CN101796187A - 乳酸菌来源的双链rna - Google Patents
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Abstract
提供一种安全、且有效地吸收至细胞的免疫调节剂及其制备方法。进一步提供了乳酸菌来源的双链RNA、以乳酸菌来源的双链RNA为有效成分的免疫调节剂以及乳酸菌来源的双链RNA的制备方法。作为乳酸菌种类之一的四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属等菌体,可以在菌体中生产具有免疫调节作用的双链RNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌来源的双链RNA及其制备方法。
背景技术
生物体内的免疫系统在由细菌、酵母、霉、病毒等微生物产生的感染、对肿瘤的预防、变态反应的发病中发挥重要的作用。众所周之,在老化或应激、癌等疾病下该免疫系统的机能下降,为了预防微生物感染、抗肿瘤、预防变态反应等,寻求一种安全且价廉、高效的免疫调节剂。
众所周之,乳酸菌为有丰富的食用经验的且安全的微生物,而且,据报道其具有整肠作用、降低血清胆固醇作用、免疫激活作用和抗变态反应作用等免疫调节作用等各种功能性(例如,参照非专利文献1)。作为具有免疫调节作用的益生菌乳酸菌,作为市售的乳酸菌,可以列举属于链球菌(Streptococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌等。这些乳酸菌可以用于乳制品(酸乳酪、酸乳酪饮料等)的发酵。
以前,以乳酸菌为有效成分的免疫激活剂或抗变态反应剂等免疫调节剂是众所周之的(例如,参照专利文献1-12)。报告了作为以这些乳酸菌为有效成分的免疫调节剂的相关成分:细胞壁成分的肽聚糖(例如,参照非专利文献2)、脂磷壁酸(例如,参照非专利文献3)、脂蛋白(例如,参照非专利文献4)、核酸(例如,参照非专利文献5、6)、热休克蛋白(heat shockprotein)(例如,参照非专利文献7)等。
这些相关成分中,作为核酸成分有过报告的是,DNA的CpG基序(例如,参照非专利文献5)、AT基序(例如,参照非专利文献6)。
现在,作为托尔样(Toll-like)受体(以下称为“TLR”),已知人存在10种TLR。TLR为存在于细胞膜的一种蛋白质,识别细胞外的病原体等,通过向细胞内传递该信息,从而生产干扰素和细胞因子。
其中,已知TLR3识别病毒的双链RNA,诱导MyD88非依赖性干扰素β启动子的活化以及干扰素β的产生。而且,干扰素β活化树突状细胞,产生白细胞介素12、TNF等炎性细胞因子。进而,白细胞介素12诱导初始T细胞分化为1型辅助性T(Th1)细胞,从而确立细胞免疫。
双链RNA是指通常在RNA病毒中可特异性看到的结构。病毒感染宿主细胞内并利用宿主的系统进行病毒基因组的复制,此时,形成双链RNA。此外,也作为双链RNA病毒的基因组,存在双链RNA。
此外,虽然极少有报告,但是细菌在某应激条件下形成双链RNA是众所周之的。例如,在大肠菌中,通过铁离子枯竭应激合成RyhB这一低分子RNA。该低分子RNA形成了编码含有sodB mRNA的铁结合蛋白的mRNA和部分的碱基对,产生双链RNA(例如,参照非专利文献8)。但是,无法得知这些双链RNA是否具有免疫调节作用。此外,到目前为止,还没有报告在乳酸菌中存在双链RNA。
像上述那样,由于病毒的双链RNA介由TLR3诱导细胞免疫,作为免疫激活剂是优选的,但是,病毒本身作为免疫激活剂来利用,在安全性方面是不现实的,需要用于确保安全性的办法。
一个解决方案为利用确保了安全性的人工的双链RNA分子。实际上,作为人工的双链RNA分子的PolyI:PolyC由于具有干扰素诱导效果,自古以来作为抗癌剂和抗病毒药进行了研究。但是,通常用于生物体方面,必须是将需要的药物有效地吸收至细胞内的系统。例如,为了使PolyI:PolyC在人体内有效地起作用,需要进行脂质体制剂化(例如,参照非专利文献9)。
从这样的背景来看,寻求一种可以作为免疫激活剂加以利用、安全且有效地吸收至细胞的双链RNA。
专利文献1:日本特开平6-80575号公报
专利文献2:日本特开平9-227392号公报
专利文献3:日本特开平7-228536号公报
专利文献4:日本特开平10-167972号公报
专利文献5:日本特开平8-99887号公报
专利文献6:日本特开平5-252900号公报
专利文献7:日本特开2003-113114号公报
专利文献8:日本特开2004-26729号公报
专利文献9:日本特开2004-18469号公报
专利文献10:日本特开2000-95697号公报
专利文献11:日本特开平10-309178号公报
专利文献12:日本特开平9-2959号公报
非专利文献1:乳酸菌的科学和技术;学会出版中心(1996)
非专利文献2:Lawrence C.,and Nauciel C.:Infection andImmunity.1998,66,4947-4949.
非专利文献3:Cleceland M.G.et al.:Infection andImmunity.1996,64,1906-1912.
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非专利文献9:日経バイオテク552,5“日本新薬米国ご治験中の2重鎖核酸医薬PolyI:PolyC の用量アツプ”(日经生物技术552,5“日本新药提高在美国治疗中的双链核酸医药PolyI:PolyC的用量”)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题为提供一种具有免疫调节作用的、安全且有效地吸收至细胞的免疫调节剂及其制备方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题,重复进行关于具有免疫调节作用的乳酸菌及其菌体成分的研究,结果发现乳酸菌来源的双链RNA具有免疫调节作用。
此外,阐明:作为乳酸菌的一种的四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属等菌体在菌体中生产具有免疫调节作用的双链RNA。还发现:在酿造酱油中作为代表性的一种乳酸菌的四联球菌属通过在应激存在下培养,可以大幅增加具有免疫调节作用的双链RNA的含量。
即通过本发明,可以提供一种安全且廉价的免疫激活剂、抗变态反应剂等免疫调节剂。
即,本发明涉及以下内容。
(1)乳酸菌来源的双链RNA。
(2)根据上述(1)所述的乳酸菌来源的双链RNA,其特征在于,乳酸菌选自于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属中的1种或2种以上。
(3)根据上述(1)或(2)所述的乳酸菌来源的双链RNA,其特征在于,免疫调节作用为TRIF依赖性信号转换路径或MyD88依赖性信号转换路径的激活。
(4)根据上述(3)所述的乳酸菌来源的双链RNA,TRIF依赖性信号转换路径或MyD88依赖性信号转换路径的激活为托尔样(Toll-like)受体3(TLR3)的活化。
(5)一种以乳酸菌来源的双链RNA为有效成分的免疫调节剂。
(6)根据上述(5)所述的免疫调节剂,其特征在于,乳酸菌选自于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属中的1种或2种以上。
(7)一种乳酸菌来源的双链RNA的制备方法,其特征在于,通过在应激条件下培养乳酸菌,使菌体内生产双链RNA。
(8)根据上述(7)所述的乳酸菌来源的双链RNA的制备方法,其特征在于,乳酸菌为选自于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属中的1种或2种以上。
(9)一种乳酸菌来源的双链RNA的制备方法,其特征在于,通过在盐分0.5-25%的乳酸菌用培养基中培养属于四联球菌属的乳酸菌,使菌体内生产双链RNA。
附图说明
图1是表示由嗜盐四联球菌Th221株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图2是表示由嗜盐四联球菌Th221株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理的菌体带来的、脾脏悬浮细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图3是表示由嗜盐四联球菌Th221株菌体带来的、基因敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图4是表示由嗜盐四联球菌Th221株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图5是表示用牛胰腺来源的RNaseA(0M NaCl条件以及0.3M NaCl条件)处理经加热杀菌的乳酸菌悬浊液,从它们的菌体精制RNA成分,对获得的RNA成分进行琼脂糖凝胶电泳时的结果的图。用光密度计(densitometer)测定低分子RNA成分的结果在各线下方用数值表示。白三角形箭头:表示低分子RNA成分。黑箭头:表示用TRIzol处理无法除尽的Th221株保有的质粒DNA。
图6是表示由牛胰腺来源的RNaseA(0M NaCl条件以及0.3M NaCl条件)以及S1核酸酶处理的嗜盐四联球菌Th221株菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图7是表示由牛胰腺来源的RNaseA(0M NaCl条件以及0.3M NaCl条件)以及S1核酸酶处理的嗜盐四联球菌Th221株菌体带来的、骨髓来源的树突状细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图8是表示由牛胰腺来源的RNaseA(0M NaCl条件以及0.3M NaCl条件)以及S1核酸酶处理的嗜盐四联球菌Th221株菌体带来的、骨髓来源的树突状细胞的干扰素β产生促进试验的结果的图。
图9是表示由嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图10是表示由戊糖片球菌OS株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图11是表示由戊糖片球菌NRIC 1915株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图12是表示由植物乳杆菌NRIC 1930株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图13是表示由德氏乳杆菌保加利亚亚种NRIC 1688株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图14是表示由德氏乳杆菌赖氏亚种NRIC1683株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图15是表示由短乳杆菌NRIC1713株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图16是表示由嗜热链球菌NRIC0256株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图17是表示由假肠膜明串珠菌ATCC12291株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图18是表示由市售的养乐多(Yakult)(养乐多公司制)分离的分离株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图19是表示由市售的植物性乳酸菌Labre(拉布莱)(可果美公司制)分离的分离株菌体以及牛胰腺来源的RNaseA处理(无NaCl存在下以及0.3M NaCl存在下)的菌体带来的、腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图20是表示TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中各种乳酸菌的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图21是表示TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中各种乳酸菌的干扰素β产生促进试验的结果的图。
图22是表示由TRIF路径抑制剂存在下的嗜盐四联球菌Th221株菌体带来的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图23是表示TRIF路径抑制剂存在下的嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体带来的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图24是表示TRIF敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中嗜盐四联球菌Th221菌体的白细胞介素12产生促进试验的结果的图。
图25是表示用实时RT-PCR测定TLR3mRNA的表达量的试验的结果的图。
图26是表示用不同的盐浓度制备的嗜盐四联球菌Th221株菌体刺激骨髓来源的树突状细胞,用PE标记抗CD40抗体(BD Pharmingen公司制)、PE标记抗CD80抗体(BDPharmingen公司制)、PE标记抗CD86抗体(BD Pharmingen公司制)来分别检测细胞表面的活化标记CD40、CD 80、CD 86,用FACS Calibur(BD Pharmingen公司制)对此时的树突状细胞的活化状态进行测定,通过Cell Quest软件(BD Pharmingen公司制)分析后的结果的图。
图27是表示从在不同盐浓度的条件下培养的嗜盐四联球菌Th221株菌体纯化双链RNA成分,进行双链RNA成分的琼脂糖凝胶电泳,分析双链RNA的含量的结果的图。
图28是表示纯化双链RNA成分的白细胞介素12产生促进活性的测定结果的图。
图29是表示纯化双链RNA成分的干扰素β产生促进活性的测定结果的图。
图30是表示由合成双链RNA DSR1带来的、骨髓来源的树突状细胞的干扰素β产生促进活性的测定结果的图。
图31是表示TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中合成双链RNA DSR1的干扰素β产生促进活性的测定结果的图。
图32是表示由合成双链RNA的序列以及长度不同带来的、骨髓来源的树突状细胞产生干扰素β的测定结果的图。
图33是表示由合成双链RNA DSR2带来的、骨髓来源的树突状细胞产生干扰素β的测定结果的图。
图34是表示使用流式细胞仪FACS Aria(BD公司制)测定将进行了RNase处理的乳酸菌以及未进行处理的乳酸菌添加到骨髓来源的树突状细胞和CD4+T细胞且共培养时的干扰素γ产生细胞、白细胞介素4产生细胞的比例时的结果的图。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
(1)乳酸菌来源的双链RNA
生物体内的免疫系统对由细菌、酵母、霉、病毒等微生物引起的感染、对肿瘤的防御、变态反应的发病发挥了重要的作用,该防御机制的中心为淋巴细胞和抗原呈递细胞。淋巴细胞和抗原呈递细胞被抗原特异性、或者抗原非特异性活化,从而提高了排除异物的能力。
众所周之,在活化淋巴细胞和抗原呈递细胞方面,白细胞介素12作用于NK细胞和T细胞,诱导产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α,活化抗原呈递细胞,增强NK细胞以及CD8+T细胞的细胞障碍活性,与白细胞介素2协同作用且活化细胞障碍性淋巴细胞,同时,诱导淋巴因子激活杀伤细胞,使辅助细胞免疫的辅助性T细胞(Th0)向Th1型分化,控制该平衡(Th1/Th2平衡)。
这样,白细胞介素12在由天然免疫以及细胞免疫的强化而带来的感染防御、增强抗肿瘤活性等免疫激活活性且预防变态反应方面起重要作用。
本发明中,免疫调节作用是指激活免疫细胞的活性或抗变态反应活性。该免疫调节作用能够以来自抗原呈递细胞的白细胞介素12产生促进活性为指标进行评价。
白细胞介素12产生促进活性可以通过以下方式容易地判断:在组织培养皿内培养含有抗原呈递细胞的细胞例如小鼠腹腔渗出巨噬细胞、小鼠脾脏悬浮细胞或骨髓来源的树突状细胞,添加乳酸菌来源的含双链RNA物质并培养一段时间,通过用酶免疫测定法测定培养基中的白细胞介素12浓度来判断。
乳酸菌是指细胞形态为杆菌或球菌的革兰氏阳性菌。过氧化氢酶为阴性,其是指对于消耗的葡萄糖产生50%以上的乳酸、且不形成内生孢子的物质。亦有较少显示运动性的情况。具体而言,包括四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属等乳酸菌。
双链RNA是指核糖核苷酸和与其互补的核糖核苷酸形成碱基对的物质。具有免疫调节作用的双链RNA的存在可以通过确认以下(a)和(b)来证明。
首先,(a)通过用牛胰腺来源的RNaseA作用,确认降低了乳酸菌菌体的免疫调节作用。由此,可以证明RNA成分(单链RNA以及双链RNA)的存在和该成分有免疫调节作用。
在此基础上,(b)确认对免疫调节作用而言,识别单链RNA的TLR7不是必需的,而识别双链RNA的TLR3是必需的。
该方法使用TLR7缺失细胞以及TLR3缺失细胞来评价免疫调节作用,在TLR3缺失细胞中与使用正常细胞的情况相比较,只要确认到活性降低即可。
在此,代替(b),利用对牛胰腺来源的RNaseA的灵敏性的不同,(c)在0.3M以上的NaCl存在下,用牛胰腺来源的RNaseA作用,与无NaCl存在下作用的情况相比较,确认到免疫活性较高即可。其原因是在0.3M以上的NaCl存在下牛胰腺来源的RNaseA仅分解单链RNA,不分解双链RNA。
通过培养乳酸菌,使该菌体内生产本发明的乳酸菌来源的双链RNA。
乳酸菌是指,例如,属于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属等的菌株,更具体而言,是嗜盐四联球菌Th221株、嗜盐四联球菌NBRC12172株、戊糖片球菌OS株(NITE P-354)、戊糖片球菌NRIC1915株、戊糖片球菌NRIC0099株、戊糖片球菌NRIC0122株、植物乳杆菌NRIC1930株、植物乳杆菌NRIC1067株、德氏乳杆菌保加利亚亚种NRIC1688株、德氏乳杆菌赖氏亚种NRIC1683株、短乳杆菌NRIC1713株、戊糖乳杆菌NRIC0391株、戊糖乳杆菌NRIC0396株、戊糖乳杆菌NRIC1836株、干酪乳杆菌干酪亚种NRIC0644株、副干酪乳杆菌副干酪亚种NRIC1936、嗜热链球菌NRIC0256株、肠膜明串珠菌肠膜亚种NRIC1982株、假肠膜明串珠菌ATCC12291株、乳酸明串珠菌NRIC1582株等。
此外,作为本发明的一个例子的嗜盐四联球菌Th221株,在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心,于2007年6月25日保藏,保藏号为FERM AP-21310。
上述乳酸菌能够从酱油醪(soy sauce moromi mash)、咸菜、市售的乳酸菌饮料等分离而利用。只要菌体生产双链RNA,怎样培养乳酸菌都可以。
众所周之,在免疫调节作用所涉及的信号转换路径中,涉及许多因子。
TLR识别细菌等结构成分而产生的信号,在细胞内,介由作为衔接分子的MyD88(髓样分化因子)、TRIF(Toll样受体相关的干扰素活化子)、TIRAP等被转换,活化下游的NF-kB和MAPK。
因此,缺失TLR3的细胞中免疫调节作用降低的情况下,依赖作为该衔接分子的TRIF的信号转换路径成为与免疫调节作用相关的路径。此外,为证明信号转换路径依赖MyD 88,利用MyD88缺失细胞进行评价的情况下,显示免疫调节作用降低即可。
以免疫调节为目的而摄取本发明的乳酸菌来源的双链RNA时,该摄取量综合摄取者的症状和体型进行适当的设定即可。可以直接以乳酸菌菌体形式摄取乳酸菌来源的双链RNA,或将纯化的乳酸菌来源的双链RNA脂质体化并投与生物体。
摄取属于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属等的乳酸菌的菌体中包含的双链RNA时,该摄取的乳酸菌的菌体量为,例如,1-1000mg/体重60kg/日。
具有激活免疫细胞的活性的乳酸菌来源的双链RNA可以单独使用,也可以添加到饮食品、药品中。
(2)乳酸菌来源的双链RNA的制备方法
可以通过培养乳酸菌,使菌体内生产本发明的乳酸菌来源的双链RNA。例如,对选自于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属等中的1种或2种以上的乳酸菌进行培养,并通过收集含有双链RNA的培养物、菌体或菌体成分来获得。
只要菌体生产双链RNA,则乳酸菌的培养基以及培养条件就没有特别限定,但是,通过在应激条件下培养乳酸菌,可以使菌体内生产更多的双链RNA。在此,应激条件下是指高盐浓度、高温、少营养、低pH应激等。
尤其属于四联球菌属的乳酸菌的情况下,期待使用含有盐分0.5-25%、优选使用含有5-10%的培养基进行培养。盐分浓度为0.5%以下、或者25%以上的培养基中,由于属于四联球菌属的乳酸菌增殖极其缓慢,因此可以说没有实用性。
含有乳酸菌来源的双链RNA的乳酸菌培养物、乳酸菌菌体或乳酸菌菌体成分可以直接使用,也可以浓缩和纯化乳酸菌来源的双链RNA。从乳酸菌菌体浓缩和纯化双链RNA时,例如,可以实施如下方法。
首先,按照公知的方法从加热处理的乳酸菌菌体提取核酸成分。例如,或者使用玻璃珠等物理性粉碎菌体,或者使用溶菌酶等将乳酸菌菌体溶菌,之后,用酚-氯仿进行处理。此后,可以利用纤维素柱色谱法和对于牛胰腺来源的RNaseA的灵敏性的不同等进行纯化。
例如,在乙醇存在下将提取的核酸吸附在纤维素上,清洗后,用不含乙醇的缓冲液将经浓缩的乳酸菌来源的双链RNA成分溶出。对于该成分,在DNase处理以及仅切断单链RNA的条件(例如,0.3M NaCl)下用牛胰腺来源的RNaseA处理,可以纯化乳酸菌来源的双链RNA。
以下,例示属于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属的乳酸菌来源的双链RNA的制备方法。
四联球菌属例如接种在含有食盐0.5-25%、优选含有食盐5-10%的MRS培养基(BD公司制)中,属于片球菌属、乳杆菌属、链球菌属以及明串珠菌属的乳酸菌接种在通常的MRS培养基上,在25-37℃下培养24-72小时。这样获得的乳酸菌培养物和乳酸菌菌体含有双链RNA,而且,即使不进行脂质体制剂化等特别处理,也可以高效地吸收至细胞。
从乳酸菌培养物和乳酸菌菌体纯化双链RNA时,例如,按如下方法进行。将乳酸菌培养物和乳酸菌菌体加热杀菌之后,清洗乳酸菌菌体并悬浮在缓冲液中,添加溶菌酶在37℃下加热。之后,添加SDS(十二烷基磺酸钠)和蛋白酶K,在37℃下加热。此后,进行酚/氯仿/异戊醇处理,获得上清液。在此获得的粗核酸提取液为包含DNA、单链RNA、双链RNA的混合物。
接下来,采用纤维素柱色谱法纯化乳酸菌来源的双链RNA。对于粗核酸提取液,添加乙醇使最终浓度为15%。向该溶液添加纤维素粉末至最终浓度为5%,从而将双链RNA吸附于该纤维素粉末。
作为纤维素粉末,优选使用CF11纤维素粉末(Whatman公司制)。在15%乙醇存在下双链RNA比DNA以及单链RNA更强烈地吸附在纤维素粉末上。通过离心分离,吸附双链RNA的纤维素粉末可以作为沉淀物加以回收。
回收的纤维素,例如,再悬浮于含有15%乙醇的缓冲液中,将该悬浊液注入柱中。使含有15%乙醇的缓冲液通过该柱,冲洗乳酸菌来源的双链RNA以外的吸附成分。
吸附在纤维素柱的乳酸菌来源的双链RNA,可以采用将不含乙醇的缓冲液通过柱的方式加以回收。对通过以上处理获得的液体试样进行乙醇沉淀处理,可以获得乳酸菌来源的双链RNA。
由于用上述纤维素柱色谱法不能完全除去混入粗核酸提取液的DNA和单链RNA,因此优选进一步高度纯化。残存的DNA,例如,可以使用作为DNA分解酶的DNaseI(宝酒造公司制)分解除去。此外,在浓度为0.3M以上的NaCl存在下,残存的单链RNA可以使用RNA分解酶,例如,用牛胰腺来源的RNaseA(Sigma公司制)分解除去。之后,通过进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀,可以获得经纯化的乳酸菌来源的双链RNA。
纯化的乳酸菌来源的双链RNA可以经脂质体化投与生物体。
以下列举实施例进一步具体说明本发明,但本发明不限于以下实施例。
实施例1
<进行牛胰腺来源的RNaseA处理的嗜盐四联球菌Th221株菌体的白细胞介素12产生促进试验>
对经加热杀菌处理的嗜盐四联球菌Th221株菌体实施牛胰腺来源的RNaseA处理,使用小鼠腹腔渗出巨噬细胞以及脾脏悬浮细胞评价菌体悬浊液的白细胞介素12产生促进活性。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
在含有0.5%、5%、10%食盐的MRS培养基(BD公司制)中接种乳酸菌嗜盐四联球菌Th221株使其成为1×107个/ml。静置培养48-72小时后,在95℃下加热杀菌10分钟。此后,通过离心除去培养基进行集菌。用生理盐水清洗菌体后,使生理盐水中悬浮有1×109个/ml,制备乳酸菌悬浊液。
(2)牛胰腺来源的RNaseA处理
在上述乳酸菌悬浊液中添加牛胰腺来源的RNaseA(Sigma公司制)使其成为10μg/ml,在37℃下孵育1小时。之后,用生理盐水清洗菌体,再次使生理盐水中悬浮有1×109个/ml,制备乳酸菌悬浊液。
(3)腹腔渗出巨噬细胞的提取、制备
将2ml巯基乙酸盐(BD公司制)投与腹腔内,投与3日后从受刺激的小鼠(8周龄BALB/c,雄性,由Charles River公司购入)无菌提取腹腔渗出巨噬细胞。测定腹腔渗出巨噬细胞悬浮液的细胞数后,在RPMI完全培养基中制备以使细胞数为2×106/ml的浓度。RPMI完全培养基的组成如下:加有25mMHEPES、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酸的RPMI1640培养基(Gibco公司制)中添加10%灭活(56℃、30分钟)的1%胎牛血清(以下称为“FCS”。Invitrogen公司制)。在96孔组织培养皿中接种该制备完的腹腔渗出巨噬细胞液,使每一个孔为100μl。
(4)脾脏细胞悬浊液的制备
对在吸入异氟烷麻醉下将6周龄BALB/c小鼠(由JapanSLC,Inc.购入)颈椎脱臼进行安乐死,之后剖腹提取脾脏,将冰冷的加有1%FCS的RPMI1640培养基(Sigma公司制)放到培养细胞用的6cm培养皿中,放入脾脏。用剪刀将2个脾脏剪成碎片,与加有400U/ml胶原酶的基本培养基(10ml)一起加入到50ml塑料管(BD FALCON公司制)中,在恒温箱(37℃)内用搅拌器缓慢搅拌30分钟。
使用如下基本培养基:在加有青霉素(100,000U/L,明治制果公司制)、链霉素(100mg/L,明治制果公司制)、2-巯基乙醇(50μM,Gibco公司制)、L-谷氨酸(2mM,ナカライテスク公司制)、HEPES(20mM,同仁化学研究所公司制)的RPMI1640培养基中(Gibco公司制),添加10%的在56℃下灭活30分钟的FCS(Hyclone公司制)。将获得的细胞悬浊液以440×g离心5分钟,之后在加有1%FCS的RPMI1640培养基中清洗2次。
将细胞悬浮在加有1%FCS的RPMI1640培养基中,之后用细胞过滤网过滤,再在细胞过滤网上用10ml塑料注射器(Terumo公司制)的柱塞部分挤碎残留的细胞块,进行过滤。
将获得的细胞悬浊液离心并吸引除去上清液,加入5ml溶血缓冲液(0.155M NH4Cl、0.01M Tris-HCl pH7.5),置于冰上5分钟,之后加入FCS(5ml),静静悬浮,加入含有1%FCS的RPMI1640培养基(10ml),以400×g离心7分钟。进一步在加有1%FCS的RPMI1640培养基中清洗3次,之后在基本培养基中悬浮。细胞液使用细胞计数器来计算细胞数。经制备的脾脏悬浮细胞接种到96孔皿中使其为5.0×105细胞/0.2ml/孔。
(5)白细胞介素12产生促进活性的测定
混合如上所述获得的2种细胞悬浊液和牛胰腺来源的RNaseA处理前后的乳酸菌悬浊液以使细胞数∶乳酸菌数为1∶50,在37℃、5%二氧化碳培养器内共培养24小时。回收上清液,采用酶免疫测定法测定白细胞介素12的浓度。
酶免疫测定法中,用0.2M、pH6.0的磷酸缓冲液将大鼠抗小鼠白细胞介素12抗体(Pharmingen公司制)制成2μg/ml的溶液,将该溶液加入到96孔组织培养皿中使每一个孔为100μl,室温放置一晚,使用各孔粘附有大鼠抗小鼠白细胞介素12抗体的皿来进行。
加入培养上清液使每一个孔为100μl,在室温下放置90分钟,使培养上清液的小鼠白细胞介素12与粘附在皿中的大鼠抗小鼠白细胞介素12抗体结合。清洗后,加入大鼠生物素化抗小鼠白细胞介素12抗体(Pharmingen公司制),使其与小鼠白细胞介素12结合。
清洗后,加入用链亲合素标记的过氧化物酶(Vector公司制),结合生物素。
清洗后,加入TMB底物溶液(Moss/COSMO BIO co.,ltd.制)使每一个孔为100μl,室温反应20分钟,用0.5N盐酸停止反应,用酶标仪(Microplate Reader)测定450nm处的吸光度,用重组小鼠白细胞介素12(Pharmingen公司制)制成的校准曲线求得培养上清液中的白细胞介素12的浓度。
使用腹腔渗出巨噬细胞时的结果示于图1,使用脾脏悬浮细胞时的结果示于图2。任一种情况下用牛胰腺来源的RNaseA作用时菌体的免疫调节作用均降低。由此,表明了RNA成分(单链RNA以及双链RNA)的存在和该成分具有免疫调节作用。
此外,使用任一种细胞时,培养时培养基食盐浓度较高的菌体中,免疫调节作用大幅下降。由此,表明了培养时的培养基食盐浓度较高时,具有免疫调节作用的RNA成分的产量较多。
实施例2
<TLR3、TLR7、MyD88敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中嗜盐四联球菌Th221菌体的白细胞介素12产生促进试验>
由敲除了识别双链RNA的TLR3、识别单链RNA的TLR7、作为与免疫调节作用相关的信号转换路径的衔接分子的MyD88的小鼠,制备骨髓来源的树突状细胞,测定白细胞介素12产生促进活性。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
在含有0%、5%、10%食盐的MRS培养基中接种1×107个/ml乳酸菌嗜盐四联球菌Th221株。静置培养48-72小时,之后在95℃下煮沸杀菌10分钟。此后,通过离心浓缩机除去培养基并集菌。用生理盐水清洗菌体后,悬浮在生理盐水中使其为1×109个/ml,制备乳酸菌悬浊液。
(2)骨髓来源的树突状细胞的制备
使用野生型小鼠以及TLR3、TLR7、MyD88敲除的小鼠(6-12周龄C 57BL/6,雌性,由兵库医科大学分让)进行试验。在吸入异氟烷麻醉条件下进行颈椎脱臼,使其安乐死后,从下肢取出大腿骨、胫骨,将冰冷的加有1%胎牛血清(FCS,经灭活的物质)的RPMI1640培养基(Sigma公司制)加入到培养细胞用的6cm培养皿(BD FALCON公司制)中,放入大腿骨、胫骨。注入加有1%FCS的RPMI1640,挤出骨髓后,悬浮。
用细胞过滤网(40μm,BD FALCON公司制)过滤获得的细胞悬浊液,之后以440×g离心分离5分钟。
加入溶血缓冲液(5mL,0.155M NH4Cl,0.01M Tris-HClpH7.5),置于冰上5分钟,之后添加含1%FCS的RPMI1640(5mL)并离心分离,进一步用加有1%FCS的RPMI1640清洗2次。
加入用MACS电泳缓冲液分别将藻红蛋白(以下称为PE)标记抗I-A抗体(Clone M5/114.14.2,BD Pharmingen公司制,0.2mg/mL)、PE标记抗CD4抗体(Clone GK1.5,BD Pharmingen公司制,0.2mg/mL)以及PE标记抗CD 8抗体(Clone 53-6.7,BD Pharmingen公司制,0.2mg/mL)稀释1000倍而成的抗体混合物(100μL/107细胞)以及兔IgG(50μg/mL Zymed公司制),在冰上静置30分钟。
用MACS电泳缓冲液清洗1次,之后加入抗PE磁珠(20μL/107细胞,美天旎公司制)和MAC S电泳缓冲液(80μL/107细胞),在4-8℃下静置15分钟。
用反应液的20倍量的MACS电泳缓冲液清洗1次,然后悬浮在MACS电泳缓冲液(0.5mL/108细胞)中,使用自动磁分离系统(Auto MACS,美天旎公司制)分离阴性产物。
用加有1%FCS的RPMI1640培养基将经分离的细胞清洗1次,然后悬浮在加有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基本培养基中。
使用如下基本培养基:在加有青霉素(100,000U/L,明治制果公司制)、链霉素(100mg/L,明治制果公司制)、2-巯基乙醇(50μM,Gibco公司制)、L-谷氨酸(2mM,ナカライテスク公司制)、HEPES(20mM,同仁化学公司制)的RPMI1640培养基(Gibco公司制)中,添加10%的在56℃下灭活30分钟的FCS(Hyclone公司制)。
GM-CSF是在基本培养基中添加10%的导入了小鼠GM-CSF基因的浆细胞瘤X63-Ag8(J558L-GM-CSF)的培养上清液。在台盼蓝(Gibco公司制)中悬浮细胞液,用细胞计数器计算细胞数,然后在细胞培养用的6孔皿(BD FALCON公司制)中分注成1.2×106/4mL/孔,进行培养。
培养开始后第3日以及第6日吸引除去2mL培养基,添加2mL新的加有GM-CSF的基本培养基,培养开始后第8日将悬浮细胞作为未成熟树突状细胞进行回收(CD11c阳性细胞>95%)。在加有1%FCS的RPMI1640培养基中清洗3次细胞后,在基本培养基中悬浮,成为骨髓来源的树突状细胞悬浊液。
(3)白细胞介素12产生促进活性的测定
与实施例1同样进行。结果示于图3。
在TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中白细胞介素12产生促进活性降低,而TLR7敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中则无变化。由此,表明了具有免疫调节作用的RNA成分不是作为TLR7的配体的单链RNA,而是作为TLR3的配体的双链RNA。
此外,由于在TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中降低,所以表明了依赖于TLR3衔接分子即TRIF的信号转换路径与免疫调节作用有关。
在MyD88敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中,白细胞介素12产生促进活性消失。
由此表明,由含有双链RNA的嗜盐四联球菌Th221菌体带来的免疫调节作用中,TRIF依赖性信号转换路径和MyD88依赖性信号转换路径协调地发挥作用。
实施例3
<在仅切断单链RNA的条件(0.3M NaCl)下,牛胰腺来源的RNaseA处理的嗜盐四联球菌Th221菌体的白细胞介素12产生促进试验>
在嗜盐四联球菌Th221株菌体中,利用对牛胰腺来源的RNaseA的灵敏性不同,确认了生产具有免疫调节作用的双链RNA。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
在含10%的盐的MRS培养基中接种嗜盐四联球菌Th221株使其为1×106个/ml。静置培养72小时,然后在95℃下加热杀菌10分钟。从样品中提取2个成分,一个成分用10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗,另一个成分用含有0.3M NaCl的10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗,之后悬浮在各自液体中。制备悬浊液以使OD600nm的值为10。
(2)牛胰腺来源的RNaseA处理
向上述乳酸菌悬浊液中添加牛胰腺来源的RNaseA(Sigma公司制)使其为10μg/ml,在37℃下孵育2小时。在该酶处理中,在无NaCl存在下单链RNA和双链RNA两者均被分解,在0.3MNaCl存在下,仅单链RNA被分解。酶处理后,分别用10mMTris-HCl(pH8.0)以及含有0.3M NaCl的10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗2次,然后在RPMI完全培养基中悬浮。制备悬浊液并使OD600nm的值为0.125。
(3)腹腔渗出巨噬细胞的提取、制备
与实施例1同样进行。
(4)白细胞介素12产生促进活性的测定
与实施例1同样进行。
结果示于图4。在无NaCl存在下进行酶处理的样品中,白细胞介素12产生促进活性大幅降低,但是在0.3M NaCl存在下进行酶处理的样品中,白细胞介素12产生促进活性的降低较少。由此,表明了双链RNA成分具有白细胞介素12产生促进活性。
(5)确认菌体中的RNA被分解
通过对经加热杀菌的乳酸菌悬浊液进行RNaseA处理,采取如下方法确认菌体内的RNA被分解。
将以下样品<1>到<3>的样品,<1>经加热杀菌的乳酸菌、<2>加热杀菌后在10mM Tris-HCl(pH8.0)下经RNaseA处理的乳酸菌、<3>加热杀菌后在含有0.3M NaCl的10mM Tris-HCl(pH8.0)下经RNaseA处理的乳酸菌分别悬浮在2.5ml的STE缓冲液(100mM NaCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA(pH8.0))中。这里,添加0.25ml 50mg/ml的溶菌酶,在37℃下孵育30分钟。
此后,添加50μl的STE缓冲液、0.15ml的10%SDS、15μl的20mg/ml的蛋白酶K,在37℃下孵育1小时。向其中添加3ml的氯仿/异戊醇,混和并离心,回收上清液。
之后,添加等量的酚/氯仿/异戊醇并混和,离心回收上清液。该操作进行2次。添加0.6当量的异丙醇使沉淀,然后悬浮在5ml的TRIzol(Invitrogen公司制)中。添加1ml的氯仿,混和并离心,回收上清液。此后,添加2.5ml的异丙醇,放置10分钟后,通过离心并回收沉淀,从而获得RNA成分。对这些RNA成分进行琼脂糖凝胶电泳。
结果示于图5。RNA主要以低分子状态存在(白三角形箭头)。此外,也检测出用TRIzol处理无法除尽的Th221株保有的质粒DNA(黑箭头)。用光密度计测定低分子RNA成分,结果得到图5所示的数值,通过RNaseA处理经加热杀菌的乳酸菌悬浊液,可以确认菌体内的RNA被分解。
实施例4
<切断单链核酸的S1核酸酶处理的嗜盐四联球菌Th221菌体的白细胞介素12产生促进试验>
在实施例3的利用对牛胰腺来源的RNaseA的灵敏性不同的试验的基础上,进行切断单链核酸的S1核酸酶处理试验,来确认在嗜盐四联球菌Th221株菌体中双链结构作为具有免疫调节作用的核酸结构的必要性。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
在含有10%的盐的MRS培养基中接种嗜盐四联球菌Th221株使其为1×106个/ml。静置培养72小时后,在95℃下加热杀菌10分钟。样品分成3个部分,第1部分用10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗,第2部分用含有0.3M NaCl的10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗,第3部分用S1核酸酶缓冲液(30mM醋酸钠pH4.6,280mMNaCl,1mM ZnSO4)清洗,然后,悬浮在各自的液体中。制备悬浊液以使OD600nm的值为10。
(2)牛胰腺来源的RNaseA处理以及S1核酸酶处理
在第1部分以及第2部分中添加牛胰腺来源的RNaseA(Sigma公司制)使其为10μg/ml,在37℃下孵育2小时。在第3部分中添加S1核酸酶(宝酒造公司制)使其为2000U/ml。酶处理后,用各自的酶处理缓冲液清洗2次,此后在RPMI完全培养基中悬浮。制备悬浊液以使OD600nm的值为0.125。
(3)腹腔渗出巨噬细胞的提取、制备以及骨髓来源的树突状细胞的制备
腹腔渗出巨噬细胞的提取、制备与实施例1同样进行。骨髓来源的树突状细胞的制备与实施例2同样进行。
(4)白细胞介素12产生促进活性的测定
腹腔渗出巨噬细胞的白细胞介素12产生促进活性的测定与实施例1同样进行。结果示于图6。在无NaCl存在下经RNaseA处理的样品中,白细胞介素12产生促进活性大幅降低,但是,在0.3M NaCl存在下经RNaseA处理的样品以及S1核酸酶处理的样品中,未发现白细胞介素12产生促进活性降低。
骨髓来源的树突状细胞的白细胞介素12产生促进活性的测定与实施例2同样进行。结果示于图7。在无NaCl存在下RNaseA处理的样品中,白细胞介素12产生促进活性大幅降低,但是,在0.3M NaCl存在下RNaseA处理的样品以及S1核酸酶处理的样品中,未发现白细胞介素12产生促进活性降低。
此外,还测定了干扰素β,该干扰素β据报道参与白细胞介素12的产生。骨髓来源的树突状细胞的干扰素β产生促进活性(培养6小时,使用PBL公司制干扰素β测定试剂盒)如图8所示。
由这些结果可知,双链结构作为具有免疫调节作用的核酸结构很重要。
实施例5
<各种乳酸菌体中双链RNA的生产>
利用对牛胰腺来源的RNaseA的灵敏性不同来确认在嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体、戊糖片球菌OS株菌体、戊糖片球菌NRIC1915株菌体、植物乳杆菌NRIC1930株菌体、德氏乳杆菌保加利亚亚种NRIC1688株菌体、德氏乳杆菌赖氏亚种NRIC1683株菌体、短乳杆菌NRIC1713株菌体、嗜热链球菌NRIC0256株菌体、假肠膜明串珠菌ATCC12291株菌体、市售的养乐多(养乐多公司制)分离株菌体、植物性乳酸菌Labre(可果美公司制)分离株菌体中生产具有免疫调节作用的双链RNA。
而且,通过乳酸菌鉴定试剂盒API50CH(日本生物梅里埃公司制),养乐多分离株鉴定为乳杆菌属副干酪种副干酪亚种、植物性乳酸菌Labre分离株鉴定为乳杆菌属短杆菌种或乳杆菌属丘状种。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
在含有10%的食盐的MRS培养基中接种嗜盐四联球菌NBRC12172株,在通常的MRS培养基中接种其他株,均为1×106个/ml。嗜盐四联球菌NBRC12172株静置培养72小时,其他株静置培养48小时,此后,在95℃下加热杀菌10分钟。从样品收集2个部分,一个部分用10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗,另一个部分用含有0.3M NaCl的10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗,然后,悬浮在各自的液体中。制备悬浊液以使OD600nm的值约为10。
(2)牛胰腺来源的RNaseA处理
在上述乳酸菌悬浊液中添加牛胰腺来源的RNaseA(Sigma公司制)使浓度为10μg/ml,在37℃下孵育2小时。在该酶处理中,在无NaCl存在下单链RNA和双链RNA两者均被分解,在0.3M NaCl存在下,仅单链RNA被分解。
酶处理后,分别用10mM Tris-HCl(pH8.0)以及含有0.3MNaCl的10mM Tris-HCl(pH8.0)清洗,此后悬浮在RPMI完全培养基中。制备悬浊液以使OD600nm的值为0.125。
(3)腹腔渗出巨噬细胞的提取、制备
与实施例1同样进行。
(4)白细胞介素12产生促进活性的测定
与实施例1同样进行。
嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体的结果示于图9,戊糖片球菌OS株菌体的结果示于图10,戊糖片球菌NRIC1915株菌体的结果示于图11,植物乳杆菌NRIC1930株菌体的结果示于图12,德氏乳杆菌保加利亚亚种NRIC1688株菌体的结果示于图13,德氏乳杆菌赖氏亚种NRIC1683株菌体的结果示于图14,短乳杆菌NRIC1713株菌体的结果示于图15,嗜热链球菌NRIC0256株菌体的结果示于图16,假肠膜明串珠菌ATCC12291株菌体的结果示于图17,由市售的养乐多(养乐多公司制)分离的分离株菌体的结果示于图18,由植物性乳酸菌Labre(可果美公司制)分离的分离株菌体的结果示于图19。
任何一种情况下,在无NaCl存在下经酶处理的样品中,白细胞介素12产生促进活性大幅下降,但是,在0.3M NaCl存在下经酶处理的样品中,白细胞介素12产生促进活性的降低较少。由此,表明了双链RNA成分具有白细胞介素12产生促进活性。
实施例6
<在TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中各种乳酸菌的白细胞介素12产生促进试验>
从敲除了识别双链RNA的TLR3的小鼠中制备骨髓来源的树突状细胞,测定白细胞介素12产生促进活性,从而确认在戊糖片球菌NRIC0099株菌体、戊糖片球菌NRIC1915株菌体、戊糖片球菌NRIC0122株菌体、戊糖乳杆菌NRIC0391株菌体、戊糖乳杆菌NRIC0396株菌体、干酪乳杆菌干酪亚种NRIC0644株菌体、植物乳杆菌NRIC1067株菌体、戊糖乳杆菌NRIC1836株菌体、植物乳杆菌NRIC1930株菌体、副干酪乳杆菌副干酪亚种NRIC1936、乳酸明串珠菌NRIC1582株菌体、肠膜明串珠菌肠膜亚种NRIC1982株菌体中也生产具有免疫调节作用的双链RNA。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
在MRS培养基中接种各种乳酸菌使其成为1×107个/ml。在30℃下静置培养48-72小时后,在95℃下煮沸杀菌10分钟。此后,采用离心浓缩机除去培养基并集菌。用生理盐水清洗菌体后,在基本培养基中悬浮并制备。
(2)骨髓来源的树突状细胞的制备
与实施例2同样进行。
(3)白细胞介素12产生促进活性的测定
与实施例2同样进行。结果示于图20。表明:在TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中白细胞介素12产生促进活性降低,因此,作为TLR3的配体的双链RNA具有免疫调节作用,图20所示的菌体内生产双链RNA。
本试验还测定了干扰素β,该干扰素β据报道参与白细胞介素12的产生。骨髓来源的树突状细胞的干扰素β产生促进活性(培养6小时,使用PBL公司制干扰素β测定试剂盒)如图21所示。
实施例7
<在TRIF路径抑制剂存在下的嗜盐四联球菌的白细胞介素12产生促进试验>
对嗜盐四联球菌Th221株菌体以及嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体,测定在TRIF路径抑制剂存在下的白细胞介素12产生促进活性。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
在含有10%食盐的MRS培养基中接种嗜盐四联球菌Th221株菌体以及嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体使成为1×106个/ml。静置培养72小时后,在95℃下加热杀菌10分钟。用生理盐水清洗菌体后,悬浮在RPMI完全培养基中。制备悬浊液使OD600nm的值为0.25、0.125。
(2)TRIF路径抑制剂的添加
已知TBK1(激酶)与TRIF相互作用,并将转录因子IRF-3磷酸化。按如下方法将已知阻碍该TBK1活性的白藜芦醇添加到乳酸菌悬浊液中。用DMSO(二甲基亚砜)溶解白藜芦醇(Sigma公司制)并使其为20mM、10mM、5mM、2.5mM。此外,作为对照也仅准备DMSO。将这些白藜芦醇溶解液添加到菌体悬浊液中使其为1%(v/v)。
(3)腹腔渗出巨噬细胞的提取、制备
与实施例1同样进行。
(4)白细胞介素12产生促进活性的测定
与实施例1同样进行。菌体和细胞的共培养液中的白藜芦醇浓度为终浓度100μM、50μM、25μM、12.5μM、0μM。
嗜盐四联球菌Th221菌体的结果示于图22,嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体的结果示于图23。任何一种情况下,白细胞介素12产生促进活性依赖白藜芦醇浓度而降低。由此,表明了通过嗜盐四联球菌Th221株菌体以及嗜盐四联球菌NBRC12172株菌体带来的白细胞介素12产生促进是由TRIF依赖性信号转换路径的激活而产生的。
实施例8
<TRIF敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中嗜盐四联球菌Th221菌体的白细胞介素12产生促进试验>
从TRIF敲除小鼠制备骨髓来源的树突状细胞,该TRIF是作为免疫调节作用所涉及的信号转换路径的衔接分子,从而测定白细胞介素12产生促进活性。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
嗜盐四联球菌Th221株用含有10%食盐的MRS培养基进行培养,与实施例1同样地制备乳酸菌悬浊液。
(2)骨髓来源的树突状细胞的制备
与实施例2同样地进行制备。
(3)白细胞介素12产生促进活性的测定
与实施例1同样地进行。结果示于图24。
TRIF敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中,白细胞介素12产生促进活性降低。由此,表明了通过嗜盐四联球菌Th221株菌体带来的白细胞介素12产生促进与TRIF依赖性信号转换路径的激活有关。
实施例9
<在嗜盐四联球菌Th221株菌体的白细胞介素12产生促进试验中TLR3mRNA的表达>
在嗜盐四联球菌Th221株菌体的白细胞介素12产生促进试验中,用实时RT-PCR法测定TLR3mRNA的表达。
(1)乳酸菌悬浊液的制备
乳酸菌嗜盐四联球菌Th221株用含有10%食盐的MRS培养基进行培养,与实施例1同样地制备乳酸菌悬浊液。
(2)腹腔渗出巨噬细胞的提取、制备
与实施例1同样地制备。
(3)TLR3mRNA的实时RT-PCR
细胞悬浊液和乳酸菌悬浊液的共培养与实施例1同样进行。共培养24小时后,除去上清液,用PBS清洗。向其中添加200μl TRIzol(Invitrogen公司制),在微量离心管(Eppendorftube)中回收样品。添加40μl氯仿,搅拌和离心后,回收水层,向其中添加等量的氯仿。搅拌离心后,回收水层,添加1.7倍量的异丙醇,混和。在4℃、12,000rpm下离心,之后回收沉淀,用70%乙醇清洗后,溶解于DEPC水(Ambion公司制),作为用于实时RT-PCR的模板。
作为TLR3的PCR正向引物,
使用5’-GAGGGCTGGAGGATCTCTTTT-3’(序列号1),
作为PCR反向引物,
使用5’-CCGTTCTTTCTGAACTGGCCA-3’(序列号2)。
作为内部标准使用β肌动蛋白,作为PCR正向引物,
使用5’-GCTACAGCTTCACCACCACAG-3’(序列号3)、
作为PCR反向引物,
使用5’-GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3’(序列号4)。
使用SYBR ExScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time宝酒造公司制),按照所附说明进行实时RT-PCR并分析。
结果示于图25。
通过与嗜盐四联球菌Th221株菌体共培养,TLR3mRNA的表达增加10倍。即,表明了通过嗜盐四联球菌Th221株菌体带来的白细胞介素12产生促进是由TLR3的活化而产生的。
实施例10
<嗜盐四联球菌Th221株菌体来源的双链RNA的制造、含有双链RNA的菌体的制造>
在400ml含有10%食盐的MRS培养基(BD公司制)中接种嗜盐四联球菌Th221株使其成为1×106个/ml。静置培养72小时后,在95℃下加热杀菌10分钟。之后,通过离心除去培养基并集菌。将该菌体悬浮于5ml的STE缓冲液(100mM NaCl,10mMTris-HCl,1mM EDTA(pH8.0)中。
向其中添加1ml 50mg/ml的溶菌酶,在37℃下孵育30分钟。
此后,添加0.1ml的STE缓冲液、0.3ml的10%SDS、30μl的20mg/ml的蛋白酶K,在37℃下孵育1小时。向其中添加6ml的氯仿/异戊醇,混和离心,回收上清液。
之后,添加等量的酚/氯仿/异戊醇并混和,离心回收上清液。该操作进行2次。添加0.6当量的异丙醇使其沉淀,然后,溶解于10ml的TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA)中。
对于该粗核酸提取液,添加乙醇并使乙醇的最终浓度为15%,充分混和。添加CF11纤维素粉末(Whatman公司制)并使最终浓度为5%,在冰中温和振荡10分钟,使双链RNA吸附在纤维素粉末上。吸附双链RNA的纤维素粉末可以通过离心分离(3,000×g,4℃,5分钟)作为沉淀来回收。被回收的纤维素再悬浮于15%乙醇/STE缓冲液、pH8.0中,得到的悬浊液注入Econopak柱(BioRad公司制)中。使100ml的15%乙醇/STE缓冲液pH8.0通过该柱,洗脱双链RNA以外的吸附成分。吸附在纤维素柱上的双链RNA可以通过以下方式获得:使不含乙醇的10ml STE缓冲液通过柱,对获得的液体试样进行乙醇沉淀,从而可以获得双链RNA。
为了除去该试样中残存的DNA,首先,进行DNaseI(宝酒造公司制)处理。接着,为了除去单链RNA,在0.3M的NaCl存在下进行牛脾脏RNaseA(Sigma公司制)处理。之后,进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀,从而可以获得纯化双链RNA。获得的纯化双链RNA可以进行脂质体化并投与生物体。
实施例11
<骨髓来源的树突状细胞的活化测定试验>
双链RNA含量依赖乳酸菌的培养盐浓度而提高时,认为利用添加乳酸菌,通过骨髓来源的树突状细胞的TLR3路径产生干扰素β,从而影响细胞的活化状态。
用在不同盐浓度下制备的嗜盐四联球菌Th221株菌体刺激骨髓来源的树突状细胞,测定此时的树突状细胞的活化状态。
用与实施例1同样的方法制备嗜盐四联球菌Th221株菌体。由BALB/c小鼠提取骨髓细胞,然后,用与实施例2同样的方法获得骨髓来源的树突状细胞。
用与实施例1同样的方法共培养骨髓来源的树突状细胞和乳酸菌。共培养24小时后,回收骨髓来源的树突状细胞,调查细胞表面的活化标记。
具体而言,分别用PE标记抗CD40抗体(BD Pharmingen公司制)、PE标记抗CD80抗体(BD Pharmingen公司制)、PE标记抗CD86抗体(BD Pharmingen公司制)检测CD40、CD80、CD86的各个活化标记。细胞用FACS Calibur(BD Pharmingen公司制)测定,通过Cell Quest软件(BD Pharmingen公司制)进行分析。
各活化标记的表达量依赖嗜盐四联球菌Th221株的培养盐浓度而增加。因此,认为嗜盐四联球菌Th221株菌体内的双链RNA含量依赖盐浓度而增加。结果示于图26。
实施例12
<嗜盐四联球菌Th221株菌体内的双链RNA含量>
从实施例11的结果来看,认为嗜盐四联球菌Th221株菌体内的双链RNA含量依赖培养时的盐浓度而增加。因此,由不同盐浓度的条件下培养的菌体纯化双链RNA成分,调查含量。
用与实施例1同样的方法进行嗜盐四联球菌Th221株菌体的培养、加热杀菌、集菌。将该菌体悬浮于STE缓冲液中进行制备,以使OD600nm的值为80。之后,为了判断由于实验操作而引起的回收率的偏差,将各个样品分成3份平行进行。用与实施例3的(5)同样的方法获得粗核酸提取液,对于该粗核酸提取液,通过TRIzol处理(Invitrogen公司制,按照所附说明处理)获得RNA成分,接下来,通过S1核酸酶处理(宝酒造公司制,按照所附说明处理)进行单链核酸的分解而获得双链RNA成分。对这些双链RNA成分进行琼脂糖凝胶电泳,调查含量。
结果示于图27。可以确认嗜盐四联球菌Th221株菌体内的双链RNA含量依赖培养时的盐浓度而增加。
实施例13
<嗜盐四联球菌Th221株来源的双链RNA的纯化和免疫调节活性的测定>
纯化从嗜盐四联球菌Th221株来源的双链RNA成分,对其中几个成分进行测序,测定免疫调节活性。
作为免疫调节活性,测定骨髓来源的树突状细胞的白细胞介素12产生促进活性。或者,由于已知干扰素β作为与白细胞介素12产生有关的细胞因子之一,因此,测定骨髓来源的树突状细胞的干扰素β产生促进活性。
(1)嗜盐四联球菌Th221株来源的双链RNA成分的纯化
从10L嗜盐四联球菌Th221株的培养液开始纯化。与实施例10同样地进行培养、加热杀菌、集菌、溶菌、氯仿/异戊醇处理、酚/氯仿/异戊醇处理、异丙醇沉淀,获得粗核酸提取液。
对于该粗核酸提取液,进行TRIzol处理(Invitrogen公司制,按照所附说明处理),DNase处理(宝酒造公司制,按照所附说明处理),在0.3M NaCl存在下的RNaseA处理(Sigma公司制,用与实施例3同样的方法进行处理),再次TRIzol处理(Invitrogen公司制,按照所附说明处理),RNeasyMini-RNase-Free DNase Set(QIAGEN公司制,按照所附说明处理),RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司制,按照所附说明处理)处理,获得双链RNA成分。
(2)纯化双链RNA成分的白细胞介素12产生促进活性的测定
对上述(1)中纯化的双链RNA成分测定白细胞介素12产生促进活性。与实施例2同样地制备骨髓来源的树突状细胞。
向骨髓来源的树突状细胞添加纯化双链RNA成分,在37℃的5%二氧化碳培养器内共培养24小时。与实施例1同样地测定白细胞介素12产生促进活性。
结果示于图28。白细胞介素12产生促进活性依赖纯化双链RNA成分的浓度而提高。
此时,也测定了干扰素β,该干扰素β据报道参与白细胞介素12的产生。结果示于图29。从骨髓来源的树突状细胞的干扰素β产生促进活性(培养6小时,使用PBL公司制干扰素β测定试剂盒)依赖纯化双链RNA成分的浓度而提高。
(3)cDNA克隆
从纯化双链RNA成分来合成cDNA时按照Lambden等的方法(J.Virol,1992,66,1817-1822)进行。合成的cDNA克隆到pCR4Blunt-TOPO载体中,转化大肠菌HB101。获得约60个克隆,对其中2个克隆的碱基序列进行测序时,为像以下那样的序列。
DSR1(46mer):
5’-AAATTTTCAAAAACCTGTTTTGCTTCTTCTAAAAATCCAATTGAAA-3’(序列号5)
DSR2(119mer):
5’-AAAAAATTACCTTTTTCTATTCGTGAGAAAATTTCTCAAGCCGACAAGTATCATAAAAAATTTGCTTTTGAACACTTTTTGAAGGTGTTTCTCTATGGCATCGATCATGAGTGTGAAAG-3’(序列号6)
(4)双链RNA DSR1的干扰素β产生促进活性
干扰素β据报道为参与白细胞介素12产生的细胞因子。因此,测定骨髓来源的树突状细胞的干扰素β产生促进活性。
双链RNA DSR1委托Gene Design Inc.来合成。
与实施例2同样地制备骨髓来源的树突状细胞。向骨髓来源的树突状细胞添加合成RNA,在37℃的5%二氧化碳培养器内共培养6小时。使用PBL公司制的干扰素β测定试剂盒来测定干扰素β产生促进活性。
调查双链合成RNA的浓度依赖性的应答,结果示于图30。活性依赖于双链合成RNA的浓度而提高。
此外,使用野生型以及TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞进行调查,结果示于图31。结果显示在TLR3敲除小鼠的骨髓来源的树突状细胞中,干扰素β产生促进活性下降,因此,双链合成RNA介由TLR3产生干扰素β。
(5)将DSR1分成3份而成的短的双链RNA的干扰素β产生促进活性
不仅双链RNA DSR1,将DSR1分成3份而成的短的双链RNA(S1、S2、S3)也委托Gene Design Inc.来合成。S1、S2、S3分别为以下那样的序列。
S1(18mer):从DSR1的第1个碱基到第18个碱基
5’-AAATTTTCAAAAACCTGT-3’(序列号7)
S2(15mer):从DSR1的第18个碱基到第32个碱基
5’-TTTTGCTTCTTCTAA-3’(序列号8)
S3(15mer):从DSR1的第32个碱基到第46个碱基
5’-AAAATCCAATTGAAA-3’(序列号9)
与实施例2同样地制备骨髓来源的树突状细胞。向骨髓来源的树突状细胞添加合成RNA,在37℃的5%二氧化碳培养器内共培养6小时。使用PBL公司制干扰素β测定试剂盒来测定干扰素β产生促进活性。
结果示于图32。根据序列以及长度,发现干扰素β量不同,但是,可以确认由于双链合成RNA,骨髓来源的树突状细胞产生干扰素β。
(6)双链RNA DSR2的干扰素β产生促进活性
双链RNA DSR2通过以下方式合成。首先,制作2种PCR扩增反应物,该PCR扩增反应物在DSR2 DNA的5’端或者3’端添加了T7RNA聚合酶的启动子区域。
使用鸟枪克隆法克隆了嗜盐四联球菌Th221株基因组,将包含DSR2区域的质粒作为模板。实际上使用的引物如下:
T7DSR2F(50mer):
5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAAAAAATTACCTTTTTCTATTCGT-3’(序列号10)
DSR2C(24mer):
5’-CTTTCACACTCATGATCGATGCCA-3’(序列号11)
DSR2F(24mer):
5’-AAAAAATTACCTTTTTCTATTCGT-3’(序列号12)
T7DSR2C(50mer):
5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCTTTCACACTCATGATCGATGCCA-3’(序列号13)
PCR产物使用MERmaid Kit(MP Biomedical制),按照所附说明纯化。将其作为模板,由T7RNA聚合酶而进行体外转录(使用宝酒造公司制in vitro Transcription T7Kit,按照所附说明实施)。
合成的转录物质使用mirVana miRNA Isolation Kit纯化,基于摩尔数进行退火操作,从而形成双链RNA。将用乙醇沉淀而纯化的物质用于以后的试验。
与实施例2同样地制备骨髓来源的树突状细胞。向骨髓来源的树突状细胞添加合成RNA,在37℃的5%二氧化碳培养器内共培养24小时。使用PBL公司制的干扰素β测定试剂盒来测定干扰素β产生促进活性。
结果示于图33。表明了由于双链合成RNA DSR2,骨髓来源的树突状细胞产生干扰素β。
实施例14
<乳酸菌的RNA对干扰素γ产生细胞的诱导的影响>
在共培养骨髓来源的树突状细胞和CD4+T细胞的试验中,添加乳酸菌时,根据是否进行菌体的RNaseA处理,从而确认了对干扰素γ产生细胞的诱导产生怎样的影响。
在含有10%食盐的MRS培养基中培养嗜盐四联球菌Th221株菌体。与实施例1同样地进行RNaseA处理的菌体以及未进行处理的菌体的制备。与实施例2同样地进行骨髓来源的树突状细胞的制备。
此外,从DO11.10小鼠的脾脏来制备CD4+T细胞。提取DO11.10小鼠的脾脏后,利用网孔粉碎,获得脾脏细胞。此后,与抗小鼠CD4珠(Miltenyi)孵育30分钟,通过Auto MACS(Miltenyi),获得CD4+T细胞。
在96孔皿中,每1个孔为1×106个骨髓来源的树突状细胞和5×105个CD4+T细胞,进行培养。同时,添加5×107个经RNaseA处理的乳酸菌以及未进行处理的乳酸菌。
培养开始第3日更换培养基,第7日使用流式细胞术FACSAria(BD公司制),调查干扰素γ产生细胞、白细胞介素4产生细胞的比例。测定使用抗小鼠干扰素γ抗体(BD Pharmingen)和抗小鼠白细胞介素4抗体(BD Pharmingen)。
结果示于图34。由于嗜盐四联球菌Th221的刺激,干扰素γ产生细胞的比例增加。并且,由于菌体的RNaseA处理,抑制了干扰素γ产生细胞的诱导。因此,确认了乳酸菌的RNA与干扰素γ产生细胞的诱导有关。
序列表
<110>龟甲万株式会社(Kikkoman Corp.)
独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology)
增田郁子(Masuda,Ikuko)
金子大辅(Kaneko,Daisuke)
川岛忠臣(Kawashima,Tadaomi)
辻典子(Tsuji,M Noriko)
小坂朱(Kosaka,Akemi)
<120>乳酸菌来源的双链RNA
<130>FP2989PCT
<150>JP 2007/175694
<151>2007-07-04
<150>JP 2007/299243
<151>2007-11-19
<160>13
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>1
gagggctgga ggatctcttt t 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>2
ccgttctttc tgaactggcc a 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>3
gctacagctt caccaccaca g 21
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>4
ggtctttacg gatgtcaacg tc 22
<210>5
<211>46
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>5
aaattttcaa aaacctgttt tgcttcttct aaaaatccaa ttgaaa 46
<210>6
<211>119
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>6
aaaaaattac ctttttctat tcgtgagaaa atttctcaag ccgacaagta tcataaaaaa 60
tttgcttttg aacacttttt gaaggtgttt ctctatggca tcgatcatga gtgtgaaag 119
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>7
aaattttcaa aaacctgt 18
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>8
ttttgcttct tctaa 15
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>9
aaaatccaat tgaaa 15
<210>10
<211>50
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>10
gatcactaat acgactcact atagggaaaa aattaccttt ttctattcgt 50
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>11
ctttcacact catgatcgat gcca 24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>12
aaaaaattac ctttttctat tcgt 24
<210>13
<211>50
<212>DNA
<213>嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400>13
gatcactaat acgactcact atagggcttt cacactcatg atcgatgcca 50
Claims (9)
1.乳酸菌来源的双链RNA。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌来源的双链RNA,其特征在于,乳酸菌为选自于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属中的1种或2种以上。
3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌来源的双链RNA,其特征在于,免疫调节作用为TRIF依赖性信号转换路径或MyD88依赖性信号转换路径的激活。
4.根据权利要求3所述的乳酸菌来源的双链RNA,其特征在于,TRIF依赖性信号转换路径或MyD88依赖性信号转换路径的激活为托尔样(Toll-like)受体3(TLR3)的活化。
5.一种以乳酸菌来源的双链RNA为有效成分的免疫调节剂。
6.根据权利要求5所述的免疫调节剂,乳酸菌为选自于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属中的1种或2种以上。
7.一种乳酸菌来源的双链RNA的制备方法,其特征在于,通过在应激条件下培养乳酸菌,从而使菌体内生产双链RNA。
8.根据权利要求7所述的乳酸菌来源的双链RNA的制备方法,其特征在于,乳酸菌为选自于四联球菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属中的1种或2种以上。
9.一种乳酸菌来源的双链RNA的制备方法,其特征在于,通过在盐分0.5-25%的乳酸菌用培养基中培养属于四联球菌属的乳酸菌,从而使菌体内生产双链RNA。
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