CN105779442B - 一种天然纤维素利用菌群的宏转录组rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，属于生物技术领域。所述提取方法的主要步骤如下：(1)采用Qiazol裂解液预处理收集的菌体；(2)结合珠磨匀浆破壁裂解菌体；(3)氯仿:异戊醇抽提分离RNA；(5)异丙醇沉淀获得RNA；(6)乙醇洗涤纯化RNA。本发明通过加入Qiazol裂解液结合玻璃珠混合匀浆强化细胞破壁，不仅使微生物细胞壁尽可能破碎，RNA分子完全释放，同时有效保证了过程的可重复性，进而保证了提取的宏转录组RNA片段完整性、纯度和菌群结构完整性。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
木质纤维素是自然界中产量最大的多糖物质，广泛存在于森林、草原和农田中。其产量丰富，价格低廉，而且多以农业和工业废弃物形式存在，是理想的生物能源类物质的生产原料。研究表明，以木质纤维素为原料的生物能源生产工艺不仅能够实现农业废弃物的再利用，而且可有效避免能源生产与粮食资源间的矛盾，成为最具潜力的生物能源工业化生产途径。
然而，由于木质纤维素组成复杂、结构致密，其水解为可利用糖的过程需要多种酶系的协同作用，导致利用成本居高不下。自然界中纤维素降解细菌菌群由多种细菌长期共生而成，能够快速高效地降解积累的大量木质纤维素。其中，木质纤维素降解菌能提供极为丰富的纤维素酶系和半纤维素酶系，而非纤维素降解菌株能提供的辅助因子，帮助纤维素快速降解。近年来的研究显示，利用菌群发酵纤维素有望实现一步法纤维素生物燃料的生产，进而较大程度的降低生产成本。因此，揭示天然菌群转化木质纤维素的作用机理，成为本领域研究的重要内容。
目前，已经建立了多种研究菌群作用机理的方法。其中，宏转录组测序是相对成熟的手段之一，已成功应用在多种菌群样品的结构分析之中，包括土壤、水体等环境样品和肠道菌群、瘤胃等功能样品。但是，由于纤维素菌群的自身特点，增加了其转因组RNA的提取难度，因此，尚未建立完善的纤维素菌群的宏转录组分析技术。
影响天然纤维素菌群宏转录组提取效果的因素主要包括如下三点：第一，纤维素菌群中的菌株多通过纤维小体结构与纤维素微丝紧密结合，以“纤维素-酶-菌体”的交联形式存在于发酵液中，这种交联会显著影响菌体的破壁和转录组提取，导致获得的RNA无法真实反映菌群基因表达情况，影响菌群转录组表达功能分析的准确性；第二，菌群发酵纤维素过程中会在细胞外积累大量的代谢产物，包括有机酸、有机醇和表面活性剂在内的多种物质，这些物质会对转录组提取试剂产生一定的干扰，影响RNA的提取效果；第三，菌群既包含革兰氏阴性菌又包含革兰氏阳性菌，还存在着大量的孢子，增加了RNA提取的难度。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，该方法的步骤如下：
1)收取纤维素发酵液，在7800g下离心5min后，收集菌体；
2)向步骤1)所得菌体中加入发酵液体积8％-10％的Qiazol裂解液，并混合均匀，将混合液转移到裂解管中，利用珠磨进行匀浆处理，匀浆处理的时间为10s，转速为4M/s，循环次数为2次，在将所得匀浆液转移到二乙基焦炭酸酯(DEPC)水处理过的EP管中；
3)在向步骤2)的EP管内加入样品等体积的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后，在室温下放置2-3min后，在4℃，15000g下离心15min；
4)向步骤3)离心所得的水相中加入等体积的异丙醇，室温放置10min后，在4℃，8000～12000g下离心10min；
5)向步骤4)离心所得上清液中加入70％体积的乙醇并混合均匀，在8000g下离心15s，取上清，重复2次，再用RNase-free的DEPC水溶解，获得宏转录组RNA。
优选地，步骤2)所述Qiazol裂解液为Qiagen公司产品号为79306的裂解液。
优选地，步骤2)所述珠磨，含有直径为1.4mm的陶瓷珠，0.1mm的硅珠和4mm的玻璃珠。根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤3)所述氯仿-异戊醇混合液，其中氯仿与异戊二烯的比例为24:1。
优选地，步骤5)所述乙醇的体积浓度为70％。
所述的提取方法的具体步骤如下：
1)收取10ml天然纤维素发酵液，在7800g条件下离心处理5min后，收集菌体；
2)向步骤1)所得菌体中加入900μL的Qiagen公司产产品号为79306的Qiazol裂解液，混合均匀后，将混合液转移到裂解管中，利用珠磨进行匀浆处理，匀浆处理的时间为10s，转速为4M/s，循环次数为2次，在将所得匀浆液转移到DEPC水处理过的EP管中；所述珠磨含有直径为1.4mm的陶瓷珠，0.1mm的硅珠和4mm的玻璃珠；
3)在向步骤2)的EP管内加入样品等体积的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后，在室温下放置2-3min后，在4℃，15000g下离心15min；所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊二烯的比例为24:1；
4)向步骤3)离心所得的水相中加入等体积的异丙醇，室温放置10min后，在4℃，8000～12000g下离心10min；
5)向步骤4)离心所得上清液中加入70％体积的乙醇并混合均匀，在8000g下离心15s，取上清，重复2次，再用RNase-free的DEPC水溶解，获得宏转录组RNA；所述乙醇为70％体积浓度的乙醇。
所述珠磨中的玻璃珠为MP Biomedicals公司，产品号116974025。
以上所述任一方法可以在提取天然菌群宏转录组RNA中的应用。
本发明获得的有益效果：
本发明通过在提取前加入Qiazol裂解液，结合珠磨匀浆破壁，不仅使微生物细胞壁更易破碎，RNA分子更易释放，同时有效保证了过程的可重复性，进而保证了提取的宏转录组RNA片段完整性、纯度和菌群结构完整性。
附图说明
图1为利用本发明提取方法与利用试剂盒法提取菌群1转录组的检测结果；
其中，a为利用本发明提取方法提取的检测结果；b为利用试剂盒法提取的检测结果。
图2为利用本发明提取方法与利用试剂盒提取菌群2转录组的检测结果；
其中，a为利用本发明提取方法提取的检测结果；b为利用试剂盒法提取的检测结果。
图3为利用本发明提取方法与利用试剂盒法提取菌群3转录组的检测结果；
其中，a为利用本发明提取方法提取的检测结果；b为利用试剂盒法提取的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用试剂、材料、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
Qiazol裂解液：Qiagen公司，产品号为79306。
玻璃珠：MP Biomedicals公司，产品号116974025
氯仿-异戊醇溶液比例为24：1(体积比)
70％乙醇为体积比
快速组织匀浆机为Master Prep。
实施例1纤维素利用菌群的宏转录组提取
一、天然纤维素利用菌群的筛选
将10g/L的木质纤维素原料与5g在纤维素富集地区采集的土壤样品共同加入富集培养基中，于55℃培养，通过连续传代培养，选择能够在连续传代过程中保持转化纤维素能力稳定的菌群1、菌群2和6株单菌复配的菌群3。
木质纤维素原料取自北方农村，土壤样品取自海南省五指山地区。
二、菌群宏转录组RNA提取
(1)收取10ml发酵液，7800g离心5分钟，收集菌体；
(2)向步骤(1)收集的菌体加入900μl Qiazol裂解液，混合均匀，
(3)将步骤(2)的混合液转移到2.5ml的Lysing Matrix E tube中，4M/s转速，珠磨匀浆处理10s x 2循环，将混合液转移到DEPC水处理过的EP管中；
(4)向步骤(3)获得样品加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，摇匀，室温放置2-3分钟，4℃12000g离心15min；
(5)向步骤(4)获得的水相，加等体积异丙醇，室温放置10分钟，4℃，10000g，离心10min；
(6)向步骤(5)获得的上清中加入70％体积的乙醇混匀，8000g离心15s，去上清，重复2次，用RNase-free的DEPC水溶解，即获得宏转录组RNA，-80℃保存。
实施例2
采用实施例1提供的取样方法进行取样，采用同样是机械破壁结合化学破壁的Mobio公司的Total RNA Isolation Kit对天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA进行提取。操作参照试剂盒说明书。
实施例3
采用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定实施例1与实施例2提取的宏转录组RNA浓度与纯度，结果如表1所示。
表1不同提取方法的NanoDrop测试结果
纯RNA的A260/A280理论值为2.
从表1中可以看出采用本专利的提取方法对3种菌群宏转录组提取之后所获得的RNA浓度和纯度更高。
采用Agilent 2100生物分析仪检测RNA浓度和完整度，以RNA完整性系数(RNAIntegrity Number,RIN)和23s/16s值判断提取的RNA完整性和纯度，操作参照仪器使用说明书，结果如图1所示。
从图1的结果可知，本发明提取方法对菌群1提取之后获得结果中23s/16s＝0.9,RIN＝8.9(图1a)；而试剂盒法为23s/16s＝0.1,RIN＝4.6(图1b)。本发明提取方法对菌群2提取之后23s/16s＝1.3,RIN＝8.4(图2a)；而试剂盒法：23s/16s＝0.8,RIN＝6.4(图2b)；本发明提取方法对菌群3提取之后23s/16s＝0.9,RIN＝9.3(图3a)；试剂盒法：23s/16s＝0.8，RIN＝9.1(图3b)；上述结果表明本发明法提取的转录组RNA特别是复杂纤维素菌群(1和2)的RNA较试剂盒法普遍具有更优的RIN系数和23s/16s值，即具有更好的RNA完整性，能更好的反映菌群转录组表达情况，更适合纤维素菌群的转录组测序和研究。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，其特征在于，步骤如下：
1)收取纤维素发酵液，在7800g下离心5min后，收集菌体；
2)向步骤1)所得菌体中加入发酵液体积8％-10％的Qiazol裂解液，并混合均匀，将混合液转移到裂解管中，利用珠磨进行匀浆处理，匀浆处理的时间为10s，转速为4M/s，循环次数为2次，再将所得匀浆液转移到DEPC水处理过的EP管中，所述Qiazol裂解液为Qiagen公司产品号为79306的裂解液；
3)再向步骤2)的EP管内加入样品等体积的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后，在室温下放置2-3min后，在4℃，15000g下离心15min；
4)向步骤3)离心所得的水相中加入等体积的异丙醇，室温放置10min后，在4℃，8000～12000g下离心10min；
5)向步骤4)离心所得上清液中加入70％体积的乙醇并混合均匀，在8000g下离心15s，取上清，重复2次，再用RNase-free的DEPC水溶解，获得宏转录组RNA。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤2)所述珠磨，含有直径为1.4mm的陶瓷珠，0.1mm的硅珠和4mm的玻璃珠。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤3)所述氯仿-异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的比例为24:1。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤5)所述乙醇的体积浓度为70％。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)收取10ml天然纤维素发酵液，在7800g条件下离心处理5min后，收集菌体；
2)向步骤1)所得菌体中加入900μL的Qiagen公司产产品号为79306的Qiazol裂解液，混合均匀后，将混合液转移到裂解管中，利用珠磨进行匀浆处理，匀浆处理的时间为10s，转速为4M/s，循环次数为2次，再将所得匀浆液转移到DEPC水处理过的EP管中；所述珠磨含有直径为1.4mm的陶瓷珠，0.1mm的硅珠和4mm的玻璃珠；
3)再向步骤2)的EP管内加入样品等体积的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后，在室温下放置2-3min后，在4℃，15000g下离心15min；所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的比例为24:1；
4)向步骤3)离心所得的水相中加入等体积的异丙醇，室温放置10min后，在4℃，8000～12000g下离心10min；
5)向步骤4)离心所得上清液中加入70％体积的乙醇并混合均匀，在8000g下离心15s，取上清，重复2次，再用RNase-free的DEPC水溶解，获得宏转录组RNA；所述乙醇为70％体积浓度的乙醇。
6.权利要求1-5任一项所述方法在提取天然菌群宏转录组RNA中的应用。
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