CN111579777A

CN111579777A - 一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质及其应用

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Publication number: CN111579777A
Application number: CN202010472314.7A
Authority: CN
Inventors: 张一平; 杨婷婷; 张海涛; 王红连; 华洵璐; 董曼佳; 陆廷瑾; 陆丽婷; 石文婷
Original assignee: JIANGSU SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH CO LTD
Current assignee: JIANGSU SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH CO LTD
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: CN111579777B

Abstract

一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质及其应用，属于免疫亲和层析及真菌毒素检测技术领域。本发明采用大粒径重组蛋白A琼脂糖凝胶作为固相载体，载体上的重组蛋白A与真菌毒素单克隆抗体定向结合，再通过双功能结合剂（DMP）将其交联，形成亲和介质；并采用该亲和介质进一步制备真菌毒素免疫亲和柱。制备所得柱子负载量加大，单抗利用率、稳定性和回收率提高，制备总成本下降；所述亲和柱顶部安装有转接头，可通过与柱管的连接而扩大上样体积。

Description

一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质及其应用

技术领域

本发明涉及一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质及其应用，属于免疫亲和层析及真菌毒素检测技术领域。

背景技术

真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，包括黄曲霉毒素、呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、伏马毒素、T-2毒素等。它们具有毒性强和污染频率高的特点，严重影响农作物产量，降低农产品、食品和饲料品质，造成巨大经济损失。人或动物摄入被真菌毒素污染的农产品和食品后，可引发多种中毒症状，对机体造成永久性损害。目前，真菌毒素已成为食品安全检测的重要内容。

免疫亲和柱是基于亲和介质上的抗体与抗原（待分析物）发生可逆特异性结合为原理，将分析物从样品中分离出来，同时完成净化与浓缩的目的。多项国家标准，例如GBT30955-2014、GBT30956-2014、GBT28716-2012等，均规定采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定饲料中的真菌毒素。因此，有必要开发出性能稳定、更高效的新型免疫亲和柱产品。

免疫亲和柱性能主要取决于作为填料的亲和介质。CN101241128A、CN103801110A和CN105771937A公开了亲和介质的随机偶联制备技术，即采用溴化氰、环氧氯丙烷或过碘酸钠活化琼脂糖凝胶载体，然后将抗体偶联到载体上。这种偶联方式是非特异性的，方向性是不可控制的，势必影响亲和柱纯化毒素的效率，增加非特异性吸附的风险，造成成本居高不下，产品不稳定。

CN104117227A、CN104415572A、CN104117229A和CN104181300A公开了一种亲和介质的定向偶联制备技术，其采用基因工程技术将链球菌细胞壁上的蛋白G基因克隆至大肠杆菌中，获得高表达的基因重组蛋白G，可特异性结合抗体的Fc端、而将Fab端游离在外，从而不影响抗体与抗原（待分析物）的结合能力。以此蛋白为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好、纯化效率高的特点。但这些专利均采用溴化氰或环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶，步骤繁琐，活化时间长，氧化过程复杂。

重组蛋白A是利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌的蛋白A基因，经生物工程技术生产出来的蛋白质。重组蛋白A含有一个C末端半胱氨酸残基，可单一位点直接固定于琼脂糖凝胶上，从而大大降低空间位阻效应，增强与抗体的结合能力；此外，相比于重组蛋白G仅含有2个位点能够与抗体Fc端结合，重组蛋白A则含有5个位点能够与抗体Fc端结合，从而提高抗体的结合载量。（田曙光，高红伟，李素波等. 利用重组蛋白A偶联的琼脂糖凝胶纯化α-半乳糖苷酶单克隆抗体[J]. 生物技术通讯，2007，18(3)︰460-462页。）经检索，国内还未见将重组蛋白A琼脂糖凝胶作为固相载体，用于制备亲和介质及其真菌毒素免疫亲和柱的专利报道。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质及其应用，制备的真菌毒素免疫亲和柱具有孔隙度大、流速快、不易堵塞的优点。

本发明的技术方案，一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质的制备方法，步骤如下：

（1）固相载体的准备：将重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤后，悬浮于同样的PBS缓冲液中；

（2）固相载体与抗体的偶联：

a、在室温下，将真菌毒素单克隆抗体与步骤（1）所述固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶按照体积比1︰20～25混合，在垂直混匀器中混匀1～3h；

b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3～4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，得反应物；

c、在步骤b所得反应物中加入5～15mL的0.1～0.3mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和15～25mg的二甲基庚二亚胺二乙酸盐（DMP）固体粉末，室温下，在垂直混匀器中混匀1～3h；

d、用10～30mL的0.1～0.3mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用20～40mL的40～60mmol/L的三乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混匀器中混匀4～6min；

e、用20～40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5～10mL、40～60mmol/L、pH3.0的甘氨酸-盐酸溶液，室温下，在垂直混匀器中混匀4～6min；

f、反应结束后，用10～30mL质量浓度为10%～30%乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的10%～30%乙醇-水重新悬浮，得到亲和介质混悬液。

步骤（1）所述重组蛋白A琼脂糖凝胶是粒径100～160μm范围内的大粒径凝胶。

步骤（2）所述真菌毒素单克隆抗体，是采用抗真菌毒素杂交瘤细胞株，经免疫小鼠后分泌所得。抗真菌毒素杂交瘤细胞株具体分为以下六种：

抗黄曲霉毒素B₁杂交瘤细胞株SW-1 E10，已由江苏省苏微微生物研究有限公司应用于黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱的制备，具体参见已公开发表的文献：龚燕，杨婷婷，莫晓嵩等.基于蛋白A-琼脂糖凝胶黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱的制备[J]. 食品科学，2015，36(10)︰216-220页。

抗呕吐毒素杂交瘤细胞株SW-3 G12，已由江苏省苏微微生物研究有限公司应用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物免疫亲和柱的制备，具体参见已公开发表的文献：董曼佳，杨婷婷，陆廷瑾等. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物免疫亲和柱的研制[J]. 粮食与食品工业，2018，25(2)︰73-79页。

抗玉米赤霉烯酮杂交瘤细胞株3D8，已由中国计量学院生命科学学院等单位应用于玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及其ELISA免疫分析，具体参见已公开发表的文献：李沐洁，张明洲，奚茜等. 玉米赤霉烯酮单克隆抗体制备及免疫分析[J]. 中国食品学报，2013，13(1)︰145-152页。

抗赭曲霉毒素杂交瘤细胞株D6，已由扬州大学兽医学院应用于赭曲霉毒素单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立，具体参见已公开发表的文献：周晓昕. 抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的研制及其ELISA检测方法的初步建立[D]. 扬州︰扬州大学，2007，16︰28页。

抗伏马毒素杂交瘤细胞株6H3，已由上海交通大学农业与生物学院应用于伏马毒素单克隆抗体的制备及其ELISA和竞争磁酶免疫检测方法的建立，具体参见已公开发表的文献：王雨晨. 伏马毒素B₁单克隆抗体的制备及多种免疫学检测方法的建立[D]. 上海︰上海交通大学，2011，26-43页。

抗T-2毒素杂交瘤细胞株2G7，已由中国农业科学院油料作物研究所等单位应用于T-2毒素单克隆抗体的制备并已鉴定，具体参见已公开发表的文献：张宁，李培武，张奇等.抗单端孢霉烯族T-2毒素单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 化学试剂，2014，36(1)︰4-8页。

步骤（2）所述真菌毒素单克隆抗体，是分别采用上述抗真菌毒素杂交瘤细胞株，经过体外培养、腹腔注射免疫小鼠、采集腹水、提取纯化而获得，具体方法步骤如下：

（1）腹水的制备：

a、在细胞培养前2周，取9～11周龄的雌性BALB/C小鼠，每只注射0.4～0.6mL石蜡预刺激，分笼做标记。将抗真菌毒素杂交瘤细胞株从冻存状态中取出，分别采用含10%～30%胎牛血清的DMEM培养基，25cm²培养瓶复苏2～4天，再采用含10%～20%小牛血清的DMEM培养基扩培至对数生长期及所需注射的细胞数量。

b、选取处于对数生长期的细胞，分别去掉培养液，换成无血清DMEM培养基，将培养瓶中贴壁细胞吹下，置入50mL灭菌离心管中，800rpm离心5min，去掉上清重新用DMEM悬起细胞，细胞计数板计数，再离心去上清，加入DMEM培养基，调整细胞数量为1×10⁵～10⁷/mL。每只小鼠细胞注射剂量为0.4～0.6mL。接种后小鼠在7～9天左右出现腹部膨大，在11～13天左右采集腹水，采用一次性收集，腹水经1500rpm离心5min，再4000rpm离心5min去细胞碎片，上清分装小瓶-20℃保存备用。

（2）腹水的纯化：

a、取-20℃保存的腹水，解冻后，4℃、10000rpm离心15min，去沉淀，记录腹水体积。用2～4倍腹水体积的醋酸钠缓冲液稀释，pH控制在3.5~5.5，温度保持在3~5℃，边搅拌边缓慢滴加正辛酸，添加量按未稀释腹水计30~50μL/mL。加完继续搅拌15 min，分装在离心管中，4℃静置3h。

b、4℃、10000rpm离心30 min。收集上清液，弃去沉淀，过0.45μm的滤膜。记录上清液体积，加入5～15倍浓缩的PBS缓冲液，加入量为上清液体积的1/9～1/11，4℃预冷，按250~300g/L上清液的量缓慢加入硫酸铵研磨粉末。加完继续磁力搅拌器搅拌30 min，4℃静置过夜。

c、4℃、12000rpm离心15min，收集沉淀，弃去上清液。在沉淀中缓慢加入130~170mmol/L的PBS溶液，加入量为搅拌后总体积的20%~30％；将溶解的抗体溶液转移至透析袋中，用150~250倍体积的PBS溶液在4℃磁力搅拌透析。每3h更换透析液，更换3次，得到纯化后的抗体过无菌0.22μm滤膜，-20℃冰箱保存。

以大粒径凝胶为载体的亲和介质的应用，将其应用于制备真菌毒素免疫亲和柱。包括只净化一种毒素的单一免疫亲和柱，如黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱、呕吐毒素免疫亲和柱、玉米赤霉烯酮免疫亲和柱、赭曲霉毒素免疫亲和柱、伏马毒素免疫亲和柱和T-2毒素免疫亲和柱，以及能同时净化多种真菌毒素的多合一免疫亲和柱，如黄曲霉毒素B₁-玉米赤霉烯酮-呕吐毒素三合一免疫亲和柱等。

所述真菌毒素免疫亲和柱包括柱管、上筛板、下筛板、亲和介质、下堵头和转接头；所述柱管内设有上筛板和下筛板，上筛板和下筛板之间填充亲和介质；所述柱管上端设有转接头，下端设有下堵头。

进一步地，所述转接头上设有凸缘，凸缘将转接头分隔为上下两部分，下端插入柱管中；上盖内部为管状，管状下端封闭，以确保柱管内装料不泄漏；使用时可剪通该封闭端，然后作为转接套头，与新的柱管连接，从而扩大上样体积；所述转接头采用的材料为柔性塑料。

所述真菌毒素免疫亲和柱的制备步骤具体为：

（1）沉降：取处理好的柱管、上筛板和下筛板，将下筛板垫好后，用移液枪加入550～800μL亲和介质，4℃沉降过夜；

（2）装柱：将上筛板及下堵头塞好后，在上筛板上的柱管中用质量浓度为10%～30%的乙醇-水密封，最后在柱管顶部装上转接头，2～8℃冰箱保存。

所述柱管为3mL柱管；所述柱管总长74.4mm，管身内径8.9 mm，管身长度64.6mm；或为1mL柱管；柱管总长66.3mm、管身内径5.7 mm、管身长度56.5mm。

本发明的有益效果：本发明采用粒径100～160μm范围内的重组蛋白A琼脂糖凝胶作为固相载体，偶联真菌毒素单克隆抗体，使制备的新型亲和介质具有较大的孔隙度，从而使样本过柱流速提高，过柱时间缩短，彻底解决了亲和柱的堵塞问题。

本发明采用的大粒径固相载体，其表面的重组蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可单一位点偶联于琼脂糖上，从而大大降低了空间位阻效应，增强了重组蛋白A与真菌毒素单抗IgG的结合能力。通过蛋白A自带的Fab片段与单抗的Fc片段发生特异性反应，使单抗的Fc端部位始终朝向蛋白A、而Fab端部位始终朝向外侧；进一步采用交联剂（DMP）分别与蛋白A的氨基和单抗的氨基结合，将单抗的F_C端牢固地系于蛋白A上，从而实现了蛋白A琼脂糖凝胶与单抗的定向结合。采用该定向偶联技术，单抗的结合容量比传统的随机偶联提高2～3倍，使得柱子的负载量加大（较小的柱床体积即可完成净化过程）、单抗利用率提高、制备总成本下降；同时还降低了抗体有效空间位点被占据或失活的可能，保证了单抗偶联后的活性，减少了非特异性吸附，使得柱子的稳定性和回收率得到提高。

本发明的新型真菌毒素免疫亲和柱，在其柱管的顶端加装有一个以柔性塑料为材质的转接头，该装置集成了上盖与转接两大功能，使用简单方便。储藏与运输时，可确保柱管内装料不泄漏；使用时剪通内部管状的封闭端，作为转接套头与新柱管连接，从而可扩大上样体积。

附图说明

图1为本发明应用原理示意图。

图2为本发明定向偶联反应示意图。

图3为传统随机偶联示意图。

图4为本发明免疫亲和柱结构示意图。

附图标记说明：1、柱管；2、上筛板；3、下筛板；4、亲和介质；5、凸缘；6、下堵头；7、转接头。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，除真菌毒素单克隆抗体外，均可从商业途径购买。黄曲霉毒素B₁单克隆抗体与呕吐毒素单克隆抗体，分别由杂交瘤细胞株SW-1 E10和SW-3 G12分泌产生。玉米赤霉烯酮单克隆抗体、赭曲霉毒素单克隆抗体、伏马毒素单克隆抗体与T-2毒素单克隆抗体，分别由杂交瘤细胞株3D8、D6、6H3和2G7分泌产生。

本发明采用的细胞株包括但不限于上述细胞株，属于所述真菌毒素大类的细胞株均可以应用于本发明。

重组蛋白A琼脂糖凝胶，购自GE公司，平均粒径：130μm。

二甲基庚二亚胺二乙酸盐（DMP），购自sigma公司，CAS号：58537-94-3，纯度：≥98.0 %。

柱管，购自深圳逗点生物技术有限公司，规格型号：3mL柱或1mL柱。

实施例1：真菌毒素单克隆抗体的制备

（1）腹水的制备

a、在细胞培养前2周，取10周龄的雌性BALB/C小鼠，每只注射0.5mL石蜡预刺激，分笼做标记。将抗真菌毒素杂交瘤细胞株从冻存状态中取出，分别采用含20%胎牛血清的DMEM培养基，25cm²培养瓶复苏3天，再采用含15%小牛血清的DMEM培养基扩培至对数生长期及所需注射的细胞数量。

b、选取处于对数生长期的细胞，分别去掉培养液，换成无血清DMEM培养基，将培养瓶中贴壁细胞吹下，置入50mL灭菌离心管中，800rpm离心5 min，去掉上清重新用DMEM悬起细胞，细胞计数板计数，再离心去上清，加入DMEM培养基，调整细胞数量为1×10⁶/mL。每只小鼠细胞注射剂量为0.5mL。接种后小鼠在8天左右出现腹部膨大，在12天左右采集腹水，采用一次性收集，腹水经1500rpm离心5 min，再4000rpm离心5 min去细胞碎片，上清分装小瓶-20℃保存备用。

（2）腹水的纯化：a、取-20℃保存的腹水，解冻后，4℃、10000rpm离心15 min，去沉淀，记录腹水体积。用3倍腹水体积的醋酸钠缓冲液稀释，pH控制在4.5，温度保持在4℃，边搅拌边缓慢滴加正辛酸，添加量按未稀释腹水计40μL/mL。加完继续搅拌15 min分装在离心管中，4℃静置3h。

b、4℃、10000rpm离心30min。收集上清液，弃去沉淀，过0.45μm的滤膜。记录上清液体积，加入10倍浓缩的PBS缓冲液，加入量为上清液体积的1/10，4℃预冷，按277g/L上清液的量缓慢加入硫酸铵研磨粉末。加完继续磁力搅拌器，搅拌30 min，4℃静置过夜。

c、4℃、12000rpm离心15min，收集沉淀，弃去上清液。在沉淀中缓慢加入150mmol/L的PBS溶液，加入量为搅拌后总体积的25％；将溶解的抗体溶液转移至透析袋中，用200倍体积的PBS溶液在4℃磁力搅拌透析。每3h更换透析液，更换3次，得到纯化后的抗体过无菌0.22μm滤膜，-20℃冰箱保存。

实施例2：新型亲和介质的制备

（1）固相载体的准备：将保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤后，悬浮于同样的PBS缓冲液中。

（2）固相载体与抗体的偶联：

a、在室温下，将实施例1获得的真菌毒素单克隆抗体与步骤（1）中的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶按照1︰21体积比混合，在垂直混匀器中混匀2h。

b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3.5倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，得反应物。

c、然后在步骤b所得反应物中加入10mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和20mg的二甲基庚二亚胺二乙酸盐（DMP）固体粉末，室温下，在垂直混匀器中混匀2h。

d、用20mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用30mL的50mmol/L的乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混匀器中混匀5 min。

e、用30mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入8mL、50mmol/L、pH3.0的甘氨酸-盐酸溶液，室温下，在垂直混匀器中混匀5 min。

f、反应结束后，用20mL质量浓度为20%乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的20%乙醇-水重新悬浮，得到混悬液。

上述偶联方法属于定向偶联技术，即通过重组蛋白A自带的Fab片段与真菌毒素单克隆抗体的Fc片段发生特异性反应，实现了单抗与重组蛋白A琼脂糖凝胶的定向结合；进一步采用交联剂（DMP）分别与重组蛋白A的氨基和抗体的氨基结合，从而将抗体的FC端牢固地系于重组蛋白A上。采用该定向偶联技术，使得亲和介质表面的单抗Fc端始终朝向重组蛋白A、而Fab端始终朝向与分析物相结合的外侧，见图2。

而传统的随机偶联技术是采用单抗与溴化氰活化的琼脂糖凝胶直接偶联，由于这种结合方式是非特异性的，方向性是不可控制的，使得亲和介质表面既有FC端朝向外侧的单抗、也有Fab端朝向外侧的单抗；同时由于琼脂糖凝胶没有专一的蛋白结合位点，也就无法将单抗固定于凝胶表面，造成单抗易于脱落，见图3。

因此，本发明定向偶联固定抗体的结合容量能比传统的随机偶联提高2～3倍，使得较小的柱床体积下即可完成净化过程，并减少了非特异性吸附，有效克服了随机偶联带来的单抗用量大、抗原结合容量低、产品不稳定、回收率低等问题。

实施例3：真菌毒素免疫亲和柱的制备

具体结构如图4所示；包括柱管1、上筛板2、下筛板3、亲和介质4、下堵头6和转接头7；所述柱管1内设有上筛板2和下筛板3，上筛板2和下筛板3之间填充亲和介质4；所述柱管1上端设有转接头7，下端设有下堵头6。

所述转接头7上设有凸缘5，凸缘5将转接头7分隔为上下两部分，下端插入柱管1中；所述转接头7内部为管状，管状下端封闭。

所述转接头7材料为柔性塑料。

具体制备过程如下：

（1）沉降：取处理好的柱管1、上筛板2和下筛板3，将下筛板3垫好后，用移液枪加入600μL实施例2制备的新型亲和介质混悬液4，4℃冰箱沉降过夜。

（2）装柱：将上筛板3及下堵头6塞好后，用质量浓度为20%的乙醇-水密封，注于上筛板2和转接头7之间；最后在柱管顶部装上实施例3制备的转接头7，4℃冰箱保存。

制备所得真菌毒素免疫亲和柱，使用时处理过程原理如图1所示：首先，含有分析物（真菌毒素）的样品提取液加入免疫亲和柱中，真菌毒素相当于抗原，因含有可被抗体识别的特征决定簇，能与亲和介质上的高纯度抗体发生免疫特异性结合而驻留在柱上，而样品提取液中的各种干扰物因不能与抗体结合而流出柱外；然后采用合适的淋洗液冲洗柱子，进一步将柱内残留的干扰物去除干净；最后选择单抗耐受力强、毒素溶解度大的溶剂洗脱柱子，将分析物（真菌毒素）从亲和介质上洗脱下来，从而获得高度纯化的目标样液，可直接用于色谱/质谱分析。注：每次使用完之后，还可以采用缓冲液冲洗的方法平衡再生，使免疫亲和柱可重复多次使用，从而既能降低分析成本，又对环境友好。

Claims

1.一种以大粒径凝胶为载体的亲和介质的制备方法，其特征在于步骤如下：

（2）固相载体与抗体的偶联：

f、反应结束后，用10～30mL质量浓度为10%～30%乙醇-水洗涤两次，最.后用等体积的10%～30%乙醇-水重新悬浮，得到亲和介质混悬液。

2.根据权利要求1所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述重组蛋白A琼脂糖凝胶是粒径100～160μm范围内的大粒径凝胶。

3.根据权利要求1所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述真菌毒素单克隆抗体是采用抗真菌毒素杂交瘤细胞株，经免疫小鼠后分泌所得。

4.根据权利要求3所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的制备方法，其特征在于：所述抗真菌毒素杂交瘤细胞株具体为抗黄曲霉毒素B₁杂交瘤细胞株、抗呕吐毒素杂交瘤细胞株、抗玉米赤霉烯酮杂交瘤细胞株、抗赭曲霉毒素杂交瘤细胞株、抗伏马毒素杂交瘤细胞株和抗T-2毒素杂交瘤细胞株。

5.以大粒径凝胶为载体的亲和介质的应用，其特征在于：将其应用于制备真菌毒素免疫亲和柱；其根据需要能够净化一种或多种真菌毒素。

6.根据权利要求5所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的应用，其特征在于所述真菌毒素免疫亲和柱包括柱管（1）、上筛板（2）、下筛板（3）、亲和介质（4）、下堵头（6）和转接头（7）；所述柱管（1）内设有上筛板（2）和下筛板（3），上筛板（2）和下筛板（3）之间填充亲和介质（4）；所述柱管（1）上端设有转接头（7），下端设有下堵头（6）。

7.根据权利要求6所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的应用，其特征在于：所述转接头（7）上设有凸缘（5），凸缘（5）将转接头（7）分隔为上下两部分，下端插入柱管（1）中；所述转接头（7）内部为管状，管状下端封闭。

8.根据权利要求7所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的应用，其特征在于：所述转接头（7）材料为柔性塑料。

9.根据权利要求5所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的应用，其特征在于：所述真菌毒素免疫亲和柱的制备步骤具体为：

（1）沉降：取处理好的柱管（1）、上筛板（2）和下筛板（3），将下筛板（3）垫好后，用移液枪加入550～800μL亲和介质（4），4℃沉降过夜；

（2）装柱：将上筛板（2）及下堵头（6）塞好后，在上筛板（2）上的柱管中用质量浓度为10%～30%的乙醇-水密封，最后在柱管（1）顶部装上转接头（7），2～8℃冰箱保存。

10.根据权利要求5所述以大粒径凝胶为载体的亲和介质的应用，其特征在于：所述柱管（1）为3mL柱管；所述柱管（1）总长74.4mm，管身内径8.9 mm，管身长度64.6mm；或为1mL柱管；柱管（1）总长66.3mm、管身内径5.7 mm、管身长度56.5mm。