CN113030304B - HPSEC-RI法检测多糖并与Sepharose CL-4B法关联的方法 - Google Patents

HPSEC-RI法检测多糖并与Sepharose CL-4B法关联的方法 Download PDF

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Abstract

HPSEC‑RI法检测多糖并与Sepharose CL‑4B法关联的方法，通过HPSEC‑RI方法，利用三根高效分子排阻色谱柱测定多糖分子大小及其分布，并将其转化为琼脂糖凝胶(Sepharose)CL‑4B法KD值和回收率。该方法与Sepharose CL‑4B法线性相关性高，对原有质量标准改动小，用时短，样品用量少，提供了新的测定多糖分子大小分布的方法和标准，为多糖疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小测定方法提供数据支持。

Description

HPSEC-RI法检测多糖并与Sepharose CL-4B法关联的方法
技术领域
本文涉及将通过HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布，特别是多糖的分配系数KD值和多糖回收率，并且将其转换为Sepharose CL-4B法测定的多糖KD值和回收率的方法。
背景技术
从病原菌中提取的荚膜多糖已被用于预防肺炎和脑膜炎等重要疾病的疫苗生产。多糖疫苗是由这些带有荚膜的细菌经过发酵培养，提取细菌的荚膜多糖抗原后纯化制成，用于预防相应细菌引起的疾病，主要包括脑膜炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖疫苗等。荚膜多糖在细菌培养和多糖纯化过程中形成具有重复单元数量不同的一系列分子量不均一的多糖混合物，例如A群脑膜炎球菌多糖为由→6-α-D-ManpNAC(3/4OAC)-1-PO4→重复单元组成的多糖混合物。其中，多糖的分子大小是影响多糖免疫原性的重要指标，因此，分子大小分布是测定多糖混合物中多糖大分子和小分子分布情况的检测项目。
《中国药典》2020版三部在测定多糖分子大小分布时采用琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-4B法检测多糖分配系数(KD值)和多糖的回收率来控制多糖质量。该方法是中国药典、欧洲药典、WHO规程等法定检验标准所使用的传统方法，多糖类疫苗大多基于此方法的检测结果批准上市。但是，该方法存在以下缺陷：由于该方法采用手工填充色谱柱，不同人填充的色谱柱分离效果可能存在一定差异，导致检测结果不稳定；另一方面，Sepharose CL-4B琼脂糖凝胶机械强度较低，耐压性不足，洗脱流速一般控制为0.3ml/min，加之色谱柱较长，检测一个样品常常需要12小时以上；并且实验室中普遍未配备低压凝胶色谱的自动进样系统，均采用单针手动进样的方式，导致检测效率较低。
近年来，高效分子排阻色谱(high performance size exclusionchromatography，HPSEC)方法以快速、高效、稳定等特点在生物检测领域的应用越来越广泛。然而，现有技术中并未公开HPSEC-RI法检测多糖的质量标准与Sepharose CL-4B法标准之间的关系，缺乏将两者快速有效关联的方法。因此，需要提供一种用于将上述两种方法检测的多糖相关数据进行桥接的方法。
发明内容
本申请提供了一种利用HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布并将其转换为Sepharose CL-4B标准的方法，具体地，该方法通过高效分子排阻色谱-示差折光检测器(HPSEC-RI)法测定多糖分子的分配系数KD值和回收率，将所得结果与琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-4B法所得结果之间建立线性回归，从而将两种检测方法有效桥接。该方法为多糖类疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小分布替代方法提供数据支持。
本申请涉及一种HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布转换为Sepharose CL-4B法标准的方法，所述方法包括：
高效分子排阻色谱-示差折光检测器法测定所述多糖的分配系数KD HPSEC-RI和回收率HPSEC-RI；
将所述KD HPSEC-RI和所述回收率HPSEC-RI转换为Sepharose CL-4B法的分配系数KD Sepharose CL-4B和回收率Sepharose CL-4B；
所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B间的对应关系分别为：
KD HPSEC-RI＝5.39×10-1～8.32×10-1 KD Sepharose CL-4B+3.49×10-2～3.78×10-1；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.40×10-1～9.95×10-1回收率Sepharose CL-4B+(-1.19)～3.43×10-1；
其中，所述KD SepharoseCL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B参照《中国药典》2020版三部规定的Sepharose CL-4B法测定；所述回收率Sepharose CL-4B为KD Sepharose CL-4B小于0.5的多糖回收率；
KD HPSEC-RI＝(Ve-V0)/(Vi-V0)，Ve为多糖供试品洗脱液峰顶保留体积或保留时间，V0为脱氧核糖核酸(DNA)溶液峰顶保留体积或保留时间，Vi为NaN3溶液峰顶保留体积或保留时间；
回收率HPSEC-RI＝供试品溶液在KDn前的色谱图面积/供试品溶液色谱图总面积×100，所述KDn为KD Sepharose CL-4B为0.5时的KD HPSEC-RI；
高效分子排阻色谱柱选自TSK G5000PWXL色谱柱、TSK GMPWXL色谱柱或SB806色谱柱。
在一些优选实施方案中，所述多糖为脑膜炎球菌多糖、流感嗜血杆菌多糖、流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种，优选地，所述多糖为A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种。
在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱柱为TSK G5000PWXL色谱柱，所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B之间的关系分别为：
KD HPSEC-RI＝8.32×10-1KD Sepharose CL-4B+3.49×10-2；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.95×10-1回收率Sepharose CL-4B-1.19；
所述KDn为0.45。
在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱柱为TSK GMPWXL色谱柱；所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B之间的关系分别为：
KD HPSEC-RI＝6.06×10-1KD Sepharose CL-4B+8.65×10-2；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.40×10-1回收率Sepharose CL-4B-8.80×10-1；
所述KDn为0.39。
在一些优选实施方案中，所述高效分子排阻色谱柱为SB806色谱柱；所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B之间的关系分别为：
KD HPSEC-RI＝5.39×10-1KD Sepharose CL-4B+3.78×10-1；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.43×10-1回收率Sepharose CL-4B+3.43×10-1；
所述KDn为0.65。
在一些优选的实施方案中，所述高效分子排阻色谱-示差折光检测器法进一步包括以下步骤：
取一定量的脱氧核糖核酸(DNA)、NaN3分别加入流动相中溶解混匀，分别配置成脱氧核糖核酸和NaN3溶液；
将所述脱氧核糖核酸溶液和所述NaN3溶液用流动相稀释后注入高效分子排阻色谱柱中，分别测定所述脱氧核糖核酸溶液和所述NaN3溶液峰顶保留体积或保留时间V0和Vi；
将多糖样品加入流动相中溶解混匀，配置成多糖的供试品溶液；
所述供试品溶液用所述流动相稀释后注入所述高效分子排阻色谱柱中，测定多糖供试品溶液的峰顶保留体积或保留时间Ve。
根据KD HPSEC-RI和回收率HPSEC-RI的计算公式，计算多糖供试品溶液的KD HPSEC-RI和回收率HPSEC-RI。
在一些优选实施方案中，所述流动相为生理氯化钠0.9％NaCl溶液；所述色谱柱的进样条件为流速：0.5ml·min-1；柱温：25℃；示差折光检测器温度：30℃；进样量：50μl。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1a-c阐明了A群脑膜炎球菌多糖在高效分子排阻色谱柱与Sepharose CL-4B色谱柱中测得的KD值相关性关系。
图2a-c阐明了A群脑膜炎球菌多糖在高效分子排阻色谱柱与Sepharose CL-4B色谱柱中测得的回收率相关性关系。
图3a-b阐明了其他多糖在TSK G5000PWXL色谱柱与Sepharose CL-4B色谱柱中测得的KD值和回收率的关系，并与实施例2对应的直线回归方程的比较。
具体实施方式
本申请描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本申请所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征或元件可以与任何其它实施例中的任何其他特征或元件结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征或元件。
此外，在描述具有代表性的实施例时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤序列。然而，在该方法或过程不依赖于本文所述步骤的特定顺序的程度上，该方法或过程不应限于所述的特定顺序的步骤。如本领域普通技术人员将理解的，其它的步骤顺序也是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对该方法和/或过程的权利要求不应限于按照所写顺序执行它们的步骤，本领域技术人员可以容易地理解，这些顺序可以变化，并且仍然保持在本申请实施例的精神和范围内。
实施例1材料与方法
1.1多糖样品：本申请采用A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和本领域常见的肺炎球菌多糖，所述多糖或其衍生物均为中国食品药品检定研究院留样。
1.2主要试剂及仪器：蓝色葡聚糖2000(美国Pharmacia公司，批号5934)，维生素B12(国药集团化学试剂有限公司，批号F20101021)，DNA(美国sigma公司，批号SLBZ1575)，叠氮钠(德国Merck公司，批号6228195)，生理氯化钠溶液(国药集团化学试剂有限公司)，XK16/100层析柱、Sepharose CL-4B凝胶(美国GE Healthcare公司)，TSK guardcolumn PWXL(6.0mm ID×4cm)和TSK G5000PWXL(7.8mm ID×30cm)色谱柱、TSK guardcolumn PWXL(6.0mm ID×4cm)和TSK GMPWXL(7.8mm ID×30cm)色谱柱(日本TOSOH株式会社)，ShodexOHpak SB-G(6.0mm ID×5cm)和OHpak SB806HQ(8.0mm ID×30cm)色谱柱(日本SHOWADENKO公司)，蛋白纯化仪AKTA Purifier液相层析系统(美国GE公司)，高效液相色谱仪e2695(美国Waters公司)，示差折光检测器及ASTRA7.1.3软件(美国怀亚特公司)，恒温培养箱(德国宾得公司)，BP211D电子天平(德国Sartorius公司)。
1.3色谱条件：
HPSEC-RI法：高效分子排阻色谱柱分别采用TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806色谱柱；流动相：生理氯化钠(0.9％NaCl)溶液；流速：0.5ml·min-1；柱温：25℃；示差折光检测器温度：30℃；进样量：50μl。
Sepharose CL-4B法：采用《中国药典》2020版三部A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法，取1.0ml待测溶液，注入Sepharose CL-4B色谱柱。
1.4供试品溶液配制
1.4.1分别称取A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和本领域常见的24个血清型肺炎球菌多糖加入生理氯化钠溶液溶解并混匀，配置成多糖浓度为5mg/ml的供试品溶液。
1.4.2将1.4.1中的A群脑膜炎球菌多糖分装后分别置于-20℃、4℃和37℃，0～35天取出。其中，向需用HPSEC-RI法测定的供试品溶液中加入生理氯化钠溶液，稀释10倍备用，向需用Sepharose CL-4B法测定的供试品溶液中加入生理氯化钠溶液，稀释2倍备用。
1.5 KD值和多糖回收率测定和计算
1.5.1测定方法：
HPSEC-RI法：将脱氧核糖核酸和NaN3分别加入流动相中溶解混匀，分别配置成浓度各为0.01％的脱氧核糖核酸溶液和NaN3溶液，注入高效分子排阻色谱柱；分别测定脱氧核糖核酸和NaN3溶液的峰顶保留体积或保留时间V0和Vi。
取1.4.2中的供试品溶液注入高效分子排阻色谱柱中，测定多糖供试品溶液的峰顶保留体积或保留时间Ve。
Sepharose CL-4B法：根据《中国药典》2020版三部A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定方法进行测定。
1.5.2 KD值的计算：
HPSEC-RI法：KD HPSEC-RI＝(Ve-V0)/(Vi-V0)，其中，Ve为供试品洗脱液峰顶保留体积或保留时间，V0为DNA保留体积或保留时间，Vi为NaN3保留体积或保留时间。
Sepharose CL-4B法：KD Sepharose CL-4B＝(Ve-V0)/(Vi-V0)，Ve为供试品洗脱液峰顶保留体积或保留时间，V0为蓝色葡聚糖保留体积或保留时间，Vi为维生素B12保留体积或保留时间。
1.5.3回收率的计算：
HPSEC-RI法：回收率HPSEC-RI(％)＝供试品溶液在KDn前的色谱图面积/供试品溶液色谱图总面积×100，其中KDn为KD Sepharose CL-4B等于0.5时对应的KD HPSEc-RI；
Sepharose CL-4B法：回收率Sepharose CL-4B(％)＝供试品溶液在KD值前的色谱图面积/供试品溶液色谱图总面积×100，在Sepharose CL-4B法中，一般计算KD值小于0.5的多糖回收率。
实施例2多糖KD值和多糖回收率的相关性分析
2.1 KD值的相关性分析
以A群脑膜炎球菌多糖为例，将1.4.2中的供试品溶液分别注入Sepharose CL-4B色谱柱和三根高效分子排阻色谱柱，根据1.5.2所述的计算方法，计算所述供试品溶液在四根色谱柱上的KD值。以Sepharose CL-4B色谱柱测得的KD Sepharose CL-4B值为横坐标，三根高效分子排阻色谱柱测得的KD HPSEC-RI值为纵坐标做直线回归，计算各直线回归方程的斜率和决定系数(R2)。所得结果见表1和图1a-c。
根据计算得出，A群脑膜炎球菌多糖供试品溶液在TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806色谱柱上的KD HPSEC-RI值与KD Sepharose CL-4B值的直线回归方程和R2分别为；y＝8.32×10-1x+3.49×10-2、R2＝0.997；y＝6.06×10-1x+8.65×10-2、R2＝0.985；y＝5.39×10-1x+3.78×10-1、R2＝0.995。
表1 A群脑膜炎球菌多糖在四根色谱柱上的KD值
Figure BDA0002952541830000081
Figure BDA0002952541830000091
2.2多糖回收率的相关性分析
以2.1中A群脑膜炎球菌多糖在Sepharose CL-4B色谱柱的多糖回收率Sepharose CL-4B为横坐标，三根高效分子排阻色谱柱的多糖回收率HPSEC-RI为纵坐标做直线回归，计算各直线回归方程的斜率和R2。
其中，所述供试品溶液在Sepharose CL-4B色谱柱的多糖回收率和所述供试品溶液在三根高效分子排阻色谱柱上的多糖回收率计算方法如1.5所述，计算供试品溶液在三根高效分子排阻色谱柱的KD值小于KDn的多糖回收率。
经计算，所述供试品溶液在TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806色谱柱上的KDn分别为0.45、0.39和0.65。A群脑膜炎球菌多糖在TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806色谱柱上的回收率HPSEC-RI与回收率Sepharose CL-4B直线回归方程和R2分别为：y＝9.95×10-1x-1.19、R2＝0.998；y＝9.40×10-1x-8.80×10-1、R2＝0.998；y＝9.43×10-1x+3.43×10-1、R2＝0.999。多糖回收率的相关性数据见表2和图2a-c。
表2 A群脑膜炎球菌多糖在四根色谱柱上的多糖回收率
Figure BDA0002952541830000092
Figure BDA0002952541830000101
结论：1.根据图1a-c可知，三根高效分子排阻色谱柱的KD HPSEC-RI值与传统Sepharose CL-4B法测定的KD Sepharose CL-4B值线性相关性均很好，相关系数均大于0.992。因此，采用HPSEC-RI法测定A群脑膜炎球菌多糖KD值替代传统Sepharose CL-4B法测定KD值是可行的。
2.图1a-c中三根高效分子排阻色谱柱的KD HPSEC-RI值与传统Sepharose CL-4B法测定的KD Sepharose CL-4B值的直线回归方程的斜率差别较大，TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806色谱柱的斜率分别为0.832、0.606和0.543。证明虽然可以采用HPSEC-RI法替代Sepharose CL-4B法测定A群脑膜炎球菌多糖的KD值，但多糖在不同高效分子排阻色谱柱上的KD值与Sepharose CL-4B法测定的KD值的线性关系不同，KD Sepharose CL-4B值转换到不同高效分子排阻色谱柱上是不同的。
3.在本申请所采用的三根高效分子排阻色谱柱中，A群脑膜炎球菌多糖在TSKG5000PWXL色谱柱的KD值与KD Sepharose CL-4B值最为接近，直线回归方程的斜率为0.832，截距为0.0349，表明TSK G5000PWXL色谱柱对于多糖的分离状况与Sepharose CL-4B色谱柱最为接近。
4.在传统Sepharose CL-4B法中，多糖的回收率一般采用KD值为0.5作为截断值。由图1a-c可知，当KD Sepharose CL-4B为0.5时，在TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806色谱柱上对应的KD HPSEC-R1分别为0.45、0.39和0.65，即KDn。根据图2a-c可知，多糖在三根高效分子排阻色谱柱上大于KDn的回收率均与传统Sepharose CL-4B法测定多糖回收率有很好的线性相关性，且相关系数均大于0.998，直线回归方程的斜率也均大于0.9。
实施例3不同多糖的色谱柱相关性研究
根据实施例2的结论，优选使用TSK G5000PWXL色谱柱，通过HPSEC-RI法和Sepharose CL-4B法测定1.4.1中的脑膜炎球菌多糖、肺炎球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌多糖和b型流感嗜血杆菌多糖衍生物的KD值，以及脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖和b型流感嗜血杆菌多糖衍生物的回收率，其中KD值和多糖回收率的计算方法，如1.5所述。所得结果见表3-4和图3a-b。
表3不同多糖在两根色谱柱上的KD值
Figure BDA0002952541830000111
Figure BDA0002952541830000121
表4不同多糖在两根色谱柱上的回收率
Figure BDA0002952541830000122
Figure BDA0002952541830000131
结论：1.根据表3和图3a的结果可知，A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和本领域常见血清型的肺炎球菌多糖在TSK G5000PWXL色谱柱的KD HPSEC-RI值与对应的KD Sepharose CL-4B值间的关系均在图1b中的直线回归方程两侧，证明A群脑膜炎球菌多糖在TSK G5000PWXL色谱柱和Sepharose CL-4B色谱柱的KD值的直线回归方程也适用于其他多糖。
2.根据表4和图3b的结果可知，A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖和b型流感嗜血杆菌多糖衍生物在TSK G5000PWXL色谱柱中的回收率HPSEC-RI与回收率Sepharose CL-4B之间的关系也位于图2a中计算所得的直线回归方程两侧，证明A群脑膜炎球菌多糖在TSK G5000PWXL色谱柱和Sepharose CL-4B色谱柱的回收率的直线回归方程也适用于其他多糖。
3.根据多糖的结构特点可知，当所述色谱柱为TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806时，图1a-c和图2a-c中A群脑膜炎球菌多糖的KD HPSEC-RI、回收率HPSEC-RI、KD Sepharose CL-4B和回收率Sepharose CL-4B之间的线性关系，同样也适用于本领域结构相同或相似的其他多糖或多糖衍生物。
另外，当所述色谱柱为TSK G5000PWXL、TSK GMPWXL和SB806以外的其他高效分子排阻色谱柱时，也可以通过本申请所述方法，利用HPSEC-RI法测定多糖在高效分子排阻色谱柱的KD HPSEC-RI值和回收率HPSEC-RI，并与KD Sepharose CL-4B值和回收率Sepharose CL-4B线性关联。当所用的高效分子排阻色谱柱不同时，各直线回归方程的斜率不同，截断值也不同。
综上，本申请采用了三根高效分子排阻色谱柱，通过HPSEC-RI法测定了多糖的KD HPSEC-RI值、KD值小于KDn的多糖回收率HPSEC-RI，并且将所得结果与Sepharose CL-4B法的KD Sepharose CL-4B值和回收率Sepharose CL-4B进行线性关联，提供了利用HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布并将其转换为Sepharose CL-4B法标准的方法，其中HPSEC-RI法所用色谱柱优选为TSK G5000PWXL色谱柱。该方法为多糖类疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小分布替代方法提供数据支持。

Claims (8)

1.一种HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布转换为Sepharose CL-4B法标准的方法，所述方法包括：
通过高效分子排阻色谱-示差折光检测器法测定多糖的分配系数KD HPSEC-RI和回收率HPSEC-RI；
将所述KD HPSEC-RI和所述回收率HPSEC-RI转换为Sepharose CL-4B法的分配系数KD Sepharose CL-4B和回收率Sepharose CL-4B；
所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B间的关系分别为：
KD HPSEC-RI＝5.39×10-1～8.32×10-1KD Sepharose CL-4B+3.49×10-2～3.78×10-1；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.40×10-1～9.95×10-1回收率Sepharose CL-4B+(-1.19)～3.43×10-1；
其中，所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B参照《中国药典》2020版三部规定的Sepharose CL-4B法测定；所述回收率Sepharose CL-4B为KD Sepharose CL-4B小于0.5的回收率；
KD HPSEC-RI＝(Ve-V0)/(Vi-V0)，Ve为多糖供试品洗脱液峰顶保留体积或保留时间，V0为脱氧核糖核酸的保留体积或保留时间，Vi为NaN3保留体积或保留时间；
回收率HPSEC-RI(％)＝供试品溶液在KDn前的色谱图面积/供试品溶液色谱图总面积×100，所述KDn为KD Sepharose CL-4B等于0.5时对应的KD HPSEC-RI；
高效分子排阻色谱柱选自TSK G5000PWXL色谱柱、TSK GMPWXL色谱柱或SB806色谱柱。
2.根据权利要求1所述的方法，所述多糖为脑膜炎球菌多糖、流感嗜血杆菌多糖、流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种。
3.根据权利要求2所述的方法，所述多糖为A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖衍生物和肺炎球菌多糖中的任一种。
4.根据权利要求1所述的方法，所述高效分子排阻色谱柱为TSK G5000PWXL色谱柱，所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B之间的关系分别为：
KD HPSEC-RI＝8.32×10-1KD Sepharose CL-4B+3.49×10-2；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.95×10-1回收率Sepharose CL-4B-1.19；
所述KDn为0.45。
5.根据权利要求1所述的方法，所述高效分子排阻色谱柱为TSK GMPWXL色谱柱；所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B之间的关系分别为：
KD HPSEC-RI＝6.06×10-1KD Sepharose CL-4B+8.65×10-2；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.40×10-1回收率Sepharose CL-4B-8.80×10-1；
所述KDn为0.39。
6.根据权利要求1所述的方法，所述高效分子排阻色谱柱为SB806色谱柱；所述KD HPSEC-RI、所述回收率HPSEC-RI、所述KD Sepharose CL-4B和所述回收率Sepharose CL-4B之间的关系分别为：
KD HPSEC-RI＝5.39×10-1KD Sepharose CL-4B+3.78×10-1；
回收率HPSEC-RI(％)＝9.43×10-1回收率Sepharose CL-4B+3.43×10-1；
所述KDn为0.65。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，所述高效分子排阻色谱-示差折光检测器法进一步包括以下步骤：
将脱氧核糖核酸和NaN3分别加入流动相中溶解混匀，分别配置成脱氧核糖核酸溶液和NaN3溶液；
将所述脱氧核糖核酸和所述NaN3溶液分别经流动相稀释后，注入高效分子排阻色谱柱，分别测定所述脱氧核糖核酸和所述NaN3溶液峰顶保留体积或保留时间V0和Vi；
取多糖样品加入流动相中溶解并混匀，配置成多糖的供试品溶液；
将所述供试品溶液用所述流动相稀释后注入高效分子排阻色谱柱中，测定多糖供试品溶液的峰顶保留体积或保留时间Ve；
根据权利要求1至6中任一项所述KD HPSEC-RI和所述回收率HPSEC-RI的计算公式，计算所述供试品溶液的KD HPSEC-RI和回收率HPSEC-RI。
8.根据权利要求7所述的方法，所述高效分子排阻色谱法的流动相为生理氯化钠溶液；所述流动相的流速为0.5ml·min-1；柱温为25℃；示差检测器温度为30℃；进样量为50μl。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2262947C2 (ru) * 2002-07-24 2005-10-27 Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" Способ получения тромбиноподобного коагулирующего фермента
CN109682903A (zh) * 2019-02-19 2019-04-26 天津赛诺制药有限公司 一种注射用黄芪多糖分子量的检测方法
CN110736796A (zh) * 2019-10-23 2020-01-31 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2262947C2 (ru) * 2002-07-24 2005-10-27 Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" Способ получения тромбиноподобного коагулирующего фермента
CN109682903A (zh) * 2019-02-19 2019-04-26 天津赛诺制药有限公司 一种注射用黄芪多糖分子量的检测方法
CN110736796A (zh) * 2019-10-23 2020-01-31 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
b 型流感嗜血杆菌精制多糖分子大小分布;李向群等;《中国生物制品学杂志》;20210131;第34卷(第1期);第97-105页 *
中药多糖质量控制研究进展;肖作奇;《中国医药导报》;20150228;第12卷(第4期);第159-164页 *
肺炎链球菌荚膜多糖分子大小及分子量;张轶等;《中国生物制品学杂志2》;20150930;第28卷(第9期);第947-960页 *

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