CN204214826U - 一种黄曲霉毒素b1免疫亲和柱 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，属于免疫亲和层析及真菌毒素残留检测技术领域。黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱包括柱管1、上筛板2、下筛板3、黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料4，上筛板2和下筛板3设于柱管内部，黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料4填充于上筛板2和下筛板3间，柱管1底部设有收窄部分，黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱还设有下堵头6。本实用新型采用重组蛋白A琼脂糖凝胶作为固相载体，载体上的重组蛋白A与AFB₁抗体IgG的Fc段定向结合，再通过双功能结合剂二甲基庚二亚胺二盐酸盐(DMP)将其交联，形成亲和介质。因此，亲和柱的负载量更大，产品更加稳定，成本相对较低。

Description

一种黄曲霉毒素B1免疫亲和柱

技术领域

本实用新型涉及黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，属于免疫亲和层析及真菌毒素残留检测技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一组结构类似的代谢物，其毒性属于剧毒，具有致畸、致癌、致诱变作用，而黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的毒性和致癌性最强，被称为第一大类致癌物，能诱发人和动物的肝癌。

目前，对于黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱-高效液相色谱法、免疫亲和柱-荧光光度法等。其中薄层层析法耗时长、灵敏度低，实验操作需接触大量标准品，既不利于操作者健康又不环保。酶联免疫吸附法适合大量样本的快速筛选，定量确定还需依靠高效液相色谱等仪器分析方法，而这往往需要复杂的样品净化过程。

国家标准GB/T18979-2003采用的方法是免疫亲和柱层析柱-高效液相色谱法和荧光光度法，该法特异性高，快速、灵敏、准确。因此，制备性能稳定、结果可靠的黄曲霉毒素免疫亲和柱乃是当务之急。目前，免疫亲和柱载体的制备方法有溴化氰法、过碘酸钠法等。当采用溴化氰活化的琼脂糖作为载体时，其中凝胶载体与抗体的偶联为随机偶联，若建合位置靠近抗体的结合位点指向有碍与待测物结合的空间时，则抗体的结合能力下降，为制备高载量的亲和介质，则所需抗体的纯度高且用量大，或制备较大的柱床体积，增加非特异性吸附的风险，成本居高不下，产品不稳定。若利用过碘酸钠法直接活化琼脂糖获得开环醛基，直接与抗体偶联，存在问题与上述溴化氰活化后偶联相似。陈光宇等专利报道过碘酸钠法使用NaIO₄将IgG Fc片段特有的单糖氧化，开环成醛，带有醛基的Fc段直接与CNBr/己二酰二肼活化的基质偶联，生成稳定的腙衍生物(无需还原)。但是当糖含量较少，游离氨基较多，氧化时易发生本身聚合，此法常见于酶标记抗体中使用。此外，过碘酸钠氧化抗体法步骤繁琐，活化时间较长、氧化过程复杂。

制成的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱还存在诸多不便，装料不平，不方便使用等问题

实用新型内容

本实用新型的目的在于克服现有技术中存在的一个或多个问题，提供一种黄曲霉毒素B₁(AFB₁)免疫亲和柱。本实用新型特别适用于性能稳定、结果可靠的黄曲霉毒素免疫亲和柱中。

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱包括柱管、上筛板、下筛板、黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料，黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱顶部还设有有凸缘，上筛板和下筛板设于柱管内部，黄 曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料填充于上筛板和下筛板间，柱管底部设有收窄部分，所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱还设有下堵头。本实用新型可以采用重组蛋白A琼脂糖凝胶(r proteinA-Sepharose CL-4B)作为固相载体；与经过辛酸-饱和硫酸铵纯化的AFB₁单克隆抗体定向偶联的免疫亲和柱中。生产工艺简单，过程温和易控制，亲和介质稳定。上筛板和下筛板压平黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料结果稳定。

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料其固相载体为重组蛋白A琼脂糖凝胶，重组蛋白A琼脂糖凝胶定向偶联黄曲霉毒素B₁单克隆抗体。

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，柱管直径为7.5mm，柱管内径为5.0mm，柱管长为66.0mm，黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料填充量为250ul，上筛板和下筛板存在于柱体管内部，黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱顶部还设有凸缘可以方便定位黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱。此规格使样品过柱时可达到所需流速且稳定，黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料填充量为250ul效率高。

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，柱管底部收窄部分的管长为10mm，体管底部收窄部分上部为倒锥型下部为直径4mm直管。方便下接导管

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，柱管顶部还设有有凸缘的上盖，上盖内部为管状，上盖内部管状下端封闭，柱管底部还设有下堵头。上盖内部为管状下部封闭方便保存时管内装料不泄漏，使用时剪通管道可做连接导管的套头。

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，柱体管为透明PE塑料，有凸缘的上盖为柔性塑料。方便观察，方便使用。

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，柱管内壁设有环槽，上筛板设于环槽内。上筛板设于环槽内防止出现上筛板浮起，没有压平黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料，使填料上表面不平出现松散出现缝隙影响结合效率与可靠性的情况。

根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，柱管内壁设有限位环，所述上筛板设于所述限位环下。上筛板设于环槽内防止出现上筛板浮起，没有压平黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料，使填料上表面不平出现松散出现缝隙影响结合效率与可靠性的情况。

本实用新型黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱中黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料可以使用市售黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶材料。

为了更好的发挥本实用新型效果，黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料可以使用如下方法制备：

(1)固相载体的准备：将保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤后，用PBS缓冲液悬浮； 

(2)抗体与固相载体的偶联：

a、将AFB₁单克隆抗体与步骤(1)中得到的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶室温下在垂直混匀器上混合1-3h；

b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3～4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，以除去未结合的抗体及其他杂蛋白；

c、然后在步骤b所得反应物中加入0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚二亚胺二盐酸盐DMP固体粉末，室温下，在垂直混匀器上混匀1-3h；

d、反应结束后，用10～30mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用20～40mL、50mmol/L的三乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混匀器上混匀4～6min，以终止联接反应；

e、用20～40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5～10mL 50mmol/L，pH3.0的甘氨酸-HCL溶液，室温下，在垂直混匀器上混匀4～6min，以除去未结合的抗体；

f、反应结束后，用10～30mL的质量浓度为20％乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的20％乙醇-水重新悬浮，得到混悬液，沉降得黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料；

此方法制备的黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料中重组蛋白A经改造含有一C末端半胱氨酸，单一位点偶联于琼脂糖；AFB₁单克隆抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到重组蛋白A琼脂糖凝胶，AFB₁单克隆抗体抗原结合部位充分暴露。净化效率和方法的灵敏度提高。

按照本实用新型提供的技术方案，本实用新型采用重组蛋白A琼脂糖凝胶(r proteinA-Sepharose CL-4B)作为固相载体；与经过辛酸-饱和硫酸铵纯化的AFB₁单克隆抗体定向偶联,使用这种纯化方案，该方法经济，更重要的是能保证IgG与proteinA高效结合，杂蛋白不被结合，洗涤后,通过双功能结合剂二甲基庚二亚胺二盐酸盐(DMP)将其交联，取制备的混悬液进行装柱，过夜沉降使柱体积为0.25mL，安装上筛板，20％乙醇-水密封，4℃保存，得到AFB₁免疫亲和柱。制备的免疫亲和层析柱，可提高样品的净化效率和方法的灵敏度，尤其适合复杂样品的前处理。

该方法制备的黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料有如下有点：

(1)载体上重组蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与AFB₁抗体IgG的结合能力；

(2)将抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到重组proteinA琼脂糖凝胶上，更好地保持了抗体的活性，使抗体上的抗原结合部位充分暴露，提高了抗体的有效利用率，较小的柱床体积下完成净化过程，减小了非特异性吸附。

(3)生产工艺简单，偶联过程对单抗的纯度要求不高，过程温和易控制，亲和介质稳定。

本实用新型与现有技术相比，本实用新型具有以下显著优点：

体积小，黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料压填平整，不松弛不出现不平有缝隙的情况影响精度，安装使用方便，利于操作。

附图说明

图1为本实用新型一实施方式结构示意图；

图2为本实用新型一实施方式局部结构示意图；

图3为本实用新型一实施方式局部结构示意图；

图4为本实用新型AFB₁10ppb标准品HPLC图谱；

图5为本实用新型AFB₁柱容量HPLC图谱；

图6为本实用新型柱容量随时间变化(2-8℃)图。

图7为本实用新型应用原理示意图。

具体实施方式

实施例1

结合图1至图3说明，一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱包括柱管1、上筛板2、下筛板3、黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料4，上筛板2和下筛板3设于柱管内部，为过盈配合，黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填4料填充于上筛板2和下筛板3间，柱管1底部设有收窄部分，黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱还设有下堵头6。

黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料4其固相载体为重组蛋白A琼脂糖凝胶，重组蛋白A琼脂糖凝胶定向偶联黄曲霉毒素B₁单克隆抗体。 

柱管1直径为7.5mm，柱管1内径为5.0mm，所述柱管1长为66.0mm，所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料4填充量为250ul，上筛板2和下筛板3存在于柱管1内部,黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱顶部还设有有凸缘5，凸缘5用于使用中固定免疫亲和柱，凸缘5还可设有孔洞用于进一步固定，。

柱体1管底部收窄部分的管长为10mm，柱管1底部收窄部分上部为倒锥型下部为直径4mm直管。

柱管1顶部还设有凸缘的上盖7，上盖7内部为管状，上盖7内部管状下端封闭，使用时将上盖下端封闭处切掉，可以用作连接注射器的接头，上盖7下端还可设有预切环这样使用时可以直接用手掰开方便使用，不用剪开或切开。

柱管1为透明PE塑料便于观察，凸缘上盖7为柔性塑料。 

柱管1内壁设有环槽8，上筛板2设于所述环槽8内，在先使用中上筛板2可能被顶起使凝胶上表面不平，影响精确性，所以设置环槽8来安装上筛板2，防止出现未压实的情况。

柱管内壁设有限位环9，上筛板2设于所述限位环9，由此防止防止出现未压实的情况。

黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料4可使用市售获得。

黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料4也可以通过以下方法获得：

AFB₁单克隆抗体的制备

(1)抗体的制备： 

a、取10-12周龄或产后的雌性BALB/c小鼠，石蜡油或降植烷每只0.5-1mL或石蜡与弗氏不完全佐剂混合液0.4-0.6mL预刺激，分笼做标记。

b、选取处于生长期的细胞(稳定分泌抗AFB₁单抗的杂交瘤细胞株)，去掉培养液，换成无血清DMEM培养基或无菌生理盐水，将贴壁细胞吹下，置入50mL灭菌离心管中，800-1000rpm离心5-8min，去掉上清重新用DMEM悬起细胞，再离心去上清，加入DMEM培养基，调整细胞数量为1×10⁶/mL。每只小鼠细胞注射剂量为0.5-1.0mL；

c、接种后小鼠在7-10天会出现腹部膨大，在10-13天左右采集腹水，采用分步骤引流收集或一次性收集，腹水4000rpm离心1-5min去细胞碎片，-20℃保存备用。

(2)抗体的纯化： 

a、取AFB₁腹水，解冻后，4℃10000-14000r/min，离心10-30min，去沉淀，记录腹水体积；

b、用3-4倍的腹水体积的醋酸钠缓冲液稀释，pH控制在4.2-4.6，温度保持在2-8℃，边搅拌边缓慢滴加正辛酸，添加量为按未稀释腹水计40μL/mL；

c、继续搅拌15-30min，2-8℃静置2-4h，4℃下以10000-14000r/min的速度离心20-30min；

d、收集上清液，弃去沉淀，过0.45μm的滤膜；

e、记录上清液体积，加入10倍浓缩的PBS缓冲液，加入量为上清液体积的1/10，2-8℃预冷，按277g/L上清液的量缓慢加入硫酸铵研磨粉末；

f、加完继续磁力搅拌器，搅拌20-30min，2-8℃静置2-4h或静置过夜；4℃下以8000-12000r/min的速度离心15-20min，收集沉淀，弃去上清液；

g、在沉淀中缓慢加入150mmol/L的PBS溶液，加入量为步骤f搅拌完毕后总体积的25％-50％；将溶解的抗体溶液转移置透析袋中，用100-200倍体积的PBS溶液在2-8℃磁力搅拌透析；

h、每2-4h更换透析液，至少3-4次，得到纯化后的抗体；用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS稀释，得到AFB₁单克隆抗体，单抗浓度在2.0-5.0mg/mL。

黄曲霉毒素B₁免疫亲和填料的制备

(1)固相载体的准备：将在乙醇中保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤2次后，再用PBS缓冲液悬浮；

(2)抗体与固相基质的偶联：

a、将AFB₁单克隆抗体与步骤(1)得到的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶室温下在垂直混匀器上混合1-3h；其中重组蛋白A琼脂糖凝胶：AFB₁单克隆抗体：PBS缓冲液按体积2：3：3配比混合；

b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3-4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，除去未结合的抗体及其他杂蛋白；

c、然后在步骤b所得反应物中加入0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚二亚胺二盐酸盐DMP固体粉末，室温下，在垂直混匀器上混匀1-3h；反应时的重组蛋白A琼脂糖凝胶：三乙醇胺-硼酸溶液：DMP按2mL:20mL:100mg配比；

d、反应结束后，用10-30mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次， 并用20-40mL、50mmol/L的乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混匀器上混匀4-6min，以终止联接反应；

e、用20-40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5-10mL 50mmol/L，pH3.0的甘氨酸-HCL溶液，室温下，在垂直混匀器上混匀4-6min，以除去未结合的抗体；

f、反应结束后，用10-30mL的质量浓度为20％乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的20％乙醇-水重新悬浮，得到混悬液，沉降得黄曲霉毒素B₁免疫亲和填料。

本黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱使用方法及可以达到的性能参数

(1)黄曲霉B₁免疫亲和柱柱容量测定

a.标准对照液制备

用移液管准确移取1.0mL的储备液到10mL锥形试管中，用氮气将溶液吹干，然后用45％的甲醇水将残渣重新溶解,定容至10mL容量瓶，振摇15min，配成浓度为10ng/mL的AFB₁标准对照品液，过0.22μm水相微孔滤膜后进样。

b.测试工作液制备

用移液管准确移取5.0mL的储备液到10mL锥形试管中，用氮气将溶液吹干，然后用10％甲醇-PBS将残渣重新溶解，定容至10mL容量瓶，振摇15min，配成浓度为50ng/mL的AFB₁测试工作液。 

c.样品过亲和柱净化

将亲和柱上方堵头7取出后剪断，再插回亲和柱；将一次性20mL注射器连接于亲和柱上部，用10mL pH7.4PBS缓冲液平衡柱子，可以1滴/秒通过亲和柱；准确移取标准液5mL注入注射器中，可以1滴/2秒的速度缓慢通过亲和柱；用20mL水冲洗亲和柱，可以流速2滴/秒，弃去流出液，直至2-3mL空气通过柱体，保证柱内无残余液体；准确加入1.0mL甲醇(B.2.1)洗脱，可以流速1滴/2-3秒，直至2-3mL空气通过柱体。收集全部洗脱液，取适量用甲醇水稀释10倍，测定AFB₁含量。

色谱条件： 

色谱柱：HP-C18柱(250nm*4.6nm，填料直径5μm)

流动相:55％甲醇水

流速：0.8mL/min

色谱柱温度：40℃

荧光检测器：激发波长365nm，发射波长440nm，，柱后光化学衍生系统

定量环：20μL

高效液相色谱如图4、图5。

(2)黄曲霉B₁免疫亲和柱柱稳定性测定

每月取2-8℃保存的不同柱容量(柱容量Ⅰ为200ng/0.125mL,柱容量Ⅱ为120ng/0.125mL,柱容量Ⅲ为50ng/0.125mL)的亲和柱5支，按照上述亲和柱柱容量测试方法进行测定，计算平均柱容量，以柱容量为纵坐标，月份为横坐标绘制曲线。由图6可以发现，在0-6个月的时候柱容量几乎没有任何变化，8-10月的时候缓慢有所降低，降幅在10％左右，10-12月柱容量降至原来的20％。测试结果说明当亲和柱需长期保存1年以上的时间，设定柱容量需提高20％。如图6。

(3)黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料抗体利用率

IgG的相对分子量为1.5×10⁵g/moL，理想状态下每个抗体分子可以与2个抗原分子结合，那么固载了48.0μg抗AFB₁单抗的理想柱容量为199.7ng/0.125mL胶。试验测得的柱容量为105ng/0.125mL，即抗体有效利用率为52.6％。因为空间位阻、热力学参数、反应平衡系数K等原因，即使在溶液中免疫反应也无法达到每个抗体分子与两分子抗原结合的理想状态(张秀莉，2006)。

章英等(2007)将纯化好的单抗与溴化氰活化的4FF葡聚糖偶联制备抗ZEN单克隆抗体免疫亲和柱，固载350ugZEN单克隆抗体的容量为0.40ug，则抗体的有效利用率为26.93％。从不同偶联方法制备真菌毒素亲和柱的单抗有效利用率来比较，蛋白A-凝胶的定向偶联是溴化氰活化随机偶联的1.96倍。该结果与黄昕(1999)报道MG₃₁-r protein A-Sepharose FF的抗原结合容量是MG₃₁-CNBr-Sepharose 4B抗原结合容量的1.8倍结论相同，说明定向偶联有助于提高免疫亲和吸附剂的抗原结合容量。

(4)黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料非特异性吸附

非特异性吸附被过量上样时，样品中的待测物除与特异性抗体结合外，还可与琼脂糖基质或杂蛋白发生非特异性吸附作用，通常用非特异性吸附率来表示，因为无法在亲和柱上直接测量待测物的非特异性吸附量，所以制备未偶联特异性单抗的蛋白A-琼脂糖凝胶柱(以下简称空白柱)对待测物的吸附作用，以非特异性吸附率来表示。

准确移取AFB₁测试工作液1mL，以1滴/2秒的速度过空白柱(柱体积为0.125mL)，然后用20mL水洗涤除杂，最后用1.0mL甲醇洗脱，收集洗脱液，计算非特异性吸附率。

说明偶联载体对AFB1无非特异性吸附，以较小的柱体积完成净化是可行的。

本实用新型黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱具体应用(样品加标回收率测定)

4.1玉米、花生加标回收

4.1.1a.玉米粉加标：分别称取5.0g玉米粉样品两份，一份设为空白样，一份添加110ngAFB₁标样设为加标样(加标浓度为22ng/g)，加入1g NaCl，再加入25mL 70％甲醇-水，振荡30min，过滤收集滤液。取10mL滤液加入20mL水混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，取15mL过柱。

4.1.1b.花生油样品加标：分别称取5.0g花生油样品两份，一份设为空白样，一份添加110ngAFB₁标样设为加标样(加标浓度为22ng/g)，加入1g NaCl，再加入25mL 70％甲醇-水，振荡30min，过滤收集滤液。取10mL滤液加入20mL水混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，取15mL过柱。

4.1.2净化：

按照实施例3c步骤进行样品过亲和柱净化，分别得试样洗脱液2份，用HPLC测定AFB₁含量，按照下述公式计算样品加标回收率：

4.1.3色谱条件： 

色谱柱：C18柱(100mm×4.6mm×5μm)

流动相：52％甲醇-水

流速：0.8mL/min

荧光检测器：激发波长365nm发射波长440nm，光化学衍生 

柱温：40℃

进样量：10μL

表1.玉米花生油样品过亲和柱液相测定结果

4.2酱油样品加标 

4.2.1加标、提取：分别称取5.0g酱油样品两份。一份设为空白样，一份添加100ng AFB₁标样设为加标样(加标浓度为20ng/g)，加入0.25g NaCl，加入80％甲醇-水至10mL，振荡30min，过滤收集滤液。

取10mL滤液加入40mL水稀释混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，调pH至7.0后取10mL混合液过柱。

4.2.2按照实施例3c步骤进行样品过亲和柱净化，分别得试样洗脱液2份。

4.2.3柱前化学衍生：准确吸取100μL洗脱液或者标准溶液(44ng/ml)于刻度离心管中，氮气吹干；加入2ml正己烷、1.0ml三氟乙酸，振荡1min，静置10min，氮气吹干；准确移取1.0ml乙腈水(85+15)溶解混匀，过0.45μm滤膜，待测。

4.2.4色谱条件

色谱柱：C18柱(250mm×4.60mm×5μm，Luna 100A)，荧光检测器(Agilent1100)

流动相：乙腈-水，梯度洗脱，乙腈的浓度从25％到35％再到25％

流速：1.0mL/min

荧光检测器：激发波长360nm发射波长440nm

进样量：20μL

柱温：30℃

表2.酱油样品过亲和柱液相测定结果

从以上数据可以看出，玉米粉、花生油、酱油几个样品回收率均在85％以上，表明本实用新型亲和柱载体

制备的方法性能稳定、结果可靠、可用于样品中黄曲霉毒素B₁分离、净化的要求。

5.本实用新型应用流程

应用本实用新型制得的黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱进行样品净化过程流程如图7所示。

使用时样品提取液液加入免疫亲和柱，目标物黄曲霉毒素B₁与单抗结合，经过洗涤除去干扰物，最后洗脱结合的黄曲霉毒素B₁，用于后续检测。

Claims (8)

1.一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱包括柱管(1)、上筛板(2)、下筛板(3)、黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料(4)，所述上筛板(2)和下筛板(3)设于柱管(1)内部，所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料(4)填充于上筛板(2)和下筛板(3)间，所述柱管(1)底部设有收窄部分，所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱还设有下堵头(6)。

2.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料(4)其固相载体为重组蛋白A琼脂糖凝胶。

3.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，所述柱管(1)直径为7.5mm，所述柱管(1)内径为5.0mm，所述柱管长为(1)66.0mm,所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和凝胶填料(4)体积为250ul，所述上筛板(2)和下筛板(3)存在于柱管内部,所述黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱顶部还设有凸缘(5)。

4.根据权利要求3所述的一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，柱管(1)底部收窄部分的管长为10mm，所述柱管(1)底部收窄部分上部为倒锥型下部为直径4mm直管。

5.根据权利要求4所述的一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，所述柱管顶部还设有上盖(7)，所述上盖(7)内部为管状，所述上盖(7)内部管状的下端封闭。

6.根据权利要求5所述的一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，柱管(1)为透明PE塑料，所述上盖(7)为柔性塑料。

7.根据权利要求1～6任一所述的一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，所述柱管(1)内壁设有环槽(8)，所述上筛板(2)设于所述环槽(8)内。

8.根据权利要求1～6任一所述的一种黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，其特征在于，所述柱管内壁设有限位环(9)，所述上筛板(2)设于所述限位环(9)下。