CN104140976A - 用于同源重组的线性sumo载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：(1)合成DNA片段，其中含有限制性内切酶识别位点和SUMO标签的核苷酸序列；(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，扩增DNA片段，双酶切，回收；(3)PCR方法扩增pET表达载体,双酶切，回收；(4)产物连接，得到载体前体；用限制性内切酶SfoI或MscI消化载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。本发明可以以商品化pET表达载体为基础，基础载体选择面广，方便灵活，重复性强，获得的用于同源重组的线性SUMO载体使用方便，方法方便快捷，不会发生载体自连现象，是表达SUMO融合蛋白的有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法。
背景技术
基因重组技术是现代基因工程研究的一项基本技术，这种操作可把特定的基因整合到载体上，并使之在受体细胞中增值表达。分离纯化供体生物遗传物质，用PCR扩增方法在两端加上特定限制酶识别位点，酶切处理后与适当载体连接，形成重组分子，然后转入受体细胞中增值表达。
为了方便表达产物纯化，一般在目的蛋白之前加上特定标签，但有些蛋白的活性受标签影响较大，需要在纯化后将标签切除。SUMO蛋白酶以非常特异的方式切割重组蛋白的SUMO标签，因此含SUMO标签的表达载体应用广泛。但目前的使用方法均为在目的蛋白基因两端设计与载体相同的酶切位点，载体和目的基因分别双酶切后纯化回收，再将目的序列和载体经T4DNA连接酶连接，转入宿主细胞。操作繁琐，成本较高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于同源重组的SUMO载体的构建方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO.1所示的第一合成片段，所述第一合成片段的第439-444的6个核苷酸为限制性内切酶SfoI识别序列，第151-441的291个核苷酸为改进后的第一种SUMO标签的核苷酸序列；
(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第一合成片段，使第一合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；
(3)设计带有与步骤(2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表达载体,得到两端带有限制性内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物，双酶切，回收；
(4)将步骤(2)和步骤(3)回收的产物连接，得到第一种载体前体；用限制性内切酶SfoI消化第一种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。
pET表达载体优选：pET28a、pET28b或pET42a。
另一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO.2所示的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的6个核苷酸为限制性内切酶MscI识别序列，第151-440的290个核苷酸为改进后的第二种SUMO标签的核苷酸序列；
(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第二合成片段，使第二合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；
(3)设计带有与步骤(2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表达载体,得到两端带有限制性内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物，双酶切，回收；
(4)将步骤(2)和步骤(3)回收的产物连接，得到第二种载体前体；用限制性内切酶MscI消化第二种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。
pET表达载体优选：pET28a、pET28b或pET42a。
本发明的优点：本发明可以以商品化pET系列表达载体为基础，基础载体选择面广，方便灵活，重复性强，可按照实验室现有载体情况选择限制性内切酶SfoI或限制性内切酶MscI进行酶切。以pET28a载体为例，该载体上没有限制性内切酶MscI识别序列，因此不用进行突变，将合成片段与pET表达载体PCR扩增产物连接获得质粒，用限制性内切酶MscI酶切质粒即可获得用于同源重组的线性SUMO载体。
若所选载体中含有相应的限制性内切酶识别序列，首先将合成片段与pET表达载体PCR扩增产物连接获得质粒，再进行点突变，将多余限制性内切酶识别序列去除之后，用限制性内切酶SfoI或限制性内切酶MscI酶切质粒即可获得用于同源重组的线性SUMO载体。
以本发明的构建方法获得的用于同源重组的线性SUMO载体使用方便，和带有多克隆位点的SUMO环状载体相比省去了现有双酶切载体和目的蛋白核酸序列，然后回收酶切产物，再进行载体和目的片段的体外连接等步骤，本发明只需将载体及目的片段以线性的形式转入载体进行同源重组连接，方法方便快捷，不会发生载体自连现象，是表达SUMO融合蛋白的有力工具。
附图说明
图1为实施例2同源重组菌落PCR检测。其中，第1道为200bp ladder第2至8道为菌落PCR结果。
图2为实施例4同源重组菌落PCR检测。其中，第1道为200bp ladder第2至8道为菌落PCR结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
下述的实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围。
为方便起见选择带有适合于后期目的蛋白表达标记基因的载体，载体中如果带有T7promoter、T7 terminator基因则在其两端设计引物，PCR产物为除去T7 promoter、T7 terminator之外的全部序列，并在引物5’端设计限制性内切酶识别位点，如Hind III内切酶识别位点AAGCTT和EcoRI内切酶识别位点GAATTC，PCR后回收纯化线性载体前体。
下面各实施例中的合成片段和引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
实施例1
一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO.1所述的第一合成片段；第一合成片段的第439-444的6个核苷酸为限制性内切酶SfoI识别序列，第151-441的291个核苷酸为改进后的第一种SUMO标签的核苷酸序列；
(2)设计第一人工合成序列引物，第二上游引物为：CCAAGCTTCGATCCCGCGAAATT(SEQ ID NO.5所示)带有Hind III内切酶识别位点AAGCTT，第二下游引物为：
CGGAATTCCAAAAAACCCCTCAAGA(SEQ ID NO.6所示)带有EcoRI内切酶识别位点GAATTC，用超保真PCR Master Mix扩增目的片段。反应体系如下：
用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物。
(3)选择商品化载体pET28a，设计引物，第一上游引物为：
CCAAGCTTCGATCCTCTACGCC(SEQ ID NO.3所示)，带有Hind III内切酶识别位点AAGCTT；第一下游引物：CGGAATTCCTGAAAGGAGGAACTAT(SEQ ID NO.4所示)。带有EcoRI内切酶识别位点GAATTC，用超保真PCR Master Mix扩增目的片段，超保真PCR Master Mix购自NEW ENGLAND BioLabs，反应体系如下：
用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物(两端带有限制性内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物)。
(4)用限制性内切酶Hind III和EcoR I分别对步骤(2)、(3)的PCR产物进行酶切，反应体系如下：
反应条件为37℃3小时。用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收酶切产物。
(5)用T4 DNA连接酶将酶切产物连接，T4 DNA连接酶购自NEW ENGLANDBioLabs，反应体系如下：
反应条件为16℃16小时，得到连接产物(第一种载体前体)。
(6)将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，先在液体LB培养基中37℃，300rpm培养1小时后，在50ng/ml kan抗性LB固体平板培养基上进行筛选，获得阳性转化子。并将阳性转化子接种于含有50ng/ml kan的液体LB培养基中，在37℃摇床中振荡培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司所生产的“SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒”按照其操作说明提取质粒DNA。
(7)序列中除了第一种SUMO标签核苷酸序列末端的限制性内切酶SfoI识别序列外，还有4个限制性内切酶SfoI识别序列GGCGCC，依次设计引物将这4个GGCGCC改为GGAGCC，用高保真DNA聚合酶扩增，回收扩增产物，平末端连接。引物序列如下：
第三上游引物：TCCCAATACGCAAACCGCC(SEQ ID NO.7)
第三下游引物：GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTC(SEQ ID NO.8)
PCR反应体系及程序参照步骤(3)(用第三上、下游引物替换第一上、下游引物)，纯化回收PCR产物，用T4 PNK酶进行磷酸化修饰，T4 PNK购自NEW ENGLAND BioLabs，再用T4 DNA连接酶连接，连接反应参照步骤(5)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞，先在液体LB培养基中37℃，300rpm培养1小时后，在50ng/ml kan抗性LB固体平板培养基上进行筛选，获得阳性转化子。并将阳性转化子接种于含有50ng/ml kan的液体LB培养基中，在37℃摇床中振荡培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司所生产的“SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒”按照其操作说明提取质粒DNA。
T4 PNK磷酸化修饰反应条件如下：
反应条件为37℃，30min，产物可直接用于连接。
(8)继续修改内切酶SfoI识别序列GGCGCC，引物如下：
第四上游引物：TCCATCTCCTTGCATGCACCA(SEQ ID NO.9)
第四下游引物：GCCCAACAGTCCCCCGG(SEQ ID NO.10)
第五上游引物：TCCTATATCGCCGACATCACCG(SEQ ID NO.11)
第五下游引物：GCCAGCAACCGCACCTGTG(SEQ ID NO.12)
第六上游引物：TCCACAGGTGCGGTTGCTG(SEQ ID NO.13)
第六下游引物：GCCGGTGATGCCGGCC(SEQ ID NO.14)
用上述引物依次替换步骤(7)中的引物，其它同步骤(7)。
(9)经过步骤(7)和步骤(8)的突变过程，只剩下第一种SUMO标签核苷酸序列末端的限制性内切酶SfoI识别序列GGCGCC，用SfoI酶切质粒DNA即得到第一种用于同源重组的线性SUMO载体。
反应条件为37℃3小时。用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收酶切产物即得到第一种用于同源重组的线性SUMO载体。
pET表达载体选用pET28b时，设计相应的引物，采作本实施例的方法，可以制备得到相应的用于同源重组的线性SUMO载体。
pET表达载体选用pET42a时，设计相应的引物，采作本实施例的方法，可以制备得到相应的用于同源重组的线性SUMO载体。
实施例2
以绿色荧光蛋白GFP为例，以同源重组的方式构建SUMO-GFP融合蛋白。
(1)设计引物扩增GFP基因，并在两端带有线性SUMO载体的同源区域，第七上游引物为：AGATTGGTGGCATGGTGAGCAAG(SEQ ID NO.15所示)，第七下游引物为：AGATCCGGCTGCTATTACTTGTACAGCT(SEQ ID NO.16所示)
PCR反应体系如下：
用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物。
(2)同源重组反应
1)、GFP基因扩增产物50ng与实施例1制备的用于同源重组的线性SUMO载体25ng混合，加入到含有HI-Control 10G大肠杆菌感受态细胞(购自Lucigen公司)的无菌1.5ml离心管中，冰上放置30min。
2)、42℃45s，再冰上放置2min。
3)、向含有转化后细胞的1.5ml无菌离心管中加入900μlLB液体培养基。
4)、37℃，300rpm培养1小时。
5)、在50ng/ml kan抗性LB平板培养基上进行筛选，获得阳性转化子。
6)、菌落PCR检测阳性转化子。
设计菌检PCR引物：第八上游引物：GAAGTGGCGAGCCCGATCTTC(SEQ ID NO.17所示)第八下游引物：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCA(SEQ ID NO.18所示)，做7个菌落PCR检测是否同源重组成功，用Taq 2X Master Mix(购自NEW ENGLAND BioLabs)进行扩增，反应体系及反应条件如下：
电泳检测PCR产物，如图1。
7)、并将阳性转化子接种于含有50ng/ml kan的LB液体培养基中，在37℃摇床中振荡培养过夜。
8)、利用生工生物工程(上海)有限公司所生产的“SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒”按照其操作说明提取质粒DNA。
9)、质粒即为含有SUMO标签核酸序列-GFP基因序列的表达载体。可在大肠杆菌BL21中表达SUMO-GFP融合蛋白。
实施例3
第二种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO.2所述的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的6个核苷酸为限制性内切酶MscI识别序列，第151-440的290个核苷酸为改进后的第二种SUMO标签的核苷酸序列；
(2)设计第二人工合成序列引物，第二上游引物为：CCAAGCTTCGATCCCGCGAAATT(SEQ ID NO.5所示)带有Hind III内切酶识别位点AAGCTT，第二下游引物为：
CGGAATTCCAAAAAACCCCTCAAGA(SEQ ID NO.6所示)带有EcoRI内切酶识别位点GAATTC，用超保真PCR Master Mix扩增目的片段。反应体系如下：
用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物。
(3)步骤同实施例1步骤(3)，回收PCR产物(T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物)。
(4)-(6)步骤同实施例1步骤(4)-(6)，得到质粒DNA。
(7)用MscI酶切质粒DNA得到第二种用于同源重组的线性SUMO载体。
MscI反应体系如下：
反应条件为37℃3小时。用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收酶切产物即得到第二种用于同源重组的线性SUMO载体。
pET表达载体选用pET28b时，设计相应的引物，采作本实施例的方法，可以制备得到相应的用于同源重组的线性SUMO载体。
pET表达载体选用pET42a时，设计相应的引物，采作本实施例的方法，可以制备得到相应的用于同源重组的线性SUMO载体。
实施例4
以绿色荧光蛋白GFP为例，以同源重组的方式构建SUMO-GFP融合蛋白。
(1)设计引物扩增GFP基因，并在两端带有线性SUMO载体的同源区域，第九上游引物为：AGATTGGTGGTATGGTGAGCAAG(SEQ ID NO.19所示)第九下游引物为：AGATCCGGCTGCTATTACTTGTACAGCT(SEQ ID NO.20所示)
PCR反应体系如下：
用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，回收PCR产物。
(2)同源重组反应
1)、GFP基因扩增产物50ng与实施例3制备的用于同源重组的线性SUMO载体25ng混合，加入到含有HI-Control 10G大肠杆菌感受态细胞(购自Lucigen公司)的无菌1.5ml离心管中，冰上放置30min。
2)、42℃45s，再冰上放置2min。
3)、向含有转化后细胞的1.5ml无菌离心管中加入900μlLB液体培养基。
4)、37℃，300rpm培养1小时。
5)、在50ng/ml kan抗性LB平板培养基上进行筛选，获得阳性转化子。
6)、菌落PCR检测阳性转化子。
设计菌检PCR引物：第八上游引物：GAAGTGGCGAGCCCGATCTTC(SEQ ID NO.17所示)第八下游引物：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCA(SEQ ID NO.18所示)，做7个菌落PCR检测是否同源重组成功，用Taq 2X Master Mix(购自NEW ENGLAND BioLabs)进行扩增，反应体系及反应条件如下：
电泳检测PCR产物，如图2。
7)、并将阳性转化子接种于含有50ng/ml kan的LB液体培养基中，在37℃摇床中振荡培养过夜。
8)、利用生工生物工程(上海)有限公司所生产的“SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒”按照其操作说明提取质粒DNA。
9)、质粒即为含有SUMO标签核酸序列-GFP基因序列的表达载体。可在大肠杆菌BL21中表达SUMO-GFP融合蛋白。
Claims (4)
1.一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO.1所示的第一合成片段，所述第一合成片段的第439-444的6个核苷酸为限制性内切酶SfoI识别序列，第151-441的291个核苷酸为改进后的第一种SUMO标签的核苷酸序列；
(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第一合成片段，使第一合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；
(3)设计带有与步骤(2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表达载体,得到两端带有限制性内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物，双酶切，回收；
(4)将步骤(2)和步骤(3)回收的产物连接，得到第一种载体前体；用限制性内切酶SfoI消化第一种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。
2.根据权利要求1所述的一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是所述pET表达载体为pET28a、pET28b或pET42a。
3.一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO.2所示的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的6个核苷酸为限制性内切酶MscI识别序列，第151-440的290个核苷酸为改进后的第二种SUMO标签的核苷酸序列；
(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第二合成片段，使第二合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；
(3)设计带有与步骤(2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表达载体,得到两端带有限制性内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物，双酶切，回收；
(4)将步骤(2)和步骤(3)回收的产物连接，得到第二种载体前体；用限制性内切酶MscI消化第二种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。
4.根据权利要求3所述的一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，其特征是所述pET表达载体为pET28a、pET28b或pET42a。
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| KR20040087356A (ko) * | 2003-04-07 | 2004-10-14 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 생쥐 뇌에 있는 새로운 수모-프로테아제와 그 유전자 |
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