CN102680588B - 一种柱层析分离检测技术及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柱层析检测技术及其用途，具有固定相少、层析柱矮以及可以循环上样等特点，提高了吸附量，缩短了检测时间，降低了检测成本，可用于多种分离检测产品的开发，具有良好的适用价值和市场前景。

Description

一种柱层析分离检测技术及其用途
技术领域
本发明涉及一种柱层析分离检测技术及其用途。
背景技术
柱层析技术是利用层析柱对生物分子进行分离和检测的技术，其中层析柱是其常用的主体结构。层析技术按层析的机理分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、疏水层析等。吸附层析是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析是利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析是利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，使之分离。凝胶层析是利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同，使之分离。亲和层析是在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质，常见的亲和对有酶和抑制剂、抗原和抗体、配体和受体等。
柱层析技术是一中分离效率很高的分析分离手段与方法，它能够将各种性质极极其类似的物质分离开，它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。目前这种技术已广泛应用于科学研究与工业生产的多个领域，在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。在通常情况下，层析柱内先填充不溶性基质，即柱层析填料，形成固定相，将待分离检测样品以溶液形式加载到层析柱上进行吸附分离和洗脱，其中的液体部分为流动相。流动相在固定相中的流动速度和固定相的厚度直接影响其吸附分离效果。一般层析柱内固定相的高度和直径比选择，5:1-10:1或更大，所需要的固定相和待分离检测样品的用量都比较大或者是分离检测所需的时间长，不适宜于样品量小、待分离检测物质的浓度低的样品的快速分离检测。因此，开发一种适用于小样品、浓度低的样品的快速柱层析分离检测技术，不仅使用方便，同时也可显著提高工作效率，在检测和分析、分离的诸多领域具有重要的实用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种柱层析检测技术及其用途，特别是一种适用于样品量小、待分离检测物质的浓度低的样品的快速柱层析分离检测技术。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案。
一种柱层析检测技术，具有如下特征：1）层析柱内固定相湿重总体积小于1毫升；2）层析柱内固定相高度和直径比小于5:1；3）流动相采用循环加载方式，以提高吸附量。所述的层析柱内固定相湿重总体积选择10微升-1毫升，优选10微升-0.5毫升，更优选10微升-0.25毫升，最优选20微升-0.15毫升。所述的层析柱内固定相高度和直径比选择0.1:1-5:1，优选0.1:1-3:1，更优选0.1:1-2:1，最优选0.1:1-1:1。层析柱内的固定相，即层析填料、层析介质，有凝胶颗粒和磁微粒。凝胶颗粒有葡聚糖凝胶系列的凝胶过滤填料和琼脂糖凝胶系列的凝胶过滤填料、葡聚糖凝胶系列的离子交换填料和琼脂糖凝胶系列的离子交换填料、疏水层析填料、亲和层析填料、纤维素类填料等，其中亲和层析填料在本发明技术中最为常用，有溴化氰活化琼脂糖凝胶介质（CNBr Sepharose FF）、NHS活化琼脂糖凝胶介质等。
所述的柱层析结构包括但不限于：1）刚性管道结构；2）非刚性管道结构；3）为预装柱；4）为使用前装载的柱状结构；5）为加有开关控制装置的管道结构；6）为出样端过滤截留出口易于被去除而使柱内固相填料易于移离柱层析结构进行下一级分析的柱状结构。刚性管道结构常见为实验室常用的两端接有接口或不接有接口的玻璃、有机玻璃、不锈钢等材质的层析柱，也包括为某些分析特制的硬质材料的柱状结构。非刚性管道结构多指塑料、橡胶、硅胶等材料制成的可以随意圈曲的管道结构，两端接有接口或不接有接口。本发明技术所采用的层析柱包括预装柱和使用前进行装载的层析柱，考虑使用的方便程度预装柱将作为优选，同时在预装柱上加建出样端截赌出口易于被去除而使柱内固定相易于转离柱层析结构。本发明技术所采用的层析柱其管道结构也是优选对象，在检测时层析填料被固定在管道的特定部位进行，分析完成后被排出管道，再进行新的分析检测。
所述的层析柱内固定相包括包括但不限于：1）凝胶微粒；2）磁微粒。其中凝胶颗粒为多种柱层析填料，常用亲和层析填料，磁微粒为适用于待检物特异性结合物，如抗体、抗原等，进行标记的磁性微粒。
所述的流动相采用循环加载方式包括重复加载方式和循环流动加载方式。当执行重复加载方式时，流动相在完成一次加样后的流出液再被加样，如此反复多次。当循环流动加载方式时，流动相加载后的流出液又返回到流动相内，如此不断循环一定的时间。
所述的柱层析检测技术在多种分析检测产品开发中的应用。有环境、临床、药物分析、食品和工业分析等多领域的检测产品。
[有益效果]
1）本发明创造性地将流动相循环加载技术应用于柱层析分析技术，间接加厚了柱层析固定相的厚度，从而增加了分离检测待吸附物质与固定相的接触时间，提高了层析柱的吸附效率。
2）本发明通过降低将层析柱内固定相高度和直径之间的比值加大了流动相的流量，从而缩短了流动相的加载时间，加快了分离检测速度。
3）本发明采用1毫升以下的小体积固定相进行样品的分离检测，在节约固定相的同时，也节约了样品量，降低了检测成本。
因此，本发明技术对改善现有柱层析检测技术具有重要的意义和良好的应用前景。
 [具体实施方式]
   通过以下具体实施实例，可以进一步了解本发明，但以下实例不是对本发明的限定。
实施例1、本发明刚性层析柱的制作：
实验材料：有机玻璃管、有机玻璃片、硅胶管、抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质。
   实验装置的制备：
   取一个内径为3.5mm的有机玻璃管，在有机玻璃管的下端安装有机玻璃片并打孔，在内侧底部放置普通定性滤纸，竖立在实验台上，向柱内添加6.25、12.5、25、50、100、150、200、250、300ul抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质,此时固定相高分别约为0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、25、30mm，用PBS缓冲液清洗，上下两端密封，4℃保存。
实施例2、本发明技术重复上样对样品吸附效果的影响：
实验材料：装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质的预装层析柱、辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、化学发光检测仪、人血红蛋白溶液。
   实验方法：取已知浓度的人血红蛋白溶液，用PBS溶液稀释配置100ng/ml人血红蛋白溶液。实验用实施例1制备的预装柱观测本发明技术单次上样和重复上样2分钟对发光量的影响。
单次上样组，取装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质的预装层析柱，室温分别加入人血红蛋白溶液各50ul,静置2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，弃流出液，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，静置2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，转移凝胶介质至发光杯，置化学发光检测仪，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。
多次上样组，取装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质的预装层析柱，室温分别加入人血红蛋白溶液各50ul,收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，弃流出液，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，转移凝胶介质至发光杯，置化学发光检测仪，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。
实验结果：见表1，单次上样层析柱固体相高20mm后才开始基本平稳，而多次上样层析柱固体相高0.625mm开始就与单次上样层析柱固体相高20mm柱检测的结果相近，说明多次上样可显著改善样品的吸附量。
表1、本发明技术重复上样对样品吸附效果的影响
                                 发光量（mV）
  柱高    0.625  1.25     2.5   5     10     15    20   25    30mm            
单次上样    4312     5128     6955  7892  16030  17892 19321 19718  19891
多次上样   18909    19215   19561 19398  19612  19871 19523 19799  19685
实施例3、本发明技术与现行化学发光检测技术检测结果的比较：
实验材料：装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的预装层析柱、抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质、辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、化学发光检测仪、人血红蛋白溶液。
   实验方法：取已知浓度的人血红蛋白溶液，用PBS溶液稀释配置10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng人血红蛋白溶液。另取健康人全血，加入等量的去离子水溶血释放血红蛋白，再用PBS进行10000倍稀释。实验将采用本发明技术与现行化学发光检测技术测定10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng人血红蛋白溶液并绘制标准曲线，然后测定健康人血红蛋白，并计算血红蛋白浓度。取42个试管，分为本发明技术组和现行化学发光检测技术组。每个样品做3个平行管。
现行化学发光检测技术组，每管加入抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul，再分别加入已知浓度的人血红蛋白溶液和待测健康人血红蛋白溶液各50ul,37℃震摇温育30分钟，3000转、分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul, 混匀，3000转、分离心3分钟，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，37℃震摇温育30分钟，3000转、分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul, 混匀，3000转、分离心3分钟，弃上清，转移凝胶介质至发光杯，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。
本发明技术组，取装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的小型预装层析柱，分别加入已知浓度的人血红蛋白溶液和待测健康人血红蛋白溶液各50ul, 收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，弃流出液，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，转移凝胶介质至发光杯，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。
实验结果：现行技术完成实验时间82分钟,测定结果2.91ug/50ul，本发明技术完成实验时间16分钟，测定结果3.17ug/50ul，两种实验方法所得结果基本一致,但本发明的完成实验时间明显短于现行技术。

Claims (1)

1.一种柱层析分离检测装置，是由层析柱、层析柱内固定相、流动相和检测器组成，其中层析柱内固定相湿重总体积为6.25微升，流动相采用循环加载方式，所述循环加载方式选自重复加载或循环流动加载两种方式，检测器为化学发光检测器，其中层析柱内固定相高度为0.625mm、层析柱内径为3.5mm；所述的柱层析结构选自刚性管道结构或非刚性管道结构；所述的层析柱内固定相选自凝胶颗粒或磁微粒。
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Denomination of invention: A column chromatographic separation detection technology, and application thereof

Effective date of registration: 20190418

Granted publication date: 20151028

Pledgee: Jiangsu Jiangnan Rural Commercial Bank Limited by Share Ltd

Pledgor: Changzhou Bo Wen Di medical Limited by Share Ltd

Registration number: 2019990000341

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Date of cancellation: 20220420

Granted publication date: 20151028

Pledgee: Jiangsu Jiangnan Rural Commercial Bank Limited by Share Ltd.

Pledgor: CHANGZHOU BOWENDI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.

Registration number: 2019990000341