CN111748505B - 一种表达羧肽酶g2的基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达羧肽酶G2的基因工程菌及其制备方法和应用。所述的基因工程菌为大肠杆菌(Escherichia coli)中同时表达SUMO蛋白标签和羧肽酶G2基因的基因工程菌，表达所述SUMO蛋白标签的SMT3基因位于表达所述羧肽酶G2的CPG2基因的上游。利用本发明的基因工程菌进行CPG2的制备，具有表达效率高、表达量大、成本低且易操作等特点，且所表达的重组CPG2蛋白纯度高(可高达99.1％)、活性高(可高达1792U/mg)，具有良好的产业化应用前景。

Description

一种表达羧肽酶G2的基因工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种表达羧肽酶G2的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

羧肽酶G2(carboxypeptidase G2,CPG2)是一种从假单胞菌属分离获得的锌离子依赖型金属酶，具有水解叶酸及其类似物的C端谷氨酸残基的作用。目前，CPG2被开发作为在使用高剂量的甲氨蝶呤(MTX)产生毒性后的急救措施。CPG2能够将MTX快速水解成两种没有毒性的代谢物：谷氨酸和2，4-二氨基-N[10]-甲基蝶呤(DAMPA)，并且通过肝脏代谢，从而起到清除血清中MTX的作用。假单胞菌属菌株RS-16的CPG2基因最初被克隆到大肠杆菌后，其表达水平相对于菌株RS-16降低了100倍。根据Jeyaharan D等人对CPG2结构进行研究后，通过大肠杆菌表达系统最终获得了250mg/L具有活性的目的蛋白。CPG2共有415个氨基酸，包括C端的25个信号肽序列和390个成熟蛋白氨基酸序列，分子量为84kD。CPG2为二聚体形式，并且每条单体络合4个Zn²⁺才具有生物活性。由于CPG2没有二硫键和糖基化，所以原核表达系统是其进行大量表达的最佳选择。

MTX是一种具有抑制二氢叶酸还原酶活性的叶酸类似物，其抑制二氢叶酸还原酶将二氢叶酸还原为四氢叶酸，从而抑制DNA的合成、修复和复制，最终也使蛋白质合成发生障碍。同时，MTX具有高度的细胞周期依赖性，主要在DNA合成(S期)期间起作用。MTX有皮下注射和口服两种给药途径，是目前应用最广泛的抗癌药物之一，并且高剂量MTX是治疗多种儿童和成人癌症的重要组成部分。同时，MTX也用于自身免疫性疾病的治疗。自1953年首次临床试验以来，MTX的使用剂量急剧增加。MTX一个较大的缺点是它对健康细胞的毒性具有剂量和时间的依赖性。MTX主要由肾排泄清除，但是MTX所致的肾功能不全将导致MTX消除延迟。Brigitte等人在2006年发现MTX一旦被多聚在一起，就会在细胞中长期保留。随着MTX剂量增加，人体中无法快速有效的将MTX全部代谢，从而使MTX在体内的累积，最终导致肝肾损坏、衰竭、中毒性脑病，甚至危及生命等。

目前，对于大剂量使用MTX后中毒的急救措施主要包括充分水化、碱化尿液、血液透析和大剂量使用亚叶酸钙等方法。亚叶酸钙和大剂量MTX的联合使用，在一定程度上能够使DNA和蛋白质的合成恢复成正常水平，但是当MTX浓度升高，亚叶酸钙也很难保护骨髓细胞不受到损坏。水化和碱化尿液同样对于降低MTX血药浓度的效果较差，时间较长。对于血液透析来说，清除速率与分子量成反比。由于MTX分子量大，水溶性差，组织高分布等特点，使得血液透析很难达到预期的清除效果，无法完全清除血液中的MTX。而对于CPG2来说，给药后几分钟内能够将血浆中的MTX浓度降低98％以上，从而降低MTX毒性威胁生命的风险。

CPG2还可应用于抗体导向酶前体药物疗法(ADEPT)和基因导向酶前体药物疗法(GDEPT)。ADEPT是一种两步治疗癌症的方法，其目的是在肿瘤部位选择性地产生一种强效的细胞毒分子。第一步，肿瘤选择性抗体与酶通过化学共轭结合；第二步，通过肿瘤选择性抗体与肿瘤部位结合，释放前药后在肿瘤部位将无活性的前药转化为活性药物，起到杀伤肿瘤细胞的作用。因此，该策略对癌细胞具有较强的细胞毒性作用，而对其他细胞的毒性较小。CPG2是ADEPT疗法目前应用最广泛的酶。GDEPT疗法与ADEPT疗法类似，也是通过两步法达到治疗效果，第一步，将外源性酶的基因转运至肿瘤细胞；第二步，系统给予无毒性的前体药物，通过酶代谢为细胞毒药物。

鉴于其重要性，现有技术中已有诸多对其表达及纯化工艺进行构建和优化的记载，然而最终所得CPG2蛋白的比活力最高仅达400-600U/mg(如专利申请CN 101509012B所公开的重组羧肽酶G2表达载体及制备重组羧肽酶G2的方法)，不能满足工业化生产以及大批量制备等的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中利用制备羧肽酶G2(CPG2)的方法所得CPG2比活力低、且纯度低等缺陷，提供一种表达CPG2的基因工程菌及其制备方法和应用。利用该基因工程菌进行CPG2的制备，最终所得CPG2的比活力可高达1792U/mg，纯度可高达99.1％，具有良好的产业化应用前景。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一为：一种表达CPG2的基因工程菌，其为在大肠杆菌(Escherichia coli)中同时表达SUMO蛋白标签和羧肽酶G2(CPG2)的基因工程菌，表达所述SUMO蛋白标签的SMT3基因位于表达所述羧肽酶G2的CPG2基因的上游。

其中，根据本领域常识，所述的SMT3基因和所述的CPG2基因可通过同源重组等方法整合到宿主大肠杆菌中进行表达，亦可通过表达载体将两者导入大肠杆菌中进行表达。本发明中，优选使用携带SMT3基因和CPG2基因的表达载体将两者导入到大肠杆菌中进行表达。

较佳地，所述的基因工程菌携带自5’端至3’端依次含有启动子、SMT3基因、CPG2基因和终止子的表达载体。

本发明中，所述的表达载体的骨架较佳地为质粒pET-28a。

本发明中，所述的启动子较佳地为T7启动子。

根据本领域公知常识，所述的CPG2基因来源于假单胞菌属；本发明中所述的CPG2基因的核苷酸序列较佳地如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本发明中所述的SMT3基因可为本领域常规的用于表达SUMO蛋白标签的SMT3基因；较佳地，所述的SMT3基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

为便于在蛋白表达后的纯化过程中除去所述SUMO蛋白标签，所述的SUMO蛋白标签较佳地携带His标签，所述的His标签优选位于所述SUMO蛋白标签的N端，所述的His标签优选为6×His。

本发明解决上述技术问题的技术方案之二为：一种如上所述的基因工程菌在制备CPG2中的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案之三为：一种如上所述的基因工程菌的制备方法，所述的制备方法包括下列步骤：将SMT3基因、CPG2基因整合到大肠杆菌中，所述SMT3基因位于所述CPG2基因的上游；

较佳地，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)构建含有SMT3基因和CPG2基因的表达载体；

(2)以大肠杆菌为宿主菌株，用步骤(1)得到的表达载体进行转化，获得所述基因工程菌。

本发明解决上述技术问题的技术方案之四为：一种CPG2的制备方法，其包括将如上所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得CPG2。

本发明解决上述技术问题的技术方案之五为：一种表达载体，其自5’端至3’端依次含有SMT3基因、CPG2基因。

其中，所述的表达载体的骨架优选质粒pET-28a。

所述的CPG2基因的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.1所示。

所述的SMT3基因的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.2所示。

根据本领域常识，所述的表达载体还含有启动子和终止子等元件，所述的启动子位于所述SMT3基因的上游，所述的终止子位于所述CPG2基因的下游。所述的启动子较佳地为T7启动子。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

利用本发明的基因工程菌进行CPG2的制备，具有表达效率高、表达量大、成本低且易操作等特点，且所表达的重组CPG2蛋白纯度高(可高达99.1％)、活性高(可高达1792U/mg)，具有良好的产业化应用前景。

附图说明

图1为CPG2基因片段PCR产物回收电泳示意图。

图2为SMT3基因片段PCR产物回收电泳示意图。

图3为SMT3-CPG2基因片段PCR产物回收电泳示意图。

图4为SMT3-CPG2基因片段结构示意图。

图5为测序结果示意图。

图6为pET-28a-SMT3-CPG2质粒的双酶切验证电泳示意图。

图7为pET-28a-SMT3-CPG2表达载体的构建示意图。

图8为重组CPG2各步纯化结果电泳示意图。

图9为重组CPG2纯化后HPLC纯度分析结果图谱。

图10为重组CPG2纯化后的Native-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

大肠杆菌DH5α，DE3购自北京天恩泽基因科技有限公司。

重组CPG2目的基因合成、引物合成以及测序服务为上海睿迪生物科技有限公司提供。

本发明中的SMT3基因由本实验室储存质粒中获得，亦可通过生物公司进行合成(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示)。

NdeI、HindⅢ、DNA连接酶、

Max DNA polymerase均购自大连宝生物有限公司(TaKaRa,Dalian,China)。

DNA胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

实施例1CPG2原始基因和SMT3基因的扩增

1、CPG2原始基因的扩增

从NCBI网站上获取CPG2原始基因序列(登录号：M12599；序列如序列表中SEQ IDNO.1所示)，以去掉C端25个信号肽氨基酸序列后的390个氨基酸为目标序列，委托专业生物公司进行基因序列合成。将含有CPG2基因序列的质粒作为模板，分别以：

P1(SMT3-G2):GAACAGATTGGTGGTCAGAAGCGCGACAAC

P2(HindIII-G2):CCCAAGCTTTTACTTGCCGGCGCCCAGATCCATG(下划线序列为HindIII酶切位点)作为上下游引物，进行PCR扩增，从而使CPG2的上游引入SMT3部分基因序列，同时在下游引入HindIII酶切位点，反应体系如下：

反应条件如下：

PCR扩增结束后使用凝胶回收试剂盒回收产物，大小约为1170bp左右，与理论值相同，见图1。

2、SMT3基因的扩增

将由本实验室储存的含有SMT3基因序列(序列如序列表中SEQ ID NO.2所示)的大肠杆菌进行质粒提取，以含有SMT3基因序列的质粒作为模板，分别以：

P3(NdeI-SMT3):

GGGAATTCCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGC

P4(G2-SMT3):GTTGTCGCGCTTCTGACCACCAATCTGTTC

(下划线序列为NdeI酶切位点)作为上下游引物，进行PCR扩增，从而使SMT3的上游引入NdeI酶切位点，同时在下游引入部分CPG2部分基因序列，反应体系如下：

反应条件如下：

PCR扩增结束后使用凝胶回收试剂盒回收产物，进行DNA电泳鉴定，大小约为294bp左右，与理论值相同，见图2。

实施例2SMT3基因与CPG2基因进行重叠PCR

将扩增后的SMT3基因序列(C端含有NdeI酶切位点)和CPG2基因序列(N端含有HindIII酶切位点)作为模板，分别以：

P3(NdeI-SMT3)：

GGGAATTCCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGC

P2(HindIII-G2)：CCCAAGCTTTTACTTGCCGGCGCCCAGATCCATG

(下划线序列分别为NdeI和HindIII酶切位点)作为上下游引物，进行重叠PCR扩增，使SMT3基因片段与CPG2基因片段连接在一起，反应体系如下：

反应条件如下：

PCR扩增结束后使用凝胶回收试剂盒回收产物，进行DNA电泳鉴定，大小约为1464bp左右，与理论值相同，见图3、4。

实施例3表达载体pET-28a-SMT3-CPG2的构建

参考TaKaRa说明书的酶切体系，使用NdeI和HindⅢ双酶切实施例2中获得的PCR产物以及pET-28a载体。酶切产物使用凝胶回收试剂盒回收后使用DNA连接酶连接两个酶切产物，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，在含有卡那(可简写为Kan)抗生素的LB培养基平板中37℃过夜培养。

挑选上述转化子培养后，进行菌落PCR和测序鉴定。经DNA电泳检测，条带大小与理论值相等，同时测序结果显示SMT3-CPG2和pET-28a载体连接成功、序列正确且无任何序列突变，如图5。提取pET-28a-SMT3-CPG2质粒，使用NdeI和HindⅢ进行双酶切验证，电泳结果显示，pET-28a和SMT3-CPG2条带与理论值相同，如图6所示。pET-28a-SMT3-CPG2表达载体成功构建，构建示意图如图7所示。将pET-28a-SMT3-CPG2转至DH5α的菌株命名为：pET-28a-SMT3-CPG2/DH5α。

实施例4表达菌株pET-28a-SMT3-CPG2的构建

接种pET-28a-SMT3-CPG2/DH5α菌株到5ml含有卡那抗生素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，收集菌体后使用质粒纯化试剂盒进行质粒制备。

将上述提取的质粒加入100μL预冷的BL(DE3)感受态细胞悬液中，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min，转入42℃温热水浴中热击45s，迅速将离心管转移到冰浴中，静置2～3min，再加入450μL LB培养基，颠倒混匀后置于37℃摇床，150rpm振荡培养45min使菌体复苏，取适量已转化的感受态细胞，加到含有卡那抗生素LB固体培养基平板，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16h。次日，挑取单菌落，最终得到表达菌株pET-28a-SMT3-CPG2/BL21(DE3)。

实施例5重组CPG2的表达和纯化

挑取表达菌株pET-28a-SMT3-CPG2/BL21(DE3)接种到3mL含有50μg/ml卡那抗生素的LB液体培养基中，37℃，250rpm,过夜培养。次日，按1％的体积比接种到20mL的LB液体培养基(50μg/ml Kan)中，37℃，250rpm，培养3～4小时。按1％的体积比接种到1L LB液体培养基(50μg/ml Kan)，37℃，220rpm，培养2.5～3h，待OD₆₀₀达到0.4～0.6后，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃，180rpm，过夜培养。次日，将诱导表达的菌液经6000rpm，4℃离心7min后弃上清收集菌体。

发酵液菌体按1:10(1g湿重菌体:10mL缓冲液)比例加入缓冲液(20mM Tris-Hcl,0.2mM Zn²⁺,100mM NaCl,50％甘油，pH8.0)进行重新悬浮。将悬浮菌体于高压匀浆机进行破碎，破碎条件为4℃，900bar，循环4次。将破碎后菌体经8000rpm，4℃离心10min后收集上清。将上清上样于经缓冲液(20mM Tris-Hcl,0.2mM Zn²⁺,100mM NaCl,50％甘油，pH8.0)平衡过的Ni柱螯合层析介质，分别以20mM和200mM咪唑进行洗脱，其中目的蛋白主要集中于200mM洗脱液中。将收集到的目的蛋白通过BCA法测得蛋白质含量后，以SUMO酶和目的蛋白质量比为1:100加入SUMO酶，4℃，酶切过夜。将酶切后的蛋白装入透析袋后，置于透析buffer中，4℃，透析过夜。次日，取出样品进行第二次Ni柱亲和层析，除去SUMO蛋白标签、SUMO酶和其他杂蛋白，收集流穿液。将收集到的流穿液进行分子筛层析，进一步除去杂蛋白和根据出峰时间间接鉴定是否为二聚体形式，获得纯度较纯的目的蛋白。最后，将获得的目的蛋白进行SDS-PAGE和Native-PAGE验证，测定分子量分别为42kD和84kD，证实目的蛋白分子量与理论值相同，同时以二聚体形式存在，纯度大于99％。HPLC分析纯度为99.1％。收集到的目的蛋白经活性检测，显示具有催化MTX降解的活性。

具体结果请参照图8～10，其中图8为重组CPG2各步纯化结果电泳示意图，泳道1～7分别是Marker、破碎后上清、第一次Ni柱亲和层析流穿液、200mM蛋白洗脱液、SUMO酶酶切后收集液、第二次Ni柱亲和层析流穿液和Hiprp凝胶层析收集液。图9为重组CPG2纯化后HPLC纯度分析结果图谱，图谱中20min后的峰为缓冲液本身引起的。图10为重组CPG2纯化后的Native-PAGE电泳图，其中泳道1～4分别为BSA标准品、破碎后上清、第二次Ni柱亲和层析流穿液和Hiprp凝胶层析收集液。

实施例6重组CPG2的活性测定

测活步骤：

(1)通过测出底物MTX不同浓度下的OD值，做底物标准曲线(C_mtx-OD₃₂₀)；

(2)37℃下，测定不同浓度的目的蛋白在相同条件下(相同Buffer，等量的底物)进行30分钟的反应，每隔30s测一次。在摸索出合适测活蛋白浓度后，将不同浓度的目的蛋白所测出来的meanV值(吸光值变化曲线的斜率OD₁-OD₂/t₂-t₁＝ΔOD₃₂₀/Δt)，做标准曲线(C_CPG2-meanV)；

(3)利用标准曲线(C_CPG2-meanV)，将未知浓度样品稀释成多个梯度浓度后，进行反应，测出其meanV后(即ΔOD₃₂₀/Δt)(需确保稀释的浓度中有一个浓度是在标准曲线范围内)，结合MTX标准曲线，求出酶活；

酶活定义：37℃，pH7.3条件下，每分钟水解1μmol MTX所需要的酶量为1个活性单位(U)。

比酶活定义：单位重量的重组CPG2中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。

测活体系(200μL)：

底物：40μL 1mmol/L甲氨蝶呤(MTX)；

缓冲液：155μL 0.l mol/L Tris-HCl，pH7.3，0.2mmol/L ZnCl₂；

酶：5μL经纯化后纯度为99％以上的重组CPG2酶(浓度范围在50μg/ml左右)，同时浓度在标准曲线(C_CPG2-meanV)范围内；于320nm下，检测吸光值变化。

通过上述酶活方法测定，最终纯化获得的纯度为99.1％的重组CPG2的比活力达到了1792U/mg。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海医药工业研究院,中国医药工业研究总院

<120> 一种表达羧肽酶G2的基因工程菌及其制备方法和应用

<130> P19010399C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> Variovorax paradoxus

<400> 1

cagaagcgcg acaacgtgct gttccaggca gctaccgacg agcagccggc cgtgatcaag 60

acgctggaga agctggtcaa catcgagacc ggcaccggtg acgccgaggg catcgccgct 120

gcgggcaact tcctcgaggc cgagctcaag aacctcggct tcacggtcac gcgaagcaag 180

tcggccggcc tggtggtggg cgacaacatc gtgggcaaga tcaagggccg cggcggcaag 240

aacctgctgc tgatgtcgca catggacacc gtctacctca agggcattct cgcgaaggcc 300

ccgttccgcg tcgaaggcga caaggcctac ggcccgggca tcgccgacga caagggcggc 360

aacgcggtca tcctgcacac gctcaagctg ctgaaggaat acggcgtgcg cgactacggc 420

accatcaccg tgctgttcaa caccgacgag gaaaagggtt ccttcggctc gcgcgacctg 480

atccaggaag aagccaagct ggccgactac gtgctctcct tcgagcccac cagcgcaggc 540

gacgaaaaac tctcgctggg cacctcgggc atcgcctacg tgcaggtcaa catcaccggc 600

aaggcctcgc atgccggcgc cgcgcccgag ctgggcgtga acgcgctggt cgaggcttcc 660

gacctcgtgc tgcgcacgat gaacatcgac gacaaggcga agaacctgcg cttcaactgg 720

accatcgcca aggccggcaa cgtctcgaac atcatccccg ccagcgccac gctgaacgcc 780

gacgtgcgct acgcgcgcaa cgaggacttc gacgccgcca tgaagacgct ggaagagcgc 840

gcgcagcaga agaagctgcc cgaggccgac gtgaaggtga tcgtcacgcg cggccgcccg 900

gccttcaatg ccggcgaagg cggcaagaag ctggtcgaca aggcggtggc ctactacaag 960

gaagccggcg gcacgctggg cgtggaagag cgcaccggcg gcggcaccga cgcggcctac 1020

gccgcgctct caggcaagcc agtgatcgag agcctgggcc tgccgggctt cggctaccac 1080

agcgacaagg ccgagtacgt ggacatcagc gcgattccgc gccgcctgta catggctgcg 1140

cgcctgatca tggatctggg cgccggcaag 1170

<210> 2

<211> 294

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 2

atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60

gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120

aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180

gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240

ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggt 294

Claims (9)

1.一种表达羧肽酶G2的基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌（Escherichia coli）中同时表达SUMO蛋白标签和羧肽酶G2的基因工程菌，表达所述SUMO蛋白标签的SMT3基因位于表达所述羧肽酶G2的CPG2基因的上游；

所述的CPG2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示；

所述的SMT3基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌携带自5’端至3’端依次含有启动子、SMT3基因、CPG2基因和终止子的表达载体。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的表达载体的骨架为质粒pET-28a；

和/或，所述的启动子为T7启动子。

4.如权利要求1~3任一项所述的基因工程菌在制备羧肽酶G2中的应用。

5.一种如权利要求1~3任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括下列步骤：将SMT3基因、CPG2基因整合到大肠杆菌中，所述SMT3基因位于所述CPG2基因的上游。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

（1）构建含有SMT3基因和CPG2基因的表达载体；

（2）以大肠杆菌为宿主菌株，用步骤（1）得到的表达载体进行转化，获得所述基因工程菌。

7.一种羧肽酶G2的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1~3任一项所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得羧肽酶G2。

8.一种表达载体，其特征在于，自5’端至3’端依次含有SMT3基因、CPG2基因；

所述的CPG2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示；

所述的SMT3基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。

9.如权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体的骨架为质粒pET-28a。

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