CN104131023A - 运动发酵单胞菌red重组系统表达质粒及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类能在运动发酵单胞菌中应用RED重组系统的质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED及其构建方法与应用。质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED都包含卡那霉素筛选标记基因、组成型启动子Ppdc和RED基因。其区别在于质粒pSUZM1a-RED包含运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pSUZM2a-RED包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401上的复制蛋白序列、质粒pSUZM3a-RED包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列。当把RED表达质粒转入Z. mobilis时，在敲入的筛选标记基因同源臂为60bp时，敲入基因能够准确地替换靶基因。运动发酵单胞菌RED系统能够对运动发酵单胞菌的基因组进行准确的编辑，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及运动发酵单胞菌RED重组系统的表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED及其构建方法与在运动发酵单胞菌中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
基因组重组系统主要有噬菌体重组系统和基因组编辑系统。噬菌体重组系统包括Red重组系统、RecET重组系统和P22重组系统。基因组编辑系统主要有锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)和CRISPR/Cas系统。
Red重组系统是利用λ噬菌体的Redα/Redβ重组系统而建立的DNA重组技术，原理是将一段携带与靶基因两侧各有40～60 bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞中，利用λ噬菌体Red 重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体) 的特定靶序列进行同源重组，靶基因被敲入基因所置换。与常规的同源重组技术不同，该技术只需通过PCR在敲入基因两侧加上相对较短的与靶基因同源的序列，无须通过复杂的酶切、连接质粒等过程来建立上千bp的同源臂。Red重组系统在大肠杆菌中得到了大量的使用，除了用来敲除染色体上的基因外，还常被用来修改大肠杆菌内的载体或BAC质粒。Red重组系统来源于λ噬菌体Red区段，编码能够启动细菌染色体与外源DNA发生同源重组的蛋白质。噬菌体Red区段包括3个基因：bet、exo和gam 。Exo具有DNA外切核酸酶活性，能以每秒钟1000个碱基的速度从双链DNA末端按5′→3′的方向降解单链DNA，Exo蛋白与单链DNA分子结合需要至少35个碱基的区域, 因此供体DNA需要35bp以上的靶位点同源臂。bet基因编码的Beta蛋白是一个单链DNA(ssDNA)结合蛋白，它可以结合到由Exo产生的3’单链DNA末端，从而启动互补DNA链的退火，引发DNA链的交换反应。Beta蛋白还可与Exo外切核酸酶形成复合体，调节核酸溶解和重组启动。gam基因的表达产物Gam蛋白与宿主的RecBCD复合体结合并抑制宿主外切核酸酶活性，阻止外源线状DNA片段被降解。当Beta蛋白与单链DNA 3′突出端结合形成丝状体后，重组机制分为两种：若参与重组的另一同源序列为没有断裂的双螺旋DNA链，单链DNA在RecA蛋白的作用下侵入双链DNA，完成重组过程，这一机制称为链侵入模型；若另一同源序列为单链DNA，比如DNA复制过程中的复制叉，Beta蛋白介导互补单链DNA退火，完成重组过程，这一机制称为单链退火模型。
目前，Red同源重组技术的研究主要在大肠杆菌进行，此外也用于其他一些细菌如痢疾杆菌、柠檬酸菌和沙门氏菌。此外相关研究说明RED重组技术在真核生物细胞中也可以实现。
外源基因在Z. mobilis中进行表达并不容易达到满意的效果，如将黑曲霉糖化酶基因转入Z. mobilis中，无法获得稳定表达的重组菌株；乳糖操纵子在Z. mobilis的表达不能使其在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长；枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因转入Z. mobilis未检测到生物活性；木糖代谢相关基因转入Z. mobilis往往不能使其在木糖为唯一碳源的培养基上生长，或是可以生长但生长和产醇速率要比在葡萄糖培养基上的低4-5倍。此外，要将Z. mobilis用于大规模乙醇生产，不仅要扩大其底物利用范围，还有必要减少其副产物的产生，如山梨醇、3-羟基丁酮、甘油、乙醛、乙酸和胞外果聚糖等。因此，为了获得乙醇生产效率高、且能利用多种碳源的运动发酵单胞菌基因工程菌，往往需要较大规模地删除或插入多个基因，因此构建运动发酵单胞菌RED重组系统具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供运动发酵单胞菌中RED重组系统表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED的构建。
本发明提供的运动发酵单胞菌中RED重组系统表达质粒分别命名为pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED。
其中pSUZM1a-RED包含运动发酵单胞菌染色体复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc和来自质粒pKD46的RED基因。
其中pSUZM2a-RED包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401上的复制蛋白序列、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自于组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc和来自质粒pKD46的RED基因。
其中pSUZM3a-RED包含运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc和来自质粒pKD46的RED基因。
本发明所提供的pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED质粒的构建方法，包括如下步骤：
1）以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a为模板，用以下引物5’-GAGCAATGGCGATGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’-CAGTTTCAGTATTAATATCCATTGCTTACTCCATATAT-3’,进行PCR扩增，获得骨架片段A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)和C（pSUZM3a）.
2)以质粒pKD46为模板，用以下引物5’-ATATATGGAGTAAGCAATGGATATTAATACTGAAACTG-3’和5’-CCCACTGCAAGCTACCTTCATCGCCATTGCTC-3’, 进行PCR扩增，获得基因片段RED。
3）将载体骨架片段A、B、C和基因片段RED分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED。
本发明的运动发酵单胞菌RED重组系统表达质粒可以用于运动发酵单胞菌基因组编辑，具有很好的应用前景。
附图说明
图1表达质粒pSUZM1a-RED的构建策略。
图2表达质粒pSUZM2a-RED的构建策略。
图3表达质粒pSUZM3a-RED的构建策略。
图4构建表达质粒pSUZM1a-RED的PCR片段电泳；M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM1a载体骨架; 2: RED基因。
图5构建表达质粒pSUZM2a-RED的PCR片段电泳；M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM2a载体骨架; 2: RED基因。
图6构建表达质粒pSUZM3a-RED的PCR片段电泳；M, λEcoT14 DNA marker, 1: pSUZM3a载体骨架; 2: RED基因。
图7表达质粒pSUZM1a-RED的酶切鉴定M, λEcoT14 DNA marker, 1和2道：NcoI/EcoRI双酶切pSUZM1a-RED。
图8 表达质粒pSUZM2a-RED的酶切鉴定M, λEcoT14 DNA marker,1、2和3道：NcoI/EcoRI双酶切pSUZM2a-RED。
图9表达质粒pSUZM3a-RED的酶切鉴定M, λEcoT14 DNA marker, 1、2和3道：EcoRI单酶切pSUZM3a-RED。
图10表达质粒pSUZM1a-RED的PCR鉴定M, 广谱DNA marker, 1和2道：质粒pSUZM1a-RED。
图11 表达质粒pSUZM2a-RED的PCR鉴定M, 广谱DNA marker, 1、2和3道：质粒pSUZM2a-RED。
图12表达质粒pSUZM3a-RED的PCR鉴定M, 广谱DNA marker, 1、2和3道：质粒pSUZM2a-RED。
图13RED表达质粒导入Z. mobilis ZM4的转化子PCR检测M,λEcoT14 DNAmarker, 1: pSUZM1a-RED; 2: pSUZM2a-RED; 3: pSUZM3a-RED; 4: Z. mobilis ZM4空菌株阴性对照; 5: 质粒pKD46阳性对照。
图14PCR扩增的bla基因和rnd基因的敲入片段M, DL500 DNA marker,1: bla基因; 2: rnd基因。
图15运动发酵单胞菌ZM4菌株bla基因和rnd基因敲除及tet基因敲入的PCR鉴定M, , λEcoT14 DNAmarker,1: ZM4(bla::tet)-bla-testF/ Test-tetR; 2: ZM4-bla-testF/ Test-tetR; 3: ZM4(bla::tet)-bla-testR/ Test-tetF; 4: ZM4-bla-testR/ Test-tetF; 5:ZM4(rnd::tet)-rnd-testF/ Test-tetR; 6: ZM4-rnd-testF/ Test-tetR; 7:ZM4(rnd::tet)-rnd-testR/ Test-tetF; 8: ZM4-rnd-testR/ Test-tetF。
图16重组菌株ZM4(bla::tet)PCR产物测序左框中为bla基因序列，右框中为tet基因序列。
图17重组菌株ZM4(rnd::tet)PCR产物测序左框中为rnd基因序列，右框中为tet基因序列。
具体实施方式
实例1表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED的构建
表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED的构建的策略见图1、图2和图3。
1) 设计引物1V-Red 上游，1V-Red下游；引物Red-1上游，引物Red-1 下游；
1V-Red上游：GAGCAATGGCGATGAAGGTAGCTTGCAGTGGG
1V-Red下游：CAGTTTCAGTATTAATATCCATTGCTTACTCCATATAT
Red-1上游：ATATATGGAGTAAGCAATGGATATTAATACTGAAACTG
Red-1下游：CCCACTGCAAGCTACCTTCATCGCCATTGCTC
2)分别以pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a质粒为模板，用引物1V-Red 上游和1V-Red 下游扩增载体骨架片段A、B、C；以pKD46质粒为模板；用引物Red-1 上游和Red-1 下游扩增RED基因。
PCR反应体系：2×PCR buffer 25μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至50μL。
扩增载体骨架片段A、B、C的PCR反应条件：98℃变性10 s，68℃延伸1min30s，共30个循环，72℃最后延伸5min。
扩增RED基因的PCR反应条件：98℃变性10 s，68℃延伸1min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果显示，载体骨架片段A的PCR产物大小为3.3kb（图4）、载体骨架片段B的PCR产物大小为5.0kb（图5）、载体骨架片段C的PCR产物大小为4.6kb(图6)，与预期结果相符。RED基因的PCR产物大小为1.8 kb（图4、图5、图6），与预期结果相符。
3）PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4）不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)，具体步骤如下：
在3个（编号为1、2、3）0.5mL的EP管中，加入4 μL 5 X T4 DNA 聚合酶缓冲液（Fermentas），0.1 μLT4 DNA 聚合酶（5 U/μL Fermentas）；1号管再加入1μL A片段、1 μL RED基因片段；2号管再加入1μL B片段、1 μL RED基因片段；3号管再加入1μL C片段、1 μL RED基因片段，3管都分别加ddH2O 到20 μL。
37℃孵育6 min，然后将EP管置于70℃的水浴中孵育10min，终止反应。取8 μL上述T4 DNA 聚合酶处理的DNA到另外一个新的0.5mL EP管，加入2 μL 10 X 退火缓冲液，10 μL ddH2O。将混合物置于75℃的水浴中反应15min，然后自然冷却至室温。取5μL产物转化大肠杆菌。挑选单克隆提取质粒，进行下述的PCR和酶切鉴定。。
实例2表达质粒pSUZM1a-RED, pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED的酶切和PCR鉴定
1) 表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED的酶切鉴定
取2个新的0.2ml的EP管，分别加入2μL的质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, 10* Tango buffer 2μL，NcoI0.4μL，EcoRI0.4μL，ddH2O 5.2μL，37℃反应3-4h，电泳检测酶切效果。
结果显示，使用NcoI和EcoRI双酶切，酶切结果与预期大小相符，见图7、图8。
取1个新的0.2ml的EP管，加入2μL的质粒pSUZM3a-RED, 10* EcoRI buffer 1μL， EcoRI0.8μL，ddH2O 6.2μL，37℃反应3-4h，电泳检测酶切效果。
结果显示，使用EcoRI单酶切，酶切结果与预期大小相符，见图9。
2）表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED的PCR鉴定
分别以质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED为模板，用引物Red-1 上游和Red-1 下游扩增RED基因。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 0.5μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，65℃延伸1min50s，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果显示，RED基因的PCR产物大小分别为1.8 kb。其结果见图10、图11和图12，与预期结果相符。
实例3 RED系统在运动发酵单胞菌中的应用
1）质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED电转化运动发酵单胞菌
挑取Z.mobilisZM4单菌落培养于5 mL RM培养基中，得到菌液全部接种于100 mL RM培养基中，培养至OD600为0.3-0.4。于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，用10 mL 10%甘油清洗菌体，于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次，将收集到的菌体悬浮于2 mL 10%甘油中，制备感受态。
采用美国BTX 公司的ECM830脉冲导入仪。分别将各1 μg的质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED与200 μLZ. mobilis感受态混合后在2500 V、200 Ω、50 μF条件下电击，电击后把菌液迅速转移至3mL RM培养基中静止恢复3 h，取100 μL菌液涂布于含卡那霉素（200 μg/mL）的平板，3 d后出现转化子，对转化子进行PCR鉴定。
以转化子单菌落为模板，用引物Red-1上游和Red-1下游，扩增RED基因。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 0.5μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s，65℃延伸1min50s，共30个循环，72℃最后延伸5min。
电泳检测结果表明，PCR扩增的Red基因片段大小为1.8kb（图13）。
2）敲入基因片段的制备
(1) 筛选标记的选择
运动发酵单胞菌自身具有氨苄青霉素和氯霉素抗性，不具有四环素抗性，RED表达质粒具有卡那霉素抗性，因此选择质粒pBR322的四环素标记基因作为敲入基因，易于检测RED系统的重组。
(2)含有同源臂四环素基因的获得
运动发酵单胞菌具有β-内酰胺酶基因（bla）和mexAB型RND药物外排泵基因（rnd），bla基因编码产物使运动发酵单胞菌具有氨苄青霉素抗性，rnd基因编码产物也使运动发酵单胞菌具有一定的耐药性，在细菌致病性方面也具有非常重要的生理作用。选定这两个基因作为靶向基因，利用RED重组系统对这两个基因进行敲除，构建bla突变株和rnd突变株。采用两轮PCR的方法，第一轮扩增以质粒pBR322为模板，产生30bp左右的靶向基因同源臂的PCR产物；第二轮扩增以第一轮扩增的PCR产物为模板，使同源臂达到60bp。
设计引物1- bla上游, 1- bla下游；引物2- bla上游,2- bla下游；1- rnd上游, 1- rnd下游；引物2- rnd上游,2- rnd下游。
其中引物1- bla上游和2- bla上游中含下划线部分为bla基因左端60bp同源臂，引物1- bla下游和2- bla下游中含下划线部分为bla基因右端60bp同源臂。
引物1-rnd上游和2-rnd上游中含下划线部分为rnd基因左端60bp同源臂，引物1- rnd下游和2-rnd下游中含下划线部分为rnd基因右端60bp同源臂，具体序列如下：
1-bla上游：
CGCCGTGTTAAAACAGTTTATTGCAAAAACAGGCCACCTGACGTCTAAGAAAC
1- bla下游：
GTCATAATCATTCCTTTGGCGGCGTTTTTTATGTTCTGCCAAGGGTTGG
2- bla上游：
GACGATCATAACGGCTGTTAAAAATTTACGCCGTGTTAAAACAGTTTATTG
2- bla下游：
TTTTTTCATAAAGAGTGCGGGGATTTTTTGTCATAATCATTCCTTTGGCG
1- rnd上游：
GAATTTTGGGTCTTGACCTCTTTATAGGAGCGCCACCTGACGTCTAAGAAAC
1- rnd下游：
GCTGGAACAAGGTTTCTGCTTGATTGACCGTCTGTTCTGCCAAGGGTTGG
2- rnd上游：
TGCAGGAAAATTCTTTTCATCAAATGAAAGAATTTTGGGTCTTGACCTCTT
2- rnd下游：
TTTGCCTGCTCCCGCAAATCTGCTTTTTGCTGGAACAAGGTTTCTGCTT
以质粒pBR322为模板，用引物1- bla上游和1- bla下游，扩增包含靶向基因同源臂的四环素基因片段1- bla-tet；以质粒pBR322为模板，用引物1- rnd上游和1- rnd下游扩增包含靶向基因同源臂的四环素基因片段1- rnd-tet。
PCR反应体系：2×PCR buffer 25μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至50μL。
PCR反应条件：98℃变性10 s，68℃延伸50min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果表明，PCR扩增的1- bla-tet，1- rnd-tet片段大小为1.5kb（图14）。
以1- bla-tet为模板，用引物2- bla上游和2- bla下游扩增包含靶向基因同源臂的四环素基因片段2-bla-tet；以1- rnd-tet为模板，用引物2- rnd上游和2- rnd下游扩增包含靶向基因同源臂的四环素基因片段2-rnd-tet。
PCR反应体系：2×PCR buffer 25μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至50μL。
PCR反应条件：98℃变性10 s，68℃延伸50s，共30个循环，72℃最后延伸5min。
结果表明，PCR扩增的2-bla-tet片段和2-rnd-tet片段的大小都为1.5kb（图14）。
(3)四环素基因片段的电转化
分别取包含pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED质粒的Z.mobilis ZM4单菌落培养于3 mL RMG培养基中，得到菌液全部接种于100 mL RM培养基中，培养至OD600为0.3-0.4。于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，用20 mL灭菌的ddH2O清洗菌体，于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次，再用10 mL 10%甘油清洗菌体，于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次，将收集到的菌体悬浮于1 mL 10%甘油中，制备感受态。
采用美国BTX 公司的ECM830脉冲导入仪。将1μg的四环素基因片段2-bla-tet和2-rnd-tet分别与200 μL Z. mobilis（pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a-RED）感受态混合后在2500 V、200 Ω、50 μF条件下电击，电击后把菌液迅速转移至3mL RM培养基中静止恢复3 h，将全部菌液离心收集后涂布于含四环素（50μg/mL）的平板，3 d后出现转化子。
(4)转化子的鉴定
为验证敲除结果，检测在bla突变株和rnd突变株中，四环素基因携带的同源臂与靶向基因是否实现了同源重组。首先在四环素基因内部设计验证引物，同时在bla和rnd基因的上下游各200bp左右的位置设计引物，将各引物配对后对突变株进行PCR鉴定。
设计扩增四环素内部引物Tet-test上游，Tet-test下游；扩增bla基因引物bla-test上游，bla-test下游。引物bla-test上游位于左端同源臂上游330bp，引物bla-test下游位于右端同源臂下游325bp。
设计扩增rnd基因引物rnd-test上游,rnd-test下游，其中引物rnd-test上游位于左端同源臂上游249bp，引物rnd-test下游位于右端同源臂下游299bp，具体序列如下：
Tet-test上游：TATCGCCGACATCACCGATGGGGAA，
Tet-test下游CGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAG，
bla-test上游：GGAATGCGTTCTTTCTCG，
bla-test下游：ACGACATGGACAATGCC；
rnd-test上游：TTGACGGGAACATTTGAT，
rnd-test下游：TATTCGCCGCTGTAGTGA
对bla突变株进行检测。以单菌落为模板，引物Test-tet上游和bla-tes下游，进行PCR扩增片段1。结果显示，PCR扩增的片段1大小为1.4kb（图15）。以单菌落为模板，引物bla-test上游和Test-tet下游，进行PCR扩增片段2。结果显示，PCR扩增的片段2大小为1.3kb（图15）。
以单菌落为模板，引物Test-tet上游和rnd-test下游，进行PCR扩增片段3，对nd突变株进行检测。结果显示，PCR扩增的片段3大小为1.3kb（图15）。以单菌落为模板，引物rnd-test上游和Test-tet下游，进行PCR扩增片段4。结果显示，PCR扩增的片段4大小为1.3kb（图15）。
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物 1.0μL，下游引物 1.0μL，模板DNA 1μL，加水至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性1min，98℃变性10 s， 63℃延伸1.5min，共30个循环，72℃最后延伸5min。
为进一步验证结果，将得到的PCR扩增得到的片段1和片段3的产物送华大基因公司进行测序，测序结果见图16，图17。测序结果表明，在bla突变株和rnd突变株中，带有60bp同源臂的四环素基因片段与靶向基因在同源区实现了同源重组，使得四环素基因整合到运动发酵单胞菌的基因组上，说明RED系统能够在运动发酵单胞菌中发挥作用。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 运动发酵单胞菌RED系统的构建与应用
<160> 19
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gagcaatggc gatgaaggta gcttgcagtg gg 32
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cagtttcagt attaatatcc attgcttact ccatatat 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atatatggag taagcaatgg atattaatac tgaaactg 38
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
cccactgcaa gctaccttca tcgccattgc tc 32
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cgccgtgtta aaacagttta ttgcaaaaac aggccacctg acgtctaaga aac 53
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gtcataatca ttcctttggc ggcgtttttt atgttctgcc aagggttgg 49
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gacgatcata acggctgtta aaaatttacg ccgtgttaaa acagtttatt g 51
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ttttttcataa agagtgcgg ggattttttg tcataatcat tcctttggcg 50
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
gaattttggg tcttgacctc tttataggag cgccacctga cgtctaagaa ac 52
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
gctggaacaa ggtttctgct tgattgaccg tctgttctgc caagggttgg 50
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
tgcaggaaaa ttcttttcat caaatgaaag aattttgggt cttgacctct t 51
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
tttgcctgct cccgcaaatc tgctttttgc tggaacaagg tttctgctt 49
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
tatcgccgac atcaccgatg gggaa 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
cgaacgccag caagacgtag cccag 25
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ggaatgcgtt ctttctcg 18
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
acgacatgga caatgcc 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
ttgacgggaa catttgat 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
tattcgccgc tgtagtga 18
Claims (3)
1.一类能在运动发酵单胞菌中应用的RED重组系统表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因和RED重组系统基因（exo、bet、gam）。
2.根据权利1所述的质粒，其特征在于：
1）pSUZM1a-RED包含运动发酵单胞菌染色体上的复制起点oriC、质粒pUC18的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌的组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc、来自质粒pKD46的RED重组系统基因；
2）pSUZM2a-RED包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、质粒pUC18的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc、来自质粒pKD46的RED重组系统基因；
3）pSUZM3a-RED包含运动发酵内源性质粒pZZM402的复制蛋白序列、质粒pUC18的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc、来自质粒pKD46的RED重组系统基因。
3.权利2所述的载体的构建方法，包括如下步骤：
1）分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a（含有运动发酵单胞菌染色体复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、以及来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM2a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18的复制起点、以及来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM3a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18的复制起点、以及来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）为模板，用以下引物5’-GAGCAATGGCGATGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’-CAGTTTCAGTATTAATATCCATTGCTTACTCCATATAT-3’，进行PCR扩增，获得载体骨架片段A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)和C（pSUZM3a）；
2)以pKD46质粒为模板，用以下引物5’- ATATATGGAGTAAGCAATGGATATTAATACTGAAACTG-3’和5’- CCCACTGCAAGCTACCTTCATCGCCATTGCTC -3’进行PCR扩增，获得基因片段RED；
(3)将载体骨架片段A、B和C与基因片段RED分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED。
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| CN109971778A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-05 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用 |
| CN110408642A (zh) * | 2019-07-30 | 2019-11-05 | 湖北大学 | 基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组大片段高效删除方法及其应用 |
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| CN1600862A (zh) * | 2003-09-23 | 2005-03-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 运动发酵单胞菌乙醇发酵基因的克隆及应用 |
| CN101889078A (zh) * | 2007-10-05 | 2010-11-17 | 国立大学法人鸟取大学 | 能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的细菌和使用该细菌生产生物乙醇的方法 |
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2014
- 2014-07-08 CN CN201410320681.XA patent/CN104131023A/zh active Pending
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