CN113337591A - 一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法 - Google Patents
一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113337591A CN113337591A CN202110740585.0A CN202110740585A CN113337591A CN 113337591 A CN113337591 A CN 113337591A CN 202110740585 A CN202110740585 A CN 202110740585A CN 113337591 A CN113337591 A CN 113337591A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibiotic resistance
- data
- gene
- resistance gene
- sequencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 10
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000013506 data mapping Methods 0.000 claims description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 6
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001678070 Caballeronia Species 0.000 description 1
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 101000694320 Drosophila melanogaster RuvB-like helicase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中新型抗生素抗性基因的活性定量方法。具体包括以下步骤：1)从环境微生物样本中提取总DNA和RNA；2)DNA样品进行宏基因组测序；RNA样品进行宏转录组测序；3)通过对宏基因组测序以及宏转录组测序结果进行分析，识别新型抗生素抗性基因及其宿主，并对其活性进行定量。本发明的方法不依赖菌株分离培养，结合了宏基因组和宏转录组方法能够实现环境微生物样品中抗生素抗性基因的活性定量及其宿主鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中新型抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法。
背景技术
抗生素抗性基因(ARG)作为环境污染物，其传播和扩散已经成为威胁全球人类健康的重要问题。目前针对ARG的检测多数是针对已知的ARG，缺乏对新型ARG的鉴定和认识，造成了对环境中ARG类群的低估。以往针对ARG的定量检测主要通过PCR和宏基因组等技术在DNA水平进行ARG分析，忽视了ARG的表达活性问题。高度活跃表达的ARG对于人类的健康的威胁更大，亟需开发新的检测和分析方法以定量检测环境中ARG的表达水平。
以往对于环境微生物群体中抗性基因的活性定量检测主要借助QPCR技术，但该技术难以定位基因的宿主，无法在菌株水平(尤其对于环境中难分离培养的菌株)对抗性基因活性进行定量分析。
发明内容
针对以上问题，本发明联合应用宏基因组和宏转录组能够获得环境微生物群体的所有基因信息和表达量信息，能够实现新型抗性基因的分析、表达活性定量及宿主鉴定。
本专利开发了基于宏转录组和宏基因组的测序和分析方法，实现了环境中新型抗生素抗性基因的活性定量检测及其宿主定位。
本发明一个方面提供了一种微生物抗生素抗性基因的表达活性定量检测及其宿主定位方法，其包括以下步骤：
1)从环境样本中提取总DNA和RNA；
2)DNA样品进行宏基因组测序；RNA样品进行宏转录组测序；
3)通过对宏基因组测序以及宏转录组测序结果进行分析，识别抗生素抗性基因及其宿主，并对其活性进行定量；
步骤3)中，所述分析的方法包括以下步骤：
3-1)对宏基因组原始数据进行质控和过滤，并进行组装和分箱后获得单菌基因组；
3-2)去除相似度高的冗余基因组，并对剩余非冗余基因组进行物种注释；
3-3)对非冗余基因组中的CDS区进行预测，并将非冗余基因组中的CDS区整合为参考基因集，并对参考基因集进行注释，并比对目的抗性基因的参考序列，识别出目的抗性基因，根据3-2)中物种注释结果获得目的抗生素抗性基因的宿主的物种分类信息；
3-4)对宏转录组原始数据进行质控和过滤，并将处理后的数据映射到所述参考基因集上，获得对应基因的表达量数据。
在本发明的技术方案中，所述抗生素抗性基因的表达活性定量检测方法是针对环境样本中的微生物进行检测的方法。所述检测方法检测样本不来自于有生命的人体或动物体。
在本发明的技术方案中，所述抗生素抗性基因的表达活性定量检测方法是非诊断和治疗目的的。
在本发明的技术方案中，所述的环境样本选自来自于环境水体、土壤、沉积物的微生物样本。
在本发明的技术方案中，在步骤3-1)中，宏基因组原始数据分别通过FastQC和Fastp进行质控和过滤。
在本发明的技术方案中，在步骤3-1)中，使用软件metaSpades组装质控和过滤后的数据。
在本发明的技术方案中，在步骤3-1)中，使用软件Maxbin2、metaBAT和CONCOCT进行分箱，获得单菌基因组。
在本发明的技术方案中，在步骤3-2)中，使用软件drep去除冗余基因组。
在本发明的技术方案中，在步骤3-2)中，通过软件GTDB-Tk对非冗余基因组进行物种注释。
在本发明的技术方案中，在步骤3-3)中，通过软件prodigal对非冗余基因组中的CDS区进行预测。
在本发明的技术方案中，在步骤3-3)中，通过blast比对NR数据库注释参考基因集，通过blast比对目的抗性基因序列识别抗性基因。
在本发明的技术方案中，在步骤3-4)中，宏转录组原始数据分别通过FastQC和Fastp进行质控和过滤。
在本发明的技术方案中，在步骤3-4)中，通过软件Bowtie2进行数据映射，使用HTseq(v 0.13.5)从映射结果文件中获得基因表达量数据。
在本发明的技术方案中，在步骤3-4)中还包括，计算目的抗性基因基因在实验组之间的每两组数据中表达量差异倍数，通过DEseq2计算基因在两组宏转录组数据中表达量差异倍数和差异显著性。
有益效果
本发明的方法结合了宏基因组和宏转录组数据，通过分析对抗性基因的活性进行定量，并获得抗性基因的宿主信息。
附图说明
图1为比对上GMC氧化酶参考基因的序列比对信息结果。Per.ident为相似度，Acc.Len为序列长度。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1定量检测和数据分析方法
(1)样品采集及核酸提取
采集环境水体或土壤微生物样品，使用液氮速冻，在核酸提取之前保存于-80℃。
使用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)提取样品总DNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并使用Nanopdrop检测DNA浓度。
使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，美国)提取样品总RNA，并使用RNase-Free DNaseSet(QIAGEN，美国)消化残余的基因组DNA。提取后的核酸样品保存于-80℃。
(2)宏基因组测序和宏转录组测序
DNA样品通过Illumina NovaSeq(PE150)平台进行宏基因组测序，测序深度约10Gb。测序过程简述如下：通过超声波破碎仪(Covaris，美国)将DNA样品随机打断成350bp的片段；使用
UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，美国)试剂盒进行建库。
RNA样品通过Illumina NovaSeq(PE150)平台进行宏转录组测序，测序深度约10Gb。建库过程如下：富集mRNA后将RNA链随机打断，将RNA片段逆转录合成cDNA第一条链，以dUTP取代dTTP合成cDNA第二条链，随后进行末端修复，加尾并连接测序接头，最后利用USER酶消化掉cDNA第二链，同时对cDNA进行PCR扩增。
(3)数据分析-新型抗性基因的活性定量及其宿主定位
宏基因组原始数据通过FastQC(v 0.11.9)和Fastp(v 0.20.1)进行质控和过滤，使用metaSpades(v 3.13.2)组装过滤后的数据；使用Maxbin2(v 2.2.7)、metaBAT(v2.12.1)和CONCOCT(v 1.1.0)进行宏基因组分箱获得单菌基因组；使用drep(v 2.0.0)去除冗余基因组；通过GTDB-Tk(v 1.0.2)对基因组进行物种注释；使用prodigal(v 2.6.3)进行CDS预测，将所有非冗余基因组的CDS整合为参考基因集，通过blast比对NR数据库注释参考基因集；通过blast比对目的抗性基因的参考序列，识别抗生素抗性基因，blast比对阈值为：相似度≥95％，比对长度≥80。
宏转录组原始数据经过FastQC(v 0.11.9)和Fastp(v 0.20.1)质控和过滤后，使用Bowtie2(v 2.3.5.1)将过滤后的reads数据映射到宏基因组参考基因集，使用HTseq(v0.13.5)从映射结果文件中获得基因表达量数据；通过DEseq2计算基因在两个组中的表达量差异倍数(Fold Change，FC)。
实施例2氯霉素类抗生素新型抗性基因GMC氧化酶的活性定量检测及宿主定位
本发明已经成功应用于氯霉素类抗生素新型抗性基因GMC氧化酶基因的活性定量检测，发现在添加120mg/L氯霉素7h后能够使该基因在生物反应器菌群中的表达量提高了11.26倍，证实了该方法应用于新型抗生素抗性基因活性定量检测的可行性。
以经过长期培养的氯霉素抗性菌好氧富集反应器为研究对象。该反应器的以当地污水处理厂的活性污泥为初始菌群，利用无机盐培养基(KH2PO4，7.0g/L；Na2HPO4，0.67g/L；CaCl2，0.015g/L；MgSO4，0.097g/L；30mg/L，NH4Cl；MnSO4·H2O，1mg/L；FeSO4·7H2O，1mg/L；Na2MoO4·2H2O，0.25mg/L；CuCl2，0.25mg/L.)，并添加120mg/L氯霉素进行富集培养，培养温度25℃，120rpm振荡培养，每周更换培养基一次。经过长期富集培养后，分别在氯霉素加药前和加药7小时后采集微生物样品(每组三个生物平行样)，按照上述方法进行DNA和RNA提取、测序和数据分析。以一种之前发现的新型氯霉素耐药基因GMC为目标抗性基因，该基因序列请见SEQ ID NO.1，
ATGTGGCCGGCCGGCAAAGTCCTCGGCGGCGGCTCGTCGATCAACGGGATGATGTATGTTCGCGGCAATCGCGGCGATTATGATCAATGGGCTCAGCTCGGCTGCAAGGGCTGGTCCTATGACGACGTGCTTCCGTTCTTTAACAAGGCCGAGACGAACGAAAACGGCGGCTCGCGCTTTCGCGGCGACAAGGGCCCTCTGCGCGTATCGAATGCCCGCCTATCGACCACGTTGGCCGACGCATTCATCGCTTCTGGCGTACGTGCGGGGATTCCGCACAATCCGGATACCAACGGTGCCGAGCAAGAGGGTATCGGCCCCTGCCAAGCCACCCAGAACAAGGGTTGGCGACATTCAACGGCACGCGCCTATCTGGCCAAGGCGAAGCGCCGATCCAATCTGAAGGTCGAGACGCATTTCATGGTCAGTCGGGTACTGATCGAGAAAGGCCGCGCGATCGGCGTCGAAGGCGTTCAGAACGGGCGCACGGTTCGCTACTTGGCAAACAAGGAGGTCATTCTTTGCGGCGGCGCGTTGTCGTCGCCGAAAATATTGATGCTCTCGGGCATTGGCCCGGCAAAGCATCTTGGCGAGCATGGCATCCCTGTTGTCGTCGATTCCCCGGGAGTGGGGCAAAATCTGCAGGAACATCCCGGAGTGTTGATGTCGACCCATGTCGGCATCGATAGCCTCAATGTCGAAGTGCAAAGCGTCGCCAGGATAGTCAAGCATGGCTTGAACTTCGCTTTGTTTGGGCGAGGGCCAGCCACGGCATGCGTTGCCTCCGCTCTCGCGTTCATTCGCACGCGAGACCATCTCGAGTGGCCCAACATCCAACTGTCGTTCTCGCCGATCGCGTACGACTTCACGCCGGACGGCGTACACCTGTACAAGCGTGCGGCAATTGGCGTTGCCATCAACATCTGCCGGCCCGAGACGCGCGGTCAGTTGCTGCTCCGCTCCACCGATCCAAGTGAGCGGCCGATTATCCAACATGAGCTGCTCGGCGGAGATGATGAGATCAAGCAGCTCATCGAAGGATGCCGGATCGTGCGCAAGATTTTCCGTTCCAAGCCATTCAGTGAATATGACAAAGGTGAACGCTTACCCGGAAAGCAGGTCGAAACCGACGCTGATTGGATCGAGTATATCCGTCAGAGCGCCTTCCTGATGTACCACCCGACTGGCACTTGCGCGATGGGAATTGGGCCGACAGCGGTTCTCGATCCGGAGTTGCGCGTCAAGGGCGTCACCGGTCTTCGCGTTGCGGATGCCTCGATCATGCCGACGCTGGTTAGCGCGAATACAAATGCACCGTGCATCATGATTGGCGAACGGGCGGCCGATCTGATCCGAAGAAGCCACTGA SEQ ID NO.1。
通过blast比对，发现菌群中Sphingomonas和Caballeronia菌属携带有该抗性基因(图1)。与对照组相比，在添加氯霉素后该基因在Sphingomonas中表达量显著提高了12.23倍(p<0.001)，在Caballeronia中表达量显著提高了3.89倍(p<0.001)。该研究案例证实了本发明方法可以成功应用于抗生素抗性基因的表达活性定量，并且在不依赖微生物分离培养的条件下实现了目的抗性基因的宿主定位。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学深圳国际研究生院
<120> 一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿
主鉴定方法
<130> CP121010544C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtggccgg ccggcaaagt cctcggcggc ggctcgtcga tcaacgggat gatgtatgtt 60
cgcggcaatc gcggcgatta tgatcaatgg gctcagctcg gctgcaaggg ctggtcctat 120
gacgacgtgc ttccgttctt taacaaggcc gagacgaacg aaaacggcgg ctcgcgcttt 180
cgcggcgaca agggccctct gcgcgtatcg aatgcccgcc tatcgaccac gttggccgac 240
gcattcatcg cttctggcgt acgtgcgggg attccgcaca atccggatac caacggtgcc 300
gagcaagagg gtatcggccc ctgccaagcc acccagaaca agggttggcg acattcaacg 360
gcacgcgcct atctggccaa ggcgaagcgc cgatccaatc tgaaggtcga gacgcatttc 420
atggtcagtc gggtactgat cgagaaaggc cgcgcgatcg gcgtcgaagg cgttcagaac 480
gggcgcacgg ttcgctactt ggcaaacaag gaggtcattc tttgcggcgg cgcgttgtcg 540
tcgccgaaaa tattgatgct ctcgggcatt ggcccggcaa agcatcttgg cgagcatggc 600
atccctgttg tcgtcgattc cccgggagtg gggcaaaatc tgcaggaaca tcccggagtg 660
ttgatgtcga cccatgtcgg catcgatagc ctcaatgtcg aagtgcaaag cgtcgccagg 720
atagtcaagc atggcttgaa cttcgctttg tttgggcgag ggccagccac ggcatgcgtt 780
gcctccgctc tcgcgttcat tcgcacgcga gaccatctcg agtggcccaa catccaactg 840
tcgttctcgc cgatcgcgta cgacttcacg ccggacggcg tacacctgta caagcgtgcg 900
gcaattggcg ttgccatcaa catctgccgg cccgagacgc gcggtcagtt gctgctccgc 960
tccaccgatc caagtgagcg gccgattatc caacatgagc tgctcggcgg agatgatgag 1020
atcaagcagc tcatcgaagg atgccggatc gtgcgcaaga ttttccgttc caagccattc 1080
agtgaatatg acaaaggtga acgcttaccc ggaaagcagg tcgaaaccga cgctgattgg 1140
atcgagtata tccgtcagag cgccttcctg atgtaccacc cgactggcac ttgcgcgatg 1200
ggaattgggc cgacagcggt tctcgatccg gagttgcgcg tcaagggcgt caccggtctt 1260
cgcgttgcgg atgcctcgat catgccgacg ctggttagcg cgaatacaaa tgcaccgtgc 1320
atcatgattg gcgaacgggc ggccgatctg atccgaagaa gccactga 1368
Claims (10)
1.一种微生物抗生素抗性基因的表达活性检测及其宿主定位方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)从环境样本中提取总DNA和RNA；
2)对DNA样品进行宏基因组测序；对RNA样品进行宏转录组测序；
3)通过对宏基因组测序以及宏转录组测序结果进行分析，识别抗生素抗性基因及其宿主，并对其表达活性进行定量；
步骤3)中，所述分析的方法包括以下步骤：
3-1)对宏基因组原始数据进行质控和过滤，并进行组装和分箱后获得单菌基因组；
3-2)去除冗余基因组，并对非冗余基因组进行物种注释；
3-3)对非冗余基因组中的CDS区进行预测，并将非冗余基因组中的CDS区整合为参考基因集，并对参考基因集进行注释，并比对目的抗性基因的参考序列，识别出目的抗性基因，根据3-2)中物种注释结果获得目的抗生素抗性基因的宿主的物种分类信息；
3-4)对宏转录组原始数据进行质控和过滤，并将处理后的数据映射到所述参考基因集上，获得对应基因的表达量数据；
优选地，所述抗生素抗性基因的表达活性检测方法是针对环境样本中的微生物进行检测的方法。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-1)中，使用软件metaSpades组装质控和过滤后的数据。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-1)中，使用软件Maxbin2、metaBAT和CONCOCT进行分箱，获得单菌基因组。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-2)中，使用软件drep去除冗余基因组。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-2)中，通过软件GTDB-Tk对非冗余基因组进行物种注释。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-3)中，通过软件prodigal对非冗余基因组中的CDS区进行预测。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-3)中，通过blast比对NR数据库注释参考基因集，通过blast比对目的抗性基因序列识别抗性基因。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-4)中，通过软件Bowtie2进行数据映射，使用HTseq从映射结果文件中获得基因表达量数据。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤3-4)中还包括进一步计算目的抗性基因基因在实验组之间的每两组数据中表达量差异倍数的步骤，该步骤通过DEseq2计算基因在两组宏转录组数据中表达量差异倍数。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的环境样本选自来自于环境水体、土壤、沉积物的微生物样本。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110740585.0A CN113337591A (zh) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110740585.0A CN113337591A (zh) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113337591A true CN113337591A (zh) | 2021-09-03 |
Family
ID=77481923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110740585.0A Pending CN113337591A (zh) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113337591A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109929862A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-25 | 云南农业大学 | 一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法 |
| CN113943787A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-01-18 | 安徽医科大学 | 一种环境样本中抗生素抗性基因的高通量检测方法和系统 |
| WO2024066461A1 (zh) * | 2022-09-26 | 2024-04-04 | 华东理工大学 | 基于宏基因组和宏转录组识别油藏驱油功能微生物的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108804875A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-11-13 | 中国科学院北京基因组研究所 | 一种利用宏基因组数据分析微生物群体功能的方法 |
| CN109686408A (zh) * | 2018-04-19 | 2019-04-26 | 江苏先声医学诊断有限公司 | 一种鉴定耐药基因和/或耐药基因突变位点的宏基因组数据分析方法及系统 |
| CN110349629A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-10-18 | 广州赛哲生物科技股份有限公司 | 一种利用宏基因组或宏转录组检测微生物的分析方法 |
| CN112111502A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-22 | 清华大学深圳国际研究生院 | 氯霉素的新型抗性基因及其应用 |
| CN112951330A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-11 | 北京大学 | 一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法 |
-
2021
- 2021-06-30 CN CN202110740585.0A patent/CN113337591A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109686408A (zh) * | 2018-04-19 | 2019-04-26 | 江苏先声医学诊断有限公司 | 一种鉴定耐药基因和/或耐药基因突变位点的宏基因组数据分析方法及系统 |
| CN108804875A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-11-13 | 中国科学院北京基因组研究所 | 一种利用宏基因组数据分析微生物群体功能的方法 |
| CN110349629A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-10-18 | 广州赛哲生物科技股份有限公司 | 一种利用宏基因组或宏转录组检测微生物的分析方法 |
| CN112111502A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-22 | 清华大学深圳国际研究生院 | 氯霉素的新型抗性基因及其应用 |
| CN112951330A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-11 | 北京大学 | 一种基于宏组学技术从复杂环境体系中获知全程氨氧化微生物相对丰度和活性的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JONATHAN ASANTE等: "Understanding antimicrobial discovery and resistance from a metagenomic and metatranscriptomic perspective: advances and applications", ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY REPORTS, vol. 11, no. 2, pages 2 - 3 * |
| RENXIN ZHAO等: "Deciphering the mobility and bacterial hosts of antibiotic resistance genes under antibiotic selection pressure by metagenomic assembly and binning approaches", WATER RESEARCH, vol. 186, pages 1 - 2 * |
| 任广旭等: "肠道菌群与精准营养健康", 31 March 2019, 中国科学技术出版社, pages: 189 - 196 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109929862A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-25 | 云南农业大学 | 一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法 |
| CN113943787A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-01-18 | 安徽医科大学 | 一种环境样本中抗生素抗性基因的高通量检测方法和系统 |
| WO2024066461A1 (zh) * | 2022-09-26 | 2024-04-04 | 华东理工大学 | 基于宏基因组和宏转录组识别油藏驱油功能微生物的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113337591A (zh) | 一种基于宏转录组学和宏基因组学的环境中抗生素抗性基因的活性定量及宿主鉴定方法 | |
| Hazen et al. | Advances in monitoring environmental microbes | |
| CN105420375B (zh) | 一种环境微生物基因组草图的构建方法 | |
| Ahsanuddin et al. | Assessment of REPLI-g multiple displacement whole genome amplification (WGA) techniques for metagenomic applications | |
| CN111315884A (zh) | 测序文库的归一化 | |
| CN108138244A (zh) | 病毒组捕获测序平台、设计和构建方法以及使用方法 | |
| EP3612646A1 (en) | Nucleic acid characteristics as guides for sequence assembly | |
| Del Chierico et al. | Choice of next-generation sequencing pipelines | |
| CN111662959A (zh) | 一种真菌高通量快速检测方法 | |
| CN105925664A (zh) | 一种确定核酸序列的方法及系统 | |
| Toulza et al. | Environmental and evolutionary genomics of microbial algae: power and challenges of metagenomics | |
| Tripathi et al. | Metagenomics: Applications of functional and structural approaches and meta-omics | |
| JP7423101B2 (ja) | 細胞集団の処理方法および細胞集団に含まれる遺伝子の分析方法 | |
| Lee | The Principles and Applications of High-Throughput Sequencing Technologies | |
| CN103874766B (zh) | 分子检测测定 | |
| KR20230039090A (ko) | 머신러닝 모델을 이용한 하폐수처리공정 안정성 평가 방법 및 시스템 | |
| De Maayer et al. | The current state of metagenomic analysis | |
| Monod et al. | Quantifying trade-offs in the choice of ribosomal barcoding markers for fungal amplicon sequencing: a case study on the grapevine trunk mycobiome | |
| CN115627295B (zh) | 试剂盒及小布氏鲸物种鉴定方法 | |
| Sharma et al. | Metagenomic Applications of Wastewater Treatment | |
| CN113637782B (zh) | 与急性胰腺炎病程进展相关的微生物标志物及其应用 | |
| Debnath et al. | Metagenomics: a hunting expedition in microbial diversity | |
| Baum | New approaches and concepts to study complex microbial communities | |
| CN114561453A (zh) | 一种通过简并测序对目标样品定性分析或定量分析的方法 | |
| CN108513581B (zh) | 双链rna的片段化方法及其利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |