CN114773484B - 吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用 - Google Patents

吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114773484B
CN114773484B CN202210106834.5A CN202210106834A CN114773484B CN 114773484 B CN114773484 B CN 114773484B CN 202210106834 A CN202210106834 A CN 202210106834A CN 114773484 B CN114773484 B CN 114773484B
Authority
CN
China
Prior art keywords
receptor
nano
cytokine
assembly
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210106834.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114773484A (zh
Inventor
王均
沈松
范亚楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Publication of CN114773484A publication Critical patent/CN114773484A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114773484B publication Critical patent/CN114773484B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6873—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an immunoglobulin; the antibody being an anti-idiotypic antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A61K47/6937—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol the polymer being PLGA, PLA or polyglycolic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/146—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L67/00—Compositions of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L67/04—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids, e.g. lactones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)

Abstract

本发明涉及重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用，所述纳米组装体由至少一种重组融合蛋白与疏水性可降解聚酯或其衍生物通过疏水相互作用结合构成，所述重组融合蛋白包括具有疏水区域的蛋白和细胞因子受体，所述疏水区域的蛋白和细胞因子受体直接连接或者通过连接子连接而成，每种不同的重组融合蛋白中的细胞因子受体不同。本发明所述纳米组装体表面的至少一种细胞因子受体可以在体内外快捷、高效地结合一种或多种类型的细胞因子，达到快速控制炎症的目的。本发明所述的这种结构的纳米组装体，多种细胞因子受体的功能不受相互间的影响。本发明首次将能高效吸附和诱捕细胞因子的纳米组装体作为药物应用于炎性疾病的治疗。

Description

吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体是涉及吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用。
背景技术
细胞因子(cytokine)是一类由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。作为细胞间通讯的重要介质，细胞因子在机体病理和生理活动中发挥着多种作用，例如慢性/急性炎症反应、自身免疫性疾病和肿瘤形成与发展等，清除细胞因子或抑制其活性是治疗炎症相关疾病的重要策略之一。临床数据表明，阻断细胞因子作用的蛋白质类药物或小分子药物可有效缓解类风湿关节炎、银屑病和克罗恩氏炎症性肠病等自身免疫性疾病患者的病情。例如，中和肿瘤坏死因子的单克隆抗体英夫利昔单抗(Remicade，Infliximab)及干扰肿瘤坏死因子功能的融合蛋白药物依那西普可以减少类风湿关节炎的炎症和关节破坏程度。
尽管目前在研究临床使的用抗细胞因子生物制剂方面取得了一些进展，但是单一药物的治疗效果仍然不能令人满意，这主要是由于细胞因子交互作用的复杂性和细胞因子的多样性所导致的。例如，黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织过表达白细胞介素1β(IL1β)、白细胞介素10(IL10)及转化生长因子β(TGFβ)等多种肿瘤免疫抑制性细胞因子，这些细胞因子协同抑制抗体提呈细胞、细胞毒性T细胞的功能，进而促进肿瘤的发展、恶化和转移。又如，风湿性关节炎患者的软骨基质中白细胞介素1β(IL1β)及肿瘤坏死因子α(TNFα)均异常高表达。有研究表明，同步清除两种或多种细胞因子有望达到更高效的疾病治疗效果。例如，加州大学圣地亚哥分校张良方教授课题组提取高表达TNFαR和IL1βR的中性粒细胞的细胞膜并包覆于PLGA纳米颗粒表面，细胞膜包覆型纳米颗粒可以有效中和促炎性细胞因子。实验结果显示，相较于TNFα单抗和IL1β单抗，该纳米颗粒能更有效地进而缓解和治疗小鼠类风湿性关节炎。又如，美国国立卫生研究院陈小元教授等课题组将单核/巨噬细胞THP1细胞的细胞膜包覆于颗粒上制备出含有丰富的IL-6、GM-CSF受体的纳米“诱饵”用于吸附炎症细胞因子。需要指出的是，细胞膜包覆型纳米颗粒比靶向细胞因子的单抗药物吸附促炎性细胞因子能力更强的重要原因之一可能是单一颗粒表面存在多种、多个细胞因子受体，即这些细胞因子受体呈现“多价态”，赋予其更强的捕获细胞因子的能力。
上述研究表明，将表达细胞因子受体的细胞膜包覆于纳米材料表面后能够高效吸附两种或多种细胞因子受体，进而达到缓解或治疗炎症相关疾病的目的。然后，某种细胞膜上表达的细胞因子受体的种类有限，且表达丰度和比例不确定(如中性粒细胞膜上高表达IL1βR而低表达IL10R)，这在一定程度上限制了这类纳米颗粒的应用范围和临床转化。如果能利用基因工程技术表达出多种细胞因子受体或其功能片段或重组融合蛋白，借助纳米技术选择性地将两种或多种细胞因子受体或其衍生物进行组合，进而构筑出“多价化”和“多特异性化”细胞因子吸附载体，有望实现恶性肿瘤、免疫相关疾病等高效化和个性化治疗。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供的重组融合蛋白，该重组融合蛋白可用于组装纳米载体，用于吸附至少一种细胞因子。
用于吸附至少一种细胞因子的重组融合蛋白，包括具有疏水区域的蛋白和细胞因子受体，所述疏水区域的蛋白和细胞因子受体直接连接或者通过肽接头连接而成。
本发明的目的之二在于提供一种用于吸附至少一种细胞因子并阻断其功能的纳米组装体，其制备方法简单，可以用于吸附至少一种细胞因子，而彼此不受影响。
实现上述目的技术方案如下。
一种用于吸附至少一种细胞因子纳米组装体，由包括至少上述一种重组融合蛋白与疏水性可降解聚酯或其衍生物通过疏水相互作用结合构成，每种不同的重组融合蛋白中的细胞因子受体不同。
本发明的第三目的是提供一种上述的纳米组装体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述重组融合蛋白与水或水溶液混合，得水相；将所述疏水性可降解聚酯及其衍生物与有机溶剂混合，得油相；
(2)将步骤(1)所述水相和油相制备成水包油的乳剂；
(3)将所述乳剂分离纯化，得纳米组装体。
本发明的第四目的是提供上述的融合蛋白在制备吸附至少一种细胞因子的纳米组装体中的应用。
还提供上述纳米组装体作为免疫治疗药物在恶性肿瘤、免疫相关疾病治疗中的应用。
或上述纳米组装体制备吸附至少一种细胞因子的免疫治疗药物或者免疫治疗剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过选择疏水性可降解聚酯或其衍生物和特定的具有疏水结构域的蛋白的重组融合蛋白制备用于吸附细胞因子的纳米颗粒，疏水性可降解聚酯或其衍生物通过疏水相互作用与重组融合蛋白的疏水结构域进行缠绕组装，具有优异的稳定性。纳米组装体表面的至少一种细胞因子受体可以在体内外快捷、高效地结合一种或多种类型的细胞因子，达到快速控制炎症的目的，并且细胞因子受体的种类、比例等可调节，可满足不同疾病的治疗需求。本发明所述的这种结构的纳米组装体，多种细胞因子受体的功能不受相互间的影响。本发明首次将能高效吸附和诱捕细胞因子的纳米组装体作为药物应用于炎性疾病的治疗。
附图说明
图1为pPICZαA-融合蛋白基因载体构建流程示意图。
图2为PCR扩增mIL1R、mIL6R和MSA片段。
图3为Overlap连接mIL1R-MSA、mIL6R-MSA和mTNFR2-MSA。
图4为双酶切mTNFR2-MSA基因片段。
图5为PCR鉴定大肠杆菌中目的基因-酵母菌载体。
图6为平板筛选酵母重组子。
图7为PCR鉴定酵母重组子。
图8为白蛋白融合蛋白的SDS-PAGE分析。
图9为白蛋白融合蛋白的Western Blot分析。
图10为ELISA检测mTNFR2-MSA对mTNF的亲和力。
图11为ELISA检测mTGFβR2-MSA对mTGFβ的亲和力。
图12为纳米粒度仪表征NPmTNFR2-MSA纳米组装体的粒径。
图13为纳米粒度仪表征NPmTGFβR2-MSA纳米组装体的粒径。
图14为纳米粒度仪表征NPmTNFR2-MSA/mIL6R-MSA纳米组装体的粒径。
图15为扫描电镜表征NPmTNFR2-MSA/mIL6R-MSA纳米组装体的形貌。
图16为NPmTNFR2-MSA/mIL6R-MSA纳米组装体在不同溶液中的稳定性。
图17为验证细胞因子纳米组装体具备结合细胞因子的能力。
图18为细胞水平验证NPmTNFR2-MSA/mIL6R-MSA纳米组装体结合两种细胞因子的能力。
图19本发明所述重组融合蛋白、纳米组装体的构成原理示意图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明一实施方式中涉及一类融合蛋白，包括具有疏水区域的蛋白通过肽接头或直接与细胞因子受体连接而成；所述细胞因子受体包括细胞因子受体胞外段或其胞外片段(受体功能区域)。
所述蛋白融合细胞因子受体片段，其与所吸附的细胞因子的功能部位一致，因此所述蛋白融合细胞因子受体功能片段与所需要吸附的细胞因子能够非共价键结合，其具有相同的种属来源。
在其中一些实施例中，蛋白融合受体包括细胞因子受体和其功能片段，所述细胞因子受体包括但不限于：小鼠来源和人来源的细胞因子受体。在其中一些实施例中，细胞因子受体功能片段的种类包括但不局限于白细胞介素1受体(IL1R)、白细胞介素2受体(IL2R)、白细胞介素3受体(IL3R)、白细胞介素4受体(IL4R)、白细胞介素5受体(IL5R)、白细胞介素6受体(IL6R)、白细胞介素7受体(IL7R)、白细胞介素9受体(IL9R)、白细胞介素10受体(IL10R)、白细胞介素11受体(IL11R)、白细胞介素15受体(IL15R)、白细胞介素19受体(IL19R)、白细胞介素19受体(IL19R)、白细胞介素20受体(IL20R)、白细胞介素21受体(IL21R)、白细胞介素24受体(IL24R)、集落刺激因子1受体(CSF-1R)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)、肿瘤坏死因子α受体(TNFαR)、转化生长因子-β家族受体(TGFβR)、干扰素γ受体(IFNγR)。进一步优选白细胞介素受体、干扰素受体、肿瘤坏死因子受体等。在其中一些实施例中，本发明的细胞因子受体为天然蛋白质的胞外段。
每种重组融合蛋白具有一种细胞因子受体，不同的细胞因子受体决定重组融合蛋白的不同种。
重组融合蛋白的细胞因子受体或其功能片段与所需要吸附的细胞因子能够非共价键结合；所吸附的细胞因子与所述融合蛋白具有相同的种属来源。融合蛋白形成的纳米组装体可以特异性结合细胞因子。
所述具有疏水区域的蛋白至少具有三个疏水区域；优选至少具有五个疏水区域，更优选是白蛋白、球蛋白和胞壁蛋白。
所述蛋白至少具有细胞因子受体和血清白蛋白片段，其能与疏水性可降解及其衍生物通过疏水相互作用结合，在本发明中，其为白蛋白，即血清白蛋白，可以是来自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白、鸡卵清白蛋白的至少一种。
在其中一些优选的实施例中，所述融合蛋白包含白蛋白和细胞因子受体蛋白的全长或部分片段，或上述经取代、缺失、突变和/或添加一个或多个天然存在的、非天然存在的或修饰的氨基酸的蛋白。
在其中的一些实施例中，所述融合蛋白中，是由小鼠血清白蛋白MSA与小鼠细胞因子受体组成，或由人血清白蛋白HSA与人细胞因子受体组成；所述小鼠血清白蛋白MSA的序列如SEQ ID No.1所示，小鼠细胞因子受体mTNFRII的序列如SEQ ID No.2所示，小鼠细胞因子受体mIL1R的序列如SEQ ID No.3所示。
肽接头可以是常规用于连接多肽的接头序列，其能够连接两个多肽并将其自然折叠成所期望结构，通常其是具有一段有疏水性和一定伸展性的短肽，在本发明中的目的是可将融合的两种蛋白分开，以缓解二者相互干扰作用。所述肽接头可以是柔性的。在某些实施方案中，柔性的肽接头可能是有利的，其能够连接两种蛋白/多肽成分，并且保持其各自的活性和功能。此类肽接头包括但不限于，(GGGGS)n。在其中一些实施例中，该肽接头使用[GlyGlyGlyGlySer]n，n为0-4的整数。当n为0时，即意味着融合蛋白中不需要肽接头，具有疏水区域的蛋白和细胞因子受体可直接连接。肽接头将第一组分的羧基末端连接至第二组分的氨基末端，肽接头可包含任何数量的氨基酸。在一些方式中，所述融合蛋白从N端到C端依次为血清白蛋白、肽接头和蛋白质受体。
在其中一些方式中，所述纳米组装体由至少两种所述融合蛋白构成，优选为两种，或者三种。
本发明的一些实施例中，涉及到所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤实现：(a)构建重组毕赤酵母细胞系；(b)重组融合蛋白在其生长培养基中经4天诱导表达，表达量达30mg/L；(c)纯化步骤(b)表达的蛋白质。
编码各种具有疏水结构域的蛋白，例如血清白蛋白的多聚核苷酸和编码细胞因子受体的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等，如从人肝胎cDNA文库获得。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。编码IL1RA的多聚核苷酸可以用人工合成的方式获得。编码血清白蛋白的多聚核苷酸和编码细胞因子受体的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，再将粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因；也可以通过overlap PCR的方法获得融合基因片段。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。表达融合蛋白的宿主可以是酵母菌、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等。融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是酵母α-factor信号肽或天然的血清白蛋白的信号肽，或这两种信号肽的类似物。更优选的用酵母α-factor信号肽，用该信号肽时融合蛋白表达水平较高。融合蛋白或多肽也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。
转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔、制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取基因组，然后PCR方法鉴定，或者，细胞培养上清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗血清白蛋白或抗的抗体检测。
可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选为生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)的生长，第二阶段主要用于表达产物。
通过离心收集细胞培养基，切向流装置浓缩培养基体积后，可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
本发明的一些实施例中，涉及到一种用于吸附至少一种细胞因子的纳米组装体，所述纳米组装体由上述至少一种融合蛋白与疏水性可降解聚酯及其衍生物通过疏水相互作用结合构成，每种不同的重组融合蛋白，其中细胞因子受体必不同，而其中的具有疏水区域的蛋白可以不同，也可以相同。其构建原理参见图19。
所述疏水性可降解聚酯及其衍生物可是目前已知的可降解的生物材料，也包括将来进一步研发产生的新的可降解的生物材料，其能与上述融合蛋白中的蛋白部分的疏水区域结合。所述聚酯为脂肪族聚酯或其衍生物，或聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯或其衍生物。
在其中一些实施例中，所述脂肪族聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚(乙交酯-co-丙交酯)和聚己内酯中的至少一种；或所述聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯为聚乙二醇修饰的聚丙交酯、聚乙二醇修饰的聚乙交酯、聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)和聚乙二醇修饰的聚己内酯中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述脂肪族聚酯为聚丙交酯；所述聚丙交酯为左旋聚丙交酯、右旋聚丙交酯或外消旋聚丙交酯；所述聚丙交酯的端基为酯基、羧基和羟基中的至少一种。
优选聚丙交酯的端基为酯基，其具有更强的疏水性。
在其中一些实施例中，所述聚丙交酯为左旋聚丙交酯，所述左旋聚丙交酯的端基为酯基。
在其中一些实施例中，所述左旋聚丙交酯的分子量范围为7200～1100000道尔顿，更进一步优选为137000～240000道尔顿。
在其中一些实施例中，纳米组装体为纳米颗粒，其粒径范围为80～150nm，优选范围为80～100nm。
本发明一些实施例中，涉及到一种上述的纳米组装体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述融合蛋白与水或水溶液混合，得水相；将所述疏水性可降解聚酯及其衍生物与有机溶剂混合，得油相；
(2)将步骤(1)所述水相和油相制备成水包油的乳剂；
(3)将所述乳剂分离纯化，得纳米组装体。
在其中一些实施例中，上述纳米颗粒的制备过程中不含额外的稳定剂。
在其中一些实施例中，纳米颗粒可以通过离心、切向流透析(通过切向流装置在切向剪切力的作用下透析)和排除色谱(根据纳米颗粒和游离蛋白的分子量大小)中的至少一种方法分离游离的蛋白和纳米颗粒。
在其中一些实施例中，将所述水相和油相制备成水包油的乳剂的方法包括超声乳化或高压均质乳化或微流控。
在其中一些实施例中，所述聚酯或其溶液与重组融合蛋白的重量比为1:0.1～1:30，优选为1:5～25，优选为1:5～15，更优选为1:7～11。
或上述水相与有机相的体积比为1～10:1，优选为6～10:1。
进一步地，所述重组融合蛋白在水相中的浓度为0.5～3mg/ml；所述聚酯在油相中的浓度为1～3mg/ml。
在其中一些实施例中，所吸附的细胞因子是至少一种，所述至少一种细胞因子包括有至少一种炎性细胞因子，或炎性细胞因子功能片段，优选包括两种或以上的细胞因子受体或其功能片段。
所述至少一种细胞因子受体是TNFαRII和IL1R。优选为，所述TNFαRII-蛋白(MSA)和IL1R-蛋白(MSA)的量1～10:1～10，为1～5:1～5，更优选为1：1～3。
本发明一实施方式中，将上述的纳米组装体应用于免疫治疗药物。
在其中一些实施例中，所述免疫治疗药物为肿瘤免疫治疗药物或自身免疫疾病治疗药物。
在其中一些实施例中，上述纳米组装体在制备吸附炎性细胞因子的药物中的应用。重组融合蛋白中的所述细胞因子受体用于吸附肿瘤或自身免疫疾病相关细胞因子。
所述炎性细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等。
所述免疫治疗药物为肿瘤免疫治疗药物或自身免疫疾病治疗药物。
在其中一些实施例中，本发明所述纳米组装体可由经FDA批准的高分子聚酯和白蛋白融合蛋白组装而成，具有优异的生物相容性。
本发明所述融合蛋白的白蛋白-细胞因子受体融合蛋白是通过受体-配体特异性识别的方式结合细胞因子，其特异性封闭细胞因子功能区、显著影响细胞因子对下游信号的传导，为免疫治疗的发展提供了一种全新思路的简便结构设计。
此外，本发明的纳米组装体还能使得细胞因子受体段朝外暴露，从而可以最大程度地保留细胞因子受体的功能。
血清白蛋白是含有三个同源的α-螺旋结构域的螺旋状蛋白，三个结构域聚集在一起形成不对称的心形结构。血清白蛋白具有七个疏水结构域，结构域是由疏水性和带正电荷的基团所形成的袋状结构，每个结构域中包含两个亚级结构域，每个亚级结构域又由6个螺旋结构所组成的。
聚乳酸，又称聚丙交酯，polylactide,；polylactic acid，(C3H4O2)n是以乳酸为主要原料聚合得到的聚酯类聚合物，是一种新型的生物降解材料。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中所用到的相关序列。
MSA
GAAGCACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGTTGTGTGCCATTCCAAACCTCCGTGAAAACTATGGTGAACTGGCTGACTGCTGTACAAAACAAGAGCCCGAAAGAAACGAATGTTTCCTGCAACACAAAGATGACAACCCCAGCCTGCCACCATTTGAAAGGCCAGAGGCTGAGGCCATGTGCACCTCCTTTAAGGAAAACCCAACCACCTTTATGGGACACTATTTGCATGAAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCAGAACTTCTTTACTATGCTGAGCAGTACAATGAGATTCTGACCCAGTGTTGTGCAGAGGCTGACAAGGAAAGCTGCCTGACCCCGAAGCTTGATGGTGTGAAGGAGAAAGCATTGGTCTCATCTGTCCGTCAGAGAATGAAGTGCTCCAGTATGCAGAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTTAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTCTGAGCCAGACATTCCCCAATGCTGACTTTGCAGAAATCACCAAATTGGCAACAGACCTGACCAAAGTCAACAAGGAGTGCTGCCATGGTGACCTGCTGGAATGCGCAGATGACAGGGCGGAACTTGCCAAGTACATGTGTGAAAACCAGGCGACTATCTCCAGCAAACTGCAGACTTGCTGCGATAAACCACTGTTGAAGAAAGCCCACTGTCTTAGTGAGGTGGAGCATGACACCATGCCTGCTGATCTGCCTGCCATTGCTGCTGATTTTGTTGAGGACCAGGAAGTGTGCAAGAACTATGCTGAGGCCAAGGATGTCTTCCTGGGCACGTTCTTGTATGAATATTCAAGAAGACACCCTGATTACTCTGTATCCCTGTTGCTGAGACTTGCTAAGAAATATGAAGCCACTCTGGAAAAGTGCTGCGCTGAAGCCAATCCTCCCGCATGCTACGGCACAGTGCTTGCTGAATTTCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTGGTCAAAACCAACTGTGATCTTTACGAGAAGCTTGGAGAATATGGATTCCAAAATGCCATTCTAGTTCGCTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACCCCAACTCTCGTGGAGGCTGCAAGAAACCTAGGAAGAGTGGGCACCAAGTGTTGTACACTTCCTGAAGATCAGAGACTGCCTTGTGTGGAAGACTATCTGTCTGCAATCCTGAACCGTGTGTGTCTGCTGCATGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCATGTTACCAAGTGCTGTAGTGGATCCCTGGTGGAAAGGCGGCCATGCTTCTCTGCTCTGACAGTTGATGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAAAGCTGAGACCTTCACCTTCCACTCTGATATCTGCACACTTCCAGAGAAGGAGAAGCAGATTAAGAAACAAACGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCC(SEQID No.1)
mIL1R
TTCACCACTCCAACAGTGGTGCACACAGGAAAGGTTTCTGAATCCCCCATTACATCGGAGAAGCCCACAGTCCATGGAGACAACTGTCAGTTTCGTGGCAGAGAGTTCAAATCTGAATTGAGGCTGGAAGGTGAACCTGTGGTTCTGAGGTGCCCCTTGGCACCTCACTCCGACATCTCCAGCAGTTCCCATAGTTTTCTGACCTGGAGTAAATTGGACTCTTCTCAGCTGATCCCAAGAGATGAGCCAAGGATGTGGGTGAAGGGTAACATACTCTGGATTCTGCCAGCAGTGCAGCAAGACTCTGGTACCTACATTTGCACATTCAGAAACGCATCCCACTGTGAGCAAATGTCTGTGGAACTCAAGGTCTTTAAGAATACTGAAGCATCTCTGCCTCATGTCTCCTACTTGCAAATCTCAGCTCTCTCCACCACCGGGTTACTAGTGTGCCCTGACCTGAAAGAATTCATCTCCAGCAACGCTGATGGAAAGATACAGTGGTATAAGGGCGCCATACTCTTGGATAAAGGCAATAAGGAATTTCTGAGTGCAGGAGACCCCACACGCCTATTGATATCCAACACGTCCATGGACGATGCAGGCTATTACAGATGTGTTATGACATTTACCTACAATGGCCAGGAATACAACATCACTAGGAATATTGAACTCCGGGTCAAAGGAACAACCACGGAACCCATCCCTGTGATCATTTCTCCCCTGGAGACAATACCAGCATCATTGGGGTCAAGACTGATAGTCCCGTGCAAAGTGTTTCTGGGAACTGGTACATCTTCCAACACCATTGTGTGGTGGTTGGCTAACAGCACGTTTATCTCGGCTGCTTACCCAAGAGGCCGTGTGACCGAGGGGCTACACCACCAGTACTCAGAGAATGATGAAAACTATGTGGAAGTGTCGCTGATTTTTGATCCAGTCACAAGGGAGGATCTGCATACAGATTTTAAATGTGTTGCCTCGAATCCACGGAGTTCTCAGTCACTCCATACCACAGTCAAAGAA(SEQ ID No.2)
IL6Rα
CTGGTCCTCGGGAGCTGCCGCGCGCTGGAGGTGGCAAATGGCACAGTGACAAGCCTGCCAGGGGCCACCGTTACCCTGATTTGCCCCGGGAAGGAAGCAGCAGGCAATGTTACCATTCACTGGGTGTACTCTGGCTCACAAAACAGAGAATGGACTACCACAGGAAACACACTGGTTCTGAGGGACGTGCAGCTCAGCGACACTGGGGACTATTTATGCTCCCTGAATGATCACCTGGTGGGGACTGTGCCCTTGCTGGTGGATGTTCCCCCAGAGGAGCCCAAGCTCTCCTGCTTCCGGAAGAACCCCCTTGTCAACGCCATCTGTGAGTGGCGTCCGAGCAGCACCCCCTCTCCAACCACGAAGGCTGTGCTGTTTGCAAAGAAAATCAACACCACCAACGGGAAGAGTGACTTCCAGGTGCCCTGTCAGTATTCTCAGCAGCTGAAAAGCTTCTCCTGCCAGGTGGAGATCCTGGAGGGTGACAAAGTATACCACATAGTGTCACTGTGCGTTGCAAACAGTGTGGGAAGCAAGTCCAGCCACAACGAAGCGTTTCACAGCTTAAAAATGGTGCAGCCGGATCCACCTGCCAACCTTGTGGTATCAGCCATACCTGGAAGGCCGCGCTGGCTCAAAGTCAGCTGGCAGCACCCTGAGACCTGGGACCCGAGTTACTACTTGCTGCAGTTCCAGCTTCGATACCGACCTGTATGGTCAAAGGAGTTCACGGTGTTGCTGCTCCCGGTGGCCCAGTACCAATGCGTCATCCATGATGCCTTGCGAGGAGTGAAGCACGTGGTCCAGGTCCGTGGGAAGGAGGAGCTTGACCTTGGCCAGTGGAGCGAATGGTCCCCAGAGGTCACGGGCACTCCTTGGATAGCAGAGCCCAGGACCACCCCGGCAGGAATCCTCTGGAACCCCACACAGGTCTCTGTTGAAGACTCTGCCAACCACGAGGATCAGTACGAAAGTTCTACAGAAGCAACGAGTGTCCTCGCCCCAGTGCAAGAATCCTCGTCCATGTCCCTGCCC(SEQ ID No.3)
IL10R1
CTAGAATTCATTGCATACGGGACAGAACTGCCAAGCCCTTCCTATGTGTGGTTTGAAGCCAGATTTTTCCAGCACATCCTCCACTGGAAACCTATCCCAAACCAGTCTGAGAGCACCTACTATGAAGTGGCCCTCAAACAGTACGGAAACTCAACCTGGAATGACATCCATATCTGTAGAAAGGCTCAGGCATTGTCCTGTGATCTCACAACGTTCACCCTGGATCTGTATCACCGAAGCTATGGCTACCGGGCCAGAGTCCGGGCAGTGGACAACAGTCAGTACTCCAACTGGACCACCACTGAGACTCGCTTCACAGTGGATGAAGTGATTCTGACAGTGGATAGCGTGACTCTGAAAGCAATGGACGGCATCATCTATGGGACAATCCATCCCCCCAGGCCCACGATAACCCCTGCAGGGGATGAGTACGAACAAGTCTTCAAGGATCTCCGAGTTTACAAGATTTCCATCCGGAAGTTCTCAGAACTAAAGAATGCAACCAAGAGAGTGAAACAGGAAACCTTCACCCTCACGGTCCCCATAGGGGTGAGAAAGTTTTGTGTCAAGGTGCTGCCCCGCTTGGAATCCCGAATTAACAAGGCAGAGTGGTCGGAGGAGCAGTGTTTACTTATCACGACGGAGCAGTATTTCACTGTGACCAACCTGAGCATC(SEQ ID No.4)
TNFR2
GTGCCCGCCCAGGTTGTCTTGACACCCTACAAACCGGAACCTGGGTACGAGTGCCAGATCTCACAGGAATACTATGACAGGAAGGCTCAGATGTGCTGTGCTAAGTGTCCTCCTGGCCAATATGTGAAACATTTCTGCAACAAGACCTCGGACACCGTGTGTGCGGACTGTGAGGCAAGCATGTATACCCAGGTCTGGAACCAGTTTCGTACATGTTTGAGCTGCAGTTCTTCCTGTACCACTGACCAGGTGGAGATCCGCGCCTGCACTAAACAGCAGAACCGAGTGTGTGCTTGCGAAGCTGGCAGGTACTGCGCCTTGAAAACCCATTCTGGCAGCTGTCGACAGTGCATGAGGCTGAGCAAGTGCGGCCCTGGCTTCGGAGTGGCCAGTTCAAGAGCCCCAAATGGAAATGTGCTATGCAAGGCCTGTGCCCCAGGGACGTTCTCTGACACCACATCATCCACTGATGTGTGCAGGCCCCACCGCATCTGTAGCATCCTGGCTATTCCCGGAAATGCAAGCACAGATGCAGTCTGTGCGCCCGAGTCCCCAACTCTAAGTGCCATCCCAAGGACACTCTACGTATCTCAGCCAGAGCCCACAAGATCCCAACCCCTGGATCAAGAGCCAGGGCCCAGCCAAACTCCAAGCATCCTTACATCGTTGGGTTCAACCCCCATTATTGAACAAAGTACCAAGGGTGGC(SEQ ID No.5)
mTGFβRII
ATCCCGCCGCACGTTCCCAAGTCGGATGTGGAAATGGAAGCCCAGAAAGATGCATCCATCCACCTAAGCTGTAATAGGACCATCCATCCACTGAAACATTTTAACAGTGATGTCATGGCCAGCGACAATGGCGGTGCGGTCAAGCTTCCACAGCTGTGCAAGTTTTGCGATGTGAGACTGTCCACTTGCGACAACCAGAAGTCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACGGCCATCTGTGAGAAGCCGCATGAAGTCTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACAAGAACATTACTCTGGAGACGGTTTGCCACGACCCCAAGCTCACCTACCACGGCTTCACTCTGGAAGATGCCGCTTCTCCCAAGTGTGTCATGAAGGAAAAGAAAAGGGCGGGCGAGACTTTCTTCATGTGTGCCTGTAACATGGAAGAGTGCAACGATTACATCATCTTTTCGGAAGAATACACCACCAGCAGTCCCGAC(SEQ ID No.6)
引物：
MSA F
GGTGGTGGTGGTTCTGAAGCACACAAGAGT SEQ ID NO.7
MSAR TATTCTAGATTGGCTAAGGCGTC SEQ ID NO.8
IL1R2-F：CGCTCGAGAAAAGATTCACCACTCC SEQ ID No.9
IL1R2-MSAR：AGAACCACCACCACCTTCTTTGACTGTGG SEQ ID No.10
实施例中所用原料及来源：
mTNFR2-MSA、mIL1R2-MSA、mIL6R-MSA、mIL10R1-MSA、mTGFβR2-MSA融合蛋白：由重组酵母菌表达，经AKTA蛋白纯化仪纯化所得。融合蛋白中的肽接头为GGGGS。
聚乳酸PLA137K，分子量为137000Da、封端为酯基的左旋聚乳酸：购自济南岱罡生物科技有限公司。
二氯甲烷：购自广州化学试剂厂
无水乙醇：购自国药集团化学试剂有限公司
无蛋白封闭液：购自上海生工生物工程股份有限公司
His-tag antibody(HRP,mouse antibody)：购自北京义翘神州生物技术有限公司
ELISA显色液：购自北京义翘神州生物技术有限公司
mTNF2细胞因子：购自北京义翘神州生物技术有限公司
mTGFβ细胞因子：购自北京义翘神州生物技术有限公司
抗mTNFR2抗体：购自购自美国abcam公司
抗mTGFβR2抗体：购自购自美国abcam公司
抗MSA抗体：购自购自美国Thermo公司
抗His tag抗体：购自购自美国abcam公司
羊抗大鼠IgG的HRP抗体：购自北京义翘神州生物技术有限公司
ELISA所用聚苯乙烯板：购自美国Corning公司实施例中所用实验仪器及型号公司：
三层组合式震荡培养箱：ZS-CR，浙江华源
超声波细胞破碎仪：VCX130，美国Sonics公司
旋转蒸发仪：RV 10digital V数显型，德国IKA公司
纳米粒度及Zeta电位仪：Nano ZSE，英国Malvern公司
台式微量冷冻离心机：Microfuge 20R，美国Beckman Coulter公司
酶标仪：美国BioTek公司。
超灵敏多功能成像仪：Amersham Imager 600，美国GE公司。
实施例1MSA cDNA的克隆
用PCR方法从公司合成的序列中获得不带有信号肽编码序列的MSA(小鼠血清白蛋白，Mouse Serum Albumin)cDNA，所用的引物MSA F和MSA R用寡聚核苷酸合成仪合成，下游引物引入XbaI酶切位点和保护碱基，划线处为内切酶识别序列。见图1。
50μL PCR反应体系：2x Mix 25μL，DNA模板<200ng，Primer F(10pmol/μL)1μL，Primer R(10pmol/μL)1μL，剩余用ddH2O补足，反应体系可按需求等倍缩小或放大。轻柔混匀后进行PCR，PCR反应条件为94℃热变性1min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1.5min；共30个循环；再72℃延伸5min。通过1％琼脂糖凝胶检测分析得到预期为1.7kb的条带，胶回收，定量。见图2中MSA片段。
实施例2细胞因子受体cDNA的克隆
用基因合成的方法获得不带有信号肽编码序列的细胞因子受体的cDNA，所用的引物如IL1R2-F和IL1R2-MSA-R用寡聚核苷酸合成仪合成，下游引物引入XhoI酶切位点和保护碱基，划线处为内切酶识别序列。见图1。
50μL PCR反应体系：2x Mix 25μL，DNA模板<200ng，Primer F(10pmol/μL)1μL，Primer R(10pmol/μL)1μL，剩余用ddH2O补足，反应体系可按需求等倍缩小或放大。轻柔混匀后进行PCR，PCR反应条件为94℃热变性1min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；再72℃延伸5min。通过1％琼脂糖凝胶检测分析得到预期为1.4kb的条带，胶回收，定量。见图2中IL1R2、IL6R片段。
实施例3Overlap PCR融合目的基因
利用Overlap PCR获得mTNFR2-MSA融合片段，见图1。50μL PCR反应体系：2x Mix25μL，TNFR2-F(10pmol/μL)1μL，MSA R(10pmol/μL)1μL，，剩余用ddH2O补足，轻柔混匀后进行PCR，PCR反应条件为94℃热变性1min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸5min，共30个循环；再72℃延伸5min。mTNFR2--MSA融合基因大小鉴定图见图3。通过胶回收的方式回收纯化目的条带，Nanodrop定量；同时构建了mIL1R-MSA，mIL6R-MSA等融合基因，具体结果见图3。
实施例4构建融合基因-酵母菌载体
利用Xhol和XbaI双酶切mTNFR2-MSA融合片段和酵母菌质粒pPICZαA，将目的基因插入到毕赤酵母表达载体上，示意图见图1。50μL酶切反应体系：mTNFR2-MSA片段和酵母菌质粒1μg，Xhol和XbaI内切酶各1μL，CutSmart buffer 5μL，剩余用ddH2O补足，37℃酶切2h以上(无星号活性最好过夜)，65℃20min热失活。琼脂糖凝胶电泳，切割目的条带后胶回收(图4)。T4DNA ligase连接胶回收后的插入片段与质粒，20μL连接反应体系：T4 ReactionBuffer 2μL，Vector DNA，50ng，Insert DNA 125ng，ddH2O XμL，T4 DNA Ligase 1μL，25℃反应20min或16℃过夜。
实施例5酵母菌载体转化大肠杆菌
E.coli DH5αCompetent Cells(100μL)使用前在冰上融化，加入10μL(<50ng)连接产物，冰中放置30min，42℃水浴热激45s，立刻放入冰中放置1-2min，避免摇动离心管，添加无抗生素LB培养基(预先在37℃保温)至1mL，混匀后37℃振荡培养1h(200rpm)，取适量(100mm平板的<100μL)涂布于选择培养基(含100μg/mL氨苄青霉素的低盐LB培养基)，正面放置半小时待菌液吸收后，37℃过夜倒置培养12-16h。
实施例6菌落PCR鉴定大肠杆菌重组子
用无菌枪头挑取平板上边缘光滑的单菌落，置于20uL 0.1％Triton X－100中混匀，将装有20uL 0.1％Triton X-100的EP管在95℃下加热2min，离心机短暂离心；取1uL上清中细菌裂解暴露的遗传物质为模板，20uL反应PCR体系为：2x Mix 10μL，DNA模板1μL，Primer 5‘AOX(10pmol/μL)0.5μL，Primer 3‘AOX(10pmol/μL)0.5μL，ddH2O 8μL。轻柔混匀后进行PCR，PCR反应条件为94℃热变性1min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸1.5min；共30个循环；再72℃延伸5min。通过1％琼脂糖凝胶检测分析得到预期为3kb的条带，胶回收，定量。参见图5，其中图5A为mTNFR2-MSA，图5B为mIL6R-MSA，图5C为mIL1R-MSA。LB(含抗生素)液体培养基进行培养扩增，培养18小时后，取1mL菌液送样测序，取部分进行冻存。
实施例7化学转化X-33酵母菌
1.毕赤酵母感受态的制备
毕赤酵母X33接种至10mL YPD培养基中，30℃摇床过夜，测得菌液OD600为1.2，利用YPD培养基将菌液稀释至0.2，30℃摇床培养6h，此时测得OD600为0.6。室温下，500g离心5min收集细胞，将细胞用10mL SolutionⅠ(含山梨醇，稳定渗透压，增加细胞膜通透性)悬浮，室温下，500g离心5min收集细胞，将细胞用1mL SolutionⅠ悬浮，200μL每管分装，-80℃保存。
2.线性化质粒
将pPICZα质粒用PmeⅠ内切酶剪切线性化，提升整合入酵母基因组的概率。酶切产物利用PCR纯化试剂盒纯化，。加入1/10质粒体积的3M乙酸钠(中和电荷)于线性化的质粒中充分混匀。加入2倍质粒体积预冷的无水乙醇，混合后均匀后，置于-20℃冰箱中30min；12000g离心10分钟，小心吸去上清，加入750μL的预冷的70％乙醇，12000g离心30分钟，小心吸去上清。EP管开盖置于超净台挥干残留的乙醇。
3.质粒转化毕赤酵母X33
取50μL感受态酵母感受态细胞，加入100μL SolutionⅠ，混合均匀。取其中50μL加入至干燥的线性化质粒中。再加入1mL SolutionⅡ，轻弹离心管混合均匀，置于30℃金属浴中温浴1h，每隔15min轻弹离心管进行混合。将混合物置于42℃金属浴中10min热激细胞。然后将细胞分成两管，各加1mL YPD培养基，置于30℃金属浴220rpm孵育1h，复苏细胞，表达zeocin抗性。室温下3000g离心5min，弃上清。每管细胞用500μL的SolutionⅢ重悬，并将两管细胞整合到一管。室温下3000g离心5min，弃上清。用100μL SolutionⅢ重悬细胞。取50μL细胞涂布在zeocin抗性的YPDS固体培养基上，培养基置于30℃培养箱培养3-4天。
实施例8筛选Mut+阳性克隆
酵母的转化过程，有可能导致Mut+阳性克隆转变为Muts克隆，变现为从甲醇高消耗型菌株转变为甲醇低消耗型菌株，导致蛋白的产量下降。因此需要利用通过将菌落同时接种于MDH(碳源为葡萄糖)与MMH(碳源为甲醇)的平板，通过比较菌落大小差异，筛选Mut+阳性克隆。选取在MDH与MMH平板上生长无显著差异的菌落，认为为Mut+阳性克隆，见图6。
实施例9提取毕赤酵母的基因组和菌落PCR
利用酵母基因组提取试剂盒，提取酵母酵母基因组；以酵母基因组为模板，以pPICZα质粒测序引物进行PCR。由于pPICZα质粒的转化是一种同源重组嵌入的过程。因此利用AOX测序引物进行PCR时，会得到两条带，一条约2000bp是自身PCR条带，另一条约3000bp是目的片段的PCR条带。其中3000bp的条带作为成功转化的标志，见图7，理想菌株利用15％甘油保存于-80℃冰箱中。
实施例10Mut+重组酵母的诱导表达(摇瓶培养)
酵母的诱导表达过程，分为两步。第一步，利用含有甘油的BMGY培养基，扩增酵母；第二步，利用含有甲醇的BMMY培养基，诱导蛋白表达。用BMGY培养基扩增目的菌株培养12-18h，至菌液OD600为6.0左右。将菌液后弃上清，菌体用少量BMMY培养基重悬后，接入到BMMY培养基中，使菌液初始OD值为1左右。每24h，向BMMY培养基中添加0.5％甲醇，96h后收取培养基上清，进行蛋白表征。
实施例11Mut+重组酵母的诱导表达(发酵罐培养)
将含有融合基因的酵母菌载体通过电转或化学转化到X33或GS115酵母菌中，为了筛选Mut+酵母重组子，通过PCR鉴定酵母菌基因组，若插入正确，则出现2.2kb的AOX1基因片段和融合基因相应大小的片段。结果参见图4。将Mut+重组酵母接种于100mL YPD培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，甘油10g/L)，摇床30℃，280转/分钟培养24h。接种至装有2L基础盐培养基的5L发酵罐，其中基础盐培养基的配制方法为：浓磷酸3.5mL/L，CaSO4·2H2O 0.15g/L，K2SO4 2.4g/L，MgSO4.7H2O 1.95g/L，KOH 0.65g/L，121℃高压灭菌30分钟，再加入40mL/L甘油(单独121℃高压灭菌30分钟)，1mL/L PTM1(配方为CuSO4·5H2O 6.0g/L，CoCl2·6H2O，MnSO4·H2O 3.0g/L，H3BO3 0.02g/L，FeSO4·7H2O 65.0g/L，NaMoO4·2H2O0.2g/L，ZnSO4·7H2O20.0g/L，Kl 0.1g/L，浓硫酸5ml/L，0.02％生物素0.5ml/L，过滤除菌)。接种前用氨水将培养基pH调至5.0。发酵过程控制温度为29℃，溶氧始终大于30％饱和度，培养至甘油耗尽后，开始流加甘油(50％甘油，含12mL/L PTM1)，继续培养至密度OD600值约为150时，开始补加甲醇(分析纯甲醇，含12mL/LPTM1)诱导培养72小时。
实施例12切向流浓缩培养基上清
发酵产物纯化过程中，存在两步浓缩，第一步浓缩位于镍柱纯化前，浓缩的主要目的是为了浓缩培养基至较小的体积；第二步浓缩位于镍柱纯化后，浓缩的主要目的是为了脱盐和提升蛋白浓度。
浓缩过程中关键考虑的因素是孔径，一般考虑的孔径为目的蛋白分子量的1/3，为了保证蛋白的收率，因此采用10kDa为过滤孔径。
对于100mL发酵体系，常采用10kDa超滤管进行浓缩，超滤管使用前使用超纯水浸泡水化，再进行培养基的浓缩，浓缩时的离心转速应≤4000g。对于1L发酵体系，常采用切向流浓缩，通过蠕动泵挤压切向过滤，切向流过滤时，应保证管道压力≤2MPa。
实施例13融合蛋白的纯化
镍柱纯化属于固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Zirconium Ion AffinityChromatography，IMAC)，具有高载量、高纯化速度、高特异性。过渡金属通过与氨基酸的羧基或氨基形成稳定的螯合物，实现对特定蛋白的纯化。Ni柱的洗脱采用竞争洗脱，先用低浓度的咪唑将杂蛋白和结合不牢的蛋白洗去，再用合适浓度的咪唑将目的蛋白洗脱。
将发酵产物浓缩至适宜体积后，利用Binding Buffer(磷酸钾缓冲液)置换培养基，以及镍柱保存液。将发酵产物与镍柱于4℃冰箱混合孵育，利用Washing Buffer(低浓度咪唑)洗涤镍柱5次，洗涤杂蛋白。利用Elution Buffer(高浓度咪唑)重悬填料，静置20min，待填料沉于管底，收集流出液，利用超滤管进行浓缩。
实施例12、白蛋白融合蛋白的结构表征
发酵产物通过SDS-PAGE电泳，确定分子量，见图8；通过Western Blot检测融合蛋白组分，例如mTNFR2-MSA的His-tag、MSA和TNFR2。其中TNFR2可以利用Anti TNFR2抗体进行检测。同样的，mTGFβR2-MSA、mIL1R-MSA等融合蛋白也以同样的方式表征，见图9。
实施例13、白蛋白融合蛋白的功能表征
用ELISA表征产物蛋白结合细胞因子的亲和力。小鼠TNFα抗原用Coating buffer稀释为1μg/mL，100μL/孔，37℃孵育2h或4℃过夜孵育包板，PBST清洗三次。利用200μL/孔，1％无蛋白封闭液进行封闭，PBST清洗三次。将融合蛋白TNFR2-MSA用PBST稀释为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.4μg/mL、0.16μg/mL、0.064μg/mL、0.016μg/mL、0.004μg/mL，100μL/孔，37℃孵育2h，PBST清洗六次。利用Mouset anti-His tag antibody(HRP)作为二抗，PBST清洗六次。利用ELISA显色液，避光反应10-20min，2M硫酸终止。利用酶标仪检测450-630nm的吸光度，mTNFR2-MSA的亲和力曲线见图10，Kd＝8.558nM；同理，mTGFβR2-MSA的亲和力曲线见图11，Kd＝36.07nM，根据亲和力曲线可以得到Kd值，即引起最大效应的一半时所需的药物摩尔浓度的负对数，Kd值反映的是化合物对靶标的亲和力大小，值越小亲和力越强。
实施例14、纳米组装体NPmTNFR2-MSA的构建及表征
使用二氯甲烷作为溶剂配置浓度为2mg/mL的PLA137k溶液，取1mg融合蛋白mTNFR2-MSA溶解在1mL的0.9％的氯化钠水溶液中，配制1％(w/v)的融合蛋白溶液，取125μL的PLA137k溶液于5mL离心管中，加入1mL的1％(w/v)的融合蛋白溶液，利用超声波细胞破碎仪进行乳化；超声功率为130W，振幅为40％，超声5s停2s，总共超声时间为1min 30s，超声结束后用超纯水将乳液洗出离心管，转移至平行蒸发仪圆底瓶中，利用平行蒸发仪，按照真空度400/350/300/250/200/150/100/75/50/25mbar的顺序依次去除二氯甲烷，蒸发结束后收集融合蛋白脂肪族聚酯纳米组装体。利用纳米粒度仪检测纳米组装体水化直径，对应的纳米组装体粒径分布图如12所示，粒径为125nm左右，PDI为0.165左右，显示其具有优良的分散性。
实施例15、纳米组装体NPmTGFβR2-MSA的构建及表征
使用二氯甲烷作为溶剂配置浓度为2mg/mL的PLA137k溶液，取1mg融合蛋白mTGFβR2-MSA溶解在1mL的0.9％的氯化钠水溶液中，配制1％(w/v)的融合蛋白溶液，取125μL的PLA137k溶液于5mL离心管中，加入1mL的1％(w/v)的融合蛋白溶液，利用超声波细胞破碎仪进行乳化；按照实施例14的制备方法，蒸发结束后收集融合蛋白脂肪族聚酯纳米组装体。利用纳米粒度仪检测纳米组装体水化直径，对应的纳米组装体粒径分布图如13所示，粒径为143nm左右，PDI为0.115左右，显示其具有优良的分散性。
实施例16、纳米组装体NPmTNFR2-MSA/mTGFβR2-MSA的构建及表征
使用二氯甲烷作为溶剂配置浓度为2mg/mL的PLA137k溶液，取0.5mg融合蛋白mTNFR2-MSA和0.5mg mTGFβR2-MSA溶解在1mL的0.9％的氯化钠水溶液中，配制1％(w/v)的融合蛋白溶液，取125μL的PLA137k溶液于5mL离心管中，加入1mL的1％(w/v)的融合蛋白溶液，利用超声波细胞破碎仪进行乳化；按照实施例14的制备方法，蒸发结束后收集融合蛋白脂肪族聚酯纳米组装体。利用纳米粒度仪检测纳米组装体水化直径，对应的纳米组装体粒径分布图如14所示，粒径为128nm左右，PDI为0.122左右，显示纳米组装体的粒径均一。
实施例17、融合蛋白-聚乳酸纳米颗粒的纯化方法(离心法)
通过台式微量冷冻离心机对实施例14、15、16所制得的纳米颗粒进行低速离心(3000rpm，5min，4℃)以去除未组装的聚乳酸；将上清液转移至新的EP管中进行高速离心(15000rpm，2h，4℃)以沉淀出纳米颗粒，去除上清中的游离蛋白，将下层颗粒沉淀用1×PBS重悬备用。
实施例18、SEM表征纳米组装体NPmTNFR2-MSA/mTGFβR2-MSA的形貌
将NPmTNFR2-MSA/mTGFβR2-MSA的浓度稀释至0.1mg/mL，取2μL滴加到硅片上，待水分挥发8h后于扫描电子显微镜下观察。如图15所示，纳米组装体呈现独立存在的圆球状形貌。
实施例19、纳米组装体NPmTNFR2-MSA/mTGFβR2-MSA的稳定性表征
按照实施例16的制备方法制备NPmTNFR2-MSA/mTGFβR2-MSA，将纳米组装体稀释至1mg/mL，调整溶剂为含有10％FBS的1×PBS，分别在0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，108h，120h，144h等时间点通过纳米粒度仪检测纳米组装体粒径及其分布情况。如图16所示，在长达一周的观察时间内，纳米组装体粒径没有显著的改变，且粒径分布没有巨大波动，说明本发明的纳米组装体可以在长达一周的时间保持水化半经的稳定。
实施例20、验证细胞因子纳米组装体具备结合细胞因子的能力
固定细胞因子纳米组装体的量一致(蛋白质含量为10μg)，按照颗粒中蛋白质与细胞因子不同的摩尔比(10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1)投入不同量的实施例17纯化重悬后的颗粒溶液，然后用PBS将各组样品的体积补至200μL，并设置相同体积的游离细胞因子(无颗粒)组，于37℃孵育1h。孵育结束后离心(15000rpm，2h)，取上清，通过ELISA测定上清中的细胞因子浓度，图17A为本实施例的示意图。
ELISA法：以细胞因子作为标准品，对各时间点取得的上清稀释20-3000倍作为样品。将细胞因子标准品及稀释后的上清样品作为一抗于37℃孵育(每孔100μL)1h，PBST洗涤去除未结合的一抗后加入抗细胞因子的HRP抗体于37℃孵育45min，PBST洗涤去除未结合的HRP抗体后进行显色。显色时A、B液1:1混合，每孔100μL，避光显色8～10min后，加入2mol/LH2SO4终止显色，立即使用酶标仪检测OD450 nm、OD630 nm的值。
对标准曲线的线性区域进行线性拟合，并依此计算各上清样品中的细胞因子含量。将游离抗体(无颗粒)组测定的细胞因子浓度作为原始投入量，从而计算颗粒与细胞因子不同摩尔比条件下的结合效率。如图17B所示，NPmTNFR2-MSA纳米组装体对不同浓度TNFα的结合情况；如图17C所示，NPmTGFβR2-MSA纳米组装体对不同浓度TGFβ的结合情况；本发明的融合蛋白纳米组装体具有优异的细胞因子结合能力。
实施例21、细胞水平验证双细胞因子纳米组装体结合细胞因子的能力
用1μg/mL LPS刺激诱导RAW264.7细胞的活化(1.0×105细胞/孔)，从而分泌大量促炎性细胞因子(TNFα、IL1、IL6等)在体外模拟炎症微环境。利用实施例14-17所述的细胞因子纳米组装体NPmTNFR2-MSA/mIL6R-MSA与LPS刺激后的RAW264.7细胞共孵育1h，收集培养基上清，通过ELISA测定上清中的细胞因子浓度。图18A为本实施例的示意图。
对标准曲线的线性区域进行线性拟合，并依此计算各上清样品中的细胞因子含量。将无颗粒组测定的细胞因子浓度作为对照组，从而比较颗粒结合细胞因子的结合效率。如图18B所示，不同浓度的NPmTNFR2-MSA/mIL6R-MSA对RAW264.7细胞上清中TNF-α的吸附情况；如图18C所示，不同浓度的NPmTNFR2-MSA/mIL6R-MSA对RAW264.7细胞上清中IL-6的吸附情况；在细胞水平本发明的融合蛋白纳米颗粒具有优异的细胞因子结合能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用
<150> 2021101643751
<151> 2021-02-05
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagcacaca agagtgagat cgcccatcgg tataatgatt tgggagaaca acatttcaaa 60
ggcctagtcc tgattgcctt ttcccagtat ctccagaaat gctcatacga tgagcatgcc 120
aaattagtgc aggaagtaac agactttgca aagacgtgtg ttgccgatga gtctgccgcc 180
aactgtgaca aatcccttca cactcttttt ggagataagt tgtgtgccat tccaaacctc 240
cgtgaaaact atggtgaact ggctgactgc tgtacaaaac aagagcccga aagaaacgaa 300
tgtttcctgc aacacaaaga tgacaacccc agcctgccac catttgaaag gccagaggct 360
gaggccatgt gcacctcctt taaggaaaac ccaaccacct ttatgggaca ctatttgcat 420
gaagttgcca gaagacatcc ttatttctat gccccagaac ttctttacta tgctgagcag 480
tacaatgaga ttctgaccca gtgttgtgca gaggctgaca aggaaagctg cctgaccccg 540
aagcttgatg gtgtgaagga gaaagcattg gtctcatctg tccgtcagag aatgaagtgc 600
tccagtatgc agaagtttgg agagagagct tttaaagcat gggcagtagc tcgtctgagc 660
cagacattcc ccaatgctga ctttgcagaa atcaccaaat tggcaacaga cctgaccaaa 720
gtcaacaagg agtgctgcca tggtgacctg ctggaatgcg cagatgacag ggcggaactt 780
gccaagtaca tgtgtgaaaa ccaggcgact atctccagca aactgcagac ttgctgcgat 840
aaaccactgt tgaagaaagc ccactgtctt agtgaggtgg agcatgacac catgcctgct 900
gatctgcctg ccattgctgc tgattttgtt gaggaccagg aagtgtgcaa gaactatgct 960
gaggccaagg atgtcttcct gggcacgttc ttgtatgaat attcaagaag acaccctgat 1020
tactctgtat ccctgttgct gagacttgct aagaaatatg aagccactct ggaaaagtgc 1080
tgcgctgaag ccaatcctcc cgcatgctac ggcacagtgc ttgctgaatt tcagcctctt 1140
gtagaagagc ctaagaactt ggtcaaaacc aactgtgatc tttacgagaa gcttggagaa 1200
tatggattcc aaaatgccat tctagttcgc tacacccaga aagcacctca ggtgtcaacc 1260
ccaactctcg tggaggctgc aagaaaccta ggaagagtgg gcaccaagtg ttgtacactt 1320
cctgaagatc agagactgcc ttgtgtggaa gactatctgt ctgcaatcct gaaccgtgtg 1380
tgtctgctgc atgagaagac cccagtgagt gagcatgtta ccaagtgctg tagtggatcc 1440
ctggtggaaa ggcggccatg cttctctgct ctgacagttg atgaaacata tgtccccaaa 1500
gagtttaaag ctgagacctt caccttccac tctgatatct gcacacttcc agagaaggag 1560
aagcagatta agaaacaaac ggctcttgct gagctggtga agcacaagcc caaggctaca 1620
gcggagcaac tgaagactgt catggatgac tttgcacagt tcctggatac atgttgcaag 1680
gctgctgaca aggacacctg cttctcgact gagggtccaa accttgtcac tagatgcaaa 1740
gacgccttag cc 1752
<210> 2
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcaccactc caacagtggt gcacacagga aaggtttctg aatcccccat tacatcggag 60
aagcccacag tccatggaga caactgtcag tttcgtggca gagagttcaa atctgaattg 120
aggctggaag gtgaacctgt ggttctgagg tgccccttgg cacctcactc cgacatctcc 180
agcagttccc atagttttct gacctggagt aaattggact cttctcagct gatcccaaga 240
gatgagccaa ggatgtgggt gaagggtaac atactctgga ttctgccagc agtgcagcaa 300
gactctggta cctacatttg cacattcaga aacgcatccc actgtgagca aatgtctgtg 360
gaactcaagg tctttaagaa tactgaagca tctctgcctc atgtctccta cttgcaaatc 420
tcagctctct ccaccaccgg gttactagtg tgccctgacc tgaaagaatt catctccagc 480
aacgctgatg gaaagataca gtggtataag ggcgccatac tcttggataa aggcaataag 540
gaatttctga gtgcaggaga ccccacacgc ctattgatat ccaacacgtc catggacgat 600
gcaggctatt acagatgtgt tatgacattt acctacaatg gccaggaata caacatcact 660
aggaatattg aactccgggt caaaggaaca accacggaac ccatccctgt gatcatttct 720
cccctggaga caataccagc atcattgggg tcaagactga tagtcccgtg caaagtgttt 780
ctgggaactg gtacatcttc caacaccatt gtgtggtggt tggctaacag cacgtttatc 840
tcggctgctt acccaagagg ccgtgtgacc gaggggctac accaccagta ctcagagaat 900
gatgaaaact atgtggaagt gtcgctgatt tttgatccag tcacaaggga ggatctgcat 960
acagatttta aatgtgttgc ctcgaatcca cggagttctc agtcactcca taccacagtc 1020
aaagaa 1026
<210> 3
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggtcctcg ggagctgccg cgcgctggag gtggcaaatg gcacagtgac aagcctgcca 60
ggggccaccg ttaccctgat ttgccccggg aaggaagcag caggcaatgt taccattcac 120
tgggtgtact ctggctcaca aaacagagaa tggactacca caggaaacac actggttctg 180
agggacgtgc agctcagcga cactggggac tatttatgct ccctgaatga tcacctggtg 240
gggactgtgc ccttgctggt ggatgttccc ccagaggagc ccaagctctc ctgcttccgg 300
aagaaccccc ttgtcaacgc catctgtgag tggcgtccga gcagcacccc ctctccaacc 360
acgaaggctg tgctgtttgc aaagaaaatc aacaccacca acgggaagag tgacttccag 420
gtgccctgtc agtattctca gcagctgaaa agcttctcct gccaggtgga gatcctggag 480
ggtgacaaag tataccacat agtgtcactg tgcgttgcaa acagtgtggg aagcaagtcc 540
agccacaacg aagcgtttca cagcttaaaa atggtgcagc cggatccacc tgccaacctt 600
gtggtatcag ccatacctgg aaggccgcgc tggctcaaag tcagctggca gcaccctgag 660
acctgggacc cgagttacta cttgctgcag ttccagcttc gataccgacc tgtatggtca 720
aaggagttca cggtgttgct gctcccggtg gcccagtacc aatgcgtcat ccatgatgcc 780
ttgcgaggag tgaagcacgt ggtccaggtc cgtgggaagg aggagcttga ccttggccag 840
tggagcgaat ggtccccaga ggtcacgggc actccttgga tagcagagcc caggaccacc 900
ccggcaggaa tcctctggaa ccccacacag gtctctgttg aagactctgc caaccacgag 960
gatcagtacg aaagttctac agaagcaacg agtgtcctcg ccccagtgca agaatcctcg 1020
tccatgtccc tgccc 1035
<210> 4
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagaattca ttgcatacgg gacagaactg ccaagccctt cctatgtgtg gtttgaagcc 60
agatttttcc agcacatcct ccactggaaa cctatcccaa accagtctga gagcacctac 120
tatgaagtgg ccctcaaaca gtacggaaac tcaacctgga atgacatcca tatctgtaga 180
aaggctcagg cattgtcctg tgatctcaca acgttcaccc tggatctgta tcaccgaagc 240
tatggctacc gggccagagt ccgggcagtg gacaacagtc agtactccaa ctggaccacc 300
actgagactc gcttcacagt ggatgaagtg attctgacag tggatagcgt gactctgaaa 360
gcaatggacg gcatcatcta tgggacaatc catcccccca ggcccacgat aacccctgca 420
ggggatgagt acgaacaagt cttcaaggat ctccgagttt acaagatttc catccggaag 480
ttctcagaac taaagaatgc aaccaagaga gtgaaacagg aaaccttcac cctcacggtc 540
cccatagggg tgagaaagtt ttgtgtcaag gtgctgcccc gcttggaatc ccgaattaac 600
aaggcagagt ggtcggagga gcagtgttta cttatcacga cggagcagta tttcactgtg 660
accaacctga gcatc 675
<210> 5
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcccgccc aggttgtctt gacaccctac aaaccggaac ctgggtacga gtgccagatc 60
tcacaggaat actatgacag gaaggctcag atgtgctgtg ctaagtgtcc tcctggccaa 120
tatgtgaaac atttctgcaa caagacctcg gacaccgtgt gtgcggactg tgaggcaagc 180
atgtataccc aggtctggaa ccagtttcgt acatgtttga gctgcagttc ttcctgtacc 240
actgaccagg tggagatccg cgcctgcact aaacagcaga accgagtgtg tgcttgcgaa 300
gctggcaggt actgcgcctt gaaaacccat tctggcagct gtcgacagtg catgaggctg 360
agcaagtgcg gccctggctt cggagtggcc agttcaagag ccccaaatgg aaatgtgcta 420
tgcaaggcct gtgccccagg gacgttctct gacaccacat catccactga tgtgtgcagg 480
ccccaccgca tctgtagcat cctggctatt cccggaaatg caagcacaga tgcagtctgt 540
gcgcccgagt ccccaactct aagtgccatc ccaaggacac tctacgtatc tcagccagag 600
cccacaagat cccaacccct ggatcaagag ccagggccca gccaaactcc aagcatcctt 660
acatcgttgg gttcaacccc cattattgaa caaagtacca agggtggc 708
<210> 6
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcccgccgc acgttcccaa gtcggatgtg gaaatggaag cccagaaaga tgcatccatc 60
cacctaagct gtaataggac catccatcca ctgaaacatt ttaacagtga tgtcatggcc 120
agcgacaatg gcggtgcggt caagcttcca cagctgtgca agttttgcga tgtgagactg 180
tccacttgcg acaaccagaa gtcctgcatg agcaactgca gcatcacggc catctgtgag 240
aagccgcatg aagtctgcgt ggccgtgtgg aggaagaacg acaagaacat tactctggag 300
acggtttgcc acgaccccaa gctcacctac cacggcttca ctctggaaga tgccgcttct 360
cccaagtgtg tcatgaagga aaagaaaagg gcgggcgaga ctttcttcat gtgtgcctgt 420
aacatggaag agtgcaacga ttacatcatc ttttcggaag aatacaccac cagcagtccc 480
gac 483
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtggtggtg gttctgaagc acacaagagt 30
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tattctagat tggctaaggc gtc 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgctcgagaa aagattcacc actcc 25
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agaaccacca ccaccttctt tgactgtgg 29

Claims (19)

1.一种用于吸附至少一种细胞因子的纳米组装体，其特征在于，由重组融合蛋白与疏水性可降解聚酯或其衍生物通过疏水相互作用结合构成，每种不同的重组融合蛋白中的细胞因子受体不同；所述疏水性可降解聚酯是脂肪族聚酯，或聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯；
所述重组融合蛋白包括具有疏水区域的蛋白和细胞因子受体，所述疏水区域的蛋白和细胞因子受体直接连接或者通过肽接头连接而成；所述细胞因子受体能与所吸附的细胞因子非共价结合；可吸附的细胞因子与所述重组融合蛋白具有相同的种属来源，所述细胞因子受体与相应细胞因子具有亲和力；
所述细胞因子受体为细胞因子受体蛋白全长或其胞外片段；所述具有疏水区域的蛋白是白蛋白；所述脂肪族聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚（乙交酯-co-丙交酯）和聚己内酯中的至少一种；或所述聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯为聚乙二醇修饰的聚丙交酯、聚乙二醇修饰的聚乙交酯、聚乙二醇修饰的聚（乙交酯-co-丙交酯）和聚乙二醇修饰的聚己内酯中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的纳米组装体，其特征在于，所述细胞因子受体选自以下任意一种：白细胞介素1受体、白细胞介素2受体、白细胞介素3受体、白细胞介素4受体、白细胞介素5受体、白细胞介素6受体、白细胞介素7受体、白细胞介素9受体、白细胞介素10受体、白细胞介素11受体、白细胞介素15受体、白细胞介素19受体、白细胞介素20受体、白细胞介素21受体、白细胞介素24受体、集落刺激因子1受体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、肿瘤坏死因子α受体、转化生长因子-β家族受体、干扰素γ受体。
3.根据权利要求1所述的纳米组装体，其特征在于，所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白、或鸡卵清白蛋白。
4.根据权利要求1-3任一项所述的纳米组装体，其特征在于，所述肽接头的残基为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-4的整数，所述重组融合蛋白的组分通过肽接头进行连接。
5.根据权利要求1所述的纳米组装体，其特征在于，所述重组融合蛋白从N端到C端依次为血清白蛋白、肽接头和蛋白质受体。
6.根据权利要求1所述的纳米组装体，其特征在于，所述脂肪族聚酯为聚丙交酯。
7.根据权利要求6所述的纳米组装体，其特征在于，所述聚丙交酯的端基为酯基、羧基和羟基中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的纳米组装体，其特征在于，所述聚丙交酯为左旋聚丙交酯、右旋聚丙交酯或外消旋聚丙交酯。
9.根据权利要求7所述的纳米组装体，其特征在于，所述聚丙交酯为左旋聚丙交酯，所述左旋聚丙交酯的端基为酯基。
10.根据权利要求9所述的纳米组装体，其特征在于，所述左旋聚丙交酯的分子量范围为7200~1100000道尔顿。
11.根据权利要求10所述的纳米组装体，其特征在于，所述左旋聚丙交酯的分子量范围为137000~240000道尔顿。
12.根据权利要求1所述的纳米组装体，其特征在于，所述纳米组装体为纳米颗粒，其粒径范围为80~200 nm。
13.根据权利要求12所述的纳米组装体，其特征在于，所述纳米组装体为纳米颗粒，其粒径范围为80~150 nm。
14.根据权利要求1所述的纳米组装体，其特征在于，所述融合蛋白至少有两种。
15.根据权利要求14所述的纳米组装体，其特征在于，所述融合蛋白为两种，或者三种。
16.一种权利要求1所述的纳米组装体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将所述重组融合蛋白与水或生理盐水溶液混合，其浓度为0.5~20 mg/mL，得水相；
将所述疏水性可降解聚酯及其衍生物与有机溶剂混合，得油相，其浓度为0.5~10 mg/mL，所述溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯的至少一种；
（2）将步骤（1）所述水相和油相制备成水包油的乳剂；
（3）将所述乳剂分离纯化，得纳米组装体。
17.根据权利要求16所述的纳米组装体的制备方法，其特征在于，在所述聚酯或其溶液与重组融合蛋白的重量比为1:0.1~1:30；
或上述水相与有机相的体积比为1-10 : 1；
所述重组融合蛋白在水相中的浓度为0.5~3 mg/ml；所述聚酯在油相中的浓度为1~3mg/ml。
18.权利要求1-15所述的纳米组装体在制备吸附至少一种细胞因子的免疫治疗药物或者免疫治疗剂中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，所述免疫治疗药物为急性或慢性炎症免疫疾病治疗药物。
CN202210106834.5A 2021-02-05 2022-01-28 吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用 Active CN114773484B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021101643751 2021-02-05
CN202110164375 2021-02-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114773484A CN114773484A (zh) 2022-07-22
CN114773484B true CN114773484B (zh) 2023-07-11

Family

ID=81475760

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210094235.6A Active CN114478800B (zh) 2021-02-05 2022-01-26 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用
CN202210106834.5A Active CN114773484B (zh) 2021-02-05 2022-01-28 吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用
CN202210107965.5A Active CN114516921B (zh) 2021-02-05 2022-01-28 基于单链抗体片段的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210094235.6A Active CN114478800B (zh) 2021-02-05 2022-01-26 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210107965.5A Active CN114516921B (zh) 2021-02-05 2022-01-28 基于单链抗体片段的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

Country Status (3)

Country Link
US (2) US20240083976A1 (zh)
CN (3) CN114478800B (zh)
WO (3) WO2022166720A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022166720A1 (zh) * 2021-02-05 2022-08-11 华南理工大学 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611052A (zh) * 2006-12-13 2009-12-23 苏伯利莫尔公司 包含修饰的Fc结构域的多聚Fc受体多肽
WO2013179143A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Biopheresis Technologies, Inc. Sensitization of cancer cells by the removal of soluble tumor necrosis factor receptors
CN105296514A (zh) * 2014-07-11 2016-02-03 兰州大学 经优化的hil-17ra-hsa融合基因编码蛋白

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040213781A1 (en) * 1994-09-16 2004-10-28 Hogarth Phillip Mark Polypeptides with Fc binding ability
EP1141711A1 (en) * 1999-01-05 2001-10-10 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
AU2001266557A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DK1432431T3 (en) * 2001-10-04 2017-07-10 Genetics Inst Llc Methods and compositions for modulating interleukin-21 activity
CN1954882A (zh) * 2005-10-14 2007-05-02 李海 长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治肝衰竭药物中的用途
EP2195028A2 (en) * 2007-09-18 2010-06-16 The Jackson Laboratory Antibodies and fc fusion protein modifications with enhanced persistence or pharmacokinetic stability in vivo and methods of use thereof
JP5639039B2 (ja) * 2008-04-11 2014-12-10 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
WO2010011096A2 (en) * 2008-07-23 2010-01-28 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
EP2531523A1 (en) * 2010-02-05 2012-12-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
WO2011124718A1 (en) * 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
CN105524176B (zh) * 2010-05-21 2021-03-19 银溪制药股份有限公司 双特异性融合蛋白
JP2014510518A (ja) * 2011-02-15 2014-05-01 メディミューン，エルエルシー Ｈｓａ関連組成物および使用方法
WO2012132067A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
US8846042B2 (en) * 2011-05-16 2014-09-30 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific FAB fusion proteins and methods of use
US9364549B2 (en) * 2011-11-30 2016-06-14 Andreas Voigt Hydrophobic drug-delivery material, method for manufacturing thereof and methods for delivery of a drug-delivery composition
FR3006315B1 (fr) * 2013-05-31 2015-10-02 Centre Nat Rech Scient Microparticules et nanoparticules auto-associatives composees de proteines
GB201508180D0 (en) * 2015-05-13 2015-06-24 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CN105288613B (zh) * 2015-11-25 2018-08-31 河北师范大学 一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂及其制备方法
WO2018151868A2 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Sonnet Bio Therapeutics Albumin binding domain fusion proteins
EP4011396A1 (en) * 2017-03-10 2022-06-15 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Releasable conjugates
CN107082815A (zh) * 2017-06-28 2017-08-22 杭州皓阳生物技术有限公司 一种fsh‑hsa融合蛋白及其制备方法
EP3427756A1 (en) * 2017-07-14 2019-01-16 Universidad Autónoma De Barcelona (UAB) Therapeutic nanoconjugates and uses thereof
CA3094112A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
CN110129273B (zh) * 2019-05-10 2020-09-08 西湖生物医药科技(杭州)有限公司 搭载抗pd-1单链抗体的基因工程化红细胞及其制备方法
CN110256577B (zh) * 2019-06-18 2021-06-25 江南大学 一种融合白蛋白纳米粒及其应用
CN112274646B (zh) * 2019-07-12 2023-06-02 北京茵诺医药科技有限公司 用于靶向活化cd44分子的双亲性蛋白质-高分子结合体递送系统、其制备方法和应用
CN112336873B (zh) * 2020-08-04 2022-04-19 华南理工大学 用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒及其应用、制备方法
WO2022166720A1 (zh) * 2021-02-05 2022-08-11 华南理工大学 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101611052A (zh) * 2006-12-13 2009-12-23 苏伯利莫尔公司 包含修饰的Fc结构域的多聚Fc受体多肽
WO2013179143A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Biopheresis Technologies, Inc. Sensitization of cancer cells by the removal of soluble tumor necrosis factor receptors
CN105296514A (zh) * 2014-07-11 2016-02-03 兰州大学 经优化的hil-17ra-hsa融合基因编码蛋白

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
不同结合种类仿生型纳米粒的研究进展;崔琳等;《中国临床药理学杂志》;20180117(第01期);全文 *
表皮生长因子偶联牛血清白蛋白纳米粒荷载紫杉醇的制备及鉴定;王树斌等;《中国组织工程研究》;20141217(第52期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022166831A1 (zh) 2022-08-11
CN114478800A (zh) 2022-05-13
WO2022166832A1 (zh) 2022-08-11
CN114516921A (zh) 2022-05-20
CN114516921B (zh) 2023-01-06
CN114773484A (zh) 2022-07-22
US20240002485A1 (en) 2024-01-04
WO2022166720A1 (zh) 2022-08-11
US20240083976A1 (en) 2024-03-14
CN114478800B (zh) 2022-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102850458B (zh) 新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途
CN112426534B (zh) 一种c端修饰肿瘤穿透肽rgerppr的铁蛋白纳米粒子、其制备方法及应用
CN114773484B (zh) 吸附细胞因子的重组融合蛋白、纳米组装体及其制备方法与应用
WO2021068752A1 (zh) 含人白细胞介素10和Fc片段的融合蛋白及其医药用途
WO2014154187A1 (zh) 二聚体化融合蛋白的制备及应用
CN116102640A (zh) 重组乳铁蛋白衍生肽及其在提高免疫力方面的应用
CN101514229B (zh) 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物
CA2927632A1 (en) Fusion protein of recombinant ganoderma immunoregulatory protein and human serum albumin, preparation method thereof, and application thereof
CN117069844B (zh) 包含特定等电点的抗人bcma纳米抗体的双特异性抗体及应用
CN114349869B (zh) 一种双特异性的nk细胞激动剂及制备方法和应用
CN111057154B (zh) 基于驼源Fc片段的免疫原的制备及应用
CN111748505B (zh) 一种表达羧肽酶g2的基因工程菌及其制备方法和应用
CN112516288A (zh) N-糖基化修饰之灵芝免疫调节蛋白的应用
CN112501192A (zh) 产生抗人il21单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN105176897A (zh) 一种表达GnRH/M2融合多肽的重组工程菌株及其构建和应用
CN104877031B (zh) 一种新型融合蛋白nscr5及其制备方法
CN115819579B (zh) 全人源抗白介素17A单链抗体No.34及应用
CN116143899B (zh) 一种重组抗菌肽pANG4及其制备方法与应用
WO2023222105A1 (zh) 一种实现工程化EVs功能蛋白模块化装载的核酸构建体及其应用
TWI314579B (en) Method for production of recombinant fungal immunomodulatory protein by bacillus licheniformis expression system
CN116173200A (zh) 一种TNF-α纳米抗体及其在制备溃疡性结肠炎药物中的应用
WO2008141511A1 (fr) ANTICORPS MONOCLONAL HUMAIN ANTI-TNFα ET SON UTILISATION
CN106544323B (zh) 杂交瘤细胞株xa272-907、抗体及其应用
CN112251453A (zh) 一种重组犬长效干扰素α的制备方法
CN117327198A (zh) 一种白细胞介素-1受体拮抗剂融合蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant