CN112501192A - 产生抗人il21单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于表达人白细胞介素21(Interleukin‑21，IL‑21)的表达载体和宿主细胞；还提供了高亲和力与人白细胞介素21特异性结合的单克隆抗体，分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述交瘤细胞株的制备方法，以及所述单克隆抗体在制备组合物、偶联物和试剂盒中的用途。

Description

产生抗人IL21单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，具体涉及抗人白细胞介素21(Interleukin-21， IL-21)单克隆抗体杂交瘤细胞株，及其制备方法和分泌的单克隆抗体，还涉及 包含所述单克隆抗体的组合物、偶联物和试剂盒。
背景技术
白细胞介素21(IL-21)是一种主要由卵泡辅助性T(Tfh)和T辅助17 (Th17)细胞产生的自分泌细胞因子，在免疫应答中具有重要作用。通过与 IL-21受体(IL-21R)结合，IL-21可以促进Tfh和Th17细胞的增殖和发育、 平衡辅助T细胞亚群、诱导B细胞增殖分化为浆细胞、以及促进免疫球蛋白的 产生。IL-21的这些生理功能主要是通过JAK/STAT，MAPK和PI3K信号通路 介导的。而IL-21的靶基因，例如B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(Blimp-1)， 细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)，CXCR5和Bcl-6，在体液免疫反应中 起重要作用。IL-21对B细胞的增殖、分化、成熟和凋亡具有正反两方面的作 用，这取决于信号激活途径和B细胞的共同刺激信号。
基于IL-21调节大量免疫细胞的证据，研究者认为IL-21与自身免疫性疾 病有关，特别在以B细胞功能紊乱、自身抗体水平异常升高为主要发病机制的 自身免疫病中具有重要作用。有研究证实，在系统性红斑狼疮(SLE)、类风 湿关节炎(RA)、1型糖尿病(T1D)、免疫性血小板减少症(ITP)、原发 性干燥综合征(pSS)、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)及银屑病患者中，外 周血或组织内IL-21水平明显高于健康人。这种升高的IL-21水平与SLE和RA 患者的Tfh细胞、浆细胞、自身抗体及疾病活性呈正相关。越来越多的证据表 明，IL-21在自身免疫性疾病、过敏、炎症性疾病和癌症中起着多种作用。
IL-21被认为是系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎(RA)，1型 糖尿病(TID)和癌症治疗中特别有吸引力的靶标。近些年，阻断IL-21信号 通路已被用于SLE，RA，T1D和银屑病小鼠模型的治疗方案研究。在SLE的 小鼠模型中封闭IL-21R治疗可显著降低狼疮症状，减轻器官组织损害，提高 生存率；中和IL-21治疗可减少自身抗体水平，提高生存率。在RA的小鼠模 型中封闭IL-21R治疗可减少关节组织的炎性细胞浸润，减轻疾病严重程度。在T1D的小鼠模型中封闭IL-21R治疗可降低疾病发生率，减少自身反应性免 疫细胞。在银屑病的小鼠模型中，中和IL-21治疗可抑制角质形成细胞增殖并 下调炎症因子。在小鼠的疾病模型中，阻断IL-21信号通路的治疗方案具有症 状改善和发病率降低的显著疗效。
在体外实验中，中和IL-21或封闭IL-21R均可抑制自身抗体产生、减少炎 症因子释放。一项临床研究发现，抗IL-21抗体可以线性药代动力学改善RA 疾病活动性，而高水平的抗IL-21抗体可导致感染风险和皮肤过敏反应的增加。 另一项临床研究发现，在健康人中由于抗药物抗体的作用，抗IL-21抗体展现 出高免疫原性、低生物利用度和快速清除率。
综上所述，以IL-21作为靶点是自身免疫性疾病治疗的新方向，特别是以 B细胞、自身抗体异常为主要发病机制的自身免疫病。但现有的抗IL-21抗体 和IL-21R封闭蛋白存在免疫原性高、亲和力有限的问题。有鉴于此，本发明 目的在于提供特异性高、亲和力强的抗IL-21单克隆抗体，有助于IL-21治疗 的进一步发展，并提供更多临床和科研的检测选择。
发明内容
为了解决前述的问题，本发明提供了以下多个方面的内容，包括特异性高、 亲和力强的抗IL-21单克隆抗体，生产该抗体的杂交瘤细胞等。
第一个方面，本发明提供了一种人IL-21重组表达质粒，其含有表达编码 人IL-21蛋白的cDNA序列，并删去非编码序列及编码序列上的分泌肽段，所 述cDNA序列为SEQ IDNo：1，其翻译的IL-21氨基酸序列为SEQ ID No：2。 进一步地，所述重组表达质粒由pET21a中插入序列SEQ ID No：1片段构建。
在一个实施方案中，前述原核表达质粒，能够表达人IL-21重组蛋白，所 述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
第二个方面，本发明提供了人IL-21重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No： 3所示；进一步地，前述人IL-21重组蛋白能够作为抗原进行动物免疫。
第三个方面，本发明提供了一种能够产生抗IL-21抗体的杂交瘤细胞的制 备方法，其包括以下步骤：
步骤1.构建第一方面中描述的人IL-21重组表达质粒；
步骤2.使用步骤1所获得的人IL-21重组表达质粒进行原核表达，获得第 二方面描述的人IL-21重组蛋白；
步骤3.使用步骤2获得的人IL-21重组蛋白作为抗原，接种小鼠产生免疫 反应；
步骤4.使用步骤3的经刺激小鼠获得脾脏细胞，然后与骨髓瘤细胞进行诱 导融合、筛选，获得能够产生抗IL-21抗体的单克隆杂交瘤细胞株。
第四个方面，本发明提供了通过前述的制备杂交瘤细胞的方法所获得的杂 交瘤细胞株；进一步地，本发明提供了2020年11月3日保藏在中国典型培养 物保藏中心(保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，电话： 027-68752319)的三株能产生抗IL-21抗体的杂交瘤细胞株5B6B7、5B6C2和 7A5D2，杂交瘤细胞株5B6B7的保藏编号为CCTCC NO：C2020214，杂交瘤 细胞株5B6C2的保藏编号为CCTCC NO：C2020215，杂交瘤细胞株7A5D2的保藏编号为CCTCC NO：C2020216。
第五个方面，本发明提供了抗人IL-21单克隆抗体，其由第五方面描述的 杂交瘤细胞株产生，进一步地，可以是保藏编号分别为CCTCC NO：C2020214， CCTCC NO：C2020215，CCTCC NO：C2020216的杂交瘤细胞株所产生，并 且能够结特异性结合细胞内及血清中的天然IL-21。
第六个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括第四方面所述的杂交瘤细 胞株或第五方面所述的抗人IL-21单克隆抗体；进一步地，该试剂盒为以下任 一：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒 (ELISA)、荧光免疫试剂盒和微流体芯片。在一个具体实施方案中，前述酶 联免疫试剂盒可用于检测血清中的IL-21。
第七个方面，本发明提供了结合物，其通过将第五个方面描述的抗人IL-21 单克隆抗体经化学标记或生物标记制备；进一步地，所述化学标记为荧光素、 同位素、免疫毒素和/或化学药物，所述生物标记为特异性抗体、生物素、亲和 素或酶标记。
第七个方面，本发明提供了偶联物，其通过将第五个方面描述的抗人IL-21 单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得；进一步地，还提供了偶联物在 制备用于中和IL-21的免疫吸附柱中的用途，以及制备用于免疫亲和纯化天然 IL-21的微珠中的用途。
第八个方面，本发明提供了第五个方面描述的抗人IL-21单克隆抗体或第 六个方面描述的结合物在制备用于降低IL-21水平的药物中的用途。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发 明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1pET21a载体结构图；
图2A重组蛋白诱导表达的考马斯亮蓝染色结果；2B重组蛋白诱导表达 的免疫印迹结果；2C重组蛋白纯化的考马斯亮蓝染色结果；
图3A免疫小鼠血清抗体效价检测结果，3B单克隆杂交瘤细胞培养上清 中抗体与抗原结合效价检测结果，3C单克隆杂交瘤细胞培养上清中抗体与商 业化IL-21重组蛋白结合效价检测结果，3D单克隆杂交瘤细胞培养上清与细 胞内IL-21结合力检测结果；
图4抗体纯化后考马斯亮蓝染色结果；
图5抗IL-21单克隆抗体亚型免疫印迹检测结果；
图6A抗IL-21单克隆抗体与抗原结合力检测结果，6B抗IL-21单克隆抗 体与商业化IL-21重组蛋白结合力检测结果，6C抗IL-21单克隆抗体与细胞内 IL-21的流式检测结果，6D抗IL-21单克隆抗体与细胞内IL-21的流式检测统 计结果；
图7 3株抗IL-21单克隆抗体与试剂盒检测IL-21的标准曲线比较结果，7A 人IL-21ELISA试剂盒标准曲线，7B抗人IL-21单抗5B6B7标准曲线，7C抗 人IL-21单抗5B6C2标准曲线，7D抗人IL-21单抗7A5D2标准曲线；
图8 3株抗IL-21单克隆抗体免疫沉淀结果；
图9 3株抗IL-21单克隆抗体可逆性吸附人血清IL-21检测结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的 优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的实施例中主要涉及到的细胞株、实验动物、载体、酶、试剂和仪 器等来源如下：
(1)细胞株：DH5α感受态细胞(擎科公司，TSV-A07)，BL21(DE3)表 达菌(擎科公司，TSV-A09)，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(湖南省表观遗传学重 点实验室保藏)。
(2)实验动物：雌性Balb/c小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)。
(3)载体：经过改造的pET21a原核表达质粒(湖南远泰生物技术有限公 司)。
(4)酶：Bam H I内切酶(Takara公司，1010S)，Xho I内切酶(Takara 公司，1094S)，T4 DNALigase(Takara公司，2011A)。
(5)蛋白及抗体：兔抗IL-21多克隆抗体(Abcam公司，ab5978)，兔 抗His-tag单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，12698T)，驴抗兔IgG-HRP抗体(金斯瑞，A00098)，羊抗鼠IgG HRP抗体(Southernbiotech 公司，1031-05)，羊抗鼠IgG1 HRP抗体(Southernbiotech公司，1071-05)， 羊抗鼠IgG2a HRP(Southernbiotech公司，1081-05)，羊抗鼠IgG2b HRP (Southernbiotech公司，1091-05)，羊抗兔IgG HRP(Southernbiotech公司， 4030-05)，商业化IL-21重组蛋白(义翘神州公司，10584-HNAE)，Anti-CD3 mouse抗体(Calbiochem公司，217570)，Anti-CD28 mouse抗体(Calbiochem 公司，217669)，Recombinanthuman IL-6(Peprotech公司，200-06)，Recombinant human IL-21(Peprotech公司，200-21)，Recombinant human IL-12(Peprotech 公司，200-12)，Recombinant humanTGF-β1(Peprotech公司，100-21)，PE 直接标记IL-21流式抗体(eBioscience公司，4300396)，PE标记驴抗鼠IgG 流式抗体(SouthernBiotech公司，6410-09)，鼠抗人IL-21生物素化抗体 (eBioscience，13-7218-81)，亲和素偶联HRP抗体(eBioscience，18-4100-51)。
(6)试剂：Density lymphocyte isolation sterile solution(GE公司， 17-1440-03)，TRIzo试剂(Thermofisher公司，15596026)，PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser试剂(Takara公司，RR047A)，Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)试剂盒(Takara公司，RR420A)，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生 工公司，B518131-0050)，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工公司， B518191-0050)，氨苄青霉素(Amp)(碧云天公司，ST007)，IPTG(碧云 天公司，ST098)，Western及IP细胞裂解液(碧云天公司，P0013J)，100mM PMSF(碧云天公司，ST506)，His GraviTrap(GE公司，11-0033-99)，10KD 透析膜(生工公司，F132572-0001)，弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)， 弗氏不完全佐剂(Sigma公司，F5506)，RPMI 1640培养基(Gibco公司， 61870036)，胎牛血清(Gibco公司，10099141C)，HAT(Sigma公司，H0262-10VL)， HT(Sigma公司，H0137-10VL)，红细胞裂解液(碧云天公司，C3702)，PEG2000 (Sigma公司，880133P)，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司，H0137-10VL)， AncillaryReagentKit(R&D公司，DY008)，CD4 MicroBeads,human细胞分 选试剂(Miltenyi公司，130-045-101)，Leukocyte Activation Cocktail with BDGolgiPlug antibody试剂(BD公司，PMG 550583)，Transcription Factor Buffer Set(BD公司，562574)，降植烷(Pristane，Sigma公司，P2870)，Protein G Agarose(Fast Flow,forIP)(碧云天公司，P2053)，Tris-HCl pH8.8(碧云天公 司，ST788)，10KD透析膜(生工公司，F132572-0001)，30kDa分子筛(Millipore 公司，UFC803008)，Human IL-21 ELISAMAXTMDeluxe试剂盒(Biolegend 公司，433804)。
本发明涉及的其他试剂如无特别说明为国产分析纯。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
实施例1制备IL-21重组蛋白
1.1构建人IL-21重组表达质粒
1.1.1获得人IL-21cDNA
1.1.1.1密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)
经知情同意后，无菌抽取正常人静脉血，约60ml，分装在3支50ml无菌 离心管中，每管20ml，加入20U/ml肝素，颠倒混匀，每管血中加入20ml常 温无菌PBS，充分混匀；取50ml无菌离心管，每管加入10-15ml Density lymphocyte isolation sterile solution无菌淋巴细胞分离液(GE公司，17-1440-03)， 用移液管沿管壁缓慢将稀释的外周血加于淋巴细胞分离液上；2000rpm(加速减 速均为0)18℃离心30min，吸取以单个核细胞为主的白色云雾层，置入另一离 心管中，加入30ml PBS至离心管中，充分混匀，1600rpm 4℃离心15min。重 复上述步骤用PBS洗涤细胞两次，得到PBMC，用台盼蓝法在显微镜下进行细 胞计数。
1.1.1.2提取总RNA
将细胞悬液分装入1.5ml EP管，离心弃上清，用PBS将细胞洗涤两遍， 每管细胞中加入1ml TRIzo试剂(Thermofisher公司，15596026)，充分吹打 混匀，室温下静置5min。向管内加入200μl 4℃预冷的氯仿，剧烈震荡混匀， 12000rpm(转/分钟)4℃离心15min。将上层水相小心移至另一新的1.5ml EP 管内，加入等体积4℃预冷的异丙醇，上下轻柔颠倒混匀，-20℃静置3-4h， 12000rpm 4℃离心30min，弃上清。向EP管内加入1ml 4℃预冷的75％无酶乙 醇，轻柔上下颠倒洗涤RNA沉淀，7500rpm 4℃离心5min，重复洗涤一次，弃 上清。用移液枪将液体吸干，室温干燥RNA沉淀约5min，加入20μl无酶水， 充分溶解RNA沉淀。分光光度计测量RNA浓度和OD值，置于-80℃冰箱保 存。
1.1.1.3制备cDNA
冰上溶解RNA样本。进行基因组DNA去除反应，用PrimeScript RT reagent KitWith gDNA Eraser试剂(Takara公司，RR047A)，取无酶200μl PCR管， 置于冰上，按下表依次加入：
Figure BDA0002790192730000081
轻弹管壁充分混匀，简短离心，42℃孵育2min，4℃孵育5min。
将反应管置于冰上进行逆转录，采用Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus) 试剂盒(Takara公司，RR420A)，反应液配置如下表：
Figure BDA0002790192730000082
Figure BDA0002790192730000091
轻弹管壁混匀，简短离心后放入PCR仪，37℃孵育15min，85℃孵育5s， 4℃保持。收集cDNA保存于-20℃。
1.1.2构建人IL-21重组表达质粒并验证
1.1.2.1 PCR扩增目的基因
扩增人IL-21基因的引物序列为(擎科公司合成)：
IL-21上游引物(SEQ ID No：4)：5’-GCCGTCTCGGATCC-3’(Bam H I)，
IL-21下游引物(SEQ ID No：5)：5’-GCCGTCTCCTCGAG-3’，
(互补序列为：5’-CTCGAGGAGACGGC-3’(Xho I))。
上游引入Bam H I内切酶位点，下游引入Xho I内切酶位点，通过PCR扩 增使目的片段去除天然IL-21分泌段的编码序列。以cDNA为模板，按照下表 配置PCR反应体系：
cDNA 2μl
IL-21上游引物 1μl
IL-21下游引物 1μl
Taq plus master mix 10μl
无酶水 6μl
PCR反应条件为：
Figure BDA0002790192730000092
1.1.2.2胶回收目的片段
采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工公司，B518131-0050)，通 过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的片段条带与其他杂带分开，用干净的手术刀将 含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入EP管中并称重。每100mg琼脂 糖凝胶加入300μl Buffer B2，50℃水浴5-10min，至胶块完全溶化，加入Buffer B2体积1/3的异丙醇混匀，移入吸附柱。10000rpm离心30s，加入300μl Buffer B2，10000rpm离心30s，加入500μl Wash Solution，10000rpm离心30s，重复 洗涤一次，空柱离心10000rpm离心30s，加入30μl Elution Buffer室温静置 1-2min，10000rpm离心30s。吸取IL-21cDNA于-20℃保存。
1.1.2.3重组表达载体的构建
原核表达质粒选择改造的pET21a(湖南远泰生物技术有限公司)，载体 结构如图1所示，该改造载体在T7启动子后引入GST标签编码序列，多克隆 位点之间引入6xHis标签编码序列和TEV位点编码序列，使得该载体表达的 重组蛋白带有GST标签，TEV位点，HIS标签。GST标签可促进重组蛋白形 成可溶结构，且可作为纯化标签。TEV酶可识别并切开TEV位点，获得仅含 目的蛋白及1个甘氨酸的重组蛋白。该载体质粒可用氨苄青霉素(Amp)(碧 云天公司，ST007)进行筛选。通过设计引物扩增IL-21编码序列，去除天然 IL-21编码序列的分泌段，并在Xho I位点前引入新的终止子。
上述胶回收的IL-21cDNA及载体质粒pET21a经Bam H I及Xho I内切酶 (均为Takara公司，1010S，1094S)处理之后，通过琼脂糖凝胶电泳尽可能 将含粘性末端的目的片段与被切下来的小片段分开。在紫外灯下选取符合目的 片段分子量大小的条带，用干净的手术刀将含目的片段的琼脂糖凝胶块切下， 放入EP管中称重，如1.1.2.2所述进行胶回收。双酶切加样体系如下：
Figure BDA0002790192730000101
Figure BDA0002790192730000111
反应条件：37℃水浴4小时。分别用1％琼脂糖凝胶进行电泳及胶回收。
经过双酶切形成粘性末端的IL-21cDNA及载体pET21a按3mol IL-21 cDNA：1molpET21a进行连接。连接采用T4 DNA Ligase(Takara公司，2011A)， 连接加样体系如下：
加样物 体积
pET21a 11.4μl
IL-21 cDNA 4.6μl
T4 Ligase酶 2μl
10x Buffer 2μl
总计 20μl
反应条件：16℃水浴过夜。
1.1.2.4重组表达载体的筛选
将-80℃冻存的DH5α感受态细胞(擎科公司，TSV-A07)冰上融化，取3管 感受态细胞，1管做未转化对照，1管做转化空pET21a对照，1管加入连接产 物。将5μl连接产物加入100μl感受态细胞中，轻柔吹打混匀，冰上放置30min， 在精确的42℃水浴中热击90s，迅速移到冰上冷却5min。向每管转化细菌中加 入室温的800μl LB(Amp-)培养基，摇床中37℃150rpm振荡培养30-60min。 3000rpm室温离心5min，留50μl弃其余上清，轻柔重悬细菌沉淀，涂布于LB (Amp+)培养板。设空白平皿、未转化平皿、转化空pET21a平皿、转化重组 质粒平皿。37℃培养箱过夜培养，第二天挑取单个克隆菌落，在30μl LB培养 基中混匀，取5μl进行菌液PCR，余下放入小管LB(Amp+)液体培养基中， 37℃150rpm振荡培养4-5h。菌液PCR反应体系如下：
菌液 5μl
IL-21上游引物 1μl
IL-21下游引物 1μl
Taq plus master mix 10μl
无酶水 3μl
PCR反应条件同1.1.2.1所述。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，IL-21目的 片段分子量处有明亮条带为菌液PCR阳性，选择该单克隆菌在LB(Amp+) 液体培养基中进行小量摇菌并保种。
1.1.2.5重组表达载体的鉴定
采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工公司，B518191-0050) 进行小量质粒提取。取过夜培养菌液20ml，8000rpm室温离心5min，弃上清。 在沉淀中加入250μlBuffer P1，彻底吹打悬浮菌体，加入250μl Buffer P2，颠 倒混匀，室温静置5min，加入350μl Buffer P3，颠倒混匀待沉淀完全。离心机 最大转速室温离心20min，将上清全部移入吸附柱同时避免加入沉淀，8000rpm 离心30s。加入500μl去蛋白液Buffer DW1，8000rpm离心30s，加入500μl Wash Solution，8000rpm离心30s，重复洗涤一次，空柱离心8000rpm 30s。在吸附 膜中央加入60μl Elution Buffer，室温静置1min，8000rpm离心1min。用分光 光度计测浓度及A260/280。
小量抽提的重组质粒和空pET21a质粒均经过Bam H I及Xho I内切酶处 理，条件同1.1.2.3所述。双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择同时含有IL-21 目的片段和pET21a载体片段的重组质粒送公司测序。测序结果表明重组表达 载体pET21a-IL21构建成功，该重组载体表达框为：T7启动子-GST标签-His 标签-TEV位点-IL21编码片段-终止子。预期表达的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，重组蛋白为GST-HIS-TEV-IL21，预期分子量大小为43kDa。
1.2人IL-21重组蛋白的原核表达
1.2.1获得含重组表达质粒的表达菌
将测序验证的重组表达载体pET21a-IL21转染入BL21(DE3)表达菌(擎 科公司，TSV-A09)中，在LB(Amp+)固体平板上连续划线接种，37℃培养 过夜。第二天挑取离群的单个克隆菌落在500μl LB(Amp+)液体培养基中37℃ 150rpm振荡培养4-6h。取菌液送公司测序验证，序列无突变的菌种进行摇菌 并保种。取400μl浑浊的新鲜菌液加入400μl 60％无菌甘油，颠倒混匀后置于 -80℃长期保存。
1.2.2诱导重组蛋白表达及条件优化
诱导BL21(DE3)重组表达菌进行外源重组蛋白的表达。通过在菌液内 加入不同浓度的诱导剂IPTG(碧云天公司，ST098)诱导重组质粒表达目的基 因并优化表达条件。将重组表达菌接种到200ml LB(Amp+)液体培养基中， 37℃180-220rpm振荡培养过夜。第二天取6管浑浊菌液，每管20ml，在菌液 内加入100mM IPTG至终浓度为0，0.2，0.5，1，2，5mmol/l，37℃180-220rpm 继续震荡培养4h。收集各IPTG浓度的菌液1ml入EP管中，10000rpm室温离心，弃上清。每管加入Western及IP细胞裂解液(碧云天公司，P0013J)和 100mM PMSF(碧云天公司，ST506)，细胞裂解液：100mM PMSF＝1000:1， 充分重悬混匀冰上静置30min，超声裂解，10000rpm 4℃离心10min。收集上 清至新EP管。沉淀加入1ml 4℃预冷PBS洗涤，离心弃上清，重复洗涤1次。
各上清和沉淀分别配置蛋白上样缓冲液，同时加入2块10％SDS-PAGE 胶进行电泳。电泳条件为80V恒压电泳20-30min，待蛋白指示条带移动至浓 缩胶与分离胶交界处时，将条件改为120V恒压电泳30-60min，待蛋白指示条 带移动距凝胶下缘1cm处停止电泳。取出1块凝胶进行考马斯亮蓝染色，另1 块凝胶进行免疫印迹检测。免疫印迹采用兔抗IL-21多克隆抗体(Abcam公司，ab5978)及兔抗His-tag单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，12698T) 1:1000稀释作为一抗，4℃孵育过夜，驴抗兔IgG-HRP抗体(金斯瑞，A00098)1:5000稀释作为二抗。
结果如图2B所示，免疫印迹显示在细菌裂解沉淀的泳道中，相比于 0mmol/lIPTG，0.2，0.5，1，2，5mmol/l浓度IPTG的诱导下IL-21重组蛋白 表达量均明显升高，且均有IL-21及His条带，2个条带位置一致且符合分子 量大小预期(43kDa)；而细菌裂解上清中未检测到IL-21重组蛋白的表达。 图2A的考马斯亮蓝染色佐证这一结果。综合上述结果发现，当IPTG终浓度 为0.5mmol/l时IL-21重组蛋白在细菌裂解沉淀中表达量较高。
1.2.3重组蛋白的镍柱纯化
根据上述表达条件的优化结果，将BL21(DE3)重组表达菌加入5瓶200ml LB(Amp+)液体培养基中，37℃180-220rpm振荡培养过夜。第二天在菌液中 加入100mM IPTG至终浓度为0.5mmol/l，继续震荡培养4小时。将浑浊菌液 10000rpm室温离心，收集菌体沉淀于同一离心管内并称重。细胞裂解液和 100mM PMSF按1000:1混合为裂解混合液，每克湿菌加入15ml裂解混合液， 充分重悬混匀冰上静置30min。冰水浴中超声裂解，每次30s间隔30s，至溶 液中出现黑色颗粒物，10000rpm4℃离心10min弃上清。沉淀加入10ml 4℃预 冷裂解混合液充分重悬，离心弃上清，加入10ml 1M尿素溶液充分重悬，离心 弃上清，重复洗涤2次。每克湿菌加入10ml 8M尿素溶液，室温下搅拌30-60min 充分溶解沉淀内的包涵体，10000rpm室温离心10min取上清。
选择His GraviTrap(GE公司，11-0033-99)纯化柱对IL-21重组蛋白进行 纯化。安装His纯化柱，用10ml含0mM咪唑8M尿素的Binding buffer平衡 柱子，向柱内加入含重组蛋白的包涵体溶液，分别用含0mM咪唑8M尿素、 10mM咪唑8M尿素、20mM咪唑8M尿素的Washbuffer 20ml洗柱，依次用含 300mM咪唑8M尿素、500mM咪唑8M尿素的Elution buffer 5ml洗脱。收集 各部分滤液，进行后续验证。对含有目的蛋白的Elution buffer进行混合后装入 10KD透析膜(生工公司，F132572-0001)封口，依次置于4℃预冷的10xPBS、 5xPBS、2xPBS内轻柔震荡透析4-6h，置于4℃预冷的1xPBS内轻柔震荡透析 过夜。目的蛋白在连续透析后形成沉淀，10000rpm 4℃离心10min收集沉淀。
1.2.4重组蛋白的纯度验证
用10％SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，操作步骤如1.2.3所述，鉴定 纯化后IL-21重组蛋白。结果如图2C所示，纯化后IL-21重组蛋白纯度达到 95％，目的条带位于43kDa左右，符合预期，通过BSA蛋白半定量比对得出 IL-21重组蛋白浓度。该IL-21重组蛋白可作为抗原进行动物免疫。
实施例2杂交瘤细胞株的制备及筛选
2.1免疫小鼠
使用10只6-8周龄雌性Balb/c小鼠，多次进行注射免疫及血清抗体效价 检测。
2.1.1首次免疫
将50μg IL-21重组蛋白与50μl弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)混合， 用无菌PBS将体积补足至100μl，混合后充分乳化至油包水状。每只Balb/c小 鼠背部多点皮下注射共100μl。
2.1.2加强免疫
首次免疫后28天，将50μg IL-21重组蛋白与50μl弗氏不完全佐剂(Sigma 公司，F5506)混合，用无菌PBS将体积补足至100μl，混合后充分乳化至油 包水状。每只Balb/c小鼠背部多点皮下注射共100μl。加强免疫分多次进行， 之间间隔28天。
第三次免疫之后开始，每次加强免疫7天后经大腿静脉采集小鼠血清，按 2.3.1所述方法进行血清抗体效价检测。1:1000稀释倍数下，免疫后血清OD值 较免疫前血清OD值增长3倍以上则认为IL-21特异性抗体效价较高，即该小 鼠可用于融合，若效价未达到则按上述方法再次进行加强免疫。结果如图3A 所示，编号为2、3、4、7的小鼠经过多次免疫后血清中抗原特异性IL-21抗体 的OD值较免疫前升高5倍以上，可用于细胞融合。
2.1.3冲击免疫
根据骨髓瘤SP2/0细胞状态选择冲击免疫时间。细胞融合前3天，对血清 高抗体效价的小鼠进行冲击免疫。用无菌PBS稀释50μg IL-21重组蛋白使总 体积为200μl，进行腹腔注射。
2.2细胞融合，单克隆杂交瘤细胞株建立
2.2.1准备饲养细胞
细胞融合前一天，取6只8周以上Balb/c小鼠颈椎脱臼法处死，固定后以 无菌注射器向腹腔内注射10ml RPMI 1640培养基(Gibco公司，61870036)并 灌洗，抽回腹腔内液体，注入离心管内，1600rpm 18℃离心10min弃上清。以 1ml含10％胎牛血清(Gibco公司，10099141C)、1％HAT(Sigma公司， H0262-10VL)的RPMI 1640培养基(以下简称HAT完全培养基)重悬细胞并 以台盼蓝法进行细胞计数，调整细胞密度为1x105/ml，每孔200μl加入96孔板， 置于37℃5％CO2细胞培养箱中进行培养。
2.2.2准备SP2/0骨髓瘤细胞
提前复苏SP2/0骨髓瘤细胞，以1640完全培养基连续传代培养。选择生 长状态良好活性率高的细胞培养瓶，用RPMI 1640培养基将细胞从细胞瓶中轻 柔吹下，1600rpm 18℃离心10min弃上清，PBS洗涤1遍并充分重悬细胞，以 台盼蓝法进行细胞计数活细胞数。
2.2.3准备脾细胞
选择血清IL-21抗体效价高的小鼠在融合前3天进行冲击免疫。颈椎脱臼 法处死小鼠，浸泡75％酒精后无菌取出脾脏放入6孔板。在孔板内用RPMI 1640 培养基洗涤脾脏2遍并研磨，经过200目细胞筛网过滤，1600rpm 18℃离心 10min，弃上清。用5ml室温无菌红细胞裂解液(碧云天公司，C3702)充分重 悬细胞，室温静置3min，加无菌PBS至40ml，离心弃上清。1ml PBS充分重 悬细胞，以台盼蓝法进行细胞计数。
2.2.4细胞融合
小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10:1的比例于离心管中混合均匀， 1600rpm 18℃离心10min弃上清。涡旋震荡沉淀使细胞混匀，缓慢加入1ml 37℃ 预热的50％PEG2000(Sigma公司，880133P)，同时旋转摇匀，室温下静置 1min。由慢至快滴加10ml 37℃预热的RPMI 1640培养基终止反应，37℃水浴 中静置10min，1600rpm 18℃离心10min，弃上清。用HAT完全培养基重悬细 胞，以台盼蓝法进行细胞计数，调整活细胞密度为0.5x105/ml。取出已铺饲养 细胞的96孔板，弃去原有培养基，每孔加入200μl融合细胞悬液，置于37℃5％CO2细胞培养箱中进行培养。
2.2.5母克隆杂交瘤细胞
用HAT完全培养基进行连续筛选培养，第3天用新鲜HAT完全培养基进 行半量换液，第5、8、11、14天用含20％胎牛血清、1％HT(Sigma公司， H0137-10VL)的RPMI 1640培养基(以下简称HT完全培养基)进行全换液。 观察细胞生长情况，选择培养基上清变黄或细胞汇合度高的孔，融合后第15 天取培养基上清。如2.3.2所述，进行抗体效价的ELISA检测，以新鲜培养基 作为阴性对照。筛选得到表达抗IL-21抗体的母克隆杂交瘤细胞。
2.2.6单克隆杂交瘤细胞及筛选
对上述母克隆杂交瘤细胞进行有限稀释。提前1天如2.2.1所述进行饲养 细胞的准备，将阳性母克隆孔内细胞用HT完全培养基轻柔吹下，细胞计数并 调整细胞密度为3-5/ml。弃去饲养细胞孔板内培养基，每孔加入200μl杂交瘤 细胞悬液，置于37℃5％CO2细胞培养箱中进行培养。根据细胞生长状态每2-4 天进行换液。7-10天后可观察到细胞克隆形成，将细胞克隆转移至24孔培养 板中进行扩大培养并冻存。如2.3.2所述，进行抗体效价的ELISA检测，分别 用IL-21重组蛋白与商业化IL-21重组蛋白作为抗原进行检测，筛选出10株高 表达抗IL-21抗体的单克隆杂交瘤细胞，重新编号为1-10。
结果如图3B所示，编号为1-10的单克隆杂交瘤细胞株产生的抗体对IL-21 抗原均有较好的亲和力。如图3C所示，编号为1、2、3、4、5、7、8、10的 单克隆杂交瘤细胞株产生的抗体对商业化IL-21重组蛋白有较好的亲和力。综 合图3B、3C的结果，编号为1、2、3、4、5、7、8、10单克隆杂交瘤细胞株 产生的抗体对IL-21抗原及商业化IL-21重组蛋白均有较好的亲和力。
进一步的，如2.3.3所述，通过流式细胞检测培养基上清中单克隆抗体与 人细胞内IL-21的亲和力。结果如图3D所示，1、2、3、6单克隆杂交瘤细胞 株产生的抗体可识别并结合人细胞内IL-21。综合上述结果，筛选出3株能特 异性识别并结合人IL-21蛋白及人细胞内IL-21的单克隆杂交瘤细胞株，其编 号为：1、2、3；克隆号为：5B657、5B6C2和7A5D2。
2.2.7冻存保种
将上述3株杂交瘤细胞在1640完全培养基中继续进行培养、传代。培养 10代后，杂交瘤细胞仍生长良好、稳定传代，其培养基上清中抗体效价仍达到 1:1000以上。在此过程中需冻存部分杂交瘤细胞进行保种。二甲基亚砜(DMSO) (Sigma公司，H0137-10VL)与胎牛血清以1:9的比例混合为细胞冻存液。将 杂交瘤细胞用1640完全培养基轻柔吹下，1600rpm18℃离心10min，弃上清， 每2-10x106cell加入1ml细胞冻存液，充分重悬后加入冻存管，放入缓冻冰盒 置于-80℃，次日将冻存管转移入液氮罐保存。
2.3 IL-21抗体效价检测
2.3.1血清抗体效价ELISA检测
大腿静脉采血法收集免疫前及加强免疫后小鼠外周血20-40μl/只，5000rpm 4℃离心20min，收集血清于新EP管，冻存于-80℃。采用IL-21重组蛋白进行 包板，羊抗鼠IgGHRP抗体(Southernbiotech公司，1031-05)作为检测抗体， ELISA其余组分来自AncillaryReagent Kit(R&D公司，DY008)。操作方式 如下：用无菌PBS稀释IL-21重组蛋白使终浓度为2.0μg/ml，在ELISA板中加 100μl/孔，封板后4℃过夜。次日取出ELISA板，弃去孔板内液体加无菌PBST 200-300μl/孔，洗板并拍干，重复3次。孔板加200μl/孔无菌1％BSA，封板后 于水平摇床上室温孵育1h。洗板3次并拍干。冰上解冻免疫前及免疫后待测小 鼠血清，5000rpm 4℃离心20min，取上清用无菌PBS 1:1000稀释，加100μl/ 孔，封板后于水平摇床上室温孵育2h。洗板4次并拍干。羊抗鼠IgG HRP抗 体用无菌PBS 1:3000稀释，加100μl/孔，封板后于水平摇床上室温孵育1h。 洗板4次并拍干。避光加入新鲜配置的TMB显色剂(过氧化氢与四甲基联苯 胺在避光条件下等体积混合)100μl/孔，封板后于水平摇床上室温孵育10min。 加终止液2N硫酸50μl/孔，充分混匀后孔内液体由蓝变黄。用多功能酶标仪读 取溶液在450nm处的OD值。
2.3.2培养基上清抗体效价ELISA检测
收集细胞融合后母克隆或单克隆杂交瘤细胞的培养基上清，5000rpm 4℃ 离心10min，收集上清于新EP管，冻存于-20℃。用IL-21重组蛋白进行包板， 培养基上清不进行稀释，其余ELISA条件及操作步骤如2.3.1所述，对母克隆 及单克隆杂交瘤细胞株进行初次筛选。得到10株与IL-21重组蛋白有特异性结 合的单克隆细胞株，编号为1-10，分别采用终浓度为2.0μg/ml IL-21重组蛋白 及终浓度为2.0μg/ml商业化IL-21重组蛋白(不含GST标签蛋白)(义翘神州 公司，10584-HNAE)进行包板，交叉检测杂交瘤细胞培养基上清抗体效价。 培养基上清不进行稀释，其余ELISA条件及操作步骤如2.3.1所述。
2.3.3培养基上清抗体效价流式检测
收集上述1-10号表达IL-21抗体的单克隆杂交瘤细胞培养基上清，5000rpm 4℃离心10min，收集上清于新EP管，冻存于-20℃。
2.3.3.1外周血CD4+T细胞的分离纯化
密度梯度离心法获得PBMC，具体步骤同1.1.1.1，获得3例正常人PBMC。 使用CD4MicroBeads,human细胞分选试剂(Miltenyi公司，130-045-101)从 PBMC中分离CD4+T细胞。将计数后PBMC加入预冷的Buffer和MACS CD4 磁珠，每107个细胞加入80μl Buffer和20μlMACS CD4磁珠，使用移液枪将 细胞轻柔吹打混匀，注意避免产生气泡，将细胞置于4℃，避光孵育15min。 加入20ml 4℃预冷Buffer混匀，2000rpm(加速度为8，减速度为9)4℃离心10min，弃上清，用500μl预冷Buffer将细胞重悬放置于冰上。将LS分离柱放 置在Midi MACS分选器上，将3ml预冷Buffer加入LS分离柱中，使分离磁 珠润湿。当分离柱中的Buffer滴完后，用移液枪将已孵育磁珠的细胞悬液加入 分离柱中，加柱的过程中避免产生气泡，等液体滴完后再用预冷Buffer洗涤分 离柱，共3次每次使用3ml，弃掉流出液体。将LS分离柱从磁场中移出，放 置在15ml离心管上，加入5ml预冷Buffer，使用推送器，将Buffer推挤至15ml 离心管中，2000rpm(加速度为8，减速度为9)4℃离心10min，去上清，管 底沉淀即为CD4+T细胞。以含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(以下简称 1640完全培养基)重悬，计数后用于后续实验。
2.3.3.2诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化
取24孔培养板，提前加入0.5ml含5μg/mlAnti-CD3抗体的PBS溶液，将24孔板放入细胞培养箱37℃孵育4-6h。取出已包被Anti-CD3抗体的24孔板， 用移液器弃去孔板中的PBS。将每例CD4+T细胞以1640完全培养基调整终浓 度为5×105/ml，按下表加入各成分及终浓度为：
成分 终浓度 公司及货号
Anti-CD3mouse抗体(已包被) 5μg/ml Calbiochem公司217570
Anti-CD28mouse抗体 2μg/ml Calbiochem公司217669
RecombinanthumanIL-6 20ng/ml Peprotech公司200-06
RecombinanthumanIL-21 20ng/ml Peprotech公司200-21
RecombinanthumanIL-12 10ng/ml Peprotech公司200-12
RecombinanthumanTGF-β1 5ng/ml Peprotech公司100-21
每孔1ml加入24孔板，置于37℃5％CO2细胞培养箱中进行培养。5天后 Tfh细胞比例有明显升高。
2.3.3.3流式细胞检测培养基上清抗体与Tfh细胞内IL-21结合力
每例正常人的诱导细胞经PBS轻柔吹下后离心收集，用1640完全培养基 调整细胞浓度为1-3×106/ml，并加入Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlugantibody试剂(BD公司，PMG 550583)，阻断细胞内高尔基体及内 质网。充分混匀后，每孔1ml加入24孔板，置于37℃5％CO2细胞培养箱中 培养4-6h。计数后加入14个流式管，每个流式管5×105个诱导分化的细胞。 流式管内加入1ml 4℃的PBS，1600rpm 4℃离心10min，弃上清。每管加入200μl 4℃预冷的Transcription Factor Buffer Set(BD公司，562574)破细胞膜，涡旋 混匀后4℃避光孵育20分钟。加入1ml 4℃的PBS，1800rpm 4℃离心10min， 弃上清，重复1次，尽量弃尽上清。流式管按下表分组标记并加入相应试剂：
Figure BDA0002790192730000211
Figure BDA0002790192730000221
加入“试剂1”并涡旋混匀，4℃孵育60min，每管加入5ml 4℃预冷PBS， 1800rpm 4℃离心10min，弃上清，重复1次。用50-100μl PBS重悬细胞，加 入“试剂2”并涡旋混匀，4℃避光孵育30min。每管加入5ml 4℃预冷PBS，离 心弃上清，重复1次，用200μl PBS重悬细胞。用BD FACSCanto II流式机进 行检测，用FlowJo软件进行分析，圈取淋巴细胞分群。在淋巴细胞亚群中以 IL-21间接标记管为阴性参照，圈取样本管高表达IL-21细胞群，并与IL-21直 接标记管的细胞比例进行比较(直接标记管以空白管作为阴性参照进行圈门)。
实施例3单克隆抗体的制备及纯化
3.1杂交瘤细胞腹水生产抗体
3.1.1癌性腹水
9只8-10周龄雌性Balb/c小鼠分为A、B、C组，每组3只，每只小鼠腹 腔注射500μl降植烷(Pristane，Sigma公司，P2870)。7天后A组小鼠腹腔 注射生长良好的1x106个5B6B7杂交瘤细胞，B组小鼠腹腔注射生长良好的 1x106个5B6C2杂交瘤细胞，C组小鼠腹腔注射生长良好的1x106个7A5D2杂 交瘤细胞。观察小鼠状态，7天后待腹部明显膨隆略有紧张感时通过无菌注射 器抽取腹水装入离心管中。
3.1.2腹水处理
腹水经1800rpm 18℃离心10min去除细胞及碎片，小心挑出絮状的纤维蛋 白及膜状的脂肪，取上清转入新离心管。向腹水上清中加入3倍体积无菌PBS 进行稀释，颠倒混匀4℃静置30min，3000rpm 4℃离心30min，再次取上清通 过0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液冻存于-20℃。
3.2 Protein G蛋白纯化
使用Protein G Agarose(Fast Flow,for IP)(碧云天公司，P2053)进行蛋白 纯化。所用溶液需经过0.45μm或0.22μm无菌滤膜过滤并排除气泡，保持低温。 各取3mlProtein G Agarose加入3个亲和层析柱内。待溶液自然流出Protein G Agarose Beads充分沉降后，用30ml 4℃预冷TBS洗涤并平衡纯化柱。将4℃ 的腹水稀释样本少量多次加入纯化柱，流速小于1ml/min，收集流出液。待样 本过柱后，用3ml 4℃预冷TBS洗涤10次，以去除未结合和非特异性结合的 蛋白。测定流出液在280nm的OD值，当减少为基线水平时可认为洗涤完全。 以含50mM甘氨酸的TBS且经盐酸调节pH2.7作为洗脱液。用1ml 4℃预冷的 洗脱液洗脱5-15次，洗脱结合的抗体，直到流出液在280nm的OD值减少为 基线水平。每个收集管中预先加入1M Tris-HCl pH8.8(碧云天公司，ST788) 100μl，每管收集1ml洗脱下的抗体立即混匀。根据280nm的OD值确定洗脱 峰所在的收集管。
对纯化各步液体收集，进行考马斯亮蓝染色。结果如图4所示，3株单克 隆抗体从腹水中富集出来且纯度较高。对含有抗体的收集管进行混合后装入 10KD透析膜(生工公司，F132572-0001)封口，依次置于4℃预冷的10xPBS、 5xPBS、2xPBS pH7.0-7.4内轻柔震荡透析4-6h，置于4℃预冷的1xPBS pH7.0-7.4 内轻柔震荡透析过夜。用30kDa分子筛(Millipore公司，UFC803008)进行抗 体浓缩。将含抗体的溶液加入30kDa分子筛，离心机最大转速4℃离心30-60min， 弃掉离心管内分子筛下液体，重复离心直至蛋白浓缩达到满意浓度。
3.3抗IL-21单克隆抗体验证
3.3.1抗IL-21单克隆抗体亚型检测
免疫印迹鉴定纯化的单克隆抗体亚型。取3株抗体的纯化收集管，蛋白浓 度使用Thermo公司的BCA试剂盒进行定量。纯化抗体各取2μg x3孔加5x、1x Loading Buffer配置蛋白上样缓冲液，98℃金属浴10min，3000rpm 4℃离心 10min。配置10％SDS-PAGE并安装入电泳槽，加入1×SDS-PAGE电泳液，取 蛋白上样缓冲液进行上样，每株纯化抗体3个孔，每孔2μg。电泳条件为80V恒 压，电泳20-30min，蛋白条带跑至浓缩胶与分离胶交界处时，将电泳条件改为 120V恒压，30-60min。将SDS-PAGE和PVDF膜安装入转膜夹置于湿转仪中， 加入转膜缓冲液，350mA恒流，转膜90min。转膜结束后，将PVDF膜置于 5％的脱脂牛奶，脱色摇床上室温封闭1小时。
裁剪PVDF膜分离泳道，各抗体样本分别孵育1:3000稀释的羊抗鼠IgG1 HRP抗体(Southernbiotech公司，1071-05)，羊抗鼠IgG2a HRP(Southernbiotech 公司，1081-05)，羊抗鼠IgG2b HRP(Southernbiotech公司，1091-05)，摇 床上4℃孵育过夜。化学发光显色，结果如图5所示，3株抗体亚型均以IgG2a、 IgG2b为主。
3.3.2抗IL-21单克隆抗体结合力检测
3.3.2.13株抗IL-21单克隆抗体与抗原结合力
采用终浓度为2.0μg/ml IL-21重组蛋白即抗原进行包板，将3株单克隆抗 体进行梯度稀释后作为待测抗体，稀释梯度：1μg/ml，10-1μg/ml，10-2μg/ml， 10-3μg/ml，10-4μg/ml，10-5μg/ml，10-6μg/ml。以1％BSA作为阴性对照，以PBS 作为空白对照，以终浓度10-3μg/ml兔抗IL-21多克隆抗体(Abcam公司，ab5978) 作为阳性对照。分别以1：3000稀释的羊抗鼠IgGHRP，羊抗兔IgG HRP (Southernbiotech公司，4030-05)为检测抗体。ELISA其余组分来自Ancillary Reagent Kit，具体操作步骤如2.3.1所述。以样本450nm处OD值减空白对照 OD值进行结合力曲线绘制，结果如图6A所示，3株单克隆抗体与IL-21重组 蛋白抗原的结合力均符合浓度效应关系，其中5B6C2、7A5D2与抗原结合力高 于5B6B7。
3.3.2.23株抗IL-21单克隆抗体与商业化IL-21重组蛋白结合力
采用终浓度为1.0μg/ml商业化IL-21重组蛋白(不含GST标签蛋白)(义 翘神州公司，10584-HNAE)进行包板。所用抗体及具体操作与3.3.2.1一致。 以样本450nm处OD值减空白对照OD值进行结合力曲线绘制，结果如图6B 所示，3株单克隆抗体与商业化IL-21重组蛋白的结合力均符合浓度效应关系， 其中5B6C2、7A5D2与商业化IL-21蛋白的结合力高于5B6B7，且在较高浓度 (＞10-2μg/ml)时5B6C2、7A5D2结合力高于商业化IL-21多克隆抗体。在浓 度为1μg/ml时，3株抗IL-21单克隆抗体与商业化IL-21蛋白的结合已达到该 实验检测上限。
3.3.2.33株抗IL-21单克隆抗体与人细胞内IL-21结合力
本发明提供的3株抗IL-21单克隆抗体可作为一抗标记人细胞内IL-21，间 接结合PE标记的驴抗鼠IgG二抗，通过流式细胞检测细胞内IL-21表达。本 发明采用IL-21表达量较高的Tfh细胞进行检测，Tfh细胞获得方法同2.3.3.1 及2.3.3.2所述。如2.3.3.3所述，对诱导分化的细胞进行离子霉素高尔基体阻 断剂处理4-6h，细胞计数后每流式管1x106细胞，洗涤后破细胞膜。对3株抗 IL-21单克隆抗体进行梯度稀释，流式管内分别加入3株抗体质量：0.1μg，0.2μg， 0.5μg，1.0μg，2.0μg。以PE直接标记IL-21流式抗体作为阳性对照，以仅加 PE标记驴抗鼠IgG流式抗体作为阴性对照，以未加抗体的细胞作为空白对照。 样本管分别加入梯度浓度的3株抗IL-21单克隆抗体并涡旋混匀，4℃孵育 60min，4℃预冷PBS洗涤2次，弃上清，用50-100μl PBS重悬细胞。样本管、 阳性及阴性对照管加入相应抗体并涡旋混匀，4℃避光孵育30min，4℃预冷PBS 洗涤2次，弃上清，用200μl PBS重悬细胞。
用BD FACSCanto II流式机进行检测，用FlowJo软件进行分析，圈取淋 巴细胞分群。在淋巴细胞亚群中以仅加PE标记驴抗鼠IgG管为阴性参照，圈 取样本管高表达IL-21细胞群，比较梯度浓度的3株抗IL-21单克隆抗体与细 胞内IL-21的结合力，并与PE直接标记IL-21管的细胞比例进行比较(直接标 记管以空白管作为阴性参照进行圈门)。
结果如图6C、6D所示，5B6B7、5B6C2抗体与细胞内IL-21的结合力存 在高浓度抑制现象，均在1.0μg/1x106细胞时结合力较高。与商业化PE直接标 记IL-21流式抗体相比，5B6B7检测细胞内IL-21的灵敏性更高，5B6C2检测 细胞内IL-21的灵敏性与商业化IL-21流式抗体无明显差异，7A5D2检测细胞 内IL-21的灵敏性较差。综合上述结果，流式检测细胞内IL-21采用浓度为 1.0μg/1x106细胞的5B6B7单克隆抗体最佳，其灵敏性高于商业化IL-21直接标 记流式抗体。
实施例4三株单克隆抗体应用
4.1用于流式检测人细胞内IL-21水平
本发明提供的3株抗IL-21单克隆抗体均可作为一抗标记人细胞内IL-21， 其中克隆号为5B6B7的抗IL-21单克隆抗体最适用于流式检测。其具体的流式 检测条件及操作为：如1.1.1.1所述，获得PBMC，细胞经PBS洗涤、计数后 离心收集。如2.3.3.3所述，用1640完全培养基调整细胞浓度为1-3×106/ml， 并加入Leukocyte Activation Cocktail with BDGolgiPlug antibody试剂，阻断细 胞内高尔基体及内质网4-6h，细胞计数后每流式管加入1x106细胞。对细胞膜 表面的分子进行常规流式抗体染色。PBS洗涤后每管加入200μl 4℃预冷的 Transcription Factor Buffer破细胞膜，涡旋混匀后4℃避光孵育20分钟。加入1ml 4℃的PBS，1800rpm 4℃离心10min，弃上清，重复1次，尽量弃尽上清。 按1.0μg/1x106细胞在样本管内加入5B6B7抗IL-21单克隆抗体并涡旋混匀，4℃ 孵育60min，4℃预冷PBS洗涤2次，弃上清，用50-100μl PBS重悬细胞。按 1.0μl/1x106细胞在样本管内加入PE标记的驴抗鼠IgG二抗(可换为其他荧光 素标记的抗鼠IgG流式抗体)涡旋混匀，4℃避光孵育30min，4℃预冷PBS洗 涤2次，弃上清，用200μl PBS重悬细胞。
用BD FACSCanto II流式机进行检测，用FlowJo软件进行分析。结果如 图6C、6D所示，检测人细胞内IL-21表达时，克隆号为5B6B7的抗IL-21单 克隆抗体敏感性高于商业化IL-21直接标记流式抗体，且特异性高。
4.2用于ELISA检测人体液及细胞培养上清中IL-21水平
以Human IL-21 ELISA MAXTMDeluxe试剂盒(Biolegend公司，433804) (以下简称为试剂盒)为人血清IL-21水平检测的标准对照，所含试剂按说明 书配制。用无菌PBS稀释5B6B7、5B6C2、7A5D2三株抗IL-21单克隆抗体使 终浓度为5μg/ml，稀释试剂盒中IL-21捕获抗体，100μl/孔加入ELISA板，封 板后4℃过夜。(以下操作试剂盒与单克隆抗体均相同)次日取出ELISA板， 弃去孔板内液体加无菌PBST 200-300μl/孔，洗板并拍干，重复3次。孔板加 200μl/孔无菌1％BSA，封板后于水平摇床上室温孵育1h。洗板3次并拍干。
以商业化IL-21重组蛋白(不含GST标签蛋白)(义翘神州公司， 10584-HNAE)作为标准蛋白，用无菌1％BSA进行梯度稀释：200ng/ml，100ng/ml， 50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml，0ng/ml。梯度浓度的商 业化IL-21重组蛋白100μl/孔加入已包被5B6B7、5B6C2、7A5D2及试剂盒IL-21 捕捉抗体的ELISA孔中，封板后于水平摇床上室温孵育1h。弃去孔板内液体 加无菌PBST 200-300μl/孔，洗板并拍干，重复3次。
将鼠抗人IL-21生物素化抗体(eBioscience，13-7218-81)用无菌1％BSA 稀释至0.5μg/ml，同时稀释试剂盒IL-21检测抗体，100μl/孔分别加入5B6B7、 5B6C2、7A5D2及试剂盒的ELISA板，封板后于水平摇床上室温孵育1h。弃 去孔板内液体加无菌PBST 200-300μl/孔，洗板并拍干，重复3次。
将亲和素偶联HRP抗体(eBioscience，18-4100-51)用无菌1％BSA 1:1000 稀释，同时稀释试剂盒IL-21检测酶，100μl/孔分别加入5B6B7、5B6C2、7A5D2 及试剂盒的ELISA板，封板后于水平摇床上室温避光孵育30min。弃去孔板内 液体加无菌PBST 200-300μl/孔，洗板并拍干，重复4次。
避光加入新鲜配置的TMB显色剂(过氧化氢与四甲基联苯胺在避光条件 下等体积混合)100μl/孔，封板后于水平摇床上室温孵育10min。加终止液2N 硫酸50μl/孔，充分混匀后孔内液体由蓝变黄。用多功能酶标仪读取溶液在 450nm处的OD值。
结果如图7所示，ELISA检测IL-21的标准曲线拟合度R2均>0.99，与人 IL-21ELISA检测试剂盒的标准曲线相似，即5B6B7、5B6C2、7A5D2三株抗 IL-21单克隆抗体均可作为捕获抗体进行ELISA检测。其中5B6B7抗IL-21单 克隆抗体ELISA检测IL-21的标准曲线与人IL-21ELISA检测试剂盒的相似度 最高，其检测结果较准确。
4.3用于免疫沉淀(IP)检测与IL-21结合的生物成分
检测5B6B7、5B6C2、7A5D2三株抗IL-21单克隆抗体是否可结合并免疫 沉淀PBMC中天然IL-21。如1.1.1.1所述，获得PBMC，细胞经PBS洗涤、 计数后离心收集。将Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)及100mM PMSF 按100:1配置蛋白提取液，每1x107细胞加入100μl蛋白提取液，轻柔吹打混 匀，冰上放置30min期间多次混匀。8000rpm 4℃离心10min，吸取含蛋白上清 转入新EP管。蛋白浓度使用Thermo公司的BCA试剂盒进行定量。取25μg PBMC总蛋白作为Input管(阳性对照)，3个样本管及IgG管(阴性对照) 各加入250μg PBMC总蛋白。3个样本管分别加入2.5μg 5B6B7、5B6C2、7A5D2 三株抗IL-21单克隆抗体，IgG管加入2.5μg鼠IgG，以蛋白提取液补充体积至 400μl，Input管不加其他成分，于垂直颠倒混匀仪中4℃过夜颠倒孵育。
次日，取4管50μl Protein G Agarose(Fast Flow,for IP)，用1ml 4℃预冷TBS洗涤并平衡微珠，离心弃上清。将样本管及IgG管中蛋白抗体混合物分别转移 入含ProteinG Agarose的管内，Input管不加其他成分，于垂直颠倒混匀仪中室 温颠倒孵育1h。离心弃上清，加入1ml TBS洗涤，离心弃上清并重复3次。 在微珠沉淀中加入40μl 0.1M甘氨酸(pH2-3)混匀。所有管均加入15μl 5x Loading buffer混匀后简短离心，100℃金属浴5min，10000rpm 4℃离心10min。 免疫印迹操作步骤如3.3.1所述。沿25kDa分子标记下缘水平裁剪PVDF膜， 10-25kDa的膜孵育1:1000稀释的兔抗IL-21多克隆抗体(Abcam公司，ab5978)，摇床上4℃孵育过夜，次日换为1:5000稀释的驴抗兔IgG HRP抗体室温摇床孵 育1h。25-130kDa的膜孵育1:5000羊抗鼠IgG HRP抗体。进行化学发光显色。
结果如图8所示，Input泳道有IL-21条带无鼠IgG条带，7A5D2单克隆 抗体泳道有较深IL-21条带及鼠IgG条带，5B6B7、5B6C2单克隆抗体泳道有 较浅IL-21条带及鼠IgG条带，IgG泳道无IL-21条带仅有鼠IgG条带。说明 鼠源的抗IL-21单克隆抗体可与PBMC中IL-21结合并被Protein G Agarose亲 和沉淀与其他蛋白分离。即5B6B7、5B6C2、7A5D2三株抗IL-21单克隆抗体 均可结合并免疫沉淀人细胞中天然IL-21，且相同抗体质量下7A5D2单克隆抗 体免疫沉淀的亲和力最强。7A5D2抗IL-21单克隆抗体可用于免疫沉淀检测天 然状态下与IL-21结合的蛋白及核酸等成分，亦可用于细胞中天然IL-21的免 疫亲和纯化。
4.4用于可逆性吸附人血清中天然IL-21
如4.2所述，以5B6B7抗IL-21单克隆抗体作为捕捉抗体，对多个患者血 清进行ELISA检测，筛选高IL-21水平的患者血清并混合均匀冻存于-80℃。 委托广州康盛公司将7A5D2抗IL-21单克隆抗体偶联至琼脂糖微珠，获得不同 偶联量的抗IL-21单克隆抗体偶联微珠，偶联量及偶联率见下表。
Figure BDA0002790192730000291
Figure BDA0002790192730000301
8管偶联的微珠置于EP管，用5ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)分5次洗涤 并平衡微珠，室温300rpm离心5min获得微珠沉淀。管内加入0.5ml高IL-21 水平的混合血清，与微珠混合均匀于垂直颠倒混匀仪中室温颠倒孵育1h。室温 300rpm离心5min，收集吸附后的血清同时沉淀微珠。用5ml无菌PBS缓冲液 分5次颠倒洗涤微珠，室温300rpm离心5min获得微珠沉淀。加入100mM甘 氨酸(pH2-3)洗脱微珠上结合的IL-21，室温300rpm离心5min，180μl洗脱 液加入18μl 1M Tris-HCl(pH8.8)中和pH至中性，收集中和后洗脱液同时沉 淀微珠。
用Human IL-21 ELISA MAXTMDeluxe试剂盒对吸附前血清、吸附后血清 及洗脱液进行IL-21水平检测，按说明书进行操作。结果如图9所示，吸附前 血清中IL-21水平均为125pg/ml，由于微珠中残留少量PBS导致血清稀释，未 偶联抗体微珠的吸附后血清IL-21水平为72.5pg/ml。吸附后血清及洗脱液中 IL-21水平具体数据见下表。吸附率＝(未偶联微珠吸附后IL-21水平-抗体偶联 微珠吸附后IL-21水平)/未偶联微珠吸附后IL-21水平x100％。
Figure BDA0002790192730000302
当抗IL-21单克隆抗体偶联量达到2.56mg/ml以上，琼脂糖微珠上抗体偶 联量的增加不能明显提高吸附率。排除琼脂糖微珠对血清的非特异性吸附后， 7A5D2抗IL-21单克隆抗体对血清中IL-21特异性吸附率为78.0-81.7％。即该 单克隆抗体在较低偶联量的条件下能吸附清除约80％血清中IL-21，并且这种 吸附结合作用是可逆的。7A5D2抗IL-21单克隆抗体可用于免疫吸附血清等体 液中IL-21，亦可用于血清等体液中天然IL-21的免疫亲和纯化。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发 明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及 其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 中南大学湘雅二医院
<120> 产生抗人IL21单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
<130> CP20211
<141> 2020-11-20
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 399
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 1
caaggtcaag atcgccacat gattagaatg cgtcaactta tagatattgt tgatcagctg 60
aaaaattatg tgaatgactt ggtccctgaa tttctgccag ctccagaaga tgtagagaca 120
aactgtgagt ggtcagcttt ttcctgcttt cagaaggccc aactaaagtc agcaaataca 180
ggaaacaatg aaaggataat caatgtatca attaaaaagc tgaagaggaa accaccttcc 240
acaaatgcag ggagaagaca gaaacacaga ctaacatgcc cttcatgtga ttcttatgag 300
aaaaaaccac ccaaagaatt cctagaaaga ttcaaatcac ttctccaaaa gatgattcat 360
cagcatctgt cctctagaac acacggaagt gaagattcc 399
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 3
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser His His
210 215 220
His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gln Gly Gln Asp Arg
225 230 235 240
His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys
245 250 255
Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp
260 265 270
Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala
275 280 285
Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val
290 295 300
Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg
305 310 315 320
Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys
325 330 335
Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys
340 345 350
Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
355 360 365
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccgtctcgg atcc 14
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgtctcct cgag 14

Claims (21)

1.一种人IL-21重组表达质粒，其特征在于，含有表达编码人IL-21蛋白的cDNA序列，所述cDNA序列为SEQ ID No：1。
2.根据权利要求1所述的原核表达质粒，其特征在于，能够表达人IL-21重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
3.人IL-21重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
4.根据权利要求3所述的人IL-21重组蛋白，其特征在于，能够用作抗原作为抗原进行动物免疫。
5.一种能够产生抗IL-21抗体的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.构建权利要求1所述的人IL-21重组表达质粒；
步骤2.使用步骤1所获得的人IL-21重组表达质粒进行原核表达，获得权利要求3所述的人IL-21重组蛋白；
步骤3.使用步骤2获得的人IL-21重组蛋白作为抗原，接种小鼠产生免疫反应；
步骤4.使用步骤3的经刺激小鼠获得脾脏细胞，然后与骨髓瘤细胞进行诱导融合、筛选，获得能够产生抗IL-21抗体的单克隆杂交瘤细胞株。
6.杂交瘤细胞株，其特征在于，通过权利要求5所述的方法获得。
7.根据权利要求6所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，被命名为杂交瘤细胞株5B6B7，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2020214。
8.根据权利要求6所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，被命名为杂交瘤细胞株5B6C2，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2020215。
9.根据权利要求6所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，被命名为杂交瘤细胞株7A5D2，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2020216。
10.抗人IL-21单克隆抗体，其特征在于，由权利要求6所述的杂交瘤细胞株产生。
11.根据权利要求10所述的抗人IL-21单克隆抗体，其特征在于，由权利要求7所述的杂交瘤细胞株产生，被命名为5B6B7。
12.根据权利要求10所述的抗人IL-21单克隆抗体，其特征在于，由权利要求8所述的杂交瘤细胞株产生，被命名为5B6C2。
13.根据权利要求10所述的抗人IL-21单克隆抗体，其特征在于，由权利要求9所述的杂交瘤细胞株产生，被命名为7A5D2。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的抗人IL-21单克隆抗体，其特征在于能够结特异性结合细胞内及血清中的天然IL-21。
15.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求10至13中任一项所述的抗人IL-21单克隆抗体。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为以下任一：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)、荧光免疫试剂盒和微流体芯片。
17.结合物，其特征在于，通过将权利要求10至13中任一项所述的抗人IL-21单克隆抗体经化学标记或生物标记制备。
18.根据权利要求17所述的结合物，其特征在于，所述化学标记为荧光素、同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为特异性抗体、生物素、亲和素或酶标记。
19.偶联物，其特征在于，通过将权利要求10至13中任一项所述的抗人IL-21单克隆抗体与固体介质或半固体介质偶联制得。
20.根据权利要求19所述的偶联物在制备用于中和IL-21的免疫吸附柱中的用途，以及制备用于免疫亲和纯化天然IL-21的微珠中的用途。
21.权利要求10至13中任一项所述的抗人IL-21单克隆抗体或权利17所述的结合物在制备用于特异性结合和/或降低IL-21水平的药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111484993A (zh) * 2020-04-30 2020-08-04 中南大学湘雅二医院 长链非编码rna il21-as1及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111484993A (zh) * 2020-04-30 2020-08-04 中南大学湘雅二医院 长链非编码rna il21-as1及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUCK K ET AL.: "NCBI Rreference Sequence:NM_021803.4", 《NCBI》 *
MARTIN PELLETIER ET AL.: "Biological functions of interleukin-21 and its role in inflammation", 《SCIENTIFICWORLDJOURNAL》 *
吴育罗等: "IL-2、IL-21诱导人外周血单个核细胞及其抗肿瘤作用", 《中国现代药物应用》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069840A (zh) * 2023-10-13 2023-11-17 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 特异性检测il-21的抗体及应用
CN117069840B (zh) * 2023-10-13 2024-01-30 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 特异性检测il-21的抗体及应用

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