CN112986457B

CN112986457B - HPSEC-MALS法检测多糖并与Sepharose CL-4B法关联的方法

Info

Publication number: CN112986457B
Application number: CN202110222592.1A
Authority: CN
Inventors: 李茂光; 李亚南; 毛琦琦; 陈苏京; 王春娥; 赵丹; 许美凤; 叶强
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2021-02-25
Filing date: 2021-02-25
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-02-25
Also published as: CN112986457A

Abstract

HPSEC‑MALS法检测多糖并与Sepharose CL‑4B法关联的方法，利用高效分子排阻色谱柱，采用高效分子排阻色谱‑多角度激光散射仪(HPSEC‑MALS)方法，测定多糖分子大小及其分布，并将其转化为琼脂糖凝胶(Sepharose)CL‑4B法的K_D值和回收率。该方法与Sepharose CL‑4B法线性相关性高，对原有质量标准改动小，并且用时短，样品用量少，提供了新的测定多糖分子大小及分布的方法和标准，为多糖疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小测定方法提供数据支持。

Description

HPSEC-MALS法检测多糖并与Sepharose CL-4B法关联的方法

技术领域

本文涉及将通过HPSEC-MALS法测定的多糖分子大小及其分布，特别是多糖重均分子量和累积分子量分布转换为Sepharose CL-4B法的多糖K_D值和回收率的方法。

背景技术

多糖疫苗是重要的一种疫苗类型，如包括脑膜炎球菌多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗等。其中，荚膜多糖是由带有荚膜的细菌经过发酵培养、提取纯化其荚膜多糖抗原而得。其在培养和纯化过程中形成重复单元数量不同的一系列分子量不均一的多糖混合物。荚膜多糖也是多糖蛋白结合疫苗的基础，如脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌多糖结合疫苗等。其中，分子大小是影响多糖免疫原性的重要指标，并且分子大小的分布是与免疫原性相关的重要物理化学参数，疫苗效力的安全可靠也依赖于免疫化学性质和物理性质的一致性，其中一个决定性的参数就是多糖分子的大小分布。研究发现分子量大于等于90000g/mol的葡聚糖具有良好的免疫原性，而小于等于50000g/mol的葡聚糖免疫原性较弱(参见KabatEA,Bezer A E.The effect of variation inmolecularweight on the antigenicity of dextran in man[J].Arch Biochem.Biophys,78:306-318,1958)。

《中国药典》2020版三部采用琼脂糖凝胶CL-4B(Sepharose CL-4B)法检测细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数K_D值和多糖在K_D值小于0.5以前的回收率来控制多糖质量。但是，该方法存在耗时长、易受人为因素影响导致结果不稳定的缺陷。近年来，人们发现高效分子排阻色谱-多角度激光散射仪(high performance size exclusion chromatography-Multiangle laser-light scattering，HPSEC-MALS)联用法具有高效、稳定等的特点。该方法通过分析激光照射样品溶液中的颗粒物产生的散射光特性来确定样品的分子特征，可不使用任何分子量标准品直接测定样品的重均分子量(weight-average molecular weight，Mw)。

虽然现有技术中记载了采用HPSEC-MALS法对多糖分子进行分析，然而并未系统的公开使用HPSEC-MALS法控制多糖质量的具体方法，也并未公开或指出HPSEC-MALS法的检测结果与Sepharose CL-4B法标准之间的关系，缺乏将两者快速有效关联的方法。

发明内容

本申请提供了一种利用HPSEC-MALS法检测多糖分子大小及其分布，并将其转换为琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-4B标准的方法，具体地，该方法将通过高效分子排阻色谱-多角度激光散射仪(HPSEC-MALS)测得的多糖重均分子量和累积分子量分布(cumulativeweight fraction，C_WF)与SepharoseCL-4B法的多糖K_D值和回收率之间建立线性回归，该方法具有线性相关性高，对原有质量标准改动小，用时短，样品用量少的特点。因此，提供了新的测定多糖分子大小及分布的标准，为多糖疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小测定方法提供数据支持。

本申请涉及一种HPSEC-MALS法检测多糖分子大小及其分布转换为SepharoseCL-4B法标准的方法，所述方法包括：

使用高效分子排阻色谱-多角度激光散射仪法测定多糖的重均分子量Mw和重均分子量Mw大于截断值Mw_n的累积分子量分布C_WF，

将所述重均分子量Mw转换为在Sepharose CL-4B法的多糖分配系数K_D值，将所述累积分子量分布C_WF转换为所述Sepharose CL-4B法的多糖回收率，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量分布C_WF之间的关系分别为：

K_D＝-3.55～-2.76×10-¹logMw+1.85～2.29；

C_WF＝1.00～1.08回收率-3.09～6.23；

其中，所述K_D和所述回收率参照《中国药典》2020版三部规定的方法测定；所述回收率为K_D小于0.5的回收率；

所述截断值Mw_n为所述K_D为0.5时计算所得的重均分子量Mw，所述高效分子排阻色谱柱选自TSK G5000PW_XL色谱柱、TSK GMPW_XL色谱柱或SB806色谱柱。

在一些优选实施方案中，所述多糖为脑膜炎球菌多糖、流感嗜血杆菌多糖、流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种，优选地，所述多糖为A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种。

在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱柱为TSK G5000PW_XL色谱柱，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量分布C_WF之间的关系分别为：K_D值＝-2.76×10^-1logMw+1.85；C_WF＝1.00回收率-3.09；所述截断值Mw_n为78000。

在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱柱为TSK GMPW_XL色谱柱，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量分布C_WF之间的关系分别为：K_D值＝-2.95×10^-1log Mw+1.95；C_WF＝1.08回收率-3.45；所述截断值Mw_n为83000。

在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱柱为SB806色谱柱，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量分布C_WF之间的关系分别为：K_D值＝-3.55×10^-1log Mw+2.29；C_WF＝1.02回收率-6.23；所述截断值Mw_n为110000。

在一些优选实施方案中，所述多糖分子量范围为2.7×10³～2×10⁶。在一些优选实施方案中，所述多糖分子量范围为2.7×10³～3.006×10⁵。

在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱-多角度激光散射仪法进一步包括以下步骤：

(1)将分子量标准品加入流动相溶解并过滤得到分子量标准品续滤液；

将所述分子量标准品续滤液注入高效分子排阻色谱柱，测定所述分子量标准品的保留时间，建立保留时间与标准分子量对数值之间的线性回归；

(2)将多糖样品加入流动相溶解，配制成供试品溶液；

将所述供试品溶液用流动相稀释后，注入高效分子排阻色谱柱中；

测定所述供试品溶液的多糖分子的重均分子量Mw和重均分子量Mw大于截断值Mw_n的累积分子量分布C_WF的百分率。

在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱柱的流动相为生理氯化钠溶液；流动相的流速为0.5ml·min-¹；柱温为25℃；示差检测器温度为30℃；进样量为50μl。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1a-c阐明了多糖分子量标准品在三根高效分子排阻色谱柱上的保留时间与重均分子量之间的线性关系。

图2a-c阐明了A群脑膜炎球菌多糖在三根高效分子排阻色谱柱的上的重均分子量Mw与Sepharose CL-4B法的K_D值的线性关系。

图3a-c阐明了A群脑膜炎球菌多糖在三根高效分子排阻色谱柱上的累积分子量分布C_WF与Sepharose CL-4B法的多糖回收率的线性关系。

图4a-b阐明了不同多糖及其衍生物在TSK5000PW_XL柱上的Mw的对数值、累积分子量分布与Sepharose CL-4B法的K_D值、多糖回收率之间的关系，并与图2a和3a对应的直线回归方程的比较。

具体实施方式

本申请描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本申请所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征或元件可以与任何其它实施例中的任何其他特征或元件结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征或元件。

此外，在描述具有代表性的实施例时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤序列。然而，在该方法或过程不依赖于本文所述步骤的特定顺序的程度上，该方法或过程不应限于所述的特定顺序的步骤。如本领域普通技术人员将理解的，其它的步骤顺序也是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对该方法和/或过程的权利要求不应限于按照所写顺序执行它们的步骤，本领域技术人员可以容易地理解，这些顺序可以变化，并且仍然保持在本申请实施例的精神和范围内。

实施例1实验材料与条件

1.1多糖样品

本申请采用多糖A群脑膜炎球菌荚膜多糖、C群脑膜炎球菌荚膜多糖、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖，该多糖样品均为中国食品药品检定研究院留样。

1.2主要试剂及仪器

蓝色葡聚糖2000(美国Pharmacia公司，批号5934)，维生素B12(国药集团化学试剂有限公司，批号F20101021)，右旋糖酐分子量标准品试剂盒(中国食品药品检定研究院，批号140646-201203)，生理氯化钠溶液(国药集团化学试剂有限公司)，XK16/100层析柱、SepharoseCL-4B凝胶(美国GE Healthcare公司)，TSK guardcolumn PW_XL(6.0mm ID×4cm)和TSK G5000PW_XL(7.8mm ID×30cm)色谱柱、TSK guardcolumn PW_XL(6.0mm ID×4cm)和TSKGMPW_XL(7.8mmID×30cm)色谱柱(日本TOSOH株式会社)，ShodexOHpak SB-G(6.0mmID×5cm)和OHpak SB806 HQ(8.0mm ID×30cm)色谱柱(日本SHOWA DENKO公司)，AKTA纯化系统(美国GE公司)，高效液相色谱仪e2695(美国Waters公司)，多角度激光光散射仪、示差折光检测器及ASTRA7.1.3软件(美国怀亚特公司)，恒温培养箱(德国宾得公司)，BP211D电子天平(德国Sartorius公司)。

1.3色谱条件

HPSEC-MALS法所用高效分子排阻色谱柱：TSK G5000PW_XL、TSK GMPW_XL和SB806色谱柱；流动相：生理氯化钠溶液(0.9％NaCl)；流速：0.5ml·min^-1；柱温：25℃；示差检测器温度：30℃；进样量：50μl。

Sepharose CL-4B法：采用《中国药典》2020版三部A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法，取1.0ml待测溶液，注入Sepharose CL-4B色谱柱。

1.4溶液配制

1.4.1多糖分子量标准品溶液配制：精密称取右旋糖酐分子量标准品(峰分子量Mp分别为2700、5250、9750、13050、36800、64650、135350、300600、2000000)各10mg，分别加入2ml生理氯化钠溶液溶解，并用0.2μm的滤膜滤过备用。

1.4.2供试品溶液配制：称取一定量的A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖，加入生理氯化钠溶液溶解，分别配置成多糖浓度为5mg/ml的供试品溶液。

1.4.3将1.4.2中的A群脑膜炎球菌荚膜多糖供试品溶液分装后分别置于-20℃、4℃和37℃中，0～35天取出。其中，向需用HPSEC-MALS法测定的所述供试品中加入生理氯化钠溶液，稀释10倍备用；向需用Sepharose CL-4B法测定的所述供试品中加入生理氯化钠溶液，稀释2倍备用。

1.5K_D值和多糖回收率计算：

在所述Sepharose CL-4B法中，K_D＝(Ve-V₀)/(V_i-V₀)，Ve为多糖供试品洗脱液峰顶保留体积或保留时间，V₀为蓝色葡聚糖保留体积或保留时间，V_i为维生素B₁₂保留体积或保留时间。

多糖回收率(％)＝供试品溶液在K_D值前的色谱图面积/供试品溶液色谱图总面积×100，计算K_D值小于0.5的多糖回收率。

实施例2·色谱柱分离范围的比较研究

将1.4.1中的多糖分子量标准品续滤液分别注入TSK G5000PW_XL、TSKGMPW_XL和SB806三根高效分子排阻色谱柱，测定多糖分子量标准品的保留时间。以测得的保留时间为横坐标，标准分子量对数值为纵坐标，分别计算所述多糖分子量标准品的保留时间与标准分子量对数值在所述三根高效分子排阻色谱柱上的线性关系，其中，色谱柱条件如1.3所述。所述结果见图1a-c。

结论：通过该实施例对所述三根高效分子排阻色谱柱的分离范围的比较结果可知，多糖分子量标准品的对数分子量与其在三根高效分子排阻色谱柱上的保留时间均呈线性相关，并且R²分别为0.956、0.949和0.989。

由图1a-c可以看出SB806色谱柱在分子量2.7×10³～2×10⁶范围内分子量的对数值与保留时间相关性最好，但保留时间跨度仅仅为从约20min至22min。TSK G5000PW_XL和TSKGMPW_XL色谱柱在分离分子量为2×10⁶的多糖分子量标准品时明显偏离了分子量为2.7×10³～3.006×10⁵时的多糖分子量标准品的线性，证明其对大分子多糖的分离度会下降。多糖分子量标准品在TSK G5000PW_XL柱上的保留时间跨度约从10min至20min，而在TSK GMPW_XL柱上约从15min至20min，分离性能不如TSK G5000PW_XL柱。

实施例3·色谱柱相关性研究

3.1Sepharose CL-4B法测得的K_D值与三根高效分子排阻色谱柱测得的Mw的相关性研究

将1.4.3中的A群脑膜炎球菌多糖供试品溶液分别注入Sepharose CL-4B色谱柱和三根高效分子排阻色谱柱，计算供试品溶液在Sepharose CL-4B色谱柱上的K_D值，供试品溶液在三根高效分子排阻色谱柱上的Mw通过ASTRA7.1.3软件计算。以三根高效分子排阻色谱柱测得的Mw对数值(即，logMw)为横坐标，以Sepharose CL-4B法测得的K_D值为纵坐标，分别计算三个直线回归方程的斜率和决定系数(R²)。其中，三根高效分子排阻色谱柱条件如1.3所述，K_D值的计算方法如1.5所述。测定结果见下表1和图2a-c。

根据计算得出，A群脑膜炎球菌多糖在Sepharose CL-4B色谱柱的K_D值与TSKG5000PW_XL、TSK GMPW_XL和SB806色谱柱测得的Mw对数值logMw之间的直线回归方程和R²分别为；y＝-2.76×10^-1x+1.85、R2＝0.992；y＝-2.95×10^-1x+1.95、R2＝0.983；y＝-3.55×10^- ¹x+2.29、R2＝0.979。

表1A群脑膜炎球菌多糖在Sepharose CL-4B色谱柱上的K_D值和三根高效分子排阻色谱柱上的Mw

3.2Sepharose CL-4B法的多糖回收率与三根高效分子排阻色谱柱上多糖的累积分子量分布C_WF相关性的研究

计算3.1中供试品溶液在Sepharose CL-4B色谱柱中的K_D值小于0.5的多糖回收率。

计算3.1中供试品溶液在三根高效分子排阻色谱柱上的累积分子量分布，计算方法如下：根据图2a-c中的直线回归方程计算K_D值为0.5时的Mw(即，截断值Mw_n)，再通过软件计算该供试品溶液Mw值大于截断值Mw_n的分布图面积的百分率，即累积分子量分布的百分率。

以该供试品溶液K_D值小于0.5时的多糖回收率为横坐标，三根高效分子排阻色谱柱的累积分子量分布为纵坐标，分别计算三个直线回归方程的斜率和R²。其中，三根高效分子排阻色谱柱条件如1.3所述，多糖回收率的计算公式如1.5所述。所得结果见下表2和图3a-c。

根据计算得出，当K_D为0.5时，A群脑膜炎球菌多糖供试品溶液在TSK G5000PW_XL、TSK GMPW_XL和SB806色谱柱的Mw_n分别约为78000、83000、110000，并且Sepharose CL-4B法的多糖回收率与TSK G5000PW_XL、TSK GMPW_XL和SB806色谱柱的累积分子量分布的直线回归方程和R²分别为：y＝1.00x–3.09、R2＝0.991；y＝1.08x–3.45、R2＝0.987；y＝1.02x-6.23、R2＝0.913。

表2A群脑膜炎球菌多糖在Sepharose CL-4B色谱柱上的多糖回收率与三根高效分子排阻色谱柱上的累积分子量分布

结论：

1.A群脑膜炎球菌多糖在所述三根高效分子排阻色谱柱上的logMw与SepharoseCL-4B法的K_D值之间的相关性均很好，且相关系数均大于0.98，因此可以采用HPSEC-MALS法测定多糖Mw代替Sepharose CL-4B法测定K_D值进行标定。另一方面，三根高效分子排阻色谱柱测得的Mw与Sepharose CL-4B法测得的K_D值的直线回归方程的斜率不同，因此多糖K_D值转换到不同色谱柱上时的Mw有差异。

2.A群脑膜炎球菌多糖在三根高效分子排阻色谱柱的累积分子量分布与SepharoseCL-4B法的回收率之间的线性相关性均较好，并且相关系数均大于0.95，直线回归方程的斜率为1.00～1.08。因此HPSEC-MALS法测定的多糖累积分子量分布也可以替代Sepharose CL-4B法测定回收率进行标定。

另外，在本领域中SepharoseCL-4B法计算多糖的回收率时一般采用K_D值为0.5作为截断值。根据图2a-c的直线回归方程得出当K_D值为0.5时，TSK G5000PW_XL、TSK GMPW_XL和SB806色谱柱对应的截断值Mw_n分别约为78000、83000和110000，均接近90000，因此计算大于截断值Mw_n的分子量累积分布具有合理性。此时，大于该截断值Mw_n的分子量累积分布的百分率即为供试品中具有良好免疫原性的大分子多糖所占的比率。

3.在所述三根高效分子排阻色谱柱中，由于TSK G5000PW_XL色谱柱所测定的多糖累积分子量分布与在Sepharose CL-4B法的多糖回收率相关性最好，所述直线回归方程的斜率为1.00，截距为-3.09，R²为0.991，证明TSK G5000PW_XL色谱柱对于多糖的分离情况与Sepharose CL-4B色谱柱最为接近。由此，提供了一种采用HPSEC-MALS法测定A群脑膜炎球菌多糖累积分子量分布转化为Sepharose CL-4B法的多糖回收率的方法，优选地，使用TSKG5000PW_XL色谱柱计算Mw大于78000的多糖累积分子量分布，控制多糖质量。

实施例4不同多糖的色谱柱相关性研究

根据实施例3的结论，采用TSK G5000PW_XL色谱柱，验证不同多糖Mw、累积分子量分布、K_D值和回收率是否满足实施例3中的线性方程。

选取1.4.2中的供试品溶液，将该供试品溶液分别注入Sepharose CL-4B色谱柱和TSK G5000PW_XL色谱柱，测定A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和本领域中常见的肺炎球菌多糖各供试品溶液的K_D值、重均分子量Mw，并且示例性地计算A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖和b型流感嗜血杆菌多糖衍生物的供试品溶液的多糖回收率和累积分子量分布。

将测得的结果与图2a和3a中的直线回归方程进行比较。其中，色谱柱条件如1.3所述，K_D值和回收率的计算如1.5所述。所得结果见表3-4和图4a-b。

表3不同多糖K_D值和Mw

表4不同多糖回收率和累积分子量分布

结论：1.根据表3和图4a的结果可知，A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖的Mw对数值与K_D值之间的关系均在图2a中相应的直线回归方程两侧，证明A群脑膜炎球菌多糖Mw对数值和K_D值之间的直线回归方程同样适用于实施例4中的多糖。

2.根据表4和图4b的结果可知，A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖和b型流感嗜血杆菌多糖衍生物的累积分子量分布与回收率之间的关系也在图3a中对应的直线回归方程两侧，证明A群脑膜炎球菌多糖累积分子量分布与回收率之间关系的直线回归方程也同样适用于实施例4中的多糖。

3.根据本申请多糖的结构特点可知，当高效分子排阻色谱柱为TSK G5000PW_XL、TSKGMPW_XL和SB806时，实施例3中A群脑膜炎球菌多糖的Mw对数值、分配系数K_D、累积分子量分布与回收率之间的线性关系，同样也适用于本领域中结构相同或相似的其他多糖、多糖衍生物等。

另外，当所述色谱柱为TSK G5000PW_XL、TSK GMPW_XL和SB806以外的其他高效分子排阻色谱柱时，也可以通过本申请所述方法，利用HPSEC-MALS法测定多糖的重均分子量Mw和累计分子量分布，并建立与SepharoseCL-4B法测得的K_D值和多糖回收率的线性关系。当所用的高效分子排阻色谱柱不同时，Mw与K_D值以及多糖回收率和累积分子量分布的各直线回归方程的斜率不同，所计算得出的截断值也不同。

综上，本申请采用了三根高效分子排阻色谱柱，通过HPSEC-MALS法测定多糖的重均分子量Mw和累计分子量分布，并将其与Sepharose CL-4B法的结果线性关联，提供了一种HPSEC-MALS法测定多糖分子大小及其分布并将其转换为Sepharose CL-4B法标准的方法，该方法缩短了检测时间，简化了检测步骤，对原有质量标准改动小，提供了新的测定多糖分子大小及分布的标准，为多糖疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小测定方法提供数据支持。

Claims

1.一种HPSEC-MALS法检测多糖分子大小及其分布转换为Sepharose CL-4B法标准的方法，所述方法包括：

将所述重均分子量Mw转换为Sepharose CL-4B法的多糖分配系数K_D值，将所述累积分子量分布C_WF转换为所述Sepharose CL-4B法的多糖的回收率，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量分布C_WF之间的关系分别为：

K_D＝-3.55～-2.76×10^-1logMw+1.85～2.29；

C_WF＝1.00～1.08回收率-3.09～6.23；

所述截断值Mw_n为所述K_D为0.5时计算所得的重均分子量Mw；

所述高效分子排阻色谱柱选自TSK G5000PW_XL色谱柱、TSK GMPW_XL色谱柱或SB806色谱柱。

2.根据权利要求1所述的方法，所述多糖为脑膜炎球菌多糖、流感嗜血杆菌多糖、流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种。

3.根据权利要求2所述的方法，所述多糖为A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种。

4.根据权利要求1所述的方法，所述高效分子排阻色谱柱为TSK G5000PW_XL色谱柱，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量C_WF之间的关系分别为：

K_D＝-2.76×10^-1logMw+1.85；C_WF＝1.00回收率-3.09；

所述截断值Mw_n为78000。

5.根据权利要求1所述的方法，所述高效分子排阻色谱柱为TSK GMPW_XL色谱柱，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量C_WF之间的关系分别为：

K_D＝-2.95×10^-1log Mw+1.95；C_WF＝1.08回收率-3.45；

所述截断值Mw_n为83000。

6.根据权利要求1所述的方法，所述高效分子排阻色谱柱为SB806色谱柱，所述K_D值、所述回收率、所述重均分子量Mw和所述累积分子量C_WF之间的关系分别为：

K_D＝-3.55×10^-1log Mw+2.29；C_WF＝1.02回收率-6.23；

所述截断值Mw_n为110000。

7.根据权利要求1所述的方法，所述多糖分子量范围为2.7×10³～3.006×10⁵。

8.根据权利要求1所述的方法，所述多糖分子量的范围为2.7×10³～2×10⁶。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，所述高效分子排阻色谱-多角度激光散射仪法进一步包括以下步骤：

(2)将多糖样品加入所述流动相中溶解，配制成供试品溶液；

将所述供试品溶液用所述流动相稀释后，注入高效分子排阻色谱柱；

10.根据权利要求9所述的方法，所述高效分子排阻色谱柱的流动相为生理氯化钠溶液；所述流动相的流速为0.5ml·min^-1；柱温为25℃；示差检测器温度为30℃；进样量为50μl。