CN109971778B - 一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用。所述载体组合包括cas9表达载体和sgRNA表达载体，其中，所述cas9表达载体通过将cas9基因引入质粒载体而得到，其中，所述cas9表达载体不含λ‑RED重组酶基因。本发明比现有的盐单胞菌的基因编辑手段更加快速，进行一次基因编辑的流程仅需8天，大大提高了盐单胞菌的改造效率。此外，本发明在盐单胞菌中使用上述载体的组合，利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法进行多个基因的连续编辑(敲除及插入)能够大大减少所需时间。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体而言，涉及一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用。
背景技术
CN102120973A公开的盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01(保藏号为CGMCC No.4353)是一株筛选自中国新疆省艾丁湖土壤样品中的革兰氏阴性嗜盐菌，由于其能够实现无灭菌开放式连续发酵，为工业发酵的低成本生产带来了突破性技术。盐单胞菌TD01的最适生长条件为高盐高碱环境，这种环境下非嗜盐菌无法生长，因此盐单胞菌TD01的发酵过程可在开放式无灭菌的条件下进行，从而直接减少了发酵生产中灭菌所带来的能耗成本。盐单胞菌TD01所生长的高盐环境的盐浓度与海水中的盐浓度相近，使用海水作为发酵底物，代替淡水，可以降低原料成本，同时减少工业发酵生产过程中的淡水消耗问题。另外，盐单胞菌TD01生长的高盐环境为高渗条件，在低渗条件下细胞更容易破裂，有利于简化胞内产物(例如聚羟基脂肪酸酯PHA)的提取，因此可以降低提纯成本。这些因素使得盐单胞菌TD01有潜力成为工业发酵生产的平台菌株，用于生产各种生物发酵产品。目前盐单胞菌TD01及其改造菌已用于PHA的生产，实现中试和小规模量产(Chen,X.,Yin,J.,Ye,J.,Zhang,H.,Che,X.,Ma,Y.,Li,M.,Wu,L.P.,Chen,G.Q.,2017.Engineering Halomonas bluephagenesisTD01for non-sterile production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).Bioresour.Technol.,244,534-541)。
盐单胞菌TD01作为低成本生产的平台菌株，需要对其进行基因编辑，包括基因敲除、基因插入以及基因替换，以实现其合成各种所需的产物。现有的对盐单胞菌TD01进行基因编辑的技术手段基于以自杀质粒和帮助质粒为载体的同源重组(Fu,X.Z.,Tan,D.,Aibaidula,G.,Wu,Q.,Chen,J.C.,Chen,G.Q.,2014.Development of Halomonas TD01as ahost for open production of chemicals.Metab.Eng.23,78–91)。其中自杀质粒载体包含R6Kγ复制子，该自杀质粒只能在含有Pir蛋白的宿主菌如大肠杆菌S17-1中复制，无法在盐单胞菌TD01中复制。自杀质粒载体上还含有氯霉素抗性基因和用于同源重组的DNA序列(称为同源臂)，同源臂序列可根据需要编辑的基因位点自由设计。另外，自杀质粒载体上还含有I-SceI酶的识别位点。当自杀质粒载体从大肠杆菌S17-1(供体菌)转入盐单胞菌TD01(受体菌)后，在抗生素氯霉素的选择压力下，自杀质粒载体上的同源臂序列与盐单胞菌TD01的基因组上的相同序列之间发生同源重组，从而得到自杀质粒载体整合到盐单胞菌TD01基因组上的嵌合体。之后再转入帮助质粒，该帮助质粒上表达I-SceI酶，切割I-SceI识别位点，形成基因组双链断裂，刺激同源臂序列和基因组序列发生第二次同源重组。同源重组发生后细菌随机回复为原来的出发菌状态(野生型)，或者突变为基因编辑状态(重组型)，经过PCR鉴定筛选即可得到基因编辑的重组型。
上述技术手段虽然能够实现盐单胞菌TD01中的基因编辑，但是存在耗时太长的缺陷。首先，得到基因编辑的重组菌的流程耗时太长，该流程所耗费时间为自杀质粒供体菌和盐单胞菌受体菌培养(1天)——接合转化将自杀质粒导入盐单胞菌，平板培养单克隆(3-4天)——单克隆传代培养，PCR验证嵌合体(2天)——嵌合体和帮助质粒培养(1天)——帮助质粒导入嵌合体，平板培养单克隆(3-4天)——单克隆传代培养，PCR筛选重组菌(2天)——重组菌在抗性平板传代培养，PCR复筛(2天)——重组菌在无抗性平板传代培养，去除帮助质粒(2天)——重组菌在无抗性液体培养基培养，PCR验证帮助质粒丢失及基因编辑(1天)，最终得到基因编辑的重组菌合计需要17-19天。其次，由于第二次同源重组后嵌合体会随机变为野生型或重组型，如果顺利得到重组型的情况下全部流程需要17-19天，但是实际操作中往往因为没有筛选到重组型而需要重复帮助质粒导入嵌合体的步骤，导致整个流程延长近10天，所以一般对一个基因位点进行编辑通常需要近1个月的时间，这意味着对N个基因进行编辑就需要N个月，严重影响基因编辑和细菌改造的效率。最后，盐单胞菌TD01中存在着必需基因，但是很多必需基因并非能够预测，需要经过实验证明。当盐单胞菌TD01中欲敲除的目的基因即便经过多次尝试敲除也无法得到重组型，在第二次同源重组后得到的始终全部为野生型时，会推测该基因为必需基因，无法实现敲除，但是得到这一结论时整个流程已经耗费了一个多月的时间。因此，现有的盐单胞菌TD01中的基因编辑手段已经难以满足越来越多的基因改造需求，亟需一种更加快速的基因编辑手段。
CN102925382A公开的另一株盐单胞菌LS21也可以实现无灭菌开放式发酵，有潜力作为工业生产的平台菌株。目前在盐单胞菌LS21中使用与盐单胞菌TD01相同的基因编辑方法，因此同样需要更加快速的基因编辑手段。
近几年来基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术快速发展，在真核生物和原核生物当中得到了广泛的应用。在大肠杆菌等革兰氏阴性菌中，用一个载体表达cas9基因，同时由于革兰氏阴性菌重组效率低，需要在这个载体上表达λ-RED重组酶；在另一个载体中表达sgRNA和用于同源重组的同源臂序列。两个载体都转入大肠杆菌中时，sgRNA介导Cas9蛋白切割基因组上特定序列，形成双链断裂，刺激同源重组的发生，从而实现基因编辑(Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.,Sun,B.,Yang,J.,Yang,S.,2015.Multigene editing in theEscherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Appl.Environ.Microbiol.81,2506-2514)。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明人进行了广泛深入的研究，最终完成本发明。
本发明构建了适用于盐单胞菌(特别是盐单胞菌TD01、盐单胞菌LS21及它们的衍生菌)的基于CRISPR/Cas9的基因编辑工具，由两个载体组成：第一个载体表达cas9基因，且不需要表达λ-RED重组酶，实际操作中不再需要诱导λ-RED重组酶的表达，简化了步骤流程；第二个载体表达sgRNA，并含有用于同源重组的同源臂序列。该技术手段比现有的盐单胞菌TD01和盐单胞菌LS21的基因编辑手段更加快速，进行一次基因编辑的流程仅需8天，大大提高了盐单胞菌TD01、盐单胞菌LS21及它们的衍生菌的改造效率。
一方面，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合，其包括cas9表达载体和sgRNA表达载体，其中，所述cas9表达载体通过将cas9基因引入质粒载体而得到，其中，所述cas9表达载体不含λ-RED重组酶基因。
本发明中，所述cas9基因用于表达Cas9蛋白，对cas9基因的使用没有特别限制，只要其不影响cas9基因的功能并同样能达到基因编辑效果即可。例如，所述cas9基因可以是来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的cas9基因。
本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合中，具体地，构建所述cas9表达载体所需的元件包括：复制子，抗性基因(筛选标记，例如，具体为氯霉素抗性基因)，启动子和cas9基因。其中复制子和抗性基因存在于质粒载体上。本发明中，所述质粒载体的实例没有特别限制，只要其能够在盐单胞菌中使用即可，例如，pSEVA321、pSEVA331、pSEVA341、pBBR1MCS-1等。
本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合中，所述sgRNA表达载体用于表达sgRNA和用于同源重组的同源臂序列，其构建原理与现有技术相同。具体地，构建所述sgRNA表达载体所需的元件包括：复制子，抗性基因(例如，具体为卡那霉素抗性基因，以及壮观霉素抗性基因)，启动子和sgRNA支架(scaffold)。
本发明中，构建所述cas9表达载体所需的元件(复制子，抗性基因，启动子和cas9基因)以及构建所述sgRNA表达载体所需的元件(复制子，抗性基因，启动子和sgRNA支架(scaffold))没有特别限制，只要其同样能达到基因编辑效果即可。
同时，除了构成载体所必需的复制子和筛选标记外，cas9表达载体的启动子和cas9基因用于表达Cas9蛋白。sgRNA表达载体在将针对目的基因的gRNA序列引入到支架上游后，由启动子转录得到针对目的基因的sgRNA。该sgRNA将引导Cas9蛋白至基因组上的目的基因，切割基因组序列，诱导同源重组的发生，从而实现基因编辑。
本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合中，所述cas9表达载体携带的抗性基因与所述sgRNA表达载体携带的抗性基因彼此不同。例如，所述cas9表达载体携带的抗性基因为氯霉素抗性基因，而所述sgRNA表达载体携带的抗性基因为卡那霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因。
本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合优选为在盐单胞菌中的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合。优选地，所述盐单胞菌为盐单胞菌TD01、盐单胞菌LS21及它们的衍生菌，更优选地，所述盐单胞菌选自盐单胞菌TD01、盐单胞菌TD08、盐单胞菌TD40、盐单胞菌TD-MmP1、盐单胞菌LS21。
本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合中，优选地，所述cas9表达载体通过将cas9基因引入pSEVA321中而得到，更优选地，所述cas9表达载体通过将cas9基因引入pSEVA321的XmaI和SacII位点之间而得到。
本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合中，优选地，所述cas9表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述，和/或所述sgRNA表达载体如SEQ ID NO:12所述。
另一方面，本发明提供了一种对盐单胞菌进行基因编辑的方法，其特征在于，使用上述载体组合对盐单胞菌进行基因编辑。
本发明的上述对盐单胞菌进行基因编辑的方法，优选地，包括以下步骤：
1)将所述cas9表达载体导入盐单胞菌出发菌中，得到重组菌1；
2)将针对目的基因的sgRNA序列和待编辑基因的同源臂序列插入所述sgRNA表达载体中，得到针对目的基因的sgRNA质粒；
3)将步骤2)中得到的针对目的基因的sgRNA质粒导入步骤1)中得到的重组菌1中，Cas9蛋白在sgRNA序列的引导下切割基因组上目的基因的序列，诱导同源重组的发生，得到基因编辑的重组菌。
本发明的对盐单胞菌进行基因编辑的方法中，所述盐单胞菌选自盐单胞菌TD01、盐单胞菌LS21及它们的衍生菌，更优选地，所述盐单胞菌选自盐单胞菌TD01、盐单胞菌TD08、盐单胞菌TD40、盐单胞菌TD-MmP1、盐单胞菌LS21。
本发明的对盐单胞菌进行基因编辑的方法中，所述基因编辑包括基因敲除、基因插入、基因替换等。
本发明中，所述对盐单胞菌进行基因编辑的方法可以是连续编辑多个基因的基因编辑方法，当连续编辑多个基因时只需在第一步转入cas9表达载体，之后依次转入针对目的基因的sgRNA序列和待编辑基因的同源臂序列的sgRNA表达载体，从而节省了重复转入cas9表达载体的流程和时间。
再一方面，本发明提供了上述载体组合用于在盐单胞菌中进行基于CRISPR/Cas9的基因编辑的用途。
本发明的上述用途中，所述基因编辑包括基因敲除、基因插入、基因替换等。
本发明的上述用途中，优选地，所述盐单胞菌选自盐单胞菌TD01、盐单胞菌LS21及它们的衍生菌，更优选地，所述盐单胞菌选自盐单胞菌TD01、盐单胞菌TD08、盐单胞菌TD40、盐单胞菌TD-MmP1、盐单胞菌LS21。
本发明中，所述“衍生菌”是指已经在盐单胞菌中进行基因改造的菌种(包括但不限于，已经用现有的手段进行了基因编辑的盐单胞菌，或者已经用本发明工具进行过基因编辑的盐单胞菌打算进一步做基因编辑)。所述衍生菌的实例包括，但不限于，盐单胞菌TD08(Fu,X.Z.,Tan,D.,Aibaidula,G.,Wu,Q.,Chen,J.C.,Chen,G.Q.,2014.Developmentof Halomonas TD01as a host for open production of chemicals.Metab.Eng.23,78–91，可由清华大学提供)，盐单胞菌TD40(Chen,X.,Yin,J.,Ye,J.,Zhang,H.,Che,X.,Ma,Y.,Li,M.,Wu,L-P.,Chen,G-Q.,Engineering Halomonas bluephagenesis TD01for Non-sterile Production of Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate),Bioresource Technology(2017)，可由清华大学提供)，盐单胞菌TD-MmP1(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-like expressionsystems used for Halomonas.Metab.Eng.,39,128-140，可由清华大学提供)等。
本发明在盐单胞菌(特别是，盐单胞菌TD01、盐单胞菌LS21及它们的衍生菌)中使用上述载体的组合，利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法进行多个基因的连续编辑(敲除及插入)能够大大减少所需时间。本发明比现有的盐单胞菌TD01和盐单胞菌LS21的基因编辑手段更加快速，进行一次基因编辑的流程仅需8天，大大提高了盐单胞菌TD01、盐单胞菌LS21及它们的衍生菌的改造效率。
具体地，本发明相对于现有技术具有下优点：
1.现有技术在盐单胞菌中对某一个基因实现编辑平均需要20天至1个月，而本发明技术对一个基因实现编辑平均只需要7-8天；
2.现有技术在盐单胞菌中连续对N个基因实现编辑平均需要N个月，而本发明技术连续技基因编辑只需要3+5N天；
3.在其他革兰氏阴性菌中基于CRISPR/Cas9的基因编辑工具都需要表达λ-RED重组酶，而在盐单胞菌中则不需要。
附图说明
图1为本发明的cas9表达载体和sgRNA表达载体结构示意图。
图2为盐单胞菌TD01中利用本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑工具进行基因编辑的流程示意图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)大肠杆菌培养基
LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
2)嗜盐菌培养基
60LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),60g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如10μg/mL卡那霉素或100μg/mL壮观霉素或25μg/mL的氯霉素。
实施例1：构建基于CRSIPR/Cas9的盐单胞菌TD01基因编辑的载体
用引物以pCas质粒(Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.,Sun,B.,Yang,J.,Yang,S.,2015.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Appl.Environ.Microbiol.81,2506-2514)为模板扩增得到含有启动子、cas9基因和终止子的DNA片段，连入pSEVA321(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.The StandardEuropean Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for the analysis anddeployment of complex prokaryotic phenotypes.NucleicAcidsRes.41,666–675.)的XmaI和SacII位点之间，得到cas9表达载体pQ08。使用的引物如下表：
所得到的载体序列为：
aggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacagctgggcgcgccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgggggatcaggaccgctgccggagcgcaacccactcactacagcagagccatgtagggccgccggcgttgtggatacctcgcggaaaacttggccctcactgacagatgaggggcggacgttgacacttgaggggccgactcacccggcgcggcgttgacagatgaggggcaggctcgatttcggccggcgacgtggagctggccagcctcgcaaatcggcgaaaacgcctgattttacgcgagtttcccacagatgatgtggacaagcctggggataagtgccctgcggtattgacacttgaggggcgcgactactgacagatgaggggcgcgatccttgacacttgaggggcagagtgctgacagatgaggggcgcacctattgacatttgaggggctgtccacaggcagaaaatccagcatttgcaagggtttccgcccgtttttcggccaccgctaacctgtcttttaacctgcttttaaaccaatatttataaaccttgtttttaaccagggctgcgccctgtgcgcgtgaccgcgcacgccgaaggggggtgcccccccttctcgaaccctcccggcccgctaacgcgggcctcccatccccccaggggctgcgcccctcggccgcgaacggcctcaccccaaaaatggcagccacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatcgacggatcgatccggggaattaattccggggcaatcccgcaaggagggtgaatgaatcggacgtttgaccggaaggcatacaggcaagaactgatcgacgcggggttttccgccgaggatgccgaaaccatcgcaagccgcaccgtcatgcgtgcgccccgcgaaaccttccagtccgtcggctcgatagtccagcaagctacggccaagatcgagcgcgacagcgtgcaactggctccccctgccctgcccgcgccatcggccgccgtggagcgttcgcgtcgtctcgaacaggaggcggcaggtttggcgaagtcgatgaccatcgacacgcgaggaactatgacgaccaagaagcgaaaaaccgccggcgaggacctggcaaaacaggtcagcgaagccaagcaggccgcgttgctgaaacacacgaagcagcagatcaaggaaatgcagctttccttgttcgatattgcgccgtggccggacacgatgcgagcgatgccaaacgacacggcccgctctgccctgttcaccacgcgcaacaagaaaatcccgcgcgaggcgctgcaaaacaaggtcattttccacgtcaacaaggacgtgaagatcacctacaccggcgtcgagctgcgggccgacgatgacgaactggtgtggcagcaggtgttggagtacgcgaagcgcacccctatcggcgagccgatcaccttcacgttctacgagctttgccaggacctgggctggtcgatcaatggccggtattacacgaaggccgaggaatgcctgtcgcgcctacaggcgacggcgatgggcttcacgtccgaccgcgttgggcacctggaatcggtgtcgctgctgcaccgcttccgcgtcctggaccgtggcaagaaaacgtcccgttgccaggtcctgatcgacgaggaaatcgtcgtgctgtttgctggcgaccactacacgaaattcatatgggagaagtaccgcaagctgtcgccgacggcccgacggatgttcgactatttcagctcgcaccgggagccgtacccgctcaagctggaaaccttccgcctcatgtgcggatcggattccacccgcgtgaagaagtggcgcgagcaggtcggcgaagcctgcgaagagttgcgaggcagcggcctggtggaacacgcctgggtcaatgatgacctggtgcattgcaaacgctagggccttgtggggtcagttccggctgggggttcagcagccacctgcatcgcggccggcctacggccagcctcgcagagcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaaggacaaaagtcaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacgaaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaatttaaatcgtaattattggggacccctggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagactagtcgccagggttttcccagtcacgacgcggccgcaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggaacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccctgcagggtttgcagtcagagtagaatagaagtatcaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatgctgttttgaatggttccaacaagattattttataacttttataacaaataatcaaggagaaattcaaagaaatttatcagccataaaacaatacttaatactatagaatgataacaaaataaactactttttaaaagaattttgtgttataatctatttattattaagtattgggtaatattttttgaagagatattttgaaaaagaaaaattaaagcatattaaactaatttcggaggtcattaaaactattattgaaatcatcaaactcattatggatttaatttaaactttttattttaggaggcaaaaatggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaAtataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttgg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ID NO:3)
用引物以pSEVA341(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.The StandardEuropean Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for the analysis anddeployment of complex prokaryotic phenotypes.NucleicAcidsRes.41,666–675.)为模板扩增得到含有复制子的片段；用引物以合成片段01(由苏州泓迅生物科技有限公司合成)为模板扩增得到含有启动子和sgRNA骨架的片段；用引物以pBBR1MCS-2(Kovach,M.E.,Elzer,P.H.,Hill,D.S.,Robertson,G.T.,Farris,M.A.,Roop,R.M.,Peterson,K.M.,1995.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166,175-176.)为模板扩增得到含有卡那霉素抗性基因的片段；用引物以pBBR1MCS1-I-SceI(Fu,X.Z.,Tan,D.,Aibaidula,G.,Wu,Q.,Chen,J.C.,Chen,G.Q.,2014.Development of Halomonas TD01as ahost for open production of chemicals.Metab.Eng.23,78–91)为模板扩增得到含有壮观霉素抗性基因的片段。上述四个片段通过Gibson Assembly的方法连接，得到表达sgRNA的载体骨架pHALORNA。使用的引物如下表：
合成片段01的序列为：
AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCTCTTCAGAGTGAACTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACTCTAGAGAATTCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCTGTCTTCGCTGGAAGACTGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGGATCCAGCATATGCGGTGAGACCAAAAGGTCTCAAGTCTCGTGAAGAGCGGATGAATGTCAGCTACTGG(SEQ ID NO:11)
所得到的载体pHALORNA的序列为：
agcggataacaatttcacacaggagctcttcagagtgaactcgagtagggataacagggtaatagatctaagcttctgcaggtcgactctagagaattcaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacctgtcttcgctggaagactgactagtattatacctaggactgagctagctgtcaaggatccagcatatgcggtgagaccaaaaggtctcaagtctcgtgaagagcggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggcgcagtggcggttttcatggcttgttatgactgtttttttggggtacagtctatgcctcgggcatccaagcagcaagcgcgttacgccgtgggtcgatgtttgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaaacatcatgagggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataaactagtaaataataaaaaagccggattaataatctggctttttatattctctgcataaccctgcttcggggtcattatagcgattttttcggtatatccatcctttttcgcacgatatacaggattttgccaaagggttcgtgtagactttccttggtgtatccaacggcgtcagccgggcaggataggtgaagtaggcccacccgcgagcgggtgttccttcttcactgtcccttattcgcacctggcggtgctcaacgggaatcctgctctgcgaggctggccgtaggccggccgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggcatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccgtgaaaggcaggccggtccgtggtggccacggcctctaggccagatccagcggcatctgggttagtcgagcgcgggccgcttcccatgtctcaccagggcgagcctgtttcgcgatctcagcatctgaaatcttcccggccttgcgcttcgctggggccttacccaccgccttggcgggcttcttcggtccaaaactgaacaacagatgtgtgaccttgcgcccggtctttcgctgcgcccactccacctgtagcgggctgtgctcgttgatctgcgtcacggctggatcaagcactcgcaacttgaagtccttgatcgagggataccggccttccagttgaaaccactttcgcagctggtcaatttctatttcgcgctggccgatgctgtcccattgcatgagcagctcgtaaagcctgatcgcgtgggtgctgtccatcttggccacgtcagccaaggcgtatttggtgaactgtttggtgagttccgtcaggtacggcagcatgtctttggtgaacctgagttctacacggccctcaccctcccggtagatgattgtttgcacccagccggtaatcatcacactcggtcttttccccttgccattgggctcttgggttaaccggacttcccgccgtttcaggcgcagggccgcttctttgagctggttgtaggaagattcgatagggacacccgccatcgtcgctatgtcctccgccgtcactgaatacatcacttcatcggtgacaggctcgctcctcttcacctggctaatacaggccagaacgatccgctgttcctgaacactgaggcgatacgcggcctcgaccagggcattgcttttgtaaaccattgggggtgaggccacgttcgacattccttgtgtataaggggacactgtatctgcgtcccacaatacaacaaatccgtccctttacaacaacaaatccgtcccttcttaacaacaaatccgtcccttaatggcaacaaatccgtccctttttaaactctacaggccacggattacgtggcctgtagacgtcctaaaaggtttaaaagggaaaaggaagaaaagggtggaaacgcaaaaaacgcaccactacgtggccccgttggggccgcatttgtgcccctgaaggggcgggggaggcgtctgggcaatccccgttttaccagtcccctatcgccgcctgagagggcgcaggaagcgagtaatcagggtatcgaggcggattcacccttggcgtccaaccagcggcaccagcggcgcctgagaggggcgcgcccagctgtctagggcggcggatttgtcctactcaggagagcgttcaccgacaaacaacagataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctttaattaa
(SEQ ID NO:12)
载体pQ08和pHALORNA的结构示意图见附图1。
载体pHALORNA中留有BsaI和BbsI位点，用于连入待编辑基因的sgRNA和同源臂片段。下文将详细描述具体编辑的几个基因的实施例。
实施例2：基于CRISPR/Cas9敲除盐单胞菌TD01的phaC基因
在盐单胞菌TD01的phaC基因序列中选取gataacattgccgtcacccc(SEQ ID NO:13)为gRNA，对应的PAM序列为AGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGATAACATTGCCGTCACCCC(SEQ IDNO:14)和TACAGAAGACAGAAACGGGGTGACGGCAATG(SEQ ID NO:15)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4353)的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGGAAGCATGGAAAGTGCAGCT(SEQ ID NO:16)和TTCTCACGCAGTGCAGCGCATGACTTCGGG(SEQ ID NO:17)扩增得到522bp的同源臂上游序列，用引物TGCGCTGCACTGCGTGAGAATGATCTTTTCTGG(SEQ ID NO:18)和TTAGGGTCTCAGACTCTGCATAGCCGTTCTCCGTTA(SEQ ID NO:19)扩增得到520bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGGAAGCATGGAAAGTGCAGCT(SEQ ID NO:16)和TTAGGGTCTCAGACTCTGCATAGCCGTTCTCCGTTA(SEQ ID NO:19)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OE PCR，扩增得到同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向phaC基因的载体pHALORNA-phaC。
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)，再通过接合转化方法(Fu XZ,Tan D,Aibaidula G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a host for openproduction of chemicals.Metab Eng 23:78–91)将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。
将质粒pHALORNA-phaC转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物ATGCTGTCAGGGTGGAAAATG(SEQ ID NO:20)和TTACGACGCGGGAAGCTCAC(SEQ ID NO:21)进行菌落PCR验证，敲除菌得到的条带大小为1.2kb，野生型得到的条带大小为1.8kb，在挑取验证的8个克隆中有6个是敲除菌，即基因编辑效率为75％。将敲除菌在60LB培养基中传代丢失质粒，即得到phaC敲除菌Halomonas TD01ΔphaC。
得到载体后在盐单胞菌TD01中敲除phaC基因的流程和时间为：培养带有pQ08的大肠杆菌S17-1和盐单胞菌TD01(1天)——pQ08转入盐单胞菌TD01(1天)——培养重组菌TD01/pQ08和带有pHALORNA-phaC的大肠杆菌S17-1(1天)——pHALORNA-phaC转入重组菌TD01/pQ08(1天)——PCR验证筛选敲除菌(1天)——敲除菌在60LB培养基传代丢失质粒(2天)——得到敲除菌Halomonas TD01ΔphaC(1天)，合计8天，流程图见图2。
若按照基于自杀质粒的基因敲除方法，预计需要20-30天，而本发明的基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法将流程缩短到了三分之一，大大提高了基因编辑的效率。其他革兰氏阴性菌中基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法需要在载体上表达λ-RED重组酶，流程中需要以添加诱导剂的方式诱导λ-RED重组酶的表达；而在盐单胞菌TD01中，则不需要表达λ-RED重组酶，因此在流程上简化了添加诱导剂的步骤。
比较例：载体含λ-RED重组酶与否对基因编辑效率的影响
用引物以pCas质粒(Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.,Sun,B.,Yang,J.,Yang,S.,2015.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Appl.Environ.Microbiol.81,2506-2514)为模板扩增得到cas基因片段；同样以pCas质粒为模板，用另一对引物扩增得到λ-RED基因片段；用引物以p321-MmP1-gfp质粒(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-likeexpression systems used for Halomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)为模板扩增得到诱导型启动子片段；用引物以pSEVA321质粒(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.TheStandard European Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for theanalysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes.NucleicAcidsRes.41,666–675.)为模板，扩增得到质粒骨架片段。上述四个片段利用BsaI内切酶，通过GoldenGate连接方法，连接得到载体pCas-RED。使用的引物如下表：
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)，再通过接合转化方法(Fu XZ,Tan D,Aibaidula G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a host for openproduction of chemicals.Metab Eng 23:78–91)将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。
将质粒pCas-RED转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD-MmP1(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-like expression systems used for Halomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)，得到重组菌Halomonas TD-MmP1/pCas-RED，该重组菌可在IPTG诱导的情况下表达λ-RED重组酶。
将实施例2中所述的质粒pHALORNA-phaC转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物ATGCTGTCAGGGTGGAAAATG(SEQ ID NO:20)和TTACGACGCGGGAAGCTCAC(SEQID NO:21)进行菌落PCR验证，敲除菌得到的条带大小为1.2kb，野生型得到的条带大小为1.8kb。
将质粒pHALORNA-phaC转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入IPTG诱导培养的Halomonas TD-MmP1/pCas-RED，同样在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物ATGCTGTCAGGGTGGAAAATG(SEQ ID NO:20)和TTACGACGCGGGAAGCTCAC(SEQ ID NO:21)进行菌落PCR验证，敲除菌得到的条带大小为1.2kb，野生型得到的条带大小为1.8kb。
同样的实验重复3次，检测基因敲除的效率，结果如下表：
载体中使用λ-RED后敲除效率反而降低，无法实现基因编辑。因此在盐单胞菌TD01中基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法无需使用λ-RED即可实现基因编辑。
实施例3：基于CRISPR/Cas9在盐单胞菌TD01的基因组上插入外源基因
在盐单胞菌TD01的基因组序列中选取ttcacctagctagatgagac(SEQ ID NO:30)为插入位点的gRNA，对应的PAM序列为AGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTTTCACCTAGCTAGATGAGAC(SEQ ID NO:31)和TACAGAAGACAGAAACGTCTCATCTAGCTAG(SEQ ID NO:32)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物扩增得到同源臂上游序列，用另一对引物扩增得到同源臂下游序列；以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物扩增得到含有porin启动子的片段；以pVGAB(Ouyang,S.,Han,J.,Qiu,Y.,Qin,L.,Chen,S.,Wu,Q.,Leski,M.L.,Chen,G.Q.,2005.Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)production inrecombinant Aeromonas hydrophila 4AK4harboring phbA,phbB and vgbgenes.Macromol.Symp.,224,21-34.)为模板，用引物扩增得到待插入的vgb基因；以PMmP1-p321(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.NovelT7-like expression systems used for Halomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)为模板扩增得到待插入的gfp基因，上述5个片段利用BsaI位点通过Golden Gate连接的方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，最终得到把porin启动子-vgb-gfp片段插入基因组的载体pHALORNA-vgb-gfp。使用的引物如下表：
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。将质粒pHALORNA-vgb-gfp转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物CCTGCATTCCTGGTTTGCCAG(SEQ ID NO:141)和ATTAACCGCCAGCTTTTGCC(SEQ ID NO:142)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为1.3kb，重组菌得到的条带大小为2.8kb，在挑取验证的8个克隆中有6个是重组菌，即基因编辑效率为75％。流程和时间与基因敲除时相同，历时8天。
在盐单胞菌TD01及其衍生菌中利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法不仅可以敲除基因组上的某个基因，也可以在基因组某个位点插入外源基因。
实施例4：基于CRISPR/Cas9敲除盐单胞菌TD01的3个phaP基因
在盐单胞菌TD01的phaP1基因序列中选取gcaagagagtcagaaaatgg(SEQ ID NO:43)为gRNA，对应的PAM序列为CGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGCAAGAGAGTCAGAAAATGG(SEQ IDNO:44)和TACAGAAGACAGAAACCCATTTTCTGACTCT(SEQ ID NO:45)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGAGAAAATTGAATACGCTATCGGACGTT(SEQID NO:46)和CTAGGGTCTCGCCTTCACATAATCTCCTTAAGTGAGCTAGCG(SEQ ID NO:47)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物CTAGGGTCTCGAAGGACGCTATTAATTGATAGATAAAATGCCGCACCGTCA(SEQ IDNO:48)和TTAGGGTCTCAGACTGAACAGCAAATCGCTGTTATACAGGC(SEQ ID NO:49)扩增得到500bp的同源臂下游序列，2个片段利用BsaI位点通过Golden Gate连接的方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，得到靶向phaP1基因的载体pHALORNA-phaP1。
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。将质粒pHALORNA-phaP1转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物CTTGGCCGATAAGTGCGGAC(SEQ ID NO:50)和TGCAGCTTGGAAACATTTACTCAAC(SEQ ID NO:51)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为1.6kb，敲除型得到的条带大小为1.1kb，挑取验证的8个克隆全部为敲除菌，即基因编辑效率为100％。将敲除菌在60LB培养基中传代丢失质粒，即得到phaP1敲除菌Halomonas TD01ΔphaP1。
在盐单胞菌TD01的phaP2基因序列中选取gctcatcagctgacgcattt(SEQ ID NO:52)为gRNA，对应的PAM序列为GGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGCTCATCAGCTGACGCATTT(SEQ IDNO:53)和TACAGAAGACAGAAACAAATGCGTCAGCTGA(SEQ ID NO:54)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGATCCGCGCGACAGCATGAATAAA(SEQ IDNO:55)和CTAGGGTCTCGCCTTGGTAAACACTCCTGTTCCATTGCC(SEQ ID NO:56)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物CTAGGGTCTCGAAGGTCTGTTGCAGTTATTGACTTGCTGTCAT(SEQ ID NO:57)和TTAGGGTCTCAGACTATTGAACGCCTGGATCTGGTCG(SEQ ID NO:58)扩增得到500bp的同源臂下游序列，2个片段利用BsaI位点通过Golden Gate连接的方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，得到靶向phaP2基因的载体pHALORNA-phaP2。
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。将质粒pHALORNA-phaP2转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物CTGCCTGGGCCGCATTTTC(SEQ ID NO:143)和AGCCTCTGATGCAGACAAGC(SEQ ID NO:144)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为1.5kb，敲除型得到的条带大小为1.1kb，挑取验证的8个克隆中6个为敲除菌，即基因编辑效率为75％。将敲除菌在60LB培养基中传代丢失质粒，即得到phaP2敲除菌Halomonas TD01ΔphaP2。
在盐单胞菌TD01的phaP3基因序列中选取cattaatttctgtcgcgctg(SEQ ID NO:59)为gRNA，对应的PAM序列为CGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTCATTAATTTCTGTCGCGCTG(SEQ IDNO:60)和TACAGAAGACAGAAACCAGCGCGACAGAAAT(SEQ ID NO:61)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGGGCGTTTCAGCAAAACCTGCTG(SEQ ID NO:62)和CTAGGGTCTCGCCTTAGTGTCTGCTCCTGTCTCTCG(SEQ ID NO:63)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物CTAGGGTCTCGAAGGACGCAACTATGTTCGCGGCG(SEQ ID NO:64)和TTAGGGTCTCAGACTCTGCGAAAACAACAGATACTGCTGC(SEQ ID NO:65)扩增得到500bp的同源臂下游序列，2个片段利用BsaI位点通过Golden Gate连接的方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，得到靶向phaP3基因的载体pHALORNA-phaP3。
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。将质粒pHALORNA-phaP2转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GATGTTAGCGTTGATACGCC(SEQ ID NO:66)和TAAAACGCCAAGTTGCGCTT(SEQ ID NO:67)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为1.7kb，敲除型得到的条带大小为1.3kb，挑取验证的8个克隆中6个为敲除菌，即基因编辑效率为75％。将敲除菌在60LB培养基中传代丢失质粒，即得到phaP3敲除菌Halomonas TD01ΔphaP3。
除了在盐单胞菌TD01中分别敲除3个phaP基因以外，还可以在连续敲除3个phaP基因：在挑选克隆验证phaP1敲除菌后，在含有氯霉素抗生素的60LB培养基中培养传代，丢失pHALORNA-phaP1载体，保留pQ08载体，得到重组菌Halomonas TD01ΔphaP1/pQ08。向该重组菌转入载体pHALORNA-phaP2，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，挑选克隆进行PCR验证，引物同上文所述，即可得到同时敲除phaP1和phaP2的重组菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2。重复该流程，在含有氯霉素抗生素的60LB培养基中培养传代，丢失pHALORNA-phaP2载体，保留pQ08载体，得到重组菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2/pQ08。向该重组菌转入载体pHALORNA-phaP3，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，挑选克隆进行PCR验证，引物同上文所述，即可得到同时敲除phaP1，phaP2和phaP3的重组菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2ΔphaP3。
连续敲除多个基因时只需在第一步转入载体pQ08，之后依次转入靶向敲除的目的基因的sgRNA表达载体，节省了重复转入pQ08的流程和时间。以敲除N个基因为例，流程为：培养带有pQ08的大肠杆菌S17-1和盐单胞菌TD01(1天)——pQ08转入盐单胞菌TD01(1天)——{培养带有pQ08的盐单胞菌重组菌和带有sgRNA表达载体的大肠杆菌S17-1(1天)——sgRNA表达载体转入带有pQ08的盐单胞菌重组菌(1天)——PCR验证筛选敲除菌(1天)——敲除菌在含有氯霉素的60LB培养基传代丢失sgRNA表达载体(2天)}重复N次——得到N个基因的敲除菌(1天)，合计3+5N天。例如，连续敲除3个基因仅需18天，而按照基于自杀质粒的基因敲除方法则需要60-90天。在盐单胞菌TD01及其衍生菌中利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法进行多个基因的连续编辑(敲除及插入)能够大大减少所需时间。
实施例5：基于CRISPR/Cas9连续敲除盐单胞菌TD01的4个基因zwf,pgi1,pgi2和gcd
在盐单胞菌TD01的zwf基因序列中选取AGCCAGTCACATTCCCCGCT(SEQ ID NO:68)为gRNA，对应的PAM序列为GGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTAGCCAGTCACATTCCCCGCT(SEQ ID NO:69)和TACAGAAGACAGAAACAGCGGGGAATGTGAC(SEQ ID NO:70)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGGGCCTTTATTATCACCCATC(SEQ ID NO:71)和AACGGCACCCCCGCCCAGCGCTCAGCTCCTATTTATAATT(SEQ ID NO:72)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物AATTATAAATAGGAGCTGAGCGCTGGGCGGGGGTGCCGTT(SEQ ID NO:73)和TTAGGGTCTCAGACTTATCAATAATCCTCGTACCA(SEQ ID NO:74)扩增得到500bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGGGCCTTTATTATCACCCATC(SEQ ID NO:71)和TTAGGGTCTCAGACTTATCAATAATCCTCGTACCA(SEQ ID NO:74)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OE PCR，扩增得到1kb同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向phaC基因的载体pHALORNA-zwf。
在盐单胞菌TD01的pgi1基因序列中选取AAACACTTTGTGTTCATACA(SEQ ID NO:75)为gRNA，对应的PAM序列为GGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTAAACACTTTGTGTTCATACA(SEQ IDNO:76)和TACAGAAGACAGAAACTGTATGAACACAAAG(SEQ ID NO:77)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGCATGCCCGGCAAGGGCCTCA(SEQ ID NO:78)和CCTTGCCCAGATGGAACACTGTTCAGGCGGTCATTTGGGA(SEQ ID NO:79)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物TCCCAAATGACCGCCTGAACAGTGTTCCATCTGGGCAAGG(SEQ ID NO:80)和TTAGGGTCTCAGACTCAGGATTATTAATGAGGCTG(SEQ ID NO:81)扩增得到500bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGCATGCCCGGCAAGGGCCTCA(SEQ ID NO:78)和TTAGGGTCTCAGACTCAGGATTATTAATGAGGCTG(SEQ ID NO:80)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OEPCR，扩增得到1kb同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向pgi1基因的载体pHALORNA-pgi1。
在盐单胞菌TD01的pgi2基因序列中选取GCTATCGCCACTGGGAAAGT(SEQ ID NO:82)为gRNA，对应的PAM序列为GGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGCTATCGCCACTGGGAAAGT(SEQ IDNO:83)和TACAGAAGACAGAAACACTTTCCCAGTGGCG(SEQ ID NO:84)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGGGTTCCATCGAAGTGACTGC(SEQ ID NO:85)和AAACAACAGGACCGCCTTCTGCGGAGGGTTGGGTAAACGT(SEQ ID NO:86)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物ACGTTTACCCAACCCTCCGCAGAAGGCGGTCCTGTTGTTT(SEQ ID NO:87)和TTAGGGTCTCAGACTTTATCCCAGCGTGCATAGTG(SEQ ID NO:88)扩增得到500bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGGGTTCCATCGAAGTGACTGC(SEQ ID NO:85)和TTAGGGTCTCAGACTTTATCCCAGCGTGCATAGTG(SEQ ID NO:88)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OEPCR，扩增得到1kb同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向pgi2基因的载体pHALORNA-pgi2。
在盐单胞菌TD01的gcd基因序列中选取CACCAAGTCTTCAGTGACAG(SEQ ID NO:89)为gRNA，对应的PAM序列为TGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTCACCAAGTCTTCAGTGACAG(SEQ ID NO:90)和TACAGAAGACAGAAACCTGTCACTGAAGACT(SEQ ID NO:91)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGTGAGCGCTTTGATGGCAACCGG(SEQ ID NO:92)和CTAGGGTCTCGCCTTAGTATGTGGTCGTTACCGCCG(SEQ ID NO:93)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物CTAGGGTCTCGAAGGCCAGCGATTACATAGTAAGCGCTACC(SEQ ID NO:94)和TTAGGGTCTCAGACTCCGTCAAAGAAGGCCTTGAAAGC(SEQ ID NO:95)扩增得到500bp的同源臂下游序列。两个片段利用BsaI通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向gcd基因的载体pHALORNA-gcd。
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。将质粒pHALORNA-zwf转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GGTCAGTAAGGTTATCGGGG(SEQ ID NO:96)和GTGTAGAACCCCCCGATACG(SEQ ID NO:97)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为2.2kb，敲除型得到的条带大小为1.2kb，挑取验证的8个克隆中全部为敲除菌，即基因编辑效率为100％。将敲除菌在含有氯霉素的60LB培养基中传代，即得到带有pQ08的zwf敲除菌Halomonas TD01Δzwf/pQ08。
将质粒pHALORNA-pgi1转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01Δzwf/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GAAAAACGATAGCTGGAGGATG(SEQ ID NO:98)和GAACGGCGGATCATATCAGG(SEQ IDNO:99)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为2.4kb，敲除型得到的条带大小为1.2kb，挑取验证的8个克隆中7个为敲除菌，即基因编辑效率为87.5％。将敲除菌在含有氯霉素的60LB培养基中传代，即得到带有pQ08的zwf、pgi1敲除菌Halomonas TD01ΔzwfΔpgi1/pQ08。
将质粒pHALORNA-pgi2转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01ΔzwfΔpgi1/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GTTCAATGAGCCTACAGCAGC(SEQ ID NO:100)和GAGCGCGAAGCAGGCAAGGC(SEQID NO:101)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为2.9kb，敲除型得到的条带大小为1.1kb，挑取验证的8个克隆中7个为敲除菌，即基因编辑效率为87.5％。将敲除菌在含有氯霉素的60LB培养基中传代，即得到带有pQ08的zwf、pgi1、pgi2敲除菌Halomonas TD01ΔzwfΔpgi1Δpgi2/pQ08。
将质粒pHALORNA-gcd转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01ΔzwfΔpgi1Δpgi2/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GAGCTGGTGCCGTATGATGA(SEQ ID NO:102)和AAGGGTTTATTGTCGCCGATC(SEQ ID NO:103)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为3.5kb，敲除型得到的条带大小为1.2kb，挑取验证的12个克隆中2个为敲除菌，即基因编辑效率为16.7％。将敲除菌在60LB培养基中传代，即得到zwf、pgi1、pgi2和gcd四基因敲除菌Halomonas TD01ΔzwfΔpgi1Δpgi2Δgcd。
连续敲除基因的流程中只有敲除第一个基因时需要先转入pQ08载体，后面无需重复转入，只需要依次转入靶向目的敲除基因的sgRNA表达载体，节约了时间。
实施例6：基于CRISPR/Cas9连续敲除盐单胞菌TD01的4个基因phaB,phaA2,phaA3和phaA5
在盐单胞菌TD01的phaB基因序列中选取gggtaactggtggaactgg(SEQ ID NO:104)为gRNAgRNA，对应的PAM序列为TGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGGGTAACTGGTGGAACTGG(SEQID NO:105)和TACAGAAGACAGAAACCCAGTTCCACCAGTT(SEQ ID NO:106)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGGTTATGAGCCCGACGAGC(SEQ IDNO:107)和AACGCTTCACGCTTGATTGGCCATTGACTACC(SEQ ID NO:108)扩增得到330bp的同源臂上游序列；用引物CCAATCAAGCGTGAAGCGTTACGGTACACC(SEQ ID NO:109)和TTAGGGTCTCAGACTCTCCCAGCCGAAAAACTTACAG(SEQ ID NO:110)扩增得到500bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGGTTATGAGCCCGACGAGC(SEQ ID NO:107)和TTAGGGTCTCAGACTCTCCCAGCCGAAAAACTTACAG(SEQ ID NO:110)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OE PCR，扩增得到0.8kb同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向phaB基因的载体pHALORNA-phaB。
在盐单胞菌TD01的phaA2基因序列中选取ggcgggcgaaccgatcagcg(SEQ ID NO:111)为gRNA，对应的PAM序列为CGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGGCGGGCGAACCGATCAGCG(SEQID NO:112)和TACAGAAGACAGAAACCGCTGATCGGTTCGC(SEQ ID NO:113)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGATCAGAGAGGGTATCGTGCC(SEQ IDNO:114)和GATGCCCTGTGACTTCTTCAACCCCGCCAG(SEQ ID NO:115)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物TGAAGAAGTCACAGGGCATCGCTGCGGGTA(SEQ ID NO:116)和TTAGGGTCTCAGACTCACCAGAGGAGGCCATGCAA(SEQ ID NO:117)扩增得到500bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGATCAGAGAGGGTATCGTGCC(SEQ ID NO:114)和TTAGGGTCTCAGACTCACCAGAGGAGGCCATGCAA(SEQ ID NO:117)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OE PCR，扩增得到1kb同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向phaA2基因的载体pHALORNA-phaA2。
在盐单胞菌TD01的phaA3基因序列中选取gttaccgctgaaaagctggg(SEQ ID NO:118)为gRNA，对应的PAM序列为TGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGTTACCGCTGAAAAGCTGGG(SEQID NO:119)和TACAGAAGACAGAAACCCCAGCTTTTCAGCG(SEQ ID NO:120)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGTATCGGGCCGTGTTGGCTAT(SEQ IDNO:121)和TGAAGTGTAAGCTACCCTGTGTATCGGCGG(SEQ ID NO:122)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物ACAGGGTAGCTTACACTTCATCAATTTGCTCTGGG(SEQ ID NO:123)和TTAGGGTCTCAGACTCATCGCATTATTATTTGTAGCTACGC(SEQ ID NO:124)扩增得到500bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGTATCGGGCCGTGTTGGCTAT(SEQ ID NO:121)和TTAGGGTCTCAGACTCATCGCATTATTATTTGTAGCTACGC(SEQ ID NO:124)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OEPCR，扩增得到1kb同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向phaA3基因的载体pHALORNA-phaA3。
在盐单胞菌TD01的phaA5基因序列中选取ggggcagccaccgccggtg(SEQ ID NO:125)为gRNA，对应的PAM序列为TGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTGGGGCAGCCACCGCCGGTG(SEQ IDNO:126)和TACAGAAGACAGAAACCACCGGCGGTGGCTG(SEQ ID NO:127)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGCTGAGATCAAGGCCCAGCTG(SEQ ID NO:128)和CAGCGTTTCAAGCGCCAGCAATGCCCGCAC(SEQ ID NO:129)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物TGCTGGCGCTTGAAACGCTGCCTCCAACAG(SEQ ID NO:130)和TTAGGGTCTCAGACTTCTCGATAAACAATCTGGTTATTTCCCG(SEQ ID NO:131)扩增得到500bp的同源臂下游序列。用引物TAAAGGTCTCAGCGGCTGAGATCAAGGCCCAGCTG(SEQ ID NO:128)和TTAGGGTCTCAGACTTCTCGATAAACAATCTGGTTATTTCCCG(SEQ ID NO:131)，以同源臂上游序列和下游序列互为模板进行OEPCR，扩增得到1kb同源臂序列，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向phaA5基因的载体pHALORNA-phaA5。
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08。将质粒pHALORNA-phaB转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GGTAGCGGGGACCGGATTTG(SEQ ID NO:132)和GAAGAGCCACACGCGGTTG(SEQ ID NO:133)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为1.6kb，敲除型得到的条带大小为1.0kb，挑取验证的8个克隆中有6个为敲除菌，即基因编辑效率为75％。将敲除菌在含有氯霉素的60LB培养基中传代，即得到带有pQ08的phaB敲除菌Halomonas TD01ΔphaB/pQ08。
将质粒pHALORNA-phaA2转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01ΔphaB/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GAAGGTGGCGGCAGTGGTCC(SEQ ID NO:134)和TTCAACCTGAGCGTTGGCCG(SEQ ID NO:135)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为2.2kb，敲除型得到的条带大小为1.2kb，挑取验证的12个克隆中2个为敲除菌，即基因编辑效率为16.7％。将敲除菌在含有氯霉素的60LB培养基中传代，即得到带有pQ08的phaB、phaA2敲除菌Halomonas TD01ΔphaBΔphaA2/pQ08。
将质粒pHALORNA-phaA3转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01ΔphaBΔphaA2/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物GGCACTTTGCTGCTTATACC(SEQ ID NO:136)和TAACGTAGAAAACGGCGAGC(SEQID NO:137)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为2.2kb，敲除型得到的条带大小为1.2kb，挑取验证的8个克隆中7个为敲除菌，即基因编辑效率为87.5％。将敲除菌在含有氯霉素的60LB培养基中传代，即得到带有pQ08的phaB、phaA2、phaA3敲除菌Halomonas TD01ΔphaBΔphaA2ΔphaA3/pQ08。
将质粒pHALORNA-phaA5转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD01ΔphaBΔphaA2ΔphaA3/pQ08，在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物TTAGGCGTAGGTGCCCAAGC(SEQ ID NO:138)和GCACTCTAAGTAGCGATGGC(SEQ ID NO:139)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为2.0kb，敲除型得到的条带大小为1.2kb，挑取验证的8个克隆中4个为敲除菌，即基因编辑效率为50％。将敲除菌在60LB培养基中传代，即得到phaB、phaA2、phaA3和phaA5四基因敲除菌Halomonas TD01ΔphaBΔphaA2ΔphaA3ΔphaA5。
连续敲除基因的流程中只有敲除第一个基因时需要先转入pQ08载体，后面无需重复转入，只需要依次转入靶向目的敲除基因的sgRNA表达载体，节约了时间。
实施例7：基于CRISPR/Cas9敲除盐单胞菌LS21的minCD基因簇
在盐单胞菌LS21的minCD基因簇中选取cttaccaaccccccctttac(SEQ ID NO:145)为gRNA，对应的PAM序列为CGG。用引物AGCCGAAGACTGTAGTCTTACCAACCCCCCCTTTAC(SEQ IDNO:146)和TACAGAAGACAGAAACGTAAAGGGGGGGTTG(SEQ ID NO:147)进行无模板PCR，得到52bp的含有gRNA的片段，通过Golden Gate连接方法连入pHALORNA的BbsI位点之间。同时，以盐单胞菌LS21(在CN102925382A中公开，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6593)的基因组为模板，用引物TAAAGGTCTCAGCGGGTGCGTAGCGTGAAAAAAAATCAACT(SEQ ID NO:148)和CTAGGGTCTCGCCTTGACCGCCCTTCTTCAACAGGG(SEQ ID NO:149)扩增得到500bp的同源臂上游序列；用引物CTAGGGTCTCGAAGGGCTGATTACGCGCTATAACCCT(SEQ ID NO:150)和TTAGGGTCTCAGACTGAGCAATTGTCTTCGCTATCAAGTGAAA(SEQ ID NO:151)扩增得到500bp的同源臂下游序列。同源臂上游序列和下游序列通过Golden Gate接方法连入pHALORNA的BsaI位点之间，即得到靶向minCD基因簇的载体pHALORNA-minCD。
将质粒pQ08转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌LS21，得到重组菌Halomonas LS21/pQ08。将质粒pHALORNA-minCD大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas LS21/pQ08。在含有氯霉素和壮观霉素的60LB固体培养基上培养得到克隆，用引物TGTTGCTGTTCTGGTTGTTGAGGG(SEQ ID NO:152)和GTGGCGCCATTGATGAAATCTCC(SEQ ID NO:153)进行菌落PCR验证，野生型得到的条带大小为2.4kb，敲除型得到的条带大小为1.3kb，挑取验证的8个克隆中6个为敲除菌，即基因编辑效率为75％。将敲除菌在60LB培养基中传代，即得到minCD基因簇敲除菌Halomonas LS21ΔminCD。
使用与盐单胞菌TD01中相同的载体组合pQ08和pHALORNA，同样可以实现在盐单胞菌LS21中的基于CRISPR/Cas9的基因编辑，其操作流程和时间也与盐单胞菌TD01的基因编辑相同，大大节约在盐单胞菌LS21及其衍生菌当中进行基因编辑的时间。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京蓝晶微生物科技有限公司
清华大学
<120> 一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用
<130> DI17-1757-XC37
<160> 153
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QQO007
<400> 1
tccccccggg aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc aga 43
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QQO008
<400> 2
tccccgcggt aaatcgatgc aggtggcact tt 32
<210> 3
<211> 8411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cas9表达载体
<400> 3
aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt 60
ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagacagc tgggcgcgcc 120
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgggggat caggaccgct 180
gccggagcgc aacccactca ctacagcaga gccatgtagg gccgccggcg ttgtggatac 240
ctcgcggaaa acttggccct cactgacaga tgaggggcgg acgttgacac ttgaggggcc 300
gactcacccg gcgcggcgtt gacagatgag gggcaggctc gatttcggcc ggcgacgtgg 360
agctggccag cctcgcaaat cggcgaaaac gcctgatttt acgcgagttt cccacagatg 420
atgtggacaa gcctggggat aagtgccctg cggtattgac acttgagggg cgcgactact 480
gacagatgag gggcgcgatc cttgacactt gaggggcaga gtgctgacag atgaggggcg 540
cacctattga catttgaggg gctgtccaca ggcagaaaat ccagcatttg caagggtttc 600
cgcccgtttt tcggccaccg ctaacctgtc ttttaacctg cttttaaacc aatatttata 660
aaccttgttt ttaaccaggg ctgcgccctg tgcgcgtgac cgcgcacgcc gaaggggggt 720
gccccccctt ctcgaaccct cccggcccgc taacgcgggc ctcccatccc cccaggggct 780
gcgcccctcg gccgcgaacg gcctcacccc aaaaatggca gccacgtaga aagccagtcc 840
gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa 900
cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg 960
ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt 1020
tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag 1080
gggatcaaga tcgacggatc gatccgggga attaattccg gggcaatccc gcaaggaggg 1140
tgaatgaatc ggacgtttga ccggaaggca tacaggcaag aactgatcga cgcggggttt 1200
tccgccgagg atgccgaaac catcgcaagc cgcaccgtca tgcgtgcgcc ccgcgaaacc 1260
ttccagtccg tcggctcgat agtccagcaa gctacggcca agatcgagcg cgacagcgtg 1320
caactggctc cccctgccct gcccgcgcca tcggccgccg tggagcgttc gcgtcgtctc 1380
gaacaggagg cggcaggttt ggcgaagtcg atgaccatcg acacgcgagg aactatgacg 1440
accaagaagc gaaaaaccgc cggcgaggac ctggcaaaac aggtcagcga agccaagcag 1500
gccgcgttgc tgaaacacac gaagcagcag atcaaggaaa tgcagctttc cttgttcgat 1560
attgcgccgt ggccggacac gatgcgagcg atgccaaacg acacggcccg ctctgccctg 1620
ttcaccacgc gcaacaagaa aatcccgcgc gaggcgctgc aaaacaaggt cattttccac 1680
gtcaacaagg acgtgaagat cacctacacc ggcgtcgagc tgcgggccga cgatgacgaa 1740
ctggtgtggc agcaggtgtt ggagtacgcg aagcgcaccc ctatcggcga gccgatcacc 1800
ttcacgttct acgagctttg ccaggacctg ggctggtcga tcaatggccg gtattacacg 1860
aaggccgagg aatgcctgtc gcgcctacag gcgacggcga tgggcttcac gtccgaccgc 1920
gttgggcacc tggaatcggt gtcgctgctg caccgcttcc gcgtcctgga ccgtggcaag 1980
aaaacgtccc gttgccaggt cctgatcgac gaggaaatcg tcgtgctgtt tgctggcgac 2040
cactacacga aattcatatg ggagaagtac cgcaagctgt cgccgacggc ccgacggatg 2100
ttcgactatt tcagctcgca ccgggagccg tacccgctca agctggaaac cttccgcctc 2160
atgtgcggat cggattccac ccgcgtgaag aagtggcgcg agcaggtcgg cgaagcctgc 2220
gaagagttgc gaggcagcgg cctggtggaa cacgcctggg tcaatgatga cctggtgcat 2280
tgcaaacgct agggccttgt ggggtcagtt ccggctgggg gttcagcagc cacctgcatc 2340
gcggccggcc tacggccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga 2400
ataagggaca gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc 2460
cggctgacgc cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt 2520
atatcgtgcg aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg 2580
ttatgcagcg gaaaaggaca aaagtcaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 2640
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc atgatgaacc 2700
tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 2760
acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 2820
cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 2880
ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 2940
tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 3000
gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg aaattccgga 3060
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 3120
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 3180
tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 3240
gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgat 3300
aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt 3360
acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa tttaaatcgt aattattggg gacccctgga 3420
ttctcaccaa taaaaaacgc ccggcggcaa ccgagcgttc tgaacaaatc cagatggagt 3480
tctgaggtca ttactggatc tatcaacagg agtccaagac tagtcgccag ggttttccca 3540
gtcacgacgc ggccgcaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccccgggaac 3600
accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg atatattttt 3660
atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttccc tgcagggttt 3720
gcagtcagag tagaatagaa gtatcaaaaa aagcaccgac tcggtgccac tttttcaagt 3780
tgataacgga ctagccttat tttaacttgc tatgctgttt tgaatggttc caacaagatt 3840
attttataac ttttataaca aataatcaag gagaaattca aagaaattta tcagccataa 3900
aacaatactt aatactatag aatgataaca aaataaacta ctttttaaaa gaattttgtg 3960
ttataatcta tttattatta agtattgggt aatatttttt gaagagatat tttgaaaaag 4020
aaaaattaaa gcatattaaa ctaatttcgg aggtcattaa aactattatt gaaatcatca 4080
aactcattat ggatttaatt taaacttttt attttaggag gcaaaaatgg ataagaaata 4140
ctcaataggc ttagatatcg gcacaaatag cgtcggatgg gcggtgatca ctgatgaata 4200
taaggttccg tctaaaaagt tcaaggttct gggaaataca gaccgccaca gtatcaaaaa 4260
aaatcttata ggggctcttt tatttgacag tggagagaca gcggaagcga ctcgtctcaa 4320
acggacagct cgtagaaggt atacacgtcg gaagaatcgt atttgttatc tacaggagat 4380
tttttcaaat gagatggcga aagtagatga tagtttcttt catcgacttg aagagtcttt 4440
tttggtggaa gaagacaaga agcatgaacg tcatcctatt tttggaaata tagtagatga 4500
agttgcttat catgagaaat atccaactat ctatcatctg cgaaaaaaat tggtagattc 4560
tactgataaa gcggatttgc gcttaatcta tttggcctta gcgcatatga ttaagtttcg 4620
tggtcatttt ttgattgagg gagatttaaa tcctgataat agtgatgtgg acaaactatt 4680
tatccagttg gtacaaacct acaatcaatt atttgaagaa aaccctatta acgcaagtgg 4740
agtagatgct aaagcgattc tttctgcacg attgagtaaa tcaagacgat tagaaaatct 4800
cattgctcag ctccccggtg agaagaaaaa tggcttattt gggaatctca ttgctttgtc 4860
attgggtttg acccctaatt ttaaatcaaa ttttgatttg gcagaagatg ctaaattaca 4920
gctttcaaaa gatacttacg atgatgattt agataattta ttggcgcaaa ttggagatca 4980
atatgctgat ttgtttttgg cagctaagaa tttatcagat gctattttac tttcagatat 5040
cctaagagta aatactgaaa taactaaggc tcccctatca gcttcaatga ttaaacgcta 5100
cgatgaacat catcaagact tgactctttt aaaagcttta gttcgacaac aacttccaga 5160
aaagtataaa gaaatctttt ttgatcaatc aaaaaacgga tatgcaggtt atattgatgg 5220
gggagctagc caagaagaat tttataaatt tatcaaacca attttagaaa aaatggatgg 5280
tactgaggaa ttattggtga aactaaatcg tgaagatttg ctgcgcaagc aacggacctt 5340
tgacaacggc tctattcccc atcaaattca cttgggtgag ctgcatgcta ttttgagaag 5400
acaagaagac ttttatccat ttttaaaaga caatcgtgag aagattgaaa aaatcttgac 5460
ttttcgaatt ccttattatg ttggtccatt ggcgcgtggc aatagtcgtt ttgcatggat 5520
gactcggaag tctgaagaaa caattacccc atggaatttt gaagaagttg tcgataaagg 5580
tgcttcagct caatcattta ttgaacgcat gacaaacttt gataaaaatc ttccaaatga 5640
aaaagtacta ccaaaacata gtttgcttta tgagtatttt acggtttata acgaattgac 5700
aaaggtcaaa tatgttactg aaggaatgcg aaaaccagca tttctttcag gtgaacagaa 5760
gaaagccatt gttgatttac tcttcaaaac aaatcgaaaa gtaaccgtta agcaattaaa 5820
agaagattat ttcaaaaaaa tagaatgttt tgatagtgtt gaaatttcag gagttgaaga 5880
tagatttaat gcttcattag gtacctacca tgatttgcta aaaattatta aagataaaga 5940
ttttttggat aatgaagaaa atgaagatat cttagaggat attgttttaa cattgacctt 6000
atttgaagat agggagatga ttgaggaaag acttaaaaca tatgctcacc tctttgatga 6060
taaggtgatg aaacagctta aacgtcgccg ttatactggt tggggacgtt tgtctcgaaa 6120
attgattaat ggtattaggg ataagcaatc tggcaaaaca atattagatt ttttgaaatc 6180
agatggtttt gccaatcgca attttatgca gctgatccat gatgatagtt tgacatttaa 6240
agaagacatt caaaaagcac aagtgtctgg acaaggcgat agtttacatg aacatattgc 6300
aaatttagct ggtagccctg ctattaaaaa aggtatttta cagactgtaa aagttgttga 6360
tgaattggtc aaagtaatgg ggcggcataa gccagaaaat atcgttattg aaatggcacg 6420
tgaaaatcag acaactcaaa agggccagaa aaattcgcga gagcgtatga aacgaatcga 6480
agaaggtatc aaagaattag gaagtcagat tcttaaagag catcctgttg aaaatactca 6540
attgcaaaat gaaaagctct atctctatta tctccaaaat ggaagagaca tgtatgtgga 6600
ccaagaatta gatattaatc gtttaagtga ttatgatgtc gatcacattg ttccacaaag 6660
tttccttaaa gacgattcaa tagacaataa ggtcttaacg cgttctgata aaaatcgtgg 6720
taaatcggat aacgttccaa gtgaagaagt agtcaaaaag atgaaaaact attggagaca 6780
acttctaaac gccaagttaa tcactcaacg taagtttgat aatttaacga aagctgaacg 6840
tggaggtttg agtgaacttg ataaagctgg ttttatcaaa cgccaattgg ttgaaactcg 6900
ccaaatcact aagcatgtgg cacaaatttt ggatagtcgc atgaatacta aatacgatga 6960
aaatgataaa cttattcgag aggttaaagt gattacctta aaatctaaat tagtttctga 7020
cttccgaaaa gatttccaat tctataaagt acgtgagatt aacaattacc atcatgccca 7080
tgatgcgtat ctaaatgccg tcgttggaac tgctttgatt aagaaatatc caaaacttga 7140
atcggagttt gtctatggtg attataaagt ttatgatgtt cgtaaaatga ttgctaagtc 7200
tgagcaagaa ataggcaaag caaccgcaaa atatttcttt tactctaata tcatgaactt 7260
cttcaaaaca gaaattacac ttgcaaatgg agagattcgc aaacgccctc taatcgaaac 7320
taatggggaa actggagaaa ttgtctggga taaagggcga gattttgcca cagtgcgcaa 7380
agtattgtcc atgccccaag tcaatattgt caagaaaaca gaagtacaga caggcggatt 7440
ctccaaggag tcaattttac caaaaagaaa ttcggacaag cttattgctc gtaaaaaaga 7500
ctgggatcca aaaaaatatg gtggttttga tagtccaacg gtagcttatt cagtcctagt 7560
ggttgctaag gtggaaaaag ggaaatcgaa gaagttaaaa tccgttaaag agttactagg 7620
gatcacaatt atggaaagaa gttcctttga aaaaaatccg attgactttt tagaagctaa 7680
aggatataag gaagttaaaa aagacttaat cattaaacta cctaaatata gtctttttga 7740
gttagaaaac ggtcgtaaac ggatgctggc tagtgccgga gaattacaaa aaggaaatga 7800
gctggctctg ccaagcaaat atgtgaattt tttatattta gctagtcatt atgaaaagtt 7860
gaagggtagt ccagaagata acgaacaaaa acaattgttt gtggagcagc ataagcatta 7920
tttagatgag attattgagc aaatcagtga attttctaag cgtgttattt tagcagatgc 7980
caatttagat aaagttctta gtgcatataa caaacataga gacaaaccaa tacgtgaaca 8040
agcagaaaat attattcatt tatttacgtt gacgaatctt ggagctcccg ctgcttttaa 8100
atattttgat acaacaattg atcgtaaacg atatacgtct acaaaagaag ttttagatgc 8160
cactcttatc catcaatcca tcactggtct ttatgaaaca cgcattgatt tgagtcagct 8220
aggaggtgac tgaagtatat tttagatgaa gattatttct taatctagac atgagcggat 8280
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 8340
aagtgccacc tgcatcgatt taccgcggcc taggcggcct cctgtgtgaa attgttatcc 8400
gctttaatta a 8411
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P017
<400> 4
cggcaaataa tttgactttt gtccttttcc gctg 34
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P018
<400> 5
tcctgtgtga aattgttatc cgct 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P012
<400> 6
ccagtagctg acattcatcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P013
<400> 7
ggatgaatgt cagctactgg 20
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P014
<400> 8
gtcaaggttc tcagaagaac tcgtcaagaa ggc 33
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P015
<400> 9
gttcttctga gaaccttgac cgaacgcagc 30
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P016
<400> 10
aaaagtcaaa ttatttgccg actaccttgg tg 32
<210> 11
<211> 307
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成片段01
<400> 11
agcggataac aatttcacac aggagctctt cagagtgaac tcgagtaggg ataacagggt 60
aatagatcta agcttctgca ggtcgactct agagaattca aaaaaagcac cgactcggtg 120
ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa 180
acctgtcttc gctggaagac tgactagtat tatacctagg actgagctag ctgtcaagga 240
tccagcatat gcggtgagac caaaaggtct caagtctcgt gaagagcgga tgaatgtcag 300
ctactgg 307
<210> 12
<211> 4727
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体pHALORNA
<400> 12
agcggataac aatttcacac aggagctctt cagagtgaac tcgagtaggg ataacagggt 60
aatagatcta agcttctgca ggtcgactct agagaattca aaaaaagcac cgactcggtg 120
ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa 180
acctgtcttc gctggaagac tgactagtat tatacctagg actgagctag ctgtcaagga 240
tccagcatat gcggtgagac caaaaggtct caagtctcgt gaagagcgga tgaatgtcag 300
ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag 360
tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 420
gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 480
cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 540
atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 600
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 660
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 720
gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 780
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 840
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 900
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 960
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 1020
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 1080
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1140
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1200
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1260
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1320
tcgccttctt gacgagttct tctgagaacc ttgaccgaac gcagcggtgg taacggcgca 1380
gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg tacagtctat gcctcgggca 1440
tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga tgttatggag cagcaacgat 1500
gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc 1560
gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg 1620
acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt 1680
gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg 1740
atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta 1800
gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa 1860
ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg 1920
atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta 1980
ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta 2040
aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta 2100
gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat 2160
gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa 2220
gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg 2280
gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataaactagt 2340
aaataataaa aaagccggat taataatctg gctttttata ttctctgcat aaccctgctt 2400
cggggtcatt atagcgattt tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt 2460
ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat 2520
aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct 2580
ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg taggccggcc gataatctca 2640
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 2700
tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 2760
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 2820
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 2880
taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 2940
taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 3000
agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 3060
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 3120
cgcttcccga agggagaaag gcggacaggc atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 3180
agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 3240
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 3300
aaaacgccag caacgcggcc gtgaaaggca ggccggtccg tggtggccac ggcctctagg 3360
ccagatccag cggcatctgg gttagtcgag cgcgggccgc ttcccatgtc tcaccagggc 3420
gagcctgttt cgcgatctca gcatctgaaa tcttcccggc cttgcgcttc gctggggcct 3480
tacccaccgc cttggcgggc ttcttcggtc caaaactgaa caacagatgt gtgaccttgc 3540
gcccggtctt tcgctgcgcc cactccacct gtagcgggct gtgctcgttg atctgcgtca 3600
cggctggatc aagcactcgc aacttgaagt ccttgatcga gggataccgg ccttccagtt 3660
gaaaccactt tcgcagctgg tcaatttcta tttcgcgctg gccgatgctg tcccattgca 3720
tgagcagctc gtaaagcctg atcgcgtggg tgctgtccat cttggccacg tcagccaagg 3780
cgtatttggt gaactgtttg gtgagttccg tcaggtacgg cagcatgtct ttggtgaacc 3840
tgagttctac acggccctca ccctcccggt agatgattgt ttgcacccag ccggtaatca 3900
tcacactcgg tcttttcccc ttgccattgg gctcttgggt taaccggact tcccgccgtt 3960
tcaggcgcag ggccgcttct ttgagctggt tgtaggaaga ttcgataggg acacccgcca 4020
tcgtcgctat gtcctccgcc gtcactgaat acatcacttc atcggtgaca ggctcgctcc 4080
tcttcacctg gctaatacag gccagaacga tccgctgttc ctgaacactg aggcgatacg 4140
cggcctcgac cagggcattg cttttgtaaa ccattggggg tgaggccacg ttcgacattc 4200
cttgtgtata aggggacact gtatctgcgt cccacaatac aacaaatccg tccctttaca 4260
acaacaaatc cgtcccttct taacaacaaa tccgtccctt aatggcaaca aatccgtccc 4320
tttttaaact ctacaggcca cggattacgt ggcctgtaga cgtcctaaaa ggtttaaaag 4380
ggaaaaggaa gaaaagggtg gaaacgcaaa aaacgcacca ctacgtggcc ccgttggggc 4440
cgcatttgtg cccctgaagg ggcgggggag gcgtctgggc aatccccgtt ttaccagtcc 4500
cctatcgccg cctgagaggg cgcaggaagc gagtaatcag ggtatcgagg cggattcacc 4560
cttggcgtcc aaccagcggc accagcggcg cctgagaggg gcgcgcccag ctgtctaggg 4620
cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc 4680
ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctt taattaa 4727
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 13
gataacattg ccgtcacccc 20
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
agccgaagac tgtagtgata acattgccgt cacccc 36
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
tacagaagac agaaacgggg tgacggcaat g 31
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
taaaggtctc agcgggaagc atggaaagtg cagct 35
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ttctcacgca gtgcagcgca tgacttcggg 30
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tgcgctgcac tgcgtgagaa tgatcttttc tgg 33
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
ttagggtctc agactctgca tagccgttct ccgtta 36
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
atgctgtcag ggtggaaaat g 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
ttacgacgcg ggaagctcac 20
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P005
<400> 22
agccggtctc agtctggttt gcagtcagag tagaatag 38
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P019
<400> 23
cgcgggtctc cggagcattc aaatatgtat ccgctcatgt c 41
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P007
<400> 24
acgtggtctc gagacatgcc tccacaccgc tcgtc 35
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P008
<400> 25
cgacggtctc cccatctagt atttctcctc tttctctagt a 41
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P009
<400> 26
cggcggtctc catggatatt aatactgaaa ctgagatcaa gc 42
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P010
<400> 27
cgtgggtctc cacccttaac tcaacagaag atgctttgtg c 41
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P020
<400> 28
tcaaggtctc actcctgtgt gaaattgtta tccgct 36
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P021
<400> 29
atagggtctc cgggtcgatg aagagcaaaa gctct 35
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 30
ttcacctagc tagatgagac 20
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
agccgaagac tgtagtttca cctagctaga tgagac 36
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
tacagaagac agaaacgtct catctagcta g 31
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q179
<400> 33
taaaggtctc agcgggatgc cataaaccgt ggtgaccatg c 41
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q457
<400> 34
agcgtgggtc tcgagcctga tcgatgtgct cggaagg 37
<210> 35
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q458
<400> 35
agcgtgggtc tcgcctcctc accttcattt ccttatgctg aacacg 46
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q182
<400> 36
ttagggtctc agacttcggc ccgcgcccgg cgtga 35
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q451
<400> 37
agcgtgggtc tcgggctcgg ccgctcagac ctgccag 37
<210> 38
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q452
<400> 38
gtgctgggtc tcacatccta gtatttctcc tctttctcta gtaaagtctg ca 52
<210> 39
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q453
<400> 39
agcgtgggtc tcagatgatg ttagaccagc aaaccattaa catcatca 48
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q454
<400> 40
gtgctgggtc tcggctatta ttcaaccgct tgagcgtaca aatct 45
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q455
<400> 41
agcgtgggtc tcttagctac tagagaaaga ggagaaatac tagatgcgt 49
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q456
<400> 42
gtgctgggtc tcggaggctg gattctcacc aataaaaaac gcccg 45
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 43
gcaagagagt cagaaaatgg 20
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
agccgaagac tgtagtgcaa gagagtcaga aaatgg 36
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
tacagaagac agaaacccat tttctgactc t 31
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
taaaggtctc agcggagaaa attgaatacg ctatcggacg tt 42
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
ctagggtctc gccttcacat aatctcctta agtgagctag cg 42
<210> 48
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
ctagggtctc gaaggacgct attaattgat agataaaatg ccgcaccgtc a 51
<210> 49
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
ttagggtctc agactgaaca gcaaatcgct gttatacagg c 41
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
cttggccgat aagtgcggac 20
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
tgcagcttgg aaacatttac tcaac 25
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 52
gctcatcagc tgacgcattt 20
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
agccgaagac tgtagtgctc atcagctgac gcattt 36
<210> 54
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
tacagaagac agaaacaaat gcgtcagctg a 31
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
taaaggtctc agcggatccg cgcgacagca tgaataaa 38
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
ctagggtctc gccttggtaa acactcctgt tccattgcc 39
<210> 57
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
ctagggtctc gaaggtctgt tgcagttatt gacttgctgt cat 43
<210> 58
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
ttagggtctc agactattga acgcctggat ctggtcg 37
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 59
cattaatttc tgtcgcgctg 20
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
agccgaagac tgtagtcatt aatttctgtc gcgctg 36
<210> 61
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
tacagaagac agaaaccagc gcgacagaaa t 31
<210> 62
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
taaaggtctc agcggggcgt ttcagcaaaa cctgctg 37
<210> 63
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
ctagggtctc gccttagtgt ctgctcctgt ctctcg 36
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
ctagggtctc gaaggacgca actatgttcg cggcg 35
<210> 65
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
ttagggtctc agactctgcg aaaacaacag atactgctgc 40
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
gatgttagcg ttgatacgcc 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
taaaacgcca agttgcgctt 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 68
agccagtcac attccccgct 20
<210> 69
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
agccgaagac tgtagtagcc agtcacattc cccgct 36
<210> 70
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
tacagaagac agaaacagcg gggaatgtga c 31
<210> 71
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
taaaggtctc agcggggcct ttattatcac ccatc 35
<210> 72
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
aacggcaccc ccgcccagcg ctcagctcct atttataatt 40
<210> 73
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
aattataaat aggagctgag cgctgggcgg gggtgccgtt 40
<210> 74
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
ttagggtctc agacttatca ataatcctcg tacca 35
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 75
aaacactttg tgttcataca 20
<210> 76
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
agccgaagac tgtagtaaac actttgtgtt cataca 36
<210> 77
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
tacagaagac agaaactgta tgaacacaaa g 31
<210> 78
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
taaaggtctc agcggcatgc ccggcaaggg cctca 35
<210> 79
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
ccttgcccag atggaacact gttcaggcgg tcatttggga 40
<210> 80
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
tcccaaatga ccgcctgaac agtgttccat ctgggcaagg 40
<210> 81
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
ttagggtctc agactcagga ttattaatga ggctg 35
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 82
gctatcgcca ctgggaaagt 20
<210> 83
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
agccgaagac tgtagtgcta tcgccactgg gaaagt 36
<210> 84
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
tacagaagac agaaacactt tcccagtggc g 31
<210> 85
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
taaaggtctc agcggggttc catcgaagtg actgc 35
<210> 86
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
aaacaacagg accgccttct gcggagggtt gggtaaacgt 40
<210> 87
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
acgtttaccc aaccctccgc agaaggcggt cctgttgttt 40
<210> 88
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
ttagggtctc agactttatc ccagcgtgca tagtg 35
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 89
caccaagtct tcagtgacag 20
<210> 90
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
agccgaagac tgtagtcacc aagtcttcag tgacag 36
<210> 91
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
tacagaagac agaaacctgt cactgaagac t 31
<210> 92
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
taaaggtctc agcggtgagc gctttgatgg caaccgg 37
<210> 93
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
ctagggtctc gccttagtat gtggtcgtta ccgccg 36
<210> 94
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
ctagggtctc gaaggccagc gattacatag taagcgctac c 41
<210> 95
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 95
ttagggtctc agactccgtc aaagaaggcc ttgaaagc 38
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 96
ggtcagtaag gttatcgggg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
gtgtagaacc ccccgatacg 20
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 98
gaaaaacgat agctggagga tg 22
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 99
gaacggcgga tcatatcagg 20
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 100
gttcaatgag cctacagcag c 21
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 101
gagcgcgaag caggcaaggc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 102
gagctggtgc cgtatgatga 20
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 103
aagggtttat tgtcgccgat c 21
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 104
gggtaactgg tggaactgg 19
<210> 105
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 105
agccgaagac tgtagtgggt aactggtgga actgg 35
<210> 106
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 106
tacagaagac agaaacccag ttccaccagt t 31
<210> 107
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 107
taaaggtctc agcgggttat gagcccgacg agc 33
<210> 108
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 108
aacgcttcac gcttgattgg ccattgacta cc 32
<210> 109
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 109
ccaatcaagc gtgaagcgtt acggtacacc 30
<210> 110
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 110
ttagggtctc agactctccc agccgaaaaa cttacag 37
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 111
ggcgggcgaa ccgatcagcg 20
<210> 112
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 112
agccgaagac tgtagtggcg ggcgaaccga tcagcg 36
<210> 113
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 113
tacagaagac agaaaccgct gatcggttcg c 31
<210> 114
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 114
taaaggtctc agcggatcag agagggtatc gtgcc 35
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 115
gatgccctgt gacttcttca accccgccag 30
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 116
tgaagaagtc acagggcatc gctgcgggta 30
<210> 117
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 117
ttagggtctc agactcacca gaggaggcca tgcaa 35
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 118
gttaccgctg aaaagctggg 20
<210> 119
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 119
agccgaagac tgtagtgtta ccgctgaaaa gctggg 36
<210> 120
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 120
tacagaagac agaaacccca gcttttcagc g 31
<210> 121
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 121
taaaggtctc agcggtatcg ggccgtgttg gctat 35
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 122
tgaagtgtaa gctaccctgt gtatcggcgg 30
<210> 123
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 123
acagggtagc ttacacttca tcaatttgct ctggg 35
<210> 124
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 124
ttagggtctc agactcatcg cattattatt tgtagctacg c 41
<210> 125
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA
<400> 125
ggggcagcca ccgccggtg 19
<210> 126
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 126
agccgaagac tgtagtgggg cagccaccgc cggtg 35
<210> 127
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 127
tacagaagac agaaaccacc ggcggtggct g 31
<210> 128
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 128
taaaggtctc agcggctgag atcaaggccc agctg 35
<210> 129
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 129
cagcgtttca agcgccagca atgcccgcac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
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tgctggcgct tgaaacgctg cctccaacag 30
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<213> 人工序列
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<223> 引物
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<223> 引物
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<223> 引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
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ttcaacctga gcgttggccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
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ggcactttgc tgcttatacc 20
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 引物
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gcactctaag tagcgatggc 20
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<212> DNA
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<223> P011
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 141
cctgcattcc tggtttgcca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
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attaaccgcc agcttttgcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctgcctgggc cgcattttc 19
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<212> DNA
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agcctctgat gcagacaagc 20
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<223> gRNA
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tacagaagac agaaacgtaa agggggggtt g 31
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<223> 引物
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taaaggtctc agcgggtgcg tagcgtgaaa aaaaatcaac t 41
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ctagggtctc gaagggctga ttacgcgcta taaccct 37
<210> 151
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<223> 引物
<400> 151
ttagggtctc agactgagca attgtcttcg ctatcaagtg aaa 43
<210> 152
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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tgttgctgtt ctggttgttg aggg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 153
gtggcgccat tgatgaaatc tcc 23
Claims (7)
1.一种对盐单胞菌进行基因编辑的方法，其特征在于，使用一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合在盐单胞菌中进行基因编辑，所述载体组合包括cas9表达载体和多个sgRNA表达载体，其中，所述cas9表达载体通过将cas9基因引入质粒载体而得到，其中，所述基于CRISPR/Cas9的基因编辑的载体组合中的载体不含λ-RED重组酶基因，
该方法包括以下步骤：
1)将所述cas9表达载体导入盐单胞菌出发菌中，得到重组菌1；
2)将针对目的基因的sgRNA序列和待编辑基因的同源臂序列插入所述sgRNA表达载体中，得到针对目的基因的sgRNA质粒；
3)将步骤2)中得到的针对目的基因的sgRNA质粒导入步骤1)中得到的重组菌1中，Cas9蛋白在sgRNA序列的引导下切割基因组上目的基因的序列，诱导同源重组的发生，得到基因编辑的重组菌，
其中，所述对盐单胞菌进行基因编辑的方法是连续编辑多个基因的基因编辑的方法，当连续编辑多个基因时只需在第一步转入cas9表达载体，之后依次转入针对目的基因的sgRNA序列和待编辑基因的同源臂序列的sgRNA表达载体，
其中，所述盐单胞菌选自盐单胞菌TD01和盐单胞菌LS21。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体组合中，构建所述cas9表达载体所需的元件包括：复制子，抗性基因，启动子和cas9基因；以及其中，构建所述sgRNA表达载体所需的元件包括：复制子，抗性基因，启动子和sgRNA支架。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体组合中，所述质粒载体包括pSEVA321、pSEVA331、pSEVA341、pBBR1MCS-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体组合中，所述cas9表达载体通过将cas9基因引入pSEVA321中而得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述载体组合中，所述cas9表达载体通过将cas9基因引入pSEVA321的XmaI和SacII位点之间而得到。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述载体组合中，所述cas9表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述，和/或其中，所述sgRNA表达载体如SEQ ID NO:12所述。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因编辑包括基因敲除、基因插入、基因替换。
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