaIO4 0,05 M durante 5 horas a TA en la oscuridad Hidrólisis de ácido teicoico

Diafiltración de 30 kDa

Lavado con NaCl 1M y H2O Eliminación de especies de bajo peso molecular

Cromatografía de intercambio aniónico(resina DEAE SepharoseFF)

Gradiente de NaCl 1M Separación según la carga (eliminación de proteína)

Filtración en gel (Sephacryl S300)

NaPi 10 mM pH 7,2 y NaCl 10 mM Separación según el peso molecular

Centrifugación del sedimento bacteriano y reacciones enzimáticas (Lisostafina y RNasa/DNasa)

Se cultivó S.aureus en un medio sólido para proporcionar una suspensión bacteriana de 600-800 ml. El sedimento

10 celular húmedo, recolectado mediante centrifugación a 8000 rpm, tenía una masa de alrededor de 30-50 g. El sedimento recolectado se lavó tres veces con Tris 50 mM -MgSO4 2 mM a pH 7,5 y después se resuspendió a 0,25-0,5 g por ml en Tris 50 mM -MgSO4 2 mM a pH 7,5 y se trató con 0,1-0,13 mg/ml de lisostafina (Sigma Aldrich). La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 16 horas (ON) con agitación moderada. Se agregaron 0,05 mg/ml de DNasa/RNasa (Sigma-Aldrich) a la suspensión y se incubó durante 5-7 horas a 37 °C. La suspensión se aclaró

15 despuésmediante centrifugación.

Reacción con NaIO4

El material se incubó con NaIO4 50 mM (Sigma-Aldrich) en la oscuridad durante 5-7 horas. El NaIO4 se eliminó mediante la adición de glicerol en exceso durante 30 minutos con agitación en la luz.

Filtración de flujo tangencial de 30 kDa

20 La filtración de flujo tangencial se llevó a cabo tal como se indica en la Tabla 2:

Tabla 2

Tipo de membrana

Sartorius HydrosartTM 30 kDa

Área de superficie

0,1 m2

Pin/Pext

0,4/0,0 bar

Caudal de permeado

80 ml/min

Volúmenes de diafiltración

10 volúmenes de NaCl 1M seguido de 10 volúmenes de agua destilada

Recuperación de producto

Volumen retenido + dos lavados con agua destilada igual al volumen muerto del sistema (con retención completamente abierta y permeado cerrado)

La filtración de flujo tangencial se realizó en un soporte Sartorius™ para casetes de 0,1 m2 usando una bomba peristáltica WatsonMarlon™ . Posteriormente, la membrana se lavó con NaOH 1 M y se almacenó en NaOH 0,1M a +2-8 °C.

Cromatografía de Flujo Rápido DEAE Sepharose

Se eliminó la proteína residual, el ácido nucleico y otras impurezas mediante cromatografía de intercambio aniónico llevada a cabo según la Tabla 3:

Tabla 3

Resina

Resina de flujo rápido DEAE SepharoseTM (G&E Healthcare)

Dimensión de columna

Ø = 5 cm; h = 7,5 cm; V = 150 ml

Equilibrio

Tampón NaPi 10 mM pH 7,2 c.s. para alcanzar 1,8-2,0 mS/cm de conductividad de eluato

Carga

Retenida desde 30 K UF tamponada hasta tampón NaPi 10 mM a pH 7,2

Elución

20 volúmenes de columna de tampón NaPi 10 mM pH 7,2

Depuración

20 volúmenes de columna de NaCl 1M

La cromatografía se realizó usando un sistema AktaTM (G&E Healthcare) y el polisacárido capsular se detectó

10 midiendo la absorción UV a 215 nm. La solución de polisacárido capsular se agregó en primer lugar a tampón NaPi 100 mM pH 7,2 para obtener una concentración final de tampón NaPi de 10 mM a pH 7,2. La resina DEAE se equilibró previamente con tampón NaPi 100 mM a pH 7,2 hasta pH 7,2 y luego se equilibró con tampón NaPi 10 mM a pH 7,2 para alcanzar la conductividad indicada (conductividad de tampón NaPi 10 mM a pH 7,2). Las fracciones resultantes se analizaron mediante RMN y aquellas que contenían polisacárido capsular se agruparon (Figura 2).

15 Cromatografía S300 Sephacryl

El polisacárido se purificó adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel llevada a cabo según la Tabla

4:

Tabla 4

Resina

Resina S300 SephacrylTM (G&E Healthcare)

Dimensión de columna

Ø = 2,6cm; h = 95 cm; V = 500ml

Equilibrio

Tampón NaCl 50 mM c.s. para alcanzar 6,3-6,5 mS/cm de conductividad de eluato

Carga

12-14ml

Elución

Tampón NaCl 50mM

20 La cromatografía se realizó en un sistema AktaTM (G&E Healthcare) y el polisacárido capsular se detectó midiendo la absorción UV a 215 nm. Las fracciones resultantes se analizaron mediante RMN y aquellas que contenían polisacárido capsular se agruparon (Figura 3).

B. Purificación de polisacáridos capsulares de S.aureus de tipo 5 y de tipo 8 (ejemplo)

Los polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 de S.aureus se purificaron según el esquema ilustrado en la Figura

25 4. Las condiciones y el fundamento para las diversas etapas de este procedimiento se describen en la Tabla 5:

Tabla 5

Etapa

Condiciones Fundamento

Crecimiento bacteriano en placas

Centrifugación de sedimento bacteriano

Recolección de células

Reacción con AcOH al 1 %

2 horas a 100 ºC Lisis de pared celular y liberación de polisacárido capsular

imagen12

imagen13

La detección se realizó usando un potencial de forma de onda AAA-Direct (Tabla 10).

Tabla 10

Tiempo (seg)

Potencial (V) frente a Ag/AgCl Potencial (V) frente. pH Integración

0,000

-0,20 +0,13

0,040

-0,20 +0,13

0,050

0,00 +0,33

0,210

0,00 +0,33 Comienzo

0,220

+0,22 +0,55

0,460

+0,22 +0,55

0,470

0,00 +0,33

0,560

0,00 +0,33 Final

0,570

-0,20 -1,67

0,580

-0,20 -1,67

0,590

+0,60 +0,93

0,600

-0,20 +0,13

Se realizó la cuantificación usando una solución patrón de 17 aminoácidos no hidrolizada (Fluka P/N 09428) en el intervalo de 2,5-50 µM. Se analizaron las muestras patrón con y sin norleucina, en la misma concentración de

5 muestra. Se usó la proporción del área pico de norleucina en la muestra dividida entre el área pico de norleucina promedio en los patrones como un factor de corrección para la posible pérdida de aminoácidos en la etapa de hidrólisis. Se usó una muestra de BSA como muestra de control.

Estimación del contenido de peptidoglicano

Se estimó el contenido de peptidoglicano usando dos procedimientos diferentes. El primer procedimiento

10 (procedimiento 1) estaba basado en el procedimiento usado en la referencia 17, que implica una suma del contenido de lisina, alanina, glicina y glutamato. En el segundo procedimiento (procedimiento 2), se calculó un factor de conversión para cada aminoácido según la siguiente fórmula:

(masa molecular de aminoácido) x (número de restos en la estructura de peptidoglicano)/

(masa molecular de la unidad de repetición de peptidoglicano).

15 La masa molecular de la unidad de repetición de peptidoglicano es 1233,27 Da (Figura 7). El contenido de peptidoglicano se calculó después como la concentración promedio de peptidoglicano obtenida al calcular la proporción de la concentración de aminoácido y el factor de conversión.

El contenido de péptidoglicano de polisacárido capsular de tipo 5 purificado tras la cromatografía de intercambio aniónico se da en la Tabla 11:

20 Tabla 11

Procedimiento de medición

Detalles del cálculo % de péptidoglicano

Medición 1

Medición 2

1

Calculado según la referencia 17 como la suma de la concentración Lys-Ala-Gly-Glx 2,04 0,74

1

Calculado según la referencia 17 como la suma de todos los aminoácidos detectables excepto para Lys-Ala-Gly-Glx 0,48 0,85

2

Calculado usando la concentracion Ala y Gly dividida entre el factor de conversión de PG (Ala = 0,2167, Gly = 0,3043) 0,88 0,81

El procedimiento de la invención proporciona un contenido muy bajo de peptidoglicano en el polisacárido purificado.

D. Conjugación e inmunogenicidad de polisacáridos purificados

Los polisacáridos de tipo 5 purificados obtenidos de los procedimientos en las secciones A y B anteriores se conjugaron con CRM197 según el procedimiento de la referencia 29. El sacárido total en el conjugado se determinó 25 mediante análisis HPAEC-PAD y el contenido de proteína mediante ensayo MicroBCA (Tabla 12).

5

10

15

20

25

30

35

TABLA 12

Procedimiento de purificación

Lote Proteína (μg/ml) Sacárido (μg/ml) Sacárido/proteína (p/p)

A

1 51,52 1,72 0,03

A

2 161,80 17,10 0,11

A

3 34,42 4,22 0,12

B

4 444,0 139,0 0,31

B

5 40,56 12,70 0,31

Los conjugados preparados usando los polisacáridos purificados mediante el procedimiento de la invención (lotes 4 y 5) tuvieron mayores proporciones de polisacárido:proteína.

La inmunogenicidad del lote 5 se probó en un modelo letal de ratón de infección por S.aureus. Brevemente, se inmunizaron ratones CD1 mediante inyección intraperitoneal con una dosis de 2 μg de antígeno en un volumen de inyección de 200 μl. Se llevaron a cabo las inmunizaciones en grupos de doce ratones según el siguiente esquema, antes de la exposición mediante inyección intraperitoneal de una suspensión bacteriana de 5x108 UFC de S.aureus de tipo 5. Se centrifugaron los cultivos de S.aureus, se lavaron dos veces y se diluyeron en PBS antes de la exposición. Se necesitaron diluciones adicionales para el inóculo deseado, que se verificó de manera experimental mediante la por colocación en placas de agar y la formación de colonias. Los animales se controlaron durante 14 días y se registró la enfermedad letal.

Grupo 1 – PBS más alum

Grupo 2 – conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote 5) más alum

Grupo 4 –conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote 5) más proteínas EsxAB, Sta006 y Sta011 y alum

Grupo 5 –conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote 5) más proteínas HlaH35L, Sta006 y Sta011 y alum

Los datos de supervivencia se representan en la Tabla 13:

TABLA 13

Grupo

Tiempo (días)

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1

100 25 17 17 17 17 17 17 17 17 8 0 0 0

2

100 50 50 50 50 50 50 50 50 42 42 42 42 42

4

100 67 67 67 67 67 67 67 67 67 67 67 67 67

5

100 100 100 100 100 100 83 83 75 75 75 75 75 75

Los conjugados preparados usando polisacáridos purificados mediante el procedimiento de la invención diron un nivel alto de supervivencia. Se mejoró la supervivencia mediante la adición de antígenos de proteína de S.aureus.

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[144] WO2006/078680.

Claims (1)

1. imagen1