CN109929862B - 一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法，主要包括提供了一种纤维素酶基因以及提供了一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法。主要方法包括：对瘤胃纤维素酶基因的核酸序列进行了测序、构建独龙牛瘤胃微生物宏转录组基因文库、分析独龙牛瘤胃微生物宏转录组数据、研究纤维素酶基因的全基因合成、克隆与酶学性质。本发明最终挑选出来自GH48家族的两个纤维素酶基因并成功克隆，酶学性质研究显示，与市场所购的两种纤维素酶相比，本发明的两种酶在高温与高pH值条件下仍然保持较高的酶活性，具有一定的应用价值。

Description

一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克 隆的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及到一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法。

背景技术

粗纤维中的纤维素和半纤维素是自然界中含量最多的可再生资源，如今能源短缺已经成为全球性的问题，从可再生生物质资源生产生物燃料是可持续发展的必然趋势，粗纤维的开发和利用被认为是缓解能源问题最有效的途径之一。纤维素酶基因的克隆与表达目前已取得了很大的进展，但没在真正意义上得到高效分解纤维素的工程菌。

反刍动物瘤胃是公认的降解纤维素能力最强的天然发酵罐，是一个良好的大型纤维素酶库，具有很高的研究价值。瘤胃微生物组成及协同作用对纤维素的水解至关重要，但自然环境中绝大多数微生物在实验室无法分离培养，这种瓶颈限制人们对其的研究和利用。宏组学 (包括宏基因组学，宏转录组学，宏蛋白组学，宏代谢组学等)研究避开了微生物分离培养的过程，极大地扩展了微生物资源的利用空间，可以更加全面的了解环境中的微生物，也可以从中筛选与挖掘新的功能基因，是现代基因工程一个新的发展方向和研究热点。

随着高通量测序技术的发展与测序成本的降低，对环境微生物 DNA、RNA进行高通量测序后进行功能分析筛选的可行性大大提高，可以从中筛选出大量的纤维素酶，相比宏基因组学，宏转录组更能反映在特定时空环境下的微生物群落基因的动态表达与调控等问题。碳水化合物活性酶(Carbohydrate-active enzymes，CAZyme)对地球上所有碳水化合物的合成、降解与修饰起重要作用，因此深入研究CAZyme，对于了解微生物碳水化合物的代谢机制非常重要。碳水化合物活性酶数据库(CAZy，http://www.cazy.org/)是关于能够合成或者分解复杂碳水化合物和糖复合物的酶类的专业数据库，根据蛋白质结构域中氨基酸序列的相似性，可以将不同物种来源的碳水化合物活性酶分成糖苷水解酶(GlycosideHydrolases，GHs)，糖基转移酶 (GlycosylTransferases，GTs)，多糖裂合酶(Polysaccharide Lyases， PLs)，碳水化合物酯酶(Carbohydrate Esterases，CEs)，碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Modules，CBMs)，辅助氧化还原酶 (AuxiliaryActivities，AAs)六大类蛋白质家族，能为纤维素酶基因的研究提供数据支持。目前尚未见到从宏转录组测序数据中挑选纤维素酶基因进行克隆的报道。

综上所述目前在瘤胃纤维素酶的研究上存在以下问题：

传统的培养分离方式不能系统的研究瘤胃微生物的结构与功能，只能分离出少数的纤维降解菌，对大量的不能分离培养的微生物不能进行进一步的研究，难以满足对瘤胃微生物研究的需求。

目前对瘤胃纤维素酶的筛选基本都是把DNA打散构建克隆文库，随机对文库进行功能筛选，虽然目前以找到了很多纤维素酶，但还没有真正意义上的高效纤维素水解酶。而且工作量大，并不能很好的挖掘新的纤维素酶基因。

根据目前的技术发展情况，本发明采用瘤胃宏转录组全测序的方法进行研究，能更加全面的对瘤胃微生物结构与功能进行探索。解决对独龙牛瘤胃微生物结构与功能研究的空白。

目前，缺乏一种专一高效的从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法。

发明内容

针对现在存在的问题，本发明提供一种专一高效的从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的两个瘤胃纤维素酶基因，所述的两个瘤胃纤维素酶基因由瘤胃纤维素酶基因 GH48HC1与瘤胃纤维素酶基因GH48HC2组成，所述的瘤胃纤维素酶基因GH48HC1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述的瘤胃纤维素酶基因GH48HC2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

本发明的一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取独龙牛瘤胃内容物的总RNA，并冷冻保存备用；

(2)将提取的总RNA进行反转录与桥式PCR，构建RNA测序文库。之后使用IlluminaHiseq对序列进行测序；

(3)将得到的序列数据进行质控与拼接，最终构建独龙牛瘤胃微生物的宏转录组非冗余基因集；

(4)将构建的非冗余基因集与CAZy数据库进行比对，得到每条基因的功能注释。通过分析最后挑选出表达突出的纤维素酶基因，进行后续步骤；

(5)将挑选出的基因序列进行全基因合成，连接在载体PUC57 上，转化感受态细胞，通过筛选获得携带重组质粒的大肠杆菌；

(6)将步骤5得到的大肠杆菌发酵培养，提取粗酶液进行酶学性质研究，探究温度与pH值对酶的影响，得到最适的反应温度与pH 值(其他条件不变的情况下，所测得酶活力最高的温度或pH值为该酶的最适反应温度或pH值)，并与市场上所购的纤维素酶做对比。

有益效果：本发明还对宏转录组数据进行了筛选，最终采取全基因合成的方式对挑选出的两个纤维素酶基因进行克隆研究，能更加专一高效的挖掘新基因，解决目前有效克隆率低的问题，同时还解决目前缺少高效纤维素水解酶的缺乏。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明采取瘤胃宏转录组全测序的方法对独龙牛瘤胃微生物结构与功能进行研究，可以更加全面的研究原生境独龙牛瘤胃降解的特征，更好的开发种质资源。

(2)本发明对瘤胃测序数据进行CAZy数据库注释与分析，最终从GH48家族中挑选出两个纤维素酶基因进行全基因合成，能避免因DNA质量、测序与数据处理、实验操作等问题导致的克隆失败，提高成功率。

(3)本发明成功克隆的两个纤维素酶在高温、高pH条件下仍保持较高酶活性，在实际应用中有较大价值，可进一步对这两个酶进行开发利用。

附图说明

图1为本发明GH48HC1氨基酸序列组成图；

图2为本发明GH48HC2氨基酸序列组成图；

图3为本发明全基因合成基因双酶切结果图；

图4为本发明pH值对纤维素酶活性的影响图；

图5为本发明温度对纤维素酶活性的影响图。

具体实施方式

为了对本发明进一步的解释，下面结合实施例进行进一步的解释，但不以任何形式对本发明的保护范围进行限定。在本发明的基础上所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明的两个瘤胃纤维素酶基因，所述的两个瘤胃纤维素酶基因由瘤胃纤维素酶基因GH48HC1与瘤胃纤维素酶基因GH48HC2组成，所述的瘤胃纤维素酶基因GH48HC1的核苷酸序列如SEQIDNo.1 所示，所述的瘤胃纤维素酶基因GH48HC2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

独龙牛瘤胃微生物宏转录组基因文库构建

本发明纤维素酶基因的克隆方法，采取独龙牛瘤胃内容物为材料，通过总RNA的提取、cDNA的合成、Illumina测序与序列的处理后，最终构建独龙牛瘤胃微生物宏转录组基因文库。具体步骤如下：

步骤1、独龙牛瘤胃内容物RNA的抽提(使用

Soil DNA Kit)：

(1)加200mg玻璃珠I和200mg玻璃珠II到15mL离心管，加入 0.5g样品。(2)添加400μl缓冲液SLX，40μL HTR2试剂到样品。注：以HTR2试剂在使用前摇晃。(3)添加400μL水饱和酚的样品。最大速度转10分钟。为获得最佳效果，可使用微珠混合器fastprep-24。(4) 添加400μL氯仿样品。在最大速度转1分钟。(5)在4℃4000x g离心 10分钟。(6)将350μL上层水相移到一个新的2毫升管。添加0.1体积(35μL)SP2缓冲液和等体积(350μL)结合缓冲液到样本。(7) 将第6步混合的样品加到HiBind DNA微柱然后插在2ml微量离心管。离心12000×1分钟。(8)抛弃HiBind DNA微型柱，然后加等体积 RNA结合缓冲液到溢流管。倒置管10-30次使混合彻底。(9)转移 750μL步骤8的混合样品到HiBind RNA微型柱，插入到一个新的2 毫升收集管。离心1200×2分钟。抛弃溢流管然后使用收集管。(10) 剩余的样品重复步骤9，抛弃溢流管后收集。(11)将柱插入一个新的2 毫升收集管。添加500μL RWC洗涤缓冲液到柱。离心12000×1分钟。抛弃溢流管和重新使用一个收集管。(12)将柱放在同一离心管中，从上一步。添加700μLRNA洗涤缓冲液II进入柱。12000x g离心1分钟。丢弃溢流管和重新使用一个收集管。(13)重复步骤12第二过程加 700μL RNA洗涤缓冲液II。抛弃溢流管和重新使用离心管。(14)将柱放入上一步的收集管中用离心机12000x g离心2分钟。(15)将HiBind RNA柱插到一个新的1.5毫升离心管。(16)在柱中心膜上加30-50μl DEPC。在室温下放置1分钟。(17)于12000x g离心1分钟洗脱RNA。完成总的RNA抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的RNA。

步骤2rRNA的去除：

采用Ribo-Zero^TMrRNA Removal Kit*(Meta-Bacteria)+Ribo-Zero^TMrRNARemoval Kit*(Human/Mouse/Rat)磁珠法去除rRNA。(1)rRNA与探针杂交； (2)杂交产物与磁珠结合，去除rRNA；(3)2.5倍无水乙醇沉淀，回收去除了rRNA的目标RNA(详见试剂盒操作说明书)。

步骤3宏转录组文库构建与测序：

以3-5ug total RNA起始量建库，使用TruSeq^TMRNA Sample Prep Kit制备cDNA，2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)，使用Hiseq 3000/4000PE Cluster Kit进行桥式PCR，使DNA 扩增子线性化成为单链，之后使用TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机，使用Illumina MiSeq(Hiseq3000/4000)测序(详见试剂盒操作说明书)。

获得高质量reads后,需要将所有测序读段进行组装拼接,之后进行ORF预测，选择核酸长度大于123bp的基因，共得到54466个 ORFs。将ORFs去冗余，构建非冗余基因集，得到44277个基因，数据量为26M。

实施例2

独龙牛瘤胃微生物宏转录组数据分析

使用CAZy数据库的对应工具hmmscan (http://hmmer.janelia.org/search/hmmscan)将基因集与CAZy数据库进行比对，比对参数设置期望值e-value为1e-5，获得基因对应的碳水化合物活性酶注释信息。

通过分析发现，GH48家族在独龙牛瘤胃中突出表达，通过NCBI 进行blast比对，最终挑选出两个纤维素酶基因GH48HC1和GH48HC2，核酸序列见序列表。使用Bioedit软件分析两个纤维素酶基因的氨基酸组成，结果显示：

GH48HC1基因编码纤维素酶的氨基酸组成如图1所示，分子式C2711H4106N722O869S20，总氨基酸563个，主要的氨基酸为Ala、 Gly、Leu，分别占总氨基酸的10.3％、9.77％、8.17％，酸性、碱性氨基酸分别70和39个，各占总氨基酸的12.43％和6..93％，极性与非极性氨基酸分别为346和217个，蛋白等电点为4.58，不稳定系数 18.66，蛋白稳定性较好，有利于后续的酶催化反应。

GH48HC2基因编码纤维素酶的氨基酸组成如图2所示，分子式C1486H2214N394O479S10，总氨基酸309个，主要的氨基酸为Ala、 Gly、Thr，分别占总氨基酸的13.27％、8.74％、8.41％，酸性、碱性氨基酸分别37和19个，各占总氨基酸的11.97％和6.14％，极性与非极性氨基酸分别为188和121个，蛋白等电点为4.55，不稳定系数 14.81，蛋白稳定性较好，有利于后续的酶催化反应。

实施例3

纤维素酶的全基因合成与酶学性质研究

考虑到大部分基因进行PCR时，由于多方面原因，不能理想的扩增目的基因。因此我们挑选出GH48家族中的两个基因GH48HC1 和GH48HC2进行全基因合成。纤维素酶基因合成后再进行克隆与酶学性质研究。具体步骤如下：

步骤1全基因合成与克隆

全基因合成委托昆明硕阳生物技术公司完成，之后将目的基因克隆到PUC57中，导入大肠杆菌中，通过AMP筛选出携带目的基因的重组大肠杆菌PUC57。对GH48HC1用HindIII和KpnI进行双酶切得到两条带，分别约为3200kb和1650kb，GH48HC2用NdeI和BsaI 进行双酶切得到两条带，分别约为2550kb和1000kb，测序结果与目的条带一致(附图3)。

步骤2pH对纤维素酶酶活的影响

将经过超声波破碎，离心后搜集的上清液，用孔径为0.22um的滤器过滤后，4℃保存，作为测定粗酶液在40℃的水浴条件下分别特定pH值为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，8.0等条件下的酶活，结果显示GH48HC1的最适pH为9，GH48HC2的最适pH为 6(附图4)。

步骤3温度对纤维素酶酶活的影响

将适当稀释的酶液分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、 60℃、65℃、70℃等条件下与底物反应30min后测定各反应酶活力。结果显示GH48HC1与GH48HC2的最适温度都为45℃(附图5)。

步骤4与市售纤维素酶对比研究

此外我们还将GH48HC1、GH48HC2与北京酷来搏科技有限公司用于生化降解与医用消化的纤维素酶cellulose与cellulose-R10进行比较。结果显示GH48HC1与GH48HC2的最适温度都为45℃(附图 5)，GH48HC1的最适pH为9，GH48HC2的最适pH为6(附图4)。 GH48HC1和GH48HC2都表现出耐高温与耐高pH的特性，与市售纤维素酶相比，在70℃与pH为10时都能表现出较高酶活性，这可能与这两种酶来源于瘤胃有关。目前耐高温的纤维素酶已有少量报道，但耐高pH的纤维素酶还很少有报道，证明本研究挑选出的这两个酶具有一定的实际与研究价值。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法

<130> 2010

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1689

<212> DNA

<213> 人工序列(GH48HC1序列)

<400> 1

ggtgacgaac tccgtaacaa tatgtatgat aagtactatc gtacaatcgg tacatccaat 60

aatgtcaata gctggcagcc cggcagtgaa gctaactgcg ctcactacct gatgaactgg 120

tacacatcct ggggcggtgc tctgtcttct tctggtcaga actggtgctg gcagattggt 180

tgctctcatg ctcatgaatt ctatcagaac ccgctggctg ctttcgctct gattcaggaa 240

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gatactcctg aagagccgac tgatgctctc tatggtgacg ttgactgcaa cggcgttgtt 1500

gacatcgttg acgttctgac tctcaaccag tatttgactg gtatcgctga atacctcact 1560

cctaacggtg agaaggaagc acagggcaag attaacgcaa acgttgacct cgacgacaag 1620

attgacgatg ctgatgctat gaacattctg aagtctctcg ttaagctggt gactctgcct 1680

gttaagaag 1689

<210> 2

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列(GH48HC2序列)

<400> 2

cattttaaaa agagtaaggc tgtagttgca gctattctga ccgctgcaat ggcagctaat 60

gcactgacag ctacaatctc cgcttctgct gctggcacaa gaactaaggc tgaggctttc 120

ggcgattcta cctatgcaga gagattcctg tcactgtatg acgacgttgt tacaaatggt 180

caggctaatg gctatctgtc tcagaacact aacggcggtg attccttcgg tatcccgttc 240

cacgctgtag aagaagttat tatcgaagct cctgactatg gtcatgaaac tacttccgaa 300

gctatgtcct acctcgtatg ggttgctgct atgcgtgata atatcgctaa gaatcacgcc 360

ggcgatgtaa gcactggcag tgttcagtat actggcgacc tcgctaaggc ttggaagact 420

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gacaagaccg cttctaaccc gatttatagc tatttcacat ctgcttattc cagtgacaag 600

ggtctgtacc tcctgcactg gctggctgac gttgaaaact ggtatggtta tggacaggga 660

acaaacttca ctttcattaa cacattccag cgtggtgagc aggaatcctg ctgggaaact 720

gttcctcatc cttgcgttga tgaattgaag tatggtaatg ctcagagagg tctgaagggt 780

atctttaaca gagaccagca ggtaactcct cagtatgctt atacaaacgc tcctgacgct 840

gaagaccgtg ctattcaggg tgtttatgat gctaatatgt ggggcgttgg cgattctaac 900

gttactactc tggctggtaa gatgggt 927

Claims (2)

1.瘤胃纤维素酶基因GH48HC1，其特征在于：所述的瘤胃纤维素酶基因GH48HC1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.瘤胃纤维素酶基因GH48HC2，其特征在于：所述的瘤胃纤维素酶基因GH48HC2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

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