CN1600862A - 运动发酵单胞菌乙醇发酵基因的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明构建了运动发酵单胞菌XW101的质粒基因文库，然后以乙醇脱氢酶II基因的部分序列为探针，从上述基因文库中筛选和克隆编码乙醇脱氢酶II酶的基因，连接到广寄主范围的穿梭质粒载体上，然后导入到野生型运动发酵单胞菌或大肠杆菌中。所克隆的乙醇脱氢酶II的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示。将所述乙醇脱氢酶II的编码基因导入到野生型运动发酵单胞菌后，可显著提高乙醇的发酵速度及产率。

Description

运动发酵单胞菌乙醇发酵基因的克隆及应用

技术领域：

本发明涉及运动发酵单胞菌基因组文库的构建、参与发酵的功能基因的克隆及相应基因在构建工程菌株方面的应用。本发明还涉及运动发酵单胞菌工程菌发酵生产乙醇的用途。

背景技术：

燃料乙醇是一类可补充或替代汽油的高效清洁环保燃料。但乙醇的生产成本较高，在价格上同汽油没有竞争力。在发酵生产乙醇的工艺方面，必须解决的关键性问题就是提高糖转化率，才能降低生产成本。

广泛应用于乙醇发酵研究和应用的传统酵母菌株主要为啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。若是以糖质或淀粉质原料生产酒精，这类酵母的酒精转化率已接近最大理论值(92克乙醇/180克葡萄糖)，可进一步挖掘的生产潜力已十分有限。

而分离自乙醇饮料物的运动发酵单胞菌被认为是可以降低发酵生产成本、大规模生产燃料乙醇的最佳替代微生物。运动发酵单胞菌为革兰氏阴性菌，自从1912年发现以来，其命名经过Termobacterium mobilis，Pseudomonas linderi，和Zymomonas mobilis的演变。Zymomonas mobilis是迄今为止所发现的唯一一株通过脱氧酮糖酸(Entner-Doudoroff，E-D)途径利用葡萄糖、果糖和蔗糖发酵生产乙醇的厌氧细菌。与酵母菌比较，具有糖的利用率高、发酵周期短、耐高渗透压，能在40％的葡萄糖(g/g)和13％乙醇(V/V)浓度下生长、在发酵中不需要控制氧气的添加量；以及容易进行遗传操作等优点。但野生型运动发酵单胞菌的生产乙醇的速度仍不够快，乙醇的产量只有在发酵72小时后才能达到最高。

在E-D代谢途径中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖内酯，同时，还原NAD生成NADH。催化活性很好的内酯酶迅速水解内酯，然后6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶将水解产物6-磷酸葡萄糖酸转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸。2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸是E-D途径中独特的中间产物。特异性醛缩酶再将这种化合物裂解为丙酮酸和甘油醛-3-磷酸，后来再经过一系列在糖酵解途径中常见的反应转化为第二个丙酮酸分子。接着丙酮酸通过一种不寻常的丙酮酸脱羧酶催化转变成乙醛和二氧化碳，这种丙酮酸脱羧酶和酵母中丙酮酸脱羧酶不同之处在于它不需要硫胺素焦磷酸作为辅酶来维持其活力。最后两种乙醇脱氢酶(乙醇脱氢酶I和乙醇脱氢酶II)将乙醛还原为乙醇，乙醇脱氢酶I同常见的乙醇脱氢酶一样，是一个四聚体，金属鋅位于其活动中心，而乙醇脱氢酶II的不同之处在于铁位于其活性中心。如果乙醇浓度降低，乙醇脱氢酶I还原乙醛的Vmax值大约是氧化乙醇的2倍，而乙醇脱氢酶II氧化乙醇的速率要快一些；如果没有乙醇存在，两者催化还原乙醛的速率是一致的；如果乙醇浓度提高，则乙醇脱氢酶I受到强烈抑制，但是，此时乙醇生产仍然能持续进行，因为这种情形极大地提高了乙醇脱氢酶II还原乙醛的速率。因此在利用运动单胞菌进行发酵生产乙醇的过程中，运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶是将糖酵解途经中产生的丙酮酸高效转化为乙醇的关键酶，而乙醇脱氢酶II对反应速度的增加起着重要作用。

发明内容：

本发明的目的是从运动发酵单胞菌中克隆乙醇脱氢酶II的编码基因，导入到野生型运动发酵单胞菌中，提高乙醇的产率。

本发明的技术方案是构建运动发酵单胞菌XW101的质粒基因文库，然后以乙醇脱氢酶II基因的部分序列为探针，从XW101的基因文库中筛选和克隆编码乙醇脱氢酶II酶的基因，直接或经过改造后，连接到广寄主范围的穿梭质粒载体上，然后导入到野生型运动发酵单胞菌或大肠杆菌中。

本发明构建基因组文库的方法是CTAB法(Wilson，K.Inf.M.et al 1987)，提取运动发酵单胞菌XW101的总DNA，限制性内切酶Sau3AI部分酶切总DNA，酶切的合适片段连接到载体pLA2917上，连接产物电击转化到宿主大肠杆菌JM109中，在含有抗生素的LB平板上筛选含有重组质粒的菌株。克隆发酵功能基因的方法是，在已构建好的基因组文库中通过菌落原位杂交方法(DNA-DNA杂交)得到含有发酵基因重组质粒的菌落，将得到的重组质粒测序，分析出能翻译有功能蛋白的框架，进而得到所需基因。得到的基因可以根据试验目的与合适载体连接，用于构建工程菌株。所克隆的乙醇脱氢酶II的编码基因大小为1.267Kb，序列如SEQ ID NO：1所示。将所述乙醇脱氢酶II的编码基因连接到质粒pLA2917后，得到重组质粒pLWP18(插入片段序列如SEQ ID NO：2所示)，转入到野生型菌株XW101后，可显著提高乙醇的发酵速度及产率，使乙醇转化效率提高8％。

本发明进行了如下实验：

A运动发酵单胞菌XW101基因文库的构建

基因文库(genomic libary)是指用分子克隆手段，将提取的某种生物核基因组或细胞器基因组DNA，随机酶切或机械剪切为一定长度的片段，再与适当的载体DNA连接后转移到受体细胞中而形成的各种片段的重组子克隆的总和。一个完整的基因文库应囊括该生物基因组上的所有基因。基因文库的构建，借助合适的探针，通过分子杂交等途径即能筛选到目的基因。因此，基因文库的建立，对研究基因的结构、功能以及基因表达调控机制等，都具有特别重要的意义。

本发明使用CTAB法提取运动发酵单胞菌XW101的总DNA，用Sau3AI限制性内切酶将总DNA部分酶切为范围在15～23kb之间的片段后，连接到位于载体pLA2917上卡那霉素抗性基因中的BglII位点上，为确定染色体插入片段最适的连接条件，按载体和插入片段的不同比值(1∶1、1∶2和1∶3)设三个处理，同时设不加插入DNA的对照反应(表4-3)。将连接混合物在4摄氏度下过夜连接后，用电击转化到宿主大肠杆菌JM109中，在含有四环素抗生素的LB平板上筛选含有重组质粒或pLA2917的菌株。第一次经含有四环素抗性筛选的菌株再转接到含有卡那霉素的LB平板上，观察生长结果，只有那些不能在含有卡那霉素平板上生长的菌株中才含有插入运动发酵单胞菌XW101 DNA片段的重组质粒，计算重组质粒的个数，并得到基因文库的容量为6.75×104。

建立了基因文库，理论上基因文库合格与否可采用Clarke建立的如下统计公式进行检验。

$N=\frac{\mathrm{Ln}(1-p)}{\mathrm{Ln}(1-f)}$

P：任何一段DNA序列在文库中出现的概率

f：插入片段长度与全体基因组总长度的比值

N：重组总数]

本试验用于连接的插入片段平均长度15kb，运动发酵单胞菌为革兰氏阴性菌，它的基因组大小约为1.56×106，如果以99％的概率筛选到任意基因，要求的重组子为4.67×102，达到基因文库的要求。

B 乙醇脱氢酶II基因的克隆

比较相关基因核苷酸序列，设计出乙醇脱氢酶II两个基因的特异性引物，分别是Adh1(5’-TTA GAA ATC GGA GGC ATT GT-3’)和Adc2(5’-TCG GGT TGT TGC TTT AAACT-3’)，经PCR得到1.267Kb产物。纯化这PCR产物，经沸水浴变性，用DIG-High-Primer标记，得到筛选阳性重组菌体所需的探针。将生长在培养基上的菌落转到尼龙膜上，碱法裂解菌体，80℃烘烤固定DNA。用前述PCR产物探针进行菌落原位杂交。随后洗脱杂交膜上非特异结合的探针，添加抗体溶液进行免疫学检测。最后用X-光底片曝光显示杂交结果。

杂交得到15个含目的基因的阳性重组菌，通过对重组质粒提取，经PCR和酶切鉴定分析，从中选取含插有目的基因的重组质粒pLWP18进行测序分析，得到插入基因的遗传结构。

C 带有目的基因的质粒的转化及其对乙醇产率的影响的测定

基因工程常用的质粒在运动发酵单胞菌中不能稳定存在，对Z.mobilis来说，最佳的可负载外源基因的质粒是其自身的原生质粒片段与一些广寄主范围的质粒片段融合后产生的质粒。本发明选取了广寄主范围的质粒pLA2917作载体，将带有乙醇脱氢酶基因的阳性克隆质粒直接电转入XW101，通过四环素抗性筛选得到阳性转化子。

在实验室中经同等条件批发酵比较，转化子乙醇产率较未转化菌体高8％，表明转化子中重组质粒携带的乙醇脱氢酶基因有效表达，且基因的拷贝数直接影响到乙醇产率。

具体实施方式：

实施例1运动发酵单胞菌XW101基因文库的构建

1、CTAB法提取细菌总DNA

1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在合适的温度下培养。根据细菌的生长率不同培养时间可由几小时到几天不等。

2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清。

3)沉淀重悬于1.0ml 0.85％NaCl中。

4)室温13,000rpm离心2min，弃上清。

5)沉淀重悬于550μl1×TE中。

6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min。

7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育30min。

8)加30μl 10％SDS，37℃温育30min。

9)加100μl 5M NaCl充分混匀。

10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min。

11)加等体积(0.7～0.8ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀。

12)室温，13,000rpm离心10min。

13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)轻轻振荡混匀。

14)重复第12)步。

15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻振荡混匀。

16)重复第12)步。

17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后室温静置60min。

18)20℃13,000rpm离心20min。

19)弃上清，加500μl 70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。

20)4℃ 15,000rpm离心20min。

21)重复洗盐两次。

22)倒置离心管，干燥DNA沉淀10～15min。

DNA沉淀溶于100μl 1×TE缓冲液，-20℃保存备用。

2、酶切DNA片断与质粒pLA2917连接反应

10×buffer               2μl

pLA2917                  100ng

酶切DNA片断              350ng

T4连接酶(3U/μl)         2μl

加水至20μl，4℃过夜连接。

3、电击转化：

感受态细胞的制备

所有步骤均在冰浴条件下操作：

1)挑取LB固体培养基上的新鲜单菌落，接种于20ml LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养2小时，菌液OD值达到0.5-0.6，冰上冷却培养物至0℃。

2)将菌液转入灭菌离心管，4℃ 4000g收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。

3)加入20ml的预冷10％甘油，置于冰上，不时轻轻颠倒离心管，将菌体泡溶。

4)4℃4000g收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。

5)加入10ml的预冷10％甘油，轻摇离心管，将菌体泡溶。

6)重复步骤(4)

7)加入10ml的预冷10％甘油，轻摇离心管，将菌液泡溶。

8)重复步骤(4)

9)加入200ul的预冷10％甘油，溶解菌体，分装成40ul/1.5ml离心管。

连接产物转化感受态细胞

1)将电转化仪(BIO-RAD Gene PulserII System)调到2.5kV，脉冲控制器调到400Ω。

2)将2ul连接产物(水溶)加入到盛有40ul新鲜制备的或融化的冻存的感受态细胞小管中，混匀。

3)将转化混合物转移到预冷的电转化池中，吸干池的外表面，然后放入样品槽中。

4)进行脉冲电转化，然后取出电转化池，马上加入1ml LB培养液，于37℃中速振荡培养60min。

5)取200ul涂布于含有四环素的LB平板上。

通过含有卡那霉素的LB平板筛选含有重组质粒的菌落。

实施例2  醇脱氢酶II基因的克隆

1、PCR反应体系：

10×PCR buffer               2μl

2.5mMdNTP                    2μl

10×BSA                      2μl

50pM引物1                    2μl

50pM引物2                    2μl

模板DNA                      5ng

5U/μlTaq酶                  0.25μl

加无菌水至20μl

2、PCR反应条件：

1、94℃预变性                20s

2、94℃                      0s

54℃                         0s

72℃                         40s

(25个循环)

3、72℃                      5min

3、DIG-DNA探针标记

主要试剂：

1)灭菌dd-Water，15-25℃，用于稀释DNA

2)EDTA：0.2MpH 8.0 15-25℃，用于终止反应

模板DNA：纯度要求为用试剂盒纯化(BioDev公司)

DNA片段大小：模板DNA为线性，大小应大于100bp，当DNA模板大于5Kb时，先用识别4bp的限制性内切酶硝化。

DNA量：原则上可标记10ng-3μg的模板DNA，如果单一拷贝基因的检测在复杂基因组进行至少300ng的DNA模板(探针浓度：25ng/ml杂交溶液)需要标记。

步骤：

1)加1μg模板DNA(线性或超螺旋)、灭菌ddH₂O终体积为16μl

2)加热沸水中变性DNA10min，迅速置于冰浴中冷却。(注意：要求完全变性)

3)混合DIG引物，取4μl DIG引物加入到变性DNA中，混匀，并稍作离心。

4)37℃培养1小时(延长培养时间到20小时会增加标记产量)

5)加入2μl 0.2M EDTA(pH8.0)或者加热65℃，10min终止反应(注意：得到DIG标记片段的长度200-1000bp或更长，取决于模板长度)

4、菌落原位杂交：

硝酸纤维素膜上菌落的培养：

1)将硝酸纤维素膜铺于含有选择性抗生素的平板上；

2)用无菌牙签将菌落逐一对应地转移至实验板的滤膜上和含有抗生素的主平板上；

3)在实验板上和主平板上各划一个含非重组质粒的克隆；

4)倒置平板37℃培养16小时；

5)在三个或更多不对称的位置标记滤膜，在主板相近的位置也做同样标记；

6)用封口膜将主板封好，颠倒后置于4℃保存，直至得出杂交实验的结果；菌落的裂解和DNA与滤膜的结合：

1)将滤纸切成大小和形状适当的三张，使之适于三个玻璃托盘的底部，将三张滤纸分别浸泡在10％SDS、变性液、中和液三种液体中；

2)倾去多余的液体，用一根玻璃棒滚压滤纸，除去滤纸与托盘底部间的气泡；

3)用平头镊子揭下琼脂板上的硝酸纤维素膜，菌落面向上置于SDS浸湿的滤纸上，3min；

4)将膜转到用变性液浸湿的第二张滤纸上，浸泡5min；

5)将滤膜转到在中和液中浸泡的第三张滤纸上，浸泡5min；

6)在托盘中放置100ml 2×SSC，使滤膜浮在液体表面数分钟。此后，在晃动容器的过程中让滤膜沉入液面以下并留在液体中，5min；

7)干燥滤膜：将滤膜置于干的滤纸上，菌落面向上，于室温至少30min；

8)固定DNA：用两张滤纸上下包夹滤膜，在烤箱内80℃烤干1-2小时；杂交：

1)确定杂交温度：Tm＝49.82+0.41(G+C％)-600/1(1为碱基对中杂交的长度)；Topt＝Tm-20到25℃

2)DIG Easy Hyb工作液的准备：将64ml无菌ddH₂O分两次加入至DIG EasyHybGranules瓶中(第7号瓶)，37℃振荡5min使之溶解；

3)DIG EasyHyb(10ml/100cm²滤膜)适当的体积预热至杂交温度37-42℃；

4)在适当的容器中轻轻摇动进行预杂交30min；

5)沸水浴5min，使DIG标记探针变性，迅速置于0℃(注意：不要用碱性溶液处理)

6)将变性DIG标记探针与预热处理的DIGEasy Hyb(3.5ml/100cm²膜)混匀(避免产生气泡)

7)倾去预杂交液加入探针/杂交混合液，轻轻摇动反应4hr。

8)大量2×SSC/0.1％SDS洗膜，15-25℃，5min，不时摇一摇液体；重复一次；

9)用大量预热至65-68℃的0.5×SSC/0.1％SDS洗膜，5min，不时摇一摇液体；重复一次；

免疫测定：

1)试剂盒工作液的制备：

终止液：用顺丁烯二酸缓冲液稀释10×终止液(1∶10)

抗体液：使用前离心抗-DIG-AP，5min，10000rpm，从表面小心吸取所需的量，用终止液稀释之，1∶10000(75mU/ml)。

2)杂交并严格洗膜后，用洗涤缓冲液漂洗膜1-5min；

3)100ml终止液中反应30min；

4)20ml抗体液培养30min；

5)100ml洗涤缓冲液漂洗15min洗2次；

6)20ml测定缓冲液中平衡2-5min；

7)将膜(DNA面作记号)置于杂交袋中，加入1mlCSPD ready-to-use(5号瓶)，15-25℃培养5min，

8)挤出多余的溶液，封口；

9)湿润的膜培养10min 37℃，以增强化学发光反应。

10)X-ray感光15-25min 15-25℃。

实施例3带有目的基因的质粒的转化及其对乙醇产率的影响

1、电转方法：同实施例1。

2、乙醇产率测定：

1)色谱条件

色谱柱长2m，内径4mm。

固定相GDX-102，60-80目

温度气化室190度，检测器190度，柱温170度。

气体流速载气(N₂)40ml/min。

2)进样量5.0ul。

3)定性以乙醇标准出峰时间定性。乙醇标准应用液和样品测定液各进样5.0ul，分别测定保留时间，样品与标准出峰时间对照而定性。

4)定量

样品测定液中乙醇含量测定取样品测定液5.0ul进样，测出乙醇峰高或峰面积，依据工作曲线或回归方程计算测定液中乙醇含量(％)。

工作曲线制作取20±0.5度的乙醇标准应用液适量用20±0.5度纯水稀释成乙醇含量(V/V)分别为：0.20％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％的标准系列浓度。分别取上述乙醇标准系列浓度5.0ul进样，测得乙醇的峰高或峰面积。以乙醇的含量百分浓度为横坐标、相应的峰高或峰面积为纵坐标，制作工作曲线，或用最小二乘法计算其回归方程。

计算样品中乙醇含量

乙醇含量(C₂H₅OH，％，V/V)＝样品测定液中乙醇含量×f

f-稀释倍数(1，50或100)。

5)乙醇实际产量与理论产量的百分数的计算

6)试验数据(10ml培养基)

1、2、3为含乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶重组质粒的XW101的三个重复，4、5、6为野生菌XW101的三个重复

编号	发酵前含糖量(g)	发酵后含糖量(g)	乙醇含量(ml)	百分数(％)
					1	1.73	0.26	0.89	94.76％
2	1.73	0.25	0.90	95.18％
					3	1.73	0.18	0.94	94.92％
4	1.73	0.33	0.77	86.09％
					5	1.73	0.35	0.75	85.07％
6	1.73	0.36	0.76	86.83％

                                         SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>运动发酵单胞菌乙醇发酵基因的克隆及应用

<130>03-02

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1152

<212>DNA

<213>运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

<400>1

1    ATGGCTTCTT CAACTTTTTA TATTCCTTTC GTCAACGAAA TGGGCGAAGG TTCGCTTGAA

61   AAAGCAATCA AGGATCTTAA CGGCAGCGGC TTTAAAAATG CGCTGATCGT TTCTGATGCT

121  TTCATGAACA AATCCGGTGT TGTGAAGCAG GTTGCTGACC TGTTGAAAGC ACAGGGTATT

181  AATTCTGCTG TTTATGATGG CGTTATGCCG AACCCGACTG TTACCGCAGT TCTGGAAGGC

241  CTTAAGATCC TGAAGGATAA CAATTCAGAC TTCGTCATCT CCCTCGGTGG TGGTTCTCCC

361  GAAGGTATCG ACAAATCTAA GAAACCTGCC CTGCCTTTGA TGTCAATCAA CACGACGGCT

421  GGTACGGCTT CTGAAATGAC GCGTTTCTGC ATCATCACTG ATGAAGTCCG TCACGTTAAG

481  ATGGCCATTG TTGACCGTCA CGTTACCCCG ATGGTTTCCG TCAACGATCC TCTGTTGATG

541  GTTGGTATGC CAAAAGGCCT GACCGCCGCC ACCGGTATGG ATGCTCTGAC CCACGCATTT

601  GAAGCTTATT CTTCAACGGC AGCTACTCCG ATCACCGATG CTTGCGCCTT GAAGGCTGCG

661  TCCATGATCG CTAAGAATCT GAAGACCGCT TGCGACAACG GTAAGGATAT GCCAGCTCGT

721  GAAGCTATGG CTTATGCCCA ATTCCTCGCT GGTATGGCCT TCAACAACGC TTCGCTTGGT

781  TATGTCCATG CTATGGCTCA CCAGTTGGGC GGCTACTACA ACCTGCCGCA TGGTGTCTGC

841  AACGCTGTTC TGCTTCCGCA TGTTCTGGCT TATAACGCCT CTGTCGTTGC TGGTCGTCTG

901  AAAGACGTTG GTGTTGCTAT GGGTCTCGAT ATCGCCAATC TCGGTGATAA AGAAGGCGCA

961  GAAGCCACCA TTCAGGCTGT TCGCGATCTG GCTGCTTCCA TTGGTATTCC AGCAAATCTG

1021 ACCGAGCTGG GTGCTAAGAA AGAAGATGTG CCGCTTCTTG CTGACCACGC TCTGAAAGAT

1081 GCTTGTGCTC TGACCAACCC GCGTCAGGGT GATCAGAAAG AAGTTGAAGA ACTCTTCCTG

1141  AGCGCTTTCT AA

<210>2

<211>13807

<212>DNA

<213>运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

<400>2

1    TACCCGCCGC CTTGGCGTTA TTCATGGCTT CATAAGCCAT GCCTGCCGTC ATCGAGCCAT

61   CACCGATAAT CGCAACCGCT TTGTCGTCGC TGTCGGATAA TTTGCTGGCC ATCGCAAAGC

121  CGAGCGCCGC AGAAATAGAA GTCGAACTAT GCGCTGCTCC AAAAGCGTCA TATTCGCTCT

181  CCGCGCGCTG CGTAAAGCCC GATAAGCCGT CACGTTGCCG CAATGTCCGA ATACGATCAC

241  GGCGACCTGT TAAAATCTTG TGAGGATAGG TTTGATGCCC AACATCCCAG ACCAAAGCGT

301  CTTTGGCGTG TTGAAAACAT AATGAAGAGC TACCGTTAAT TCGATAACCC CCAGACCGGA

361  ACCGAGATGT CCGCCGGTCA CACCCACTGC CGAGATGGTC TCTTTCCGTA ATTCATCCGC

421  CAATTGCCGG AGGCTGTTGC GATCTAATTG ACGCAATTCT GCCGGTGTCT TGATCTTGTC

481  TAACAACGGC GTCTTTTTAT TCGGAAACAT AGGCCTGAAA TCAAACTCTG CATTAGGCAT

541  TTACCCGATA AAACGAAAAG CGGTTTTAAC AAGGTAAAGA CTTTATCTGA AAAATATTTC

601  GTCGCCTTCA TAAGGCAAAC GCGGCTTTTC TGTACACTTT CACCGCCTGG ATGTAAAAAT

661  AATAAAGCAG GCGAGCAAAA GGCCAGCTAT CAAAGAATTT CCCGCTATTA AACCCGAAAA

721  GATTTCTGCC ATGGCTGAAA TCGGGGCGAA AATCCTGATA ATAGGCTTTA AATGGCAAAT

781  TATTTATGAC GGTAGGCTTA ATAGCCTGTA AAAATTTGTA ACAATATTTT TTGTTTTTGC

841  AATAAACAAA AACAAATGCC TCCGATTAGA AATCGGAGGC ATTGTTTGCT TGAAAATCAA

901  GACAGGACGG AAAACCGTTT TCCTGTTTTG AAATTAGAAA GCGCTCAGGA AGAGTTCTTC

961  AACTTCTTTC TGATCACCCT GACGCGGGTT GGTCAGAGCA CAAGCATCTT TCAGAGCGTG

1021 GTCAGCAAGA AGCGGCACAT CTTCTTTCTT AGCACCCAGC TCGGTCAGGT TTGCTGGAAT

1081 ACCAATGGGA GCAGCCAGAT CGCGAACAGC CTGAATGGTG GCTTCTGCGC CTTCTTTATC

1141 ACCGAGATTG GCGATATCGA GACCCATAGC AACACCAACG TCTTTCAGAC GACCAGCAAC

1201 GACAGAGGCG TTATAAGCCA GAACATGCGG AAGCAGAACA GCGTTGCAGA CACCATGCGG

1261 CAGGTTGTAG TAACCGCCCA ACTGGTGAGC CATAGCATGG ACATAACCAA GCGAAGCGTT

1321 GTTGAAGGCC ATACCAGCGA GGAATTGGGC ATAAGCCATA GCTTCACGAG CCGGCATATC

1381 CTTACCGTTG TCGCAAGCGG TCTTCAGATT CTTAGCGATC ATGGAAGCTG CTTTCAAAGC

1441 GCAAGCATCG GTGATCGGAG TAGCTGCCGT TGAAGAATAA GCTTCAAATG CGTGGGTCAG

1501 AGCATCCATA CCGGTGGCGG CGGTCAGGCC TTTTGGCATA CCAACCATCA ACAGAGGATC

1561 GTTGACGGAA ACCATCGGGG TAACGTGACG GTCAACAATG GCCATCTTAA CGTGACGGAC

1621 TTCATCAGTG ATGATGCAGA AACGCGTCAT TTCAGAAGCC GTACCAGCCG TCGTGTTGAT

1681 TGACATCAAA GGCAGGGCAG GTTTCTTAGA TTTGTCGATA CCTTCGTAGT CTTTGACTTC

1741 ACCACCATTG GTTGCGACCA GAGCGATGGC TTTGGCGCAG TCATGGGGAC AACCACCACC

1801   GAGGGAGATG  ACGAAGTCTG  AATTGTTATC  CTTCAGGATC  TTAAGGCCTT  CCAGAACTGC

1861   GGTAACAGTC  GGGTTCGGCA  TAACGCCATC  ATAAACAGCA  GAATTAATAC  CCTGTGCTTT

1921   CAACAGGTCA  GCAACCTGCT  TCACAACACC  GGATTTGTTC  ATGAAAGCAT  CAGAAACGAT

1981   CAGCGCATTT  TTAAAGCCGC  TGCCGTTAAG  ATCCTTGATT  GCTTTTTCAA  GCGAACCTTC

2041   GCCCATTTCG  TTGACGAAAG  GAATATAAAA  AGTTGAAGAA  GCCATAGCTA  TAACCTCACC

2101   CTACATACTA  GTTTAAAGCA  ACAACCCGAA  AACAACCATT  TTCGAGAAAT  CGCTTTCTAT

2161   TGTTTTTGCG  TTTTAATCCC  GTTTTCGAGA  CGTTTTCTCA  AAGTTTTTCC  TGAAAACGAG

2221   TAAAATCACC  AATTTTACGC  ATTTTCAGCA  ATCGGGCAGC  GCAAAAGCAA  TATGTCTATC

2281   AGTTTTATCA  GATCAAGGGG  TTCGCTTTAT  TCCAGCACAT  TTATAGTCTG  TNTTAACGAA

2341   GCGACCTCTA  TTTTCTGAAA  GCCGAGATTT  TTCTACTCGC  GACAGCGGTG  ATGAGCAAGG

2401   CTGCTTGTTC  TTTCTAAATA  TGTATTTTTT  ACATCAAGAC  TTATGCAAAT  TATGAAAAAG

2461   TTGTCTTTTT  ANTATGAAGT  ATTGTTTAAT  AATTGAGATG  TGGTTACCGA  TTTTGCCTTT

2521   AAATTAAAAT  AATAAATTTC  AGGCGAAATA  TTTTAAAATA  AAACATTTAT  GTTAAATTTT

2581   AAGAAAGGAA  ATTTTGAAGA  ATCTGTTATT  TTGTTCGTTT  TTGAGGCTTT  TTAGAGAAAG

2641   ATAAGACTAA  AAATAACATA  GTTGTTAGGT  ATTCATTCCA  ATTTATTGTT  CAAATATTAA

2701   AAGCCAAATT  GTAAATAGAA  AACAAGAAAA  TATCGTATAT  GGCGAAATAT  ACTGTATAAA

2761   TTGCACAACA  TTAAAATAAA  GACATTTTCA  GATATCCAAA  TAGATTGTGA  AAAAAGAAAT

2821   AAAAGAATAA  TTTGTAAGGA  TGCAGGGGAA  TAGTCAGGAA  AAGAAGCTAT  GGGGGTCGCG

2881   GTAGCTTGAG  GAGGAGGGGG  GGGAGTGCTA  CCGCCACCCG  CTCTGCCGAA  ATAGGGATAT

2941   TCATCCATAA  TAAAAATAGA  AAAACCAGAC  AATTATCGTT  TCCATTTTTC  ATCTAATCAA

3001   TTGTCTCACA  CGCTGCATCA  AAAGCAGCTT  GTTCTTTCTT  CTGCTCAAAA  TGGCAGATCA

3061   GGCTTTCCTC  AAAAAACGCA  AAAAGACAAA  AAAAATTGCA  GCGGTAATGA  AAAAATAAAA

3121   GAAATTTTGA  AAATTTTTGC  CGCTTTTATG  TGGAAGCGGA  TATTTTATCT  ATTTACAGTC

3181   TCGACGAGAC  AATCTTTGTT  GTTGTTAAAG  AAAAATCAGT  AAGATGATGC  TGTTTTGGAA

3241   ACAATGATTC  AACGGGGGGA  TATATTTTTA  TGAAGCGTTC  CTTGCTATTT  TTGCTAGCGA

3301   CCAGTGCCAT  CGCTTGGCAG  GCACAAGCGA  TACCAGCTGG  AAATTCTGCA  CCTCAACCTA

3361   TGGCGATATC  TGAAACGATT  CCGGCTGCGG  TTGATAAACC  TTATAGCGGT  CTCATTCGTC

3421   TTAATGTCGA  TGCCACAGAC  ACGCAGCGCG  GTATTGTTCG  GGTAACGGAA  ACGATTCCTG

3481   TTCAGGCTGG  TGCGCTGACT  TTGCTCTATC  CTGAATGGTT  GCCGGGACAT  CATAGTCCAT

3541   CAGGTCCCAT  CGAAAAATTG  GCAGGTTTGA  TTGTTACCGC  CAATAATCAG  GTTATTCCTT

3601   GGCAACGCGA  TTCTGTCGAT  GTTTATGCCT  TTCATCTTGA  TATTCCGGCA  GGCGTGACCG

3661   AAATCACCGC  CCAATATCAA  TATCTCTCCC  CGACTTCGGA  GTCGCAGGGA  AGAATCCAGT

3721   CCACACCGGA  AATGGTCAAT  TTGCAGTGGA  ATACGCTGGC  TTTATATCCG  GCCGGATATT

3781   TTACCCGCCA  AATCCAGATA  CAGCCGACCG  TTATTTATCC  AACGGGTTGG  AAATCGGCTT

3841   CTGCCTTAGA  AATTTCTGGT  ATCACGCCTG  ATGGACAGAC  ACCCAATGTC  GTCCAATATA

3901   AAACTACCGA  TTTTGATACG  CTAATTGATT  CGCCGGTAAT  GGCGGGTCGT  TATACGCGGA

3961   CAGAAACGCT  CGCCCCCGGG  GTTCGTCTCA  ATCTTATAGC  AGACAAACCC  GAAGATATGG

4021  TGATGACGGA  CAAACAGCTT  AACGCGCATC  GCCAGCTCAT  AACCCAAGCC  GTAAAACTTT

4081  ACGGCGCACA  ACATTATAGC  CATTATGATT  TCTTGCTGGC  TTTGTCCGAA  AAGCTCGGTG

4141  GTATTGGTTT  AGAACATCAC  CAATCTTCCG  AAGATGGGGA  AGGGGCTGAT  TACTTCTCGA

4201  AATGGGATAA  ATCAGCCGTT  GGTCGTGATC  TCCTCGCCCA  TGAATATAAC  CATAGCTGGA

4261  ATGGTAAATA  TCGCCGCCCC  GCTGATCTTT  GGACACCGGA  CTATAAAACG  CCGATGCGGG

4321  ATAGCCTCCT  TTGGGTTTAT  GAAGGTCAAA  CCCAGTTTTG  GGGTTATGTA  TTGGCCGCGC

4381  GTTCCGGTCT  GTGGCAGCAA  AAAGATGCCT  TGGAAGCCTT  GGCTTTGGTG  GCCGCCACTT

4441  ACGACAATCG  GGCAGGCCGC  CGTTGGCGTC  CGGTGGAAGA  TACCACTAAT  GATCCGATTA

4501  TTTCGCAACG  CCGCCCCAAA  GGCTGGCTAA  GCTGGCAACG  TTCCGAAGAT  TACTACAGTG

4561  AAGGTCAGTT  GATCTGGCTT  GATGTTGATA  GCCTGCTCCG  GCAACAAACT  CATGGCAAAC

4621  ATTCGCTTGA  CGATTTTGCA  AAAGCCTTTT  TCGGAATGCG  TGACCGTGAT  TGGGGTGAGT

4681  TAACCTATAA  TTTTGACGAT  GTCGTCAAAA  CCTTAAATGA  CATCATGCCT  TATGACTGGG

4741  CAGCCTTCTT  TAACCAGCGT  TTGAATCAGC  GTTCGACCCA  TGCGCCTTTG  GACTGGATCA

4801  GCCGTGGCGG  TTACAAACTG  GTTTACAGTG  ATGAGCCAAC  CGACTGGATC  AAAGGTGTTG

4861  AAGGCGCACG  CCATATGGCC  GAGTTGTCTT  TCTCTTTGGG  ATTATCGACT  TCTGAAAAAG

4921  GCAAAGTCTC  TTCGGTGATG  TGGGATAGCC  CTGCCTTTAA  CGCTGGATTG  ACCGTAGGAA

4981  GTGAATTGGT  CGCGGTTGAT  GGTCATGCCT  TTAGCAATGA  TCTGCTAAAA  ACAGCGATCA

5041  AAAATGCCAA  GGCCAATAAA  ACGCCGATCA  AATTGCTCAT  CAAGCAAGGC  GATAATTATC

5101  GGGATGTCGC  GATTCCTTAT  TATGACGGCT  TCCGTTACCC  GCGCCTTGAG  AAAATCGATA

5161  AAACCCATAG  CTATCTCGAG  GATTTACTCG  CAGCCAAAAA  CTAATTTTGA  TCCATGATGA

5221  AAAGCAGTCA  GGTATAAAGC  CGATTTCGGT  GCTTGCCTGA  CTGCTTTTTC  AGTCTTATTA

5281  AAAAAGAGTG  CAGATTTCTT  CTCCTCTCCG  TCTGGAATTA  GACAAATCAG  CCCTGATGGC

5341  AAACTGGCAA  AGTTTGAACC  GGATAACGGC  TGGTCATTGT  GGTGCCGCGA  TCAAGGCTAA

5401  TGGCTATGGT  TTAGGGGCTG  AACGCGTTCG  TCATTATCTG  GCACAGGCCG  GATGTCGCGA

5461  TTTTTTGTTT  CCAGTTGGGA  TGAAGCTCGC  TTACTCGATA  GTTCGGAAAA  GGATTTCTCC

5521  CTTTCTGTTC  TCCATGGCCT  AAGGGAAGAT  GACCTCGGCT  ATGCTCTGAA  TTCTTCGGTC

5581  AAGCCGGTTT  TATGTAGTCC  AGCGATGATT  GCCCGCTGGA  AACTCACGCG  CCGAACCGTC

5641  CCTGCGATGT  CATGGTCGAT  ACTGGAATGA  ATCGGCTGGG  TCTTTCGATG  GAAGAGCGGG

5701  TTCAGGCCTG  CTGGATGGTC  TTTCTATCGA  CAATATTTTG  AGCCATCTGG  CCTGTGCAGA

5761  CGAGGCAGAT  CACCCGCTTA  ATCAAAAGCA  GCTTGAACGC  TTTCGGATTT  TAGCCGCCAG

5821  AAAACAGGCA  AAACGCTATA  GTTTGGCTAA  TTCTGCCGGT  ATTTTTCTCA  GCAAAGACTA

5881  TCATTTTGAT  CTGGCGCGTC  CGGGCTTGGC  GCTTTACGGC  GGCCTGCCTG  TTCCGCAATC

5941  CAAAGATATT  CTGAAACCCG  TCGTTGCTAT  TGCCGCCCAA  GCCATTCAGG  TAAGAGAAGT

6001  CAGCGCCGGT  GAGGCGATTG  GCTATGGTGC  TTGTTTTGTC  ACGCCCAAAA  AAATGCGGGT

6061  GGCTATTTTG  CATGTCGGTT  ATGCTGATGG  GTATTGGCGG  GCTTTCTTTG  AAAAAGGCCA

6121  TGCCCGAAAA  GACGGCGTTA  TCTGTCCTTT  GGCCGGTCGG  GTTTCTATGG  ATATGATAAC

6181  GGTTGCCTTG  CCGGATGTAT  TGACAGCTCA  CGAAGGTGAC  TGGTTCTCGG  TTGATTTTGA

6241    CTTGCCTTCC  CTTCGCAACA  GACCGGATTA  TCCCAATATG  AACTACTGAC  GGGCTTGGGG

6301    CATCGTTACC  AATCTGTCTG  GCAGGCAATA  TAAATGCCGC  CATTATCTAA  TAATGTAGAG

6361    AGAGGATCAG  CATTGCTTTT  CCCTATTCGG  TGCTTGGCCG  CCATTGGTCG  TTTGTTTATT

6421    GCTTTTTTGG  CTGGCATCGG  TCGGATAGCC  CGTTTCGGAA  TGACGATTTT  GTTGAGAGGC

6481    GCTTTACCGC  CTTATTATCC  CGGTCGTTTT  TTCCACGAAT  TTTTTGAAAT  CGGCTGGAAT

6541    TCGCTTCCAG  TTGTGGCCTT  AACCGCTGTT  TTTACCGGAT  CAGCCTTGGC  ACAACAGGTC

6601    TATGCTGCGG  CCAGCCGTTT  TTCAGCGCAA  TCGACAGTTC  CGGCGGCGGT  TGTTATCGGT

6661    ATGGTTCGGG  AATTAGGCCC  TGTTTTGGTC  GGATTGATGG  TTGTCGGTCG  AGTCACTTCT

6721    GCGATTGCCG  CCGAATTGGG  CGCTATGCGG  GTGACCGAGC  AAATTGATGC  GATGGAAACG

6781    CTGCATACAG  ATCCCTATCG  CTATCTTTTG  GCACCTCGCC  TTTATGCGGC  TACCCTCGCT

6841    TTGCCTTTCT  TGGTGATGCT  GGCCAATGTT  ATCGGCATTT  TCGGGGGCTA  TCTTCTTTCA

6901    ATCAGCAAAT  TGGGCTTTAA  CCCTGAAAAT  TATCTCAAGG  TAACACGCGA  ATTCCTAAAG

6961    GCCGAAGATG  TCCATATGGC  GCTGGTAAAA  TCGGCAGTTT  TCGGTTTTCT  CGTTGCATTA

7021    TTGGGCTGTT  ATAATGGCTT  TTTTGCCACC  GGCGGCGCGG  CAGGTGTTGG  ACGTTCAACA

7081    AAGCGGGCGG  TGGTCAGCGC  CTTTATCATG  ATCCTGTTTT  CAAATCTGAT  GATTACCATG

7141    TTCTTTTTCG  GATAAAGAGT  CTTATGCCTC  AGACACAGCC  TCTCATCCGA  ATTCGCGGGT

7201    TAAGAAAATC  TTTTGGCGAT  CACGCTGTTT  TACAAGGCGT  GGATATTGAT  ATCGACAAAG

7261    GACAGTCGGT  TGTCATTATC  GGCCAGTCCG  CGCGGCAAAT  CGGTTTGCTG  AAACCATATT

7321    AGGCCTGATC  GAAGCCGATG  CCGGTTCTAT  CGAAATAGAG  GGGCAGGATA  TTGAAACCAT

7381    GTCCCAAAGC  CAATTGGCTT  CTATTCGCGA  TCATATCGGG  ATGCTGTTCC  AAGGCGGGGC

7441    GTTATTCGAT  TCCTTGCCAG  TTTGGCGCAA  TATTACCTTT  GCCATTACCC  AAGGTCATTT

7501    ACGCGATACC  GCCAAAATGC  AAAAATTGGC  GAGCGAATAT  CTCGCACGGG  TCGGATTGGA

7561    TGACAGGATT  CTCAATCTTC  GTTCTGGGGA  ATTATCAGGA  GGGATGCAAA  AACGCGTAGC

7621    GATTGCGCGG  GCGATTGCGG  CTAAACCCGA  AATCCTGTTG  TTTGATGAAC  CGACCGCAGG

7681    CCTCGACCCC  ATTCGCTCTG  ATGTCATTGA  CGACTTAACG  CTTAGCCTCG  TGCGCGATAA

7741    TGGTATGACC  GCAATTACCA  TTACCCATGA  CATGGCTTCG  GTTTGCAAAA  TTGCGGATAA

7801    GATCGCCTTC  CTGCATGAAG  GCCGTATTAT  CTGGACAGGG  AATACTCAAG  ACCTTCGGAC

7861    AACCGACAAT  CCCTATGTTC  GGCAATTTTT  TGATCGCAAA  GCCGAAGGCC  CCTTCATTGA

7921    AAACAGCCTA  CTGACTGTTT  GTATAACCAG  TAACGATCTA  AACGCTAGAA  TTAATGAATG

7981    AAAAAAGAGG  CTATAAACAT  AATCTATAGC  CTCTAATTTT  ATTAAAAAAT  TTAAGGCATC

8041    TTTATGCCGA  CATGCGTTAT  AAAATCATTC  CATAAATTTT  CGGCAGCCTC  TTGTGAAGTT

8101    AATGGTTTAT  TACTTAAAGA  TCCTCCCCCT  CTTAAAAGGA  ACTGATTGTA  TCATCTGAGG

8161    ATACTTGAAA  CCACCCATTC  ATTGAACCTT  CTGGAGCATG  TTCTGTAAAA  GAAAATTGAA

8221    TATCTCCAAA  AGAGGTAGAG  TTTTTAGCGG  ATCGGACGGT  AATATAGGCA  GTTTTATTCG

8281    CCATTTTTTT  GTTTACGAGA  GTGCATCCAA  AAGATAATGA  ATCAATTTCA  TCAAAAGCCC

8341    ATGTAATCAT  CTATTGAATT  GATTCTGTTA  TTGATCTTTA  AAAAATTCTT  TAATGGCATT

8401    GAAAGATTGT  MTTTTGAATT  CTGTBTTGTC  AATTTGATCA  AAATCTTTYT  GAATTTGATA

8461    TTSCCNYGAA  ACATCCATCT  BTSYBKCTTG  GAATCGACTG  GGAACATTGT  TCGTATTTGT

8521    STGATACTGG  ATAATATCTC  GTAAGCCATT  TACGATGCTC  AAAAATGCAA  GGTTTGTATT

8581    TGTCCACAGG  CTGATGGGCT  GTGCATCTYT  TGGTAATGCT  TTCAAACGGG  ATAATTCTGT

8641    TACAGATTTC  CAGTCACATG  GTTCTGCGAT  AATAGGAATT  ACACGAGCCT  CGCCTTTATC

8701    GTGACGATTT  AGTGCATATC  GCATTTCCGT  ATCCATACAG  TAAGGAGACG  CGATAAAATC

8761    AGGCGTTATT  ATTAGTAAAA  ATAAATCACT  ATTTTTTAAA  TTAACCTTTA  TTGTTTGATC

8821    TATTGAGTCT  CCAGGTAATA  TTTGATGATC  AAACCATGCT  TCGATGAGAC  CGTCCCTTTT

8881    TTAACCCAGT  AAGATGGGTT  TTGAGATCAT  TAAGAATATT  CTCATCTTTA  TGACAATAAG

8941    AGATAAACGC  TTTCATAAAA  AACCTTGTTT  CTGAGTATTA  GATAAAAATT  AAAATAAATT

9001    TTATCTATAT  TTACTGCATC  TATACATAAT  ATTATATATT  TAATTTTCWW  TTTTATAATA

9061    TATATTCTAA  GATCACTAGC  TGTAATCAGG  GTTAGCTTCT  AAAAAAATGA  CCCTAATCTT

9121    GACCGCCTAT  TTGGTCAGGT  TGAAGCATCC  GTTTTAAATA  ATGGCCAGCC  ACCAGTGCCA

9181    CCTTCAGGAC  CCAGATCAAT  TAGCCAATCA  GCTGTCTTAA  TGACATCCAG  ATTATGCTCG

9241    ATCACGACAA  TGCTATTTCC  TTGATCGACT  AGAGCATTCA  GAACTTCCAG  CAATTTTCGG

9301    ACATCTTCAA  AATGAAGACC  CGTGGTTGGT  TCATCAAGAA  TATACAGCGT  TCGCCCTGTT

9361    GCCCTTTTCG  ACAATTCTTT  TGCTAATTTA  ACGCGCTGCG  CCTCACCGCC  TGATAAAGTC

9421    GTCGCTTGCT  GACCAACCTT  GATATAGCCC  AAACCAACAC  GGGCAAGCAT  TGCCATCTTG

9481    TCACGGATAG  AAGGCACCGC  TTCAAAAAAT  TCTGCTGCCT  GATCGACCGT  CATATTCAAA

9541    ACATCGGCAA  TAGATTGGCC  TTTGAATTTG  ACCTCCTGCG  TTTCGCGATT  ATAGCGCGCA

9601    CCATGACAGA  CATCACAGGT  GACATAAACA  TCCGGCAAGA  AATGCATCTC  AATCTTTTTG

9661    ACGCCATCAC  CTTGGCAAGC  CTCACAACGC  CCGCCCTTGA  CGTTAAAACT  AAAACGACCG

9721    GCTTTATAAC  CGCGGGCTTG  AGCCTCCGGT  AATTTGGCAA  ACCATTCCCG  AATAGCGGTA

9781    AACGCACCGG  TATAGGTTGC  CGGATTGGAA  CGGGGCGTGC  GCCCAATAGG  TGATTGGTCA

9841    ATATCAATCA  CCTTATCGAG  ATGCTCCAAT  CCCGAAATAG  ATTTATAGTC  ACCACTAATC

9901    AGCCGCGCAC  CATTCAATTC  TCTGGCCGCC  GCCGTATAAA  GCGTATCCAA  AATCAGGCTG

9961    GATTTACCGG  AGCCGGAAAC  CCCCGTGACA  CAGGTGAAAG  TCCCCAAAGG  AATAGATGCC

10021   GTCACATTTT  GAAGGTTATT  GGCGGTCGCT  CCTTTAATGG  TCAGCTTTTT  ACCATTCCCC

10081   TTGCGACGTT  TATCGGGAAC  TGCAATTTCC  CGCCGCCCTG  AAAGATAAGC  GCCTGTCAAA

10141   CTATCAGGAC  AATCAATAAT  ATCCTGTGGC  GAACCGGCGG  CAATCACTTT  ACCACCCATC

10201   ACCCCCGCAC  CGGGGCCCAT  ATCGACGACA  TAATCGGCAA  GACGAATAGC  ATCTTCATCA

10261   TGCTCGACAA  CCAGAACTGA  ATTGCCCAAA  TCGCGCAATC  GCTTCAAAGG  TTTCAAGCAA

10321   GCGATCATTA  TCACGCTGAT  GCAAACCGAT  AGAGGGTTCA  TCCAACACAT  ATAAACACCG

10381   GACAAACCGG  AACCGATCTG  ACTAGCGAGA  CGGATGCGCT  GACTTTCACC  ACCAGAAAGT

10441   GTGCCGGAAG  AGCGGTCGAG  GCTCAAATAA  TCCAGCCCGA  CATTATCGAG  GAATCCTAGC

10501   CTTTCGATAA  TCTCTTTCAA  AATGCGTTCA  GCAATTTGAT  TTTGTGCTTC  CGTCAGCTTT

10561   TCGGGTAACT  GTCTGAAAAA  TTCCAAAGCT  GGCTTGACGG  TCATCTTGGT  CACATCAGAA

10621   ATATTATGAT  GGTCAATCAG  AACGGCCAAG  GCTTCCGGCC  TTAATCTAGC  ACCATGACAG

10681  ACCTCGCAGG  GCGCTGCCGA  TTGATAACGT  CCAATATCTT  CGCGAATGCT  TTCGCTATCA

10741  GTCGTTACCA  GCCGCCTTTC  CAAATTGCGG  ATCACACCTT  CAAAGCCTTT  TTCAACCTCA

10801  TAAATCTGAT  TACCTTCAGA  AAAGCGCAAA  GGAATAACTT  CGCCTTCACT  CCCGTAAAGA

10861  ATGACATTCT  GAATTTTTTC  AGGGAGCTTT  TTCCAAGGCG  TTTCCAACGA  GAAATCATAA

10921  TAACGCGCCA  GACTGGATAA  AATCTGCATA  TAATAAGGGC  TGGGCGGCGT  GCTTCTCGCC

10981  CAAGGCATCA  AAGCCCCCTT  CGCCAAAGAA  AGGGATTCAT  TCGGCACAAT  CAACCGCACA

11041  TCGAAATAAG  GCTTTTCGCC  CAACCCATCA  CAAGCAGGGC  AGGCACCCTG  TGGCGCGTTA

11101  AAAGAGAAAA  GGCGTGGCTC  GATTTCAGGA  ATGGTAAAAC  CTGATACTGG  ACAAGAAAAA

11161  TGCTCGGAAA  AAAGCATCGG  CTCGAAACTG  CCTTCATCGG  CTGGCTCGGA  AATCGCAATC

11221  CCGCCCGCCA  ATTTTAATGC  GGTTTCAAGC  GATTGCGCCA  AACGGGTTTC  CAGCCCTTCT

11281  TTGATAACCA  GACGATCAAC  CACAACCTCA  ATGTCATGCT  TGCGTTTCTT  GTCAATTTTG

11341  GGTGCTTCTT  CGATCAGATA  ATATTCACCA  TCAATCCGAA  GACGTGAAAA  GCCCGCTTTC

11401  TGCCATTCGG  CCATTTCTTT  GCGATATTCG  CCTTTTCGTC  CTCTGACGAC  CGGAGCCAAC

11461  AAATGCAATC  GGCTCCCTTC  CGGCAAAGCC  ATCACCCGAT  CAACCATCTG  GCTGACGGTC

11521  TGCGCGGTAA  TAGGCAATCC  TGTTGCCGGA  GAATAAGGAA  TCCCGACCCG  CGCCCATAAC

11581  AGCCGCATGT  AATCATAAAT  CTCGGTGACT  GTGGCGACCG  TCGAACGCGG  ATTTTTGCTG

11641  GTCGTTTTCT  GTCCGATAGA  AATCGCTGGC  GATAAACCCT  CAATATGATC  GACATCCGGC

11701  TTTTGCATCA  TTTCCAAAAA  TTGGCGNGCA  TAAGCGGACA  GGGATTCGAC  ATAACGCCGC

11761  TGTCCTTCGG  CATAGATAGT  ATCAAAAGCG  AGGCTGGATT  TACCCGACCC  CGACAAGCCG

11821  GTCATGACGA  CAAGTTTATT  GCGCGGAATA  TCAATCGAAA  CATTTTTGAG  ATTATGTTCG

11881  CGTGCGCCGC  GAATAGAAAT  AGTCGAAAGC  ATAACAGGCA  AAAATCCTAT  CTTTCAGAAA

11941  ATGGGTCTGG  TGATGCGGGG  CTATCAATCA  GGGCGAGGAA  AAGAGATGGA  TATTCCCCCT

12001  TTGTTCTACA  AGAGGCTATC  CAAAAACGGC  AAGGCAAGGG  ACTTTGAAAT  CGGCAGAAAT

12061  GTCATTCTGC  TACCGTTCAT  AGCCATTATA  GCGATAAGCG  CCATCCCAGC  GATTGGACGG

12121  ATATAAAAGC  TGCCTATCCA  GATGATTATA  GCTGTGATTA  TAGCGCATAG  GATTATGATT

12181  ATAGGGATTA  TAACGATGGT  TATAGCCCAT  TGACCCATAG  CGCGGCACAT  AGCCAGACCA

12241  GCCATAATGA  CGGATATAGC  CGGAATGATC  ATAACCTCTG  ACATAACCGG  ATGAATAACC

12301  GTTTCGGATA  TATCCCGACC  GCCCATAATG  GCCATAGTGA  TATCCACGGG  GATAAGCCAT

12361  GACCGCAACC  GGAAGCGTCA  AGGCAAGAAG  CCCTATTCCA  GCCCAGAAAA  GATTTTTTCC

12421  CATAAGATGA  CTTCTTCTTT  CATAAACAGG  CGGCAACAGG  CTATTCCAGC  CCAGAAAAGA

12481  TTTTTTCCCA  TAAGATGACT  TCTTCTTTCA  TAAACAGGCG  GCAACAGGCG  GCGGCATAGC

12541  TGCCATGACA  AGACATGGCA  GCTATTTTTC  CGATAAATCA  GGCTGGATCA  GAATTCTGCT

12601  GAATATAGCG  TTCCAATCCC  ATCAGCTCGA  TCAGATTAAG  CTGGGTATTC  AGGAAATCGA

12661  TATGGGCTTC  TTCGGCGATC  AAAATTTTGA  CGAACAGATC  GCGGGATACA  AAATCATGCG

12721  TTGATTCTGC  ATAGGCGATG  GCTACTTTCA  AATCGCTGAC  TGCTTTTCTC  TCAAGCCGCA

12781  AGTCCGTATT  CAAAACCGCA  GCACGTCTTC  ACTAGCGGTA  ATAGCTTCAT  AACGCTGCAA

12841  GTTAGGCAAG  CCGCCAAGAT  AAAAAATCCG  CTCGATCAAA  GCATCGGCAT  GGCCTCTTTC

12901  TTCAAGAGAT  TCTTCGGATT  CTTTTCTGGC  AAGAACCGAA  ACGGCCCAAT  GTTCTAAACT

12961  GCGGGCATGG  AGAAAATATT  GATTGATGAC  CGTCAATTCA  TTGGTAAGTT  GGCGGTTAAG

13021  ATGTTCGATT  ATTTTAGGAT  CTGCGCTCAT  TGATGGGTGC  CTTTCGCTCT  TTAGCTTTTA

13081  TTAGCCTAGC  ATTAAAACTT  TATTATAAAA  AAATTAACTT  TGCCAATATC  ATTATCATAT

13141  AAATTCTATC  GGAACGGGGC  ATTACTGTGT  TTATATCCGG  CTTCTCTCAA  TGATTCCGTC

13201  ACACAGCATC  GATACAGCGA  ACTGGCTGTA  ACTGACGTGA  AATGTGCGTA  ACAACATTTA

13261  GAAGCGATTC  GTTGCTTTCT  CCGGGCGAGA  TTTCGCGGCA  GCCCTTTACC  TGATCTTGTC

13321  CGGCGCGAAG  GCGAGGGCGG  TTTTGCGATT  TCGGCCAAAC  TGCATCCACT  GGAATCCTCA

13381  GGCCGAATTG  ATCCCGTAAC  CATTGGTATC  GGGCTTGCAC  CTCGGGCATC  CTCGCGTCAG

13441  GTGCGCGTTA  ATGGCGTGAC  GACTTCGGCT  AATGCCTTAT  CGGAATGGCT  GGCGATATTA

13501  TGGCTTACCC  CTGCAATGGA  CAGATTGTAT  CAGGAAGGTG  CTTCTTCGCG  CCGCCGTTTT

13561  CTAGATCGGC  TGACATTGAC  GATTTTTCCG  TCTCATGCCC  GACATTACAG  CCGTTATGAA

13621  GCAGCGATGC  GACAACGGAA  CAAGCTGCTT  TCCGATGAAA  AAGGCTATGA  TCCTCTTTGG

13681  TTAGACGGCT  TGGAACAGAT  TATGGCGGAA  CAGGCGACCC  ATATTCTTTT  GGCACGGCGG

13741  CAGCTTGTCG  ATTTACTATC  CGAAGAAATT  GCCAAACAGG  AAGACGGCCT  TTTCGCCAAA

13801  GCGGATC

Claims (9)

1.编码乙醇脱氢酶II的DNA序列，如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组质粒，含有SEQ ID NO：2所示的DNA序列。

3.权利要求1所述的DNA序列的制备方法，包括构建运动发酵单胞菌基因组文库、克隆参与发酵的功能基因。

4.权利要求3所述的制备方法，所述构建基因组文库的方法是CTAB法，即提取运动发酵单胞菌XW101的总DNA，用限制性内切酶Sau3AI部分酶切总DNA，将酶切的合适片段连接到载体pLA2917上，连接产物电击转化到宿主大肠杆菌JM109中，在含有抗生素的LB平板上筛选含有重组质粒的菌株。

5.权利要求3所述的制备方法，所述克隆发酵功能基因的方法是，在已构建好的基因组文库中通过菌落原位杂交方法得到含有发酵基因重组质粒的菌落，将得到的重组质粒测序，分析出能翻译有功能蛋白的框架，进而得到所需基因。

6.权利要求1所述的DNA用于制备运动发酵单胞菌工程菌的用途。

7.一种运动发酵单胞菌工程菌，包含有权利要求1所述的DNA。

8.权利要求7所述的运动发酵单胞菌工程菌生产乙醇的用途。

9.一种生产乙醇的方法，其特征是用权利要求7所述的运动发酵单胞菌工程菌发酵。