CN111909929B - 一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法。本发明通过差减杂交技术，获得里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下基因表达升高或降低的差异表达的cDNA文库，对里氏木霉的差减基因进行RNA干扰，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。

Description

一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法。

背景技术

里氏木霉的纤维素酶系包括两个外切纤维素酶、五个内切纤维素酶、一个b葡萄糖苷酶和三个裂解性多糖单加氧酶（lytic polysaccharides monooxygenases, LPMOs，即原GH61家族成员）。对这些纤维素酶的分泌表达的调控非常复杂，涉及到多个阶段，如转录、翻译、转运、蛋白折叠、胞外降解等，每个调控过程都涉及多种关键调控因子，但目前对这些调控因子的认识还非常欠缺。

里氏木霉的纤维素酶表达的转录调控、信号传导机制目前研究的还不清楚。基因调控涉及多个阶段，而里氏木霉中与纤维素酶活表达分泌密切相关的调控基因在哪个时期发挥调控作用并不清楚。

目前，在里氏木霉中发现新的调控基因、揭示新调控机制的方法多依赖于对木霉随机诱变菌株的组学分析，从中分析突变基因并进行功能基因组学验证。显然，由于诱变常常导致基因组上多个基因组座位发生突变，难以直接确定哪个基因发挥了关键的调控作用，如果对每个突变位点都进行分析则需要很大的工作量。此外，借鉴对其它物种中已鉴定功能的调控基因，对它们在里氏木霉中的同源基因进行功能基因组学的分析，也能发现一些里氏木霉中的调控基因，但显然这种方法只能研究同源基因，并不能发现全新的调控途径。

使用基因工程法建立微生物的突变体库，是一种有效的发现调控基因的办法。和上述提及的随机诱变所获得的突变体库不同，由于所构建的基因元件可方便的在工程菌中进行回溯，因此当得到理想的突变表型后，可快速的获取调控基因的信息。在一些转化效率高的生物体系中，可以通过基因工程方法，例如RNAi、CRISPR基因组编辑等方法，对全基因组范围内的基因进行缺失或沉默分析，从表型变化的菌株中获得调控基因的信息。然而，里氏木霉转化效率较低，一般每次转化数量为几十至几百个；对于具有工业应用价值的突变菌株来说，其转化效率更低，甚至每次转化只有几个到几十个。由于里氏木霉基因组包含上万个基因，因此这些转化子最理想情况下也只能对应于百分之一甚至千分之一水平上的基因，这样就导致上述建库方法并不适用于这些里氏木霉菌株。

如果能获得相对于全基因组而言数量较少的基因亚群，对这些基因亚群采用基因工程方法进行操作，由此构建并获得里氏木霉的突变体库并进行筛选和功能验证就有可能快速得到关于调控基因的信息。里氏木霉在纤维素、葡萄糖、甘油、纤维二糖、槐二糖和木聚糖等多种不同的培养基中纤维素酶的表达情况不一致，这说明纤维素酶的基因表达和转录水平在这些不同条件下是不一样的。在纤维素培养基上，里氏木霉产酶量相对是最强的，因此相对应有的调控基因在纤维素培养基上，和其它碳源的培养上相区别必然发挥着不同的重要作用；由于在纤维素培养基上有上千基因的表达发生了变化，目前尚没有对这些基因的系统性分析，因此哪些基因在纤维素培养基上发挥了调控作用并不明确。此外，有许多调控基因（例如分子伴侣pdi1、转运蛋白sso等）在纤维素培养基中其转录水平并未发生特别明显的变化，因此也无法通过简单分析纤维素培养基上转录水平发生上调或下调变化的基因就能预测它们参与了纤维素酶的表达调控。

本发明对里氏木霉在纤维素诱导培养基上转录水平发生变化的基因中是否包含调控基因进行了探索。SSH是一项可以快速获取两个mRNA群体中差异表达基因的分子生物学技术，是快速筛选差异表达基因的有效方法，也是寻找新基因的重要手段。在转录水平上研究基因表达的技术，可以获得低丰度差异表达基因，构建出一个差异表达的cDNA文库。

RNA干扰（RNAi）技术提供了一种快速、有效抑制目的基因表达的方法，通过设计，使得细胞合成双链RNA、发卡状RNA或反义RNA等，诱导细胞内产生和目的mRNA互补的单链小分子RNA，再介导DICER对目的mRNA的切割和降解，从而降低目的基因的表达水平。RNAi的一大特点是：受到RNA干扰的受体菌株，其被调控基因的表达正好具有从高到低的一系列表达水平，反映在生物性状上，具有连续性的特点，而不是如基因敲除，在性状上呈现有或无截然不同的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法。

根据本发明的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，包括以下步骤：

（1）构建里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下转录水平基因表达升高或降低的差异表达cDNA文库

（2）构建从步骤（1）所得cDNA文库中的差异表达cDNA的RNAi质粒，并转化入里氏木霉；

（3）诱导里氏木霉转化子，筛选维素酶酶活发生变化的转化子，确定纤维素酶调控基因。

根据本发明的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，在步骤（1）中，以在纤维素培养基中的cDNA作为参照，构建在葡萄糖中差异表达的cDNA文库；以葡萄糖培养基中的cDNA作为参照，构建在纤维素中差异表达的cDNA文库，从而获得里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下转录水平基因表达升高或降低的差异表达cDNA文库。

根据本发明的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，在步骤（2）中，将RNAi质粒转化入含红色荧光蛋白的里氏木霉菌株，可通过高通量筛选来获得“可提高纤维素酶酶活的”有效RNA干扰片段以及高产转化子。

根据本发明的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，所述差减基因SSH进行RNA干扰的质粒是以pAPA-tel为模板构建而成，将pdc1启动子、SSH差减杂交基因库片段和eno1启动子的片段串联拼接而成的。

根据本发明的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，所述纤维素酶调控基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明将RNAi和SSH技术相结合，首先使用SSH技术获得在诱导期间特异变化的基因亚群。以此富集的基因亚群为基础进行RNAi质粒库的构建，再对里氏木霉转化

本发明通过对里氏木霉的差减基因进行RNA干扰，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养5天后，其中酶活最高的一株转化子，其纤维素酶的CMC酶活46.2 U/mL，较出发菌株提高了4.2倍；对该菌株进行迭代进化，得到的转化子SUS4-SSH2 (G16) 酶活达75.6 U/ml，比出发菌株SUS4提高了6倍。

附图说明

图1显示 差减基因接头的扩增。

图2为RNAi的差显基因转化子FACS分选图，其中A：SUS4-SSH (A) 转化子FACS分选；B：SUS4-SSH (G) 转化子FACS分选。

图3显示 RNAi-SSH转化子第6 d EG活性及蛋白含量分析，其中，A: SUS4-SSH1(A) 转化子酶活及蛋白含量分析；B: SUS4-SSH1 (G) 转化子酶活及蛋白含量分析。

图4显示 RNAi-SSH转化子酶活及蛋白浓度测定。

具体实施方式

本发明通过差减杂交技术，获得里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下基因表达（转录水平上）升高或降低的差异表达的cDNA文库。设计引物，从里氏木霉TU-6的基因组DNA中扩增pdc1基因启动子片段、eno1启动子片段和cbh1终止子片段，同时将pAPA-tel质粒载体进行EcoRI的酶切，电泳回收四个片段。将这四个片段利用ClonExpress Ultra One StepCloning Kit进行一步同源重组，由于在引物设计时，加入了特殊的末端重叠序列，因此pAPA-tel和这三个外源片段可以通过无缝拼接连接起来，获得新的质粒pRNAi。挑取筛选平板上的阳性克隆，通过PCR及质粒测序的方法验证这三个片段和载体的连接。然后设计引物，再从差减突变体库中扩增差减基因片段，PCR产物回收后，将其连接至PacI和Bgl II双酶切的pRNAi质粒载体中，即得对差减基因进行RNA干扰的重组质粒pSSH-i。对里氏木霉的差减基因进行RNA干扰，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养5天后，其中酶活最高的一株转化子，其纤维素酶的CMC酶活46.2 U/mL，较出发菌株提高了4.2倍；对该菌株进行迭代进化，得到的转化子 SUS4-SSH2 (G16) 酶活达75.6 U/ml，比出发菌株SUS4提高了6倍。

实施例1 抑制性差减杂交技术获得里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下差异表达的cDNA文库

以Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kit做差减杂交实验。主要过程为将样品(tester)和对照(driver)的mRNA分别反转录并合成为双链cDNA后进行酶消化；样品(tester)分为两组，分别加上不同的adaptor1/2；再将两组样品(tester)分别与过量的对照(driver)杂交，两份杂交结果混合，加入过量的对照再进行第二轮杂交；补齐adaptor然后用PCR选择性扩增。由于过量的对照封闭了在样品中共同表达的基因，而在样品中特异表达的基因会被选择性地扩增出来，这些扩增的片断经过克隆 、测序后可以进行拼接或者用RACE的方法从已知片断钓全长cDNA，再做进一步的分析。

具体实验流程如下：

（1）提取总RNA

MP1-DsRed-SUS1(-pyr4)菌株，是将红色荧光蛋白基因和烟曲霉MP1的GPI结构域基因相融合，并将其置于cbh1启动子下构建所得的质粒转入SUS1中所得的转化子。由于MP1GPI锚定结构域的存在，该菌株可以在细胞表面展示红色荧光蛋白，由于cbh1启动子是主要的纤维素酶启动子，因此通过筛选荧光信号强的转化子可以得到高产纤维素酶的菌株。将该菌株的孢子接种于50ml MM-glucose中，28℃，培养2天后，目筛收集菌丝，无菌水冲洗2次，接等量的菌丝于50ml MM-Avicel（诱导性碳源）和MM-glucose（抑制性碳源）培养基中，再继续培养28h收集菌丝。Trizol法提取总RNA。经核酸定量分析仪检测Avicel培养基菌丝总RNA浓度1000ng/ul（Avicel）；Glucose培养基菌丝总RNA浓度2000 ng/ul。

（2）分离mRNA

总RNA中大多数RNA分子是tRNA和rRNA，而转录出的mRNA仅占总细胞RNA的1-5％，mRNA富集对于构建cDNA文库是必需的。通过减少不需要的rRNA和tRNA的量，大大增加了选择正确克隆的可能性。使用Oligotex mRNA Mini Kit 对mRNA进行纯化，纯化后mRNA浓度为200 ng/ul （Avicel）和100 ng/ul (Glucose)

（3）合成第一链和第二链cDNA

将两个mRNA群利用随机引物反转录为双链cDNA，分别合成第一链cDNA，和第二链cDNA。

（4）RsaI酶切

用四碱基识别酶RsaI(GTAC)将测试组和对照组cDNA切割成平均大小为600 bp左右的平端片段，可防止长链cDNA片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰，大大提高了片段的代表性，提高了基因克隆的效率。电泳检测得到的消化前双链cDNA和消化后的产物。未消化的cDNA约0.5-3kb，消化后条带略小于消化前条带，约0.1-2kb。

（5）连接cDNA末端接头

将测试组 cDNA分为两组，分别于其5'端上接上两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸、去磷酸化接头，以利于随后的选择性扩增。

（6）第一次杂交

应用两次消减杂交，将测试组cDNA片段均与过量对照组cDNA片段杂交，使差异表达基因的cDNA得到二次富集。第一次杂交中，将过量的对照组 cDNA分别加入两份测试组cDNA中，变性后退火杂交。两组测试组cDNA样品分别与过量的对照组 cDNA进行第一次杂交，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富集。

（7）第二次杂交

第一次杂交后，合并两份杂交产物，另加上新的变性对照组单链，再次杂交退火。在这一次杂交中，只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链测试cDNA能与drivercDNA一起形成各种双链分子。这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子，这种分子的两个5′端有两个不同的接头，正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效的扩增。

两轮抑制性PCR扩增

SSH方法通过它的两次特异性杂交和两次PCR特异性扩增使得假阳性率大大降低。两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR原理进行扩增，将两个长接头序列设计成内外两对引物，先用外侧那对引物进行PCR反应。结束反应，在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带。第二轮PCR再用内侧那对引物进行配对，可极大提高扩增的特异性。

实施例2 对差显基因进行RNA干扰的重组质粒pSSH-i的构建

以里氏木霉Tu-6的基因组DNA为模板，扩增pdc1基因启动子进行扩增。在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DNA。

设计差显基因二次扩增引物，该引物含有建库RNAi质粒的重复序列。以差减杂交获得的不同培养条件下差异表达cDNA文库为模板，以二次扩增引物对差减基因片段进行扩增。在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DNA。用该引物扩增差显基因，发现有明显的特异性扩增，如图1所示。

以里氏木霉Tu-6的基因组DNA 为模板，对正向的eno1启动子片段进行扩增。在1%琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化DNA。

以里氏木霉Tu-6的基因组DNA 为模板，扩增cbh1基因终止子进行扩增。

利用扩增获得pdc1启动子、差减基因片段、eno1启动子以及cbh1终止子，并于pdc1启动子和eno1启动子之间引入PacI和Bgl II酶切位点。将pAPA-tel质粒用EcoRI酶切，电泳、回收线性化质粒载体。将其与pdc1启动子、eno1启动子以及cbh1终止子同源重组，并转化大肠杆菌Trans I-T1感受态细胞对大肠杆菌菌落做菌落PCR，以鉴定三个片段是否已经连接到pAPA-tel上。将PCR鉴定为阳性的菌落挑取并接种于LB培养基上，振摇培养过夜，提取质粒。将重组质粒pAPA-tel-pdc1p-eno1p-cbh1t用PacI和Bgl II双酶切，回收酶切后的线性化大片段，将扩增的差减基因片段同源重组到线性化质粒上并转化大肠杆菌Trans I- T1感受态细胞，菌落PCR验证后，挑取阳性转化子，获得pSSH-i。

实施例3. 将pSSH-i转化入里氏木霉

本发明构建的pSSH-i，转入里氏木霉中，在双向启动子pdc1和eno1的驱动下转录得到mRNA，含有互补的两段干扰基因序列，经折叠可以形成发卡状双链RNA。发卡状双链RNA被体内的酶识别、切割形成小的单链RNA分子，它们和目的菌株中差减基因的mRNA互补并介导DICER对差减基因的mRNA的切割，从而抑制目的菌株差减基因的表达。

将里氏木霉mp1- DsRed -SUS1(-pyr4)接种于土豆培养基（PDA）平板上，30ºC静置培养7 d待其产孢，将孢子刮下并接种于MM-glucose培养基中，振摇培养过夜。过滤收集萌发的菌丝，加入10 mg/ml的Lysing enzymes（购自Sigma公司）消化。收集原生质体，将pSSH-i质粒以PEG介导的原生质体转化法将其转入里氏木霉mp1- DsRed -SUS1(-pyr4)菌株。

将转化子菌块挑至新的筛选培养基PDA上进行培养，培养至产孢，用无菌水冲洗平板上的孢子（所有转化子的孢子混合物），重悬混匀，200目筛过滤至无菌尖底离心管中，即为流式细胞仪分析及分选的孢子悬液，孢子浓度控制在10⁶至10⁸个孢子。

转化子孢子的分析使用流式细胞仪进行，样品压力设为1000 EPS（每秒分析1000个信号颗粒），利用前向角散射光面积和宽度图，去除粘连和杂信号，荧光信号使用488 nm激光激发，利用RFP表达的阴性对照菌株设定电压以分辨表达的孢子集群。根据阴阳性孢子的信号差别，设门圈定阳性孢子区域，所有样品的分析在相同的方法下进行。将荧光信号最强的孢子直接分选到含PDA的6孔板中，共分选了36个转化子，培养至产孢，流式分选图如图2所示。

将筛选出的转化子孢子接种于液体MM-glucose中，振摇培养。提取基因组DNA，通过PCR验证pSSH-i重组质粒是否已成功转化进入里氏木霉细胞，通过测序确定筛选出的红色荧光增强的转化子是通过干扰了何种差减基因所导致的酶活提高。

实施例4 转化子的诱导培养和纤维素酶活测定

转化子的诱导培养

将出发菌株mp1- DsRed -SUS1（-pyr4）的孢子和各转化子的孢子，接种MM-glucose培养基中，振摇培养，过滤收集菌丝并用大量无菌水冲洗，以去除残余的葡萄糖。

称取等量的菌丝，接种于MM-Avicel液体培养基中，出发菌株和每个转化子均做3个平行，振摇培养以诱导纤维素酶的生产。从第3 d开始，每12小时收集发酵液，储存于4 ºC冰箱备用。

内切纤维素酶酶活测定：采用羧甲基纤维素钠（CMC）作为底物进行测定。取500 mg羧甲基纤维素钠，用柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（0.05 M、pH 4.8）定容至50 ml，得到1%的羧甲基纤维素钠溶液。羧甲基纤维素钠溶液应立即使用，使用前适当摇匀。在4°C下避光保存，有效期为3天。在各试管中加入1％的羧甲基纤维素钠溶液1.5 ml，50°C水浴平衡后，加入酶液62.5 µl（空白先不加），振荡混合均匀。50°C水浴保温30 min，迅速冷却。向各试管中加入375 µl DNS试剂，再向空白中加酶液62.5 µl，混合均匀。在沸水中煮10 min，迅速冷却，。以0号管为参比，测定540 nm的吸光度。1 ml液体酶，在50°C、pH 4.8的条件下，每小时水解羧甲基纤维素钠，产生1 mg还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

以mp1-DsRed-SUS1（-pyr4）为对照菌株，对FACS筛选得到的转化子进行摇瓶发酵，取Avicel诱导培养6 d的发酵上清液，测定EG酶活及蛋白质浓度。如图3所示，大多数高通量筛选得到的RNAi-SSH转化子 在摇瓶发酵中的EG活性和胞外蛋白浓度比出发菌株mp1-DsRed-SUS1（-pyr4） (图中已用文字标注) 都要高。表明通过RNAi差异表达的基因，可以提高里氏木霉纤维素酶酶活并可以通过FACS高通量筛选出高酶活转化子。其中两个筛选库中酶活最高的转化子SSH (A23) 和SSH (G60) 的EG酶活分别为36.6和40.7 U/ml，如图4所示，图4中的“A”和“B”图，折线由上至下依次为SSH (G60)、SSH (A23)、mp1-DsRed-SUS1。

实施例6. 关键纤维素酶调控基因的分析

为了鉴定酶活提高的转化子中RNAi的差减基因片段，将转化子菌丝用BeadBeater破碎后提取基因组，PCR扩增转化子中RNAi的差显基因片段并测序分析。发现了基因在Avicel诱导条件下，转录水平下降，而在Glucose抑制条件下转录水平升高的基因。当该基因被RNAi后，转录水平降低，使得转化子酶活升高，为纤维素酶表达抑制型基因。该基因编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其基因序列如SEQ ID No：1所示。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3003

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichodermareesei)

<400> 1

atgtacctag caaccgacgc cgccattccg ccgccacaag ctcgtcgacc aactcaggag 60

cagcagcccg ccgccgtcga atgcattgag tgtcgccgca ggctgagccg gagcctgacc 120

cccgagcccg acgccgcgag gaggacacgc atagggggcg agagcgaggc ggcccctgta 180

gacgcggagg aggagtctga acccgagctc gatcgcgaca ccaggaggcc ccgggcccgg 240

agccggattt tggaggcact gtgcttcttg tctgctgccg gcggcgagag agcgtgcgct 300

gcgggcgcgg cacgacgacg aggcatgcag acggcaaagg ggaaggccga ggcgcaggga 360

cgaaaggcca agcttgccac ttcgtaccag gagcttctag acgaattctc gagcaaggac 420

ctcaagtctg ttggcaatta caccctcggc cgcctcattg gcaaaggctc ctttggcaag 480

gtctacctgg ccacccacaa gctcacgaat ggctccaagg ttgtcttgaa gtcggcgaac 540

cggaccgact ccaacctcgc ccgcgagatc caccaccacc gccagttcgt ccatccccat 600

attgccagat tgtacgaggt gatcgtgacg gagaacttgg tgtggatggt cctcgagtac 660

tgtgcaggtg acgagctcta taactatctg ctcgatcatg gccccctacc cgtggccaaa 720

gtgcaaaaga tatttgccca gctggtcggc gccgtcagct atgtccacat gcagtcatgt 780

gtccatcgcg atctgaagct cgaaaacatt ctcttcgaca cccatgaaaa cgtcaagctt 840

gtcgactttg gctttacgag agagtacgaa gggcggacga accacctaca gacgttttgc 900

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gacgatgatg acgacaatgt gacccgaacc aagatcctga cggaagaggc aaagtacccc 1080

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atctcggtgg cgtcgagtcg gttcgagcgg atgctgcagg acgtggacga ggatggtggt 1500

ctgacgaagc agtttatcag gctaggagaa cccgccatgc ccaggacccg cgggagaccg 1560

gaccgaagga gcgctcacta ctacgatctg gccatccacg acatgtcgta ctttacggag 1620

ggaggtcgtt cgaatggtcc gcagaccccc gatgaaaacg ggcgccatcg ttctattgac 1680

agccactcga tccgctcggt ctcgacaacg cgcaactatc gacccatccc gccgcctaag 1740

gagggcattc tgcgcagcgc cagatctcga ggatcgactc tacacctcgt caccaccacc 1800

gagtccctgg gcctgggcga ccacagcgct ccaccgagct cgcagcagca ggacgacagc 1860

agtctacaga aggcgaagaa gaagcctagt caagccatca tcgctcactg gaagaattgg 1920

acgcattggt tcttcgaaaa cacgaccaga aggcggcgcg ggcatgaacg acgcacaagt 1980

cggagcgtgc ctgatctgca caagaaagag ggtagcacca agagcagcaa tgatgtcagt 2040

cctaggccgc agacgagcaa gtaccctcac acgaaccccc ttggggccaa tgcaacggtt 2100

cccctgccca aaggggtcgt tgcgaacggc cacttgggga gggccaacgg gtcgtccagc 2160

tatggatctc tcaggggaag cgtaagcggg ccggtgggaa caccatctca gcatcccttg 2220

aggcctcaca tttctacgtc gcagccttat aagcgtcagt cactgtcacc atcgccattg 2280

acacctcggg ggacggttcg tcgctcatct gcaggcttgc ggggaagaaa gtcgacttcc 2340

tcttccgtat cttccgtccg gtcaatgcac caccatcatc acacccattc caaggcgtct 2400

tccaccagct caacgggctc cgtgtcaacg acgaaaacac cgctaggccg tggacagtca 2460

cctcaccact cggttaaggt tctccctgcg acgcccacgg gcactgcttt cccttcgaac 2520

attcgtcttg tccgcatgcc gccggtcaac tcctataacg agggtatgcc ttcagcccag 2580

ccacaagccc ctggttctcc caatccattt ggctcgggtg tcatgtttgc aaagaggaag 2640

aagaatattt tcaaggggcc gagtctcagc tttgggggcc ctcacggagc catgcgaaat 2700

ggggctggtg gttcccattc tcactcccgc agtggtagcg cctcggggct ggggcgccgg 2760

tcaggagaga ttaccattca agaggaggat gaagatcaca tgggaggtgt cgacgaggaa 2820

gagattgagg aggtggatgc ttttgggccc gtggtgggcg gccctgggga gattattgag 2880

gagcaaattc tcgaagacga ggcgacaacc cctacggcgg aggttcacag tccttcggcg 2940

atttccccca gaaacacgat tagtagccgc ataaatatcc ctcgggcgaa ggagaacgaa 3000

tga 3003

Claims (1)

1.纤维素酶调控基因用于提高里氏木霉纤维素酶酶活的应用，其特征在于，

所述纤维素酶调控基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；

所述纤维素酶调控基因被RNAi干扰后，转录水平降低，使里氏木霉转化子的纤维素酶酶活升高。

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