CN102935238A - 一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用及其制备方法。制备方法为：通过RNA酶消化法或柱层析法从酵母总RNA中分离制得小分子dsRNA群，即酵母M-dsRNA。酵母M-dsRNA可以刺激细胞的天然免疫，激活TLR3的信号通路，从而抑制肿瘤。本发明可用于制备防癌、抗癌及抗病毒医学健康保健品。本发明制备方法简便，易操作。

Description

一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用及其制备方法。

背景技术

Toll样受体(Toll-like Receptors，TLRs)是一类进化中序列高度保守的天然免疫受体大家族。TLRs能特异地识别病原相关的分子模式(Pathogen AssociatedMolecular Patterns，PAMPs)，不仅在激活天然免疫中发挥重要的作用，而且还调节获得性免疫，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。

TLRs是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLRs可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。

目前，在哺乳动物及人类中已经发现的人TIRs家族成员有11个。根据染色体的位置、基因结构和氨基酸序列，人的TLRs受体可以分为5个亚科，即TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9。TLR2亚科有TLR1、TLR2、TLR6和TLR10；TLR9亚科有TLR7、TLR8和TLR9；TLR3、TLR4和TLR5各自形成一个亚科。

TLR如同天然免疫的眼睛，监视与识别各种不同的疾病相关分子模式(PAMP)，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。其中TLR4可以识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)，还可识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(Heat-ShockProteins，HSP)，体内类肝素硫酸盐和透明质酸盐降解的多糖部分以及局部的内源性酶的级联活化反应也可激活TLR4。TLR2的配体较TLR4的广泛，包括脂蛋白、脂多肽、脂壁酸(LTA)、阿拉伯甘聚糖(LAM)及酵母多糖等。TLR5可以识别鞭毛蛋白，鞭毛蛋白是目前发现的TLR5的惟一配体。具有鞭毛蛋白的L型细菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门菌等可被TLR5识别。TLR7识别咪喹啉家族低分子量的咪唑莫特、R-848和R-847等。TLR9识别细菌的CpG-DNA(含有胞嘧啶-鸟嘌呤模体的未甲基化DNA片段)，激活B细胞和APC的免疫刺激特性。

TLR3特异识别病毒复制的中间产物双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，从而激活NF-κB和干扰素IFN-β前体。Doyle S E等证实，抗TLR3单克隆抗体能抑制成纤维细胞IFN-β的产生。ChristopherA等证实TLR3还具有调控鼻病毒对人支气管细胞感染的能力，这也说明了TLR3在宿主抵抗活病毒中发挥重要的作用。TLR3表达于免疫细胞和某些非免疫细胞如皮肤角质化细胞、纤维母细胞和肺上皮细胞等，近年来发现人肿瘤组织中也有TLR3表达。TLR3配体dsRNA能直接激活自然杀伤细胞，增强抗原特异性CD8+T细胞应答，促进树突状细胞的抗原呈递激活。

dsRNA也能通过激活多条信号转导途径，即：诱生干扰素(IFN)、激活dsRNA激活蛋白激酶(PKR)、激活2′，5′A合成酶(2′，5′oligoadenylate synthetase)、抑制蛋白质合成、刺激前列腺素E的合成、促进白细胞的分化、促进巨噬细胞、NK细胞及特异性细胞毒T淋巴细胞的活性，诱导抗原呈递细胞产生各种细胞因子，抑制化学致突变剂的作用，恢复细胞间的接触抑制等。

从肿瘤生长和转移的的内环境而言，均依赖于丰富的血管形成，血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)可以引起肿瘤血管生成，并导致肿瘤组织的快速生长。TLR3配体dsRNA能通过刺激体内干扰素生成，发挥抗肿瘤血管生成的作用，是抑制肿瘤的生成与转移的另一个重要因素。

dsRNA作为体内干扰素(IFN)诱生剂而言经济而实惠。从植物、微生物到不同种类的动物，其细胞内的dsRNA组份都具有干扰素诱生活性。目前干扰素已经用于治疗许多慢性病毒性疾病和肿瘤，但基本上都是使用基因工程干扰素或从人的细胞组织培养中经诱生、纯化而生产的干扰素制品。前者不仅价格昂贵，而且一般只含有单一亚型，抗病毒效果不尽完全；组织细胞培养干扰素价格亦较昂贵，而且经常存在批间差别、外源性污染和纯度等问题，这些外源性干扰素反复使用还经常会出现抗干扰素抗体，从而大大降低了干扰素再使用的效果。以天然dsRNA为干扰素诱生剂直接用于机体，在体内诱生的自身干扰素是广谱的，而且dsRNA是免疫调节剂(Immune Modulator)，已经证实dsRNA还可诱生其他一些细胞因子。因此，dsRNA作用于机体以后的生物学活性远远超出了单纯的干扰素诱生活性，而且自身干扰素在体内不会产生抗体，因此可表现出更好的治疗效果。

TLR3激动剂是不需要大分子(长链)dsRNA的，小分子dsRNA完全可以有效的激活TLR3。人们早就利用人工合成的dsRNA聚合物-聚肌胞(Poly(I:C)：由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多核苷酸链)作为免疫佐剂已应用到某些肿瘤的辅助性免疫治疗。由于Poly(I:C)的急性毒性较大，且非天然品，故不适合用于保健品类产品的开发。近年来也证实：人工合成小分子dsRNA可以作为TLR3有效的激动剂而抗血管新生等(WG Cho，PNAS 2009)。由于dsRNA作为配体激活TLR3为广谱的(何序列度可以作为配体而激活TLR3)，只要满足功能性长度19-25bp即可作激活TLR3受体(ME Kleinman，Nature 2008)，但原料造价昂贵，每克达数万元，目前无法满足大规模产业化的要求。

天然酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。最常提到的酵母为酿酒酵母(也称面包酵母)(Saccharomyces cerevisiae)，自从几千年前人类就用其发酵面包和酒类，在全球范围都被认定为食品。热带假丝酵母RNA累积能力很好，也被用于RNA的制备和提取。酵母菌属于单细胞真核生物。大多数酵母菌在生存竞争中都有相互嗜杀特性。具有这种特性的酵母为嗜杀酵母。其遗传物质基础为这种酵母细胞核外具有自我复制能力的dsRNA嗜杀质粒。利用天然酵母菌中的dsRNA为原料，将其制备为小分子dsRNA作为TLR3配体(激动剂)，激活人体各种组织细胞膜表面的TLR3发挥其局部及提高全身免疫力用于防癌、抗癌、抗病毒医学健康保健品开发具有广阔的使用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用。

优选地，所述酵母M-dsRNA的序列与SEQ ID NO：1同源。

优选地，所述酵母M-dsRNA的分子长度为15-100bp。

进一步地，所述酵母M-dsRNA的分子长度为19-25bp。

优选地，所述的酵母M-dsRNA可以激活细胞内天然免疫系统TLR3的信号通路，引发下游相关基因的表达上调。

进一步地，所述的下游相关基因为IFN-γ、NF-κB、Caspase-3或Caspase-8。

一种上述任意一项所述的酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂在制备防癌、抗癌及抗病毒医学健康保健品中的应用。

本发明还提供了一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，通过RNA酶消化法或柱层析法从酵母总RNA中分离制得小分子dsRNA群，即酵母M-dsRNA。

优选地，所述的RNA酶为RNase T1、RNase A或两者的混合物。

优选地，所述的酵母为嗜杀酵母，含有大分子dsRNA和中等分子dsRNA中的至少一种。

进一步地，所述的嗜杀酵母为啤酒酵母或热带假丝酵母。

优选地，所述的柱层析法为CF11纤维素层析。

优选地，所述酵母M-dsRNA的分子长度为15-100bp。

进一步地，所述酵母M-dsRNA的分子长度为19-25bp。

在嗜杀酵母细胞中，有两种核外dsRNA所编码的蛋白质和嗜杀现象有关：一种是分子量约为2.5×10⁶道尔顿的大分子dsRNA(Large dsRNA，简称L-dsRNA，长度约为4.5kb)，占90％以上；另一种是分子量约为1～1.4×10⁶道尔顿的中等分子dsRNA(Medium dsRNA，简称M-dsRNA，长度约为1.8kb)，占6％左右。两者的总和约占嗜杀酵母细胞全部核酸的0.1％。这两种大、中分子的dsRNA可以作为Toll样受体3(TLR3)的激动剂，而工业级生产的酵母总RNA中含有的dsRNA由于剪切力的原因，其分子长度小于100bp。最新的研究表明，长度为19～25bp的小分子dsRNA即可以作为TLR3的配体，有效的激活TLR3而发挥其应有的生理功能(ME Kleinman，Nature 2008)。利用酵母小分子dsRNA作为TLR3的激动剂开发新一代的天然健康产品不但可以使酵母天然的大分子及中等分子dsRNA生物利用率提高～20倍，而且更加安全(理论上普遍认为，分子量越大越易引起过敏反应)。

本发明提供的酵母M-dsRNA可以作为TLR3的配体，激活人体各种组织细胞膜表面的TLR3，进而产生内源性干扰素(如IFN-γ)及细胞介素(如IL-12)细胞活性物质，发挥局部及全身防癌、抗癌、抗病毒等作用。本发明提供的制备方法简便，易操作。

附图说明

图1为RNA酶消化法纯化的酿酒酵母M-dsRNA和热带假丝酵母M-dsRNA的凝胶电泳图；

图中：M为RNA Marker；1为热带假丝酵母总RNA；2为经RNase T1分离的热带假丝酵母小dsRNA；3为酿酒酵母总RNA；4为经RNase T1分离的酿酒酵母小dsRNA。

图2为层析法分离的热带假丝酵母小dsRNA电泳检测图；

图中：1为热带假丝酵母总RNA；2为RNA Marker；3为层析分离后的热带假丝酵母小dsRNA。

图3为层析法分离的酿酒酵母小dsRNA电泳检测图；

图中：1为酿酒酵母总RNA；2为层析分离后的酿酒酵母小dsRNA；3为RNA Marker。

图4为酵母小dsRNA分子转化成cDNA后PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图5为pRNAi-U6H1/Neo的载体图谱；

图6为酵母小dsRNA分子库电转化后克隆培养平板照片。

图7为菌检PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图8为SfiI酶切证实重组体和非重组体的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图9为酵母小dsRNA分子库中24例重组质粒(阳性克隆)电泳检测图；

图中：M为1kb plus DNA Ladder。

图10为酵母小dsRNA分子库的小dsRNA位点均匀分布示意图；

图中：1为酵母嗜杀质粒(dsRNA)全长序列(1801bp)；2为酵母小dsRNA。

图11为pNF-κB-TA-Luc质粒图；

图12为酵母小dsRNA各组之间萤火虫荧光素酶的RLU值海参荧光素酶的RLU的比值图；

图13A为酿酒酵母小dsRNA处理主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图；

图13B为热带假丝酵母小dsRNA处理主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图；

图13C为酵母小分子dsRNAPool处理主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图；

图13D为Avastin处理主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图；

图13E为5％葡萄糖处理主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图；

图14为各处理组动脉环内皮细胞向外生长迁出的节点数统计学分析结果柱形图；

图15为各处理组23周时测得的肝脏/体重比柱形图(*P＜0.05，与PBS组相比)；

图16为实时定量PCR测定的各处理组TLR3、NF-κB的mRNA相对表达水平柱形图；

图17为酵母小dsRNAPool、poly(I:C)、PBS分别处理TLR3、NF-κB、β-actin(内参基因)的蛋白表达水平Western Blot分析结果对比图；

图18为图17中各处理组TLR3、NF-κB相对于β-actin蛋白表达水平的柱形图(*TLR3，P＜0.05，与PBS组相比，#NF-κB，P＜0.05，与PBS组相比)；

图19A为酵母小dsRNA Pool处理大鼠HCC模型23周时肝脏切片Laminin抗体免疫组化抗体标记染色放大100倍的显微照片；

图19B为poly(I:C)处理大鼠HCC模型23周时肝脏切片Laminin抗体免疫组化抗体标记染色放大100倍的显微照片；

图19C为PBS处理大鼠HCC模型23周时肝脏切片Laminin抗体免疫组化抗体标记染色放大100倍的显微照片；

图19D为酵母小dsRNAPool处理大鼠HCC模型23周时肝脏切片PCNA抗体免疫组化抗体标记染色放大400倍的显微照片；

图19E为poly(I:C)处理大鼠HCC模型23周时肝脏切片PCNA抗体免疫组化抗体标记染色放大400倍的显微照片；

图19F为PBS处理大鼠HCC模型23周时肝脏切片PCNA抗体免疫组化抗体标记染色放大400倍的显微照片；

图20为用软件Histolab 5.8计算的图20A中肿瘤结节的数量柱形图(*P＜0.05，与PBS组相比；#P＜0.05，与酵母小dsRNAPool组相比)；

图21为19D-19F中PCNA阳性细胞数柱形图(*P＜0.05，与PBS组相比；#P＜0.05，与酵母小dsRNAPool组相比)；

图22为实时定量PCR测定的各处理组Caspase-8、IFN-γ和VEGF的mRNA相对表达水平柱形图(*P＜0.05，与PBS组相比；#P＜0.05，与酵母小dsRNA Pool组相比)。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

为方便起见，在具体实施方式中，术语“酵母小分子dsRNA”、“酵母小dsRNA”、“酵母小分子dsRNA群”或“酵母小dsRNA群”可以互换，它们表示的意思和范围相同。

实施例1

RNA酶消化法分离酵母小分子dsRNA

1.酵母总RNA：酿酒酵母总RNA(百奥迈科生物技术有限公司)、热带假丝酵母总RNA(南通秋之友生物科技有限公司)。

2.主要试剂和材料：RNase T1(美国Fermentas公司)、RNAMarker(RL1000，TaKaRa公司)，无RNA酶污染的肝糖(上海瑞齐生物科技)，其它生化试剂均购于上海生工。

3.主要仪器：超净工作台(SW-CJ-2F苏州净化设备厂)；低温冰箱(-80℃，DF-U4086S，日本三洋)；电泳仪(Bio-rad，美国)；凝胶成像系统(Biosens，美国)；紫外分光光度计及分析工作站(岛津Shimadazi，日本)等。

4.用RNaseT1处理酵母总RNA分离出dsRNA。反应系如下：200μL的液中含有20μL(20μg)RNA；10μL(10U)RNase T1；20μL 10×TE Buffer(10mMTris-HCl、1mN EDTA，pH＝8.0)，150μL无菌水。37℃反应30min，加20μL EDTA(250mM)中止反应，72℃加热20min灭活酶。取5μL电泳分析。并用取1μL酵母dsRNA加入99μL的1×TE Buffer(100倍稀释)，紫外分光光度计检测OD₂₆₀及OD₂₈₀比值(此值在1.8～2.0之间为dsRNA)。

5.电泳分析消化产物：

分离后的酵母小dsRNA经15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示，分离的酵母小dsRNA长度主要分布于100bp以下，无DNA及其他单链RNA所见。图中：M为RNA Marker；1为热带假丝酵母总RNA；2为经RNaseT1分离的热带假丝酵母小dsRNA；3为酿酒酵母总RNA；4为经RNase T1分离的酿酒酵母小dsRNA。

6.紫外分光光度计检测：测得经分离热带假丝酵母和酿酒酵母小dsRNA的OD₂₆₀与OD₂₈₀比值分别为1.91和1.89，证实为dsRNA。

实施例2

柱层析法分离酵母小分子dsRNA

1.主要试剂材料和仪器

1.1酵母总RNA：酿酒酵母总RNA(百奥迈科生物技术有限公司)、热带假丝酵母总RNA(南通秋之友生物科技有限公司)。

1.2主要试剂：CF11纤维素填料(美国Waterman公司)、STE Buffer(25mMTris-HCl，pH7.5、50mM NaCl、0.5M EDTA)、其它生化试剂(百奥迈科)、RNAMarker(RL1000，TaKaRa公司)，其它生化试剂均购于上海生工。

1.3主要仪器：SHZ-III型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)、凝胶电泳系统(北京六一)、离心机(Eppendorf公司)、凝胶成像系统(上海山富)。

1.4其它材料：空层析柱(美国QIAGEN公司)、抽滤瓶(海门仪器)、5mL注射器(河南曙光健士医疗器械集团有限公司)等。

2.实验方法

CF11纤维素填料预先用STE Buffer洗涤一次，然后填充到空的层析柱里，将填充好的层析柱连接到5mL注射器和真空泵上。

将酵母总RNA配置成溶液，将其加到层析柱里，用真空泵进行洗脱，立即加入5mL洗涤Buffer(含16％乙醇的STE Buffer)以完全洗脱DNA和ssRNA。将层析柱移到1.5mL离心管中，10,000×g离心30sec去除残余的洗涤Buffer。将层析柱移到一新的1.5mL离心管中，加入200μL不含乙醇的STE Buffer，以覆盖CF11纤维素填料，10,000×g离心2min洗脱。每一步得到的样品均重复上述步骤分离，以提高回收率。

洗脱后的dsRNA加入2倍体积的乙醇后，置于-20℃进行沉淀过夜。0,000×g离心15min，吹干dsRNA沉淀，然后用适量无核酸酶水重悬沉淀。

3.实验结果

分离后的酵母小dsRNA经15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图2-3所示，分离的酵母小dsRNA长度主要分布于100bp以下，无DNA及其他单链RNA所见。

图2为热带假丝酵母小dsRNA电泳检测图，图中：1为热带假丝酵母总RNA；2为RNA Marker(分子量大小与图1相同)；3为层析分离后的热带假丝酵母小dsRNA。

图3为酿酒酵母小dsRNA电泳检测图，图中：1为酿酒酵母总RNA；2为层析分离后的酿酒酵母小dsRNA；3为RNA Marker(分子量大小与图1相同)。

实施例3

构建酵母小dsRNA分子库(方法见朱远源，专利号为ZL 200710024217.6的专利)鉴定酵母小dsRNA的序列

1.主要试剂材料和仪器

1.1酵母小dsRNA：实施例2制得的酿酒酵母dsRNA。

1.2主要试剂：T4DNA Ligase(NEB公司)、LB液体培养基、LB固体培养基等(百奥迈科)、QIAEX II Gel Extration Kit(美国QIAGEN公司)、TIANprepMini Plasmid Kit(TIANGEN公司)、pRNAi-U6H 1/Neo(百奥迈科)、SuperScriptII RT(SSII RT)(美国Invitrogen公司)、1kb plus DNA Ladder(美国Invitrogen公司)、BSA(美国NEB公司)、Taq DNA聚合酶(百奥迈科)、琼脂糖(上海生工)、dNTP(上海生工)、酚∶氯仿∶异戊醇(上海生工)、低分子量DNALadder(美国NEB公司)、T4DNA聚合酶(美国NEB公司)、BsaI酶(美国NEB公司)、SfiI酶(美国NEB公司)、感受态细胞(美国Invitrogen公司)，其它生化试剂(百奥迈科)等。

1.3Oligo及引物：

Smart Oligo：5’AAGCAGTGGTATCAACCAGAGTTTTTGNG-3’(GNG：2’-O-甲基化修饰的RNA碱基，N为A、U、C、G中任一种)；

5’引物：5’-AAGCAGTGGTATCAACCAGAG-3’；

反转录引物：

5’-AAGCAGTGGTATCAACCAGAGTTTTTNNNNNNNN-3’(N：为DNA碱基A、T、C、G中任一种)；

5’U6：5’-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3’；

3’H1：5’-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3’。

1.3主要仪器：PCR仪(ABI公司)、凝胶电泳系统(北京六一)、离心机(Eppendorf公司)、凝胶成像系统(上海山富)、电转仪(Bio-Rad公司)等。

2.实验步骤

2.1将酵母RNA稀释至1mg/mL。

2.2反转录合成cDNA第一链(用Smart技术(朱远源，专利号ZL01113524.7)将酵母dsRNA反转录成cDNA)：建立如下体系，混匀：2μL(2μg)的RNA，1μL的反转录引物(10μM)，1μL的Smart Oligo(10μM)，1.5μL的dNTPs(10mM each)，用无RNase水补足至15μL。70℃反应5min，反应结束后置冰上冷却5min。将下列试剂加入到上述反应体系中：5μL的5×M-MLV RT Reaction Buffer，1μL的SSII RT，3μL的无RNase水和1μL的RNasin。42℃反应60min。

2.3PCR扩增：4μL的cDNA，0.5μL的dNTP，2.5μL的10×Taq Buffer，1μL的5’引物(10μM)，0.25μL的Taq DNA聚合酶，用ddH₂O补足至25μL，反应条件为：95℃预变性1min，95℃变性15sec，68℃退火延伸5min，循环30次。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4中箭头所示。

2.4PCR产物纯化：在上述100μL的PCR产物中加入2倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，涡旋振荡混匀，置于离心机中，13,000rpm离心5min。将上清液转移至另一干净1.5mL离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3M的醋酸钠溶液，混合均匀，置于-80℃超低温冰箱约1h。取出置于离心机，13,000rpm离心20min。弃掉上清液，吹干残余乙醇。加入约10μL的无RNA酶水充分溶解沉淀。

2.5BsaI酶切：BsaI酶消化上述纯化后PCR产物，切成粘端DNA片段。

取20μL上述PCR纯化后产物，加入2μL BsaI酶，5μL的NEBuffer-4，1μL的100×BSA，用ddH₂O补到50μL，混匀后加100μL，37℃反应2h。用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并用QIAEX II Gel Extration Kit回收目的片段。

2.6与RNA表达载体连接

将BsaI酶切后的DNA片段连接到带有U6和H1双启动子的RNA表达载体pRNAi-U6H1/Neo，如图5所示。

反应体系为：1μL载体，2μL BsaI酶切的DNA，10μL 1.5×P Buffer(90mM Tris(pH8.5～9.0)；12mM DTT；6mM MgCl₂；40％PEG8000)，0.5μL的ATP(10mM)，0.25μL的T4DNA Ligase，用ddH₂O补足到15μL，16℃反应30min。连接后用ddH₂O补到100μL，进行连接产物纯化：加1.5μL glycogen(10mg/mL)，2.5倍体积的预冷无水乙醇，-80℃放置30min沉淀后，离心加5μL ddH₂O溶解DNA沉淀。

2.7电转化

融化-80℃保存的感受态细胞。将40μL的细胞和5μL纯化后的连接产物在冰上混匀，放置1min，然后加入到预冷的电击杯中，将电击杯置于电转化仪中进行电击。加入150μL SOC培养基(2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，20mM葡萄糖，pH7.0)，37℃摇床，220rpm振摇40～60min。将菌液均匀涂布到含50μg/ml卡那霉素(Kan⁺)的LB琼脂平板(1％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast，1％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)Agar，pH7.0)上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日观察平板克隆数达到10³/平板(12cm平板)，如图6所示。

2.8菌液PCR检测

随机挑取菌斑至400μL LB(1％(W/V)，Tryptone0.5％(W/V)，Yeast1％(W/V)，NaCl，pH7.0)48深孔板中，37℃摇床，220rpm振摇2h。

PCR检测：取2μL培养菌液为模板，进行PCR反应。PCR体系为：2μL菌液、0.5μL 3’H1(10μM)、0.5μL 5’U6(10μM)、0.5μL dNTP(10mM)、3μL 10×PCRBuffer、0.3μL Taq DNA polymerase，用ddH₂O补足至30μL。反应体系为95℃预变性5min，94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸40sec，72℃终末延伸7min，循环25次。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，如图7所示，有条带的为阳性；没有PCR产物的为没挑到菌斑或接菌培养失败。计算得到平均阳性率为93％。

SfiI酶切证实真阳性：重组体(真阳性克隆)和非重组体(假阳性空载体克隆)的PCR产物长度鉴定极为困难。为了进-步鉴定真阳克隆，利用pRNAi-U6H1/Neo空载体多克隆位点含有SfiI酶切位点的特点，将菌液PCR产物进行SfiI酶切，PCR产物不能被消化者为真阳性克隆。反应体系为：取4μL菌液PCR产物，加入0.25μL SfiI酶，0.75μL NEBuffer-2，混匀后PCR仪，50℃，反应1.5h。酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8中箭头所示，被SfiI消化即为假阳性，计算得到重组率为97.6％。

2.9接菌扩大培养，质粒抽提

取100μL的2h培养的菌液接种到4mL Kan⁺ LB液体培养基试管中，37℃摇床，220rpm过夜摇菌。次日取800μL菌液保种为20％的甘油菌，-20℃保存；用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒，50μL ddH₂O洗脱DNA，-20℃保存。1μL质粒1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，如图9所示，其中M为1kb plus DNALadder，质粒大小约为5.5kb。

2.10测序鉴定

从抽提的质粒中取出20μL，送测序(上海英骏生物技术有限公司)。所得序列用alignment program软件和酵母嗜杀质粒(dsRNA)全长序列进行比对。

3.结果分析

1)美国NCBI数据库中的酵母的嗜杀质粒(Saccharomyces cerevisiae killervirus M1)M-dsRNA序列如下：

  1gaaaaauaaa gaaaugacga agccaaccca aguauuaguu agauccguca guauauuauu

 61uuucaucaca uuacuacacc uagucguagc gcugaacgau guggccgguc cugcagaaac

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1801a(SEQ ID NO：1)

2)从酵母小dsRNA分子库中，随机抽样30例进行测序，所得结果统计见表1：

表1

将测序结果，与SEQ ID NO：1进行序列比对，发现测序的酵母嗜杀质粒dsRNA 1的序列与SEQ ID NO：1具有80～100％的同源性，且位点均匀分布于全长序列，如图10所示，证实分离的酵母小dsRNA 2与酵母M-dsRNA的数据库同源。

实施例4

检测酵母小dsRNA介导的TLR3对NF-κB靶向激活

1.原理：dsRNA能够介导TLR3激活NF-κB，导致IFN-γ等细胞因子的分泌。本实验通过检测酵母小分子dsRNA群处理SMCC-7721细胞后的NF-κB活性，来检测其小分子dsRNA群对TLR3的激活能力。实验以报道的Poly(I:C)作为阳性对照。用于检测NFκB转录活性水平的报告基因质粒为pNF-κB-TA-Luc，可以高灵敏度地检测NFκB的激活水平。本实验通过将含有NF-κB结合位点的pNF-κB-TA-Luc质粒(如图11所示)转染SMCC-7721细胞。pNF-κB-TA-Luc质粒在NF-κB结合位点的下游有报告基因Luciferase，激活的NF-κB能够与该质粒的NF-κB结合位点结合，从而诱导Luciferase的表达。

2.主要试剂、材料与仪器

2.1细胞株：人肝癌细胞株SMMC-7721购于美国Sciencell公司。

2.2主要试剂：pNF-κB-TA-Luc和Renilla(海参)荧光素酶报告基因质粒购自美国Clontech公司，胎牛血清(FBS)、脂质体转染试剂Lipofectamine^TM2000购自美国Gibco公司，双荧光素酶检测试剂盒(Dual Luciferase Assay Kit)购自美国Promega公司等。

2.3主要仪器：生物发光检测仪Luminometer(美国Promega公司)，超净工作台(SW-CJ-2F苏州净化设备厂)，BLP-192核酸合成仪购自美国Biolytic公司等。

3化学合成：

1)实验序列：为了检测上述序列介导的TLR3激活效应，将上述列表中正义链序列连同各序列相应的反义链进行化学合成，用BLP-192核酸合成仪合成，其中18#和25#序列用百奥迈科的体外转录试剂盒合成。退火成双链结构，形成dsRNA，并将所有合成的dsRNA混合，称为“酵母小dsRNA Pool”。

2)阳性对照序列：

用化学合成的小dsRNA(ss-UP：AGAGAGAAAGUAGAGAAGGGC；ssDN：GCCCUUCUCUACUUUCUCUCU)作为阳性对照。

4.细胞培养与NF-κB相对活性测定：人肝癌细胞株SMMC-7721细胞常规培养于含10％FBS的DMEM培养液中(美国Invitrogen公司)。取对数生长期的细胞，按4.0×10⁴/mL接种于96孔板，每孔接种200μL，继续培养24h。根据Lipofectamine2000转染试剂的操作指南，将pNF-κB-TA-Luc与Renilla荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染到SMMC-7721细胞中，Renilla荧光素酶报告基因作为内参。转染后6h更换新鲜培养基，同时在培养中分别进行如下处理以刺激细胞(分为4组；每组12孔)：每孔加20μL(2μg)Poly(I:C)(阳性对照组；n＝12)；20μL 5％葡萄糖(阴性对照组；n＝12)；20μL(2μg)化学合成的小dsRNA(ss-UP/ssDN；n＝12)；20μL(2μg)酵母小dsRNAPool(n＝12)；20μL(2μg)酿酒酵母小dsRNA(n＝12)(由实施例2制得)；20μL(2μg)热带假丝酵母小dsRNA(n＝12)(实施例2分离)。继续培养24h后，NF-κB的活性用双荧光素酶检测试剂盒根据仪器操作指南在生物发光检测仪上进行检测。

5.结果：各组之间萤火虫荧光素酶的相对发光值(Relative Light Unit，RLU)海参荧光素酶的RLU的比值，如图12所示。经单因素方差分析，酵母小dsRNAPool、酿酒酵母小dsRNA、热带假丝酵母小dsRNA与合成的小dsRNA之间无显著差异(P＞0.05)；此酵母小dsRNA处理的两组荧光素酶的比值较Poly(I:C)阳性对照组及阴性对照组明显增高，存在统计学的显著差异(**P＜0.001)，表明：酵母小dsRNA(群)较Poly(I:C)更有效的通过TLR3激活NF-κB的活性。

实施例5

动脉环内皮细胞生长

1.酵母小dsRNA：酵母小dsRNA Pool、热带假丝酵母小dsRNA(由实施例2制得)。

2.溶液配制：

2.1纤维蛋白原溶液：将纤维蛋白原溶解于MCDB131无血清培养液中，质量浓度为3g/L。

2.2牛凝血酶溶液：牛凝血酶溶解于灭菌的蒸馏水中，浓度为50NIH U/mL；

2.3D-Hanks液：氯化钠8.0g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.H₂O)0.06g，氯化钾0.4g，磷酸二氢钾0.06g，碳酸氢钠0.35g溶解于三蒸水1000mL中，高温灭菌后4℃备用。

3.实验方法

3.1取材：8周龄的雄性Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)，大剂量2％戊巴比妥钠麻醉断头处死，将处死后的大鼠浸入75％乙醇中，放入超净台。无菌条件下切取胸主动脉，立即放入D-Hanks液中，在解剖显微镜观察下，用眼科手术剪及镊子小心地去除血管外纤维和脂肪组织，切成1mm长的动脉环，置D-Hanks液中冲洗数次备用，48孔板每孔加入10μL 50NIH U/mL牛凝血酶溶液，然后加入0.4mL的3g/L纤维蛋白原溶液，立即垂直放入动脉环，使其沉于底部正中部位。大约10min，纤维蛋白凝固。预实验过程中，在孔中加入含有不同浓度胎牛血清的MCDB131培养液，在培养液中加入抑制纤维蛋白水解的6-氨基己酸150μg/mL，每3天换液一次。放入培养箱中培养动脉环，隔天观察动脉环血管生成的情况并计数。血管生长的分枝顶点被认为分枝形成。

3.2计数：新生血管生长迁出的分枝算作为一个“节点”，代表新的血管形成。

根据预实验结果，选择含5％血清的MCDB131培养基培养大鼠主动脉环。实验分为5组：5％葡萄糖作为阴性对照组，采用含5％血清的MCDB131培养基；Avastin作为阳性对照组，采用含5％血清的MCDB131培养基+阿瓦斯汀(Avastin；美国罗氏公司)10μg/mL培养；酿酒酵母小dsRNA组采用5％血清的MCDB131培养基+酵母小dsRNA Pool(10μg/mL)培养；酿酒酵母小dsRNA组采用5％血清的MCDB131培养基+酿酒酵母小dsRNA(10μg/mL)；热带假丝酵母小dsRNA组采用5％血清的MCDB131培养基+热带假丝酵母小dsRNA(10μg/mL)。酿酒酵母小dsRNA、热带假丝酵母小dsRNA、酵母小分子dsRNA Pool、Avastin(阳性对照组)、5％葡萄糖(阴性对照组)处理主动脉环血管向外生长迁出抑制试验显微镜观察图如图13A-13E所示。隔天计数新生血管数。实验重复3次。

4.实验结果：按照动脉环外内皮细胞生长迁出的节点数对各组进行评分，每组有6个动脉环分别单独评分，然后对各组评分的均数进行比较。实验结果表明：酵母小dsRNA Pool、酿酒酵母小dsRNA、热带假丝酵母小dsRNA处理组和阳性对照的Avastin组均有显著抑制动脉环内皮细胞增生的能力(如图14所示)。单因素方差分析表明酿酒酵母小dsRNA、热带假丝酵母小dsRNA处理组与5％葡萄糖对照组存在显著差异(P＜0.01)。

实施例6

1.主要材料和试剂：2-acetylaminofluorene(2-AAF，美国Sigma公司)、Poly(I:C)(美国InvivoGen公司)、酵母小dsRNA Pool(同实施例4)、Survivin抗体(美国Santa Cruz公司)、Bcl-2抗体(美国Santa Cruz公司)、PCNA抗体(美国Santa Cruz公司)、Caspase-3抗体(美国Santa Cruz公司)、phospho-NF-κB p65抗体(美国Cell Signaling公司)，TLR3抗体(美国Abcam公司)、PVDF膜(美国Millipore公司)等。

2.实验动物：SD大鼠(南通大学实验动物中心)。

3.主要仪器：光学显微镜(日本奥林巴斯公司)、Decloaking Chamber(美国BioCare公司)、LightCycler 480(美国Roche公司)、化学发光系统(美国Pierce公司)等。

4.实验方法：

4.1SD大鼠HCC模型建立：30只雄性SD大鼠，4-6周龄，120-160克。在洁净环境中，所有的30只大鼠喂食含0.03％的2-AAF的常规饲料16周建立HCC模型，第12、14、16、18周分别处死10只大鼠，观察恶性转化程度。选取15只HCC模型大鼠，随机分成3组，每组5只，另5只鼠备用。

4.2给药：两组动物实验组分别用酵母小dsRNA Pool和poly(I:C)(作为阳性对照)处理。酵母小dsRNAPool和poly(I:C)均用无菌的PBS配置，注射剂量为：1.0mg/kg，一周一次，连续给药6周。第3组大鼠注射同等体积的PBS作为对照。给药结束后，处死15只鼠，取肝脏并称重。肝脏样本取出后进行病理检查和免疫组化分析，其余样品保存于-80℃，进行RNA和蛋白分析。

4.3免疫组化染色：大鼠HCC石蜡切片脱蜡至水，用140mM的柠檬酸缓冲液(pH6.0)在Decloaking Chamber中115℃/3min修复抗原。将切片移至开水中，室温冷却20min。用Laminin抗体(按1∶100孵育)、PCNA抗体(按1∶100孵育)室温孵育30min，然后4℃过夜。用标准的DAB显色法显色，显微镜下观察并拍照。

4.4实时定量PCR：大鼠肝脏总RNA用RISO提取，检测TLR3、NF-κB、TRIF、Caspase-8、IFN-γ和VEGF的mRNA表达水平。反应条件为：95℃预变性3min，35个循环：95℃变性45sec，60℃退火45sec，72℃延伸30sec。

引物序列如下：

引物名称	引物序列(5′→3′)
		R-TLR3-F	CGGTCAAGGTGTTCAAGA
R-TLR3-R	GGATGGTAGAAGCGTGTT
		R-NF-κB-F	TGGCTTCTATTACCTGTA
R-NF-κB-R	TAACGACATATACCATCAG
		R-casepase-8-F	TGAACTATGATGTGAGCAATA
R-casepase-8-R	TTCCGTAGTGTGAAGATG
		R-IFN-γ-F	TCTTCACATCAAAGGAGTCATC
R-IFN-γ-R	TGCTGCTGGAGGTCATTA
		R-VEGF-F	GCAGCATAGCAGATGTGAAT
R-VEGF-R	TTGACCCTTTCCCTTTCCT
		R-β-actin-F	TATGGAATCCTGTGGCATC

R-β-actin-R

GTGTTGGCATAGAGGTCTT

4.5Western Blot分析：大鼠HCC肝脏组织匀浆后，等量的蛋白样品进行10％SDS-PAGE分离，转膜至PVDF膜上。膜先用5％的脱脂牛奶的TBST(20mMTris-HCl，500mM NaCl(pH7.5)，0.1％Tween-20)溶液封闭。

孵育抗体为：phospho-NF-κB p65抗体(1∶500)，TLR3抗体(1∶500)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，各5min，然后孵育二抗：anti-β-actin(按1∶2500孵育)，室温孵育2h。用化学发光系统检测。用ImageQuant软件(美国MolecularDynamics公司)扫描膜上的条带灰度值。计算相对于β-actin的表达量百分比。

4.6统计学分析：用SPSS 17.0软件进行统计学分析。不同组别之间的差异用ANOVA方差分析检验。P＜0.05表示差异显著。肿瘤结节的大小用Histolab 5.8软件(法国Microvision Instruments公司)。

5.结果分析

SD大鼠在用含2-AAF的饲料喂食16周后，用酵母小dsRNA Pool和poly(I:C)连续处理6周，大鼠处死，取出肝脏检测。测得的肝脏/体重比，如图15所示，酵母小dsRNAPool和poly(I:C)处理组与PBS处理组相比，体重明显下降，差异显著(P＜0.05)，肿瘤生长得到抑制。用实时定量PCR和Western Blot测得的TLR3、NF-κB的mRNA和蛋白水平结果显示，酵母小dsRNA Pool和poly(I:C)处理组的TLR3和NF-κB的表达与PBS处理组相比显著升高(P＜0.05)，如图16-18所示，表明酵母小dsRNAPool和poly(I:C)刺激了肝脏组织细胞中的TLR3信号通路。

免疫组化结果显示，肝脏组织切片用Laminin和PCNA抗体标记，观察HCC细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡。HCC中的毛细血管中的血供伴随着肿瘤结节内的Laminin上调，Laminin的免疫标记用于观察肝脏切片中肿瘤结节的变化，用Histolab软件计算肿瘤结节的面积大小。酵母小dsRNA Pool和poly(I:C)处理组与PBS处理组相比，肿瘤结节明显减小，尤其是酵母小dsRNA Pool处理组(P＜0.05)，如图19A-19F、20所示，肿瘤得到显著抑制。如图22所示，与PBS组相比，酵母小dsRNAPool和poly(I:C)处理组的PCNA阳性细胞率显著降低(P＜0.05)，表明肿瘤细胞的增殖受到显著抑制。

实时定量PCR检测结果显示，酵母小dsRNA Pool和poly(I:C)处理组，与PBS对照组相比，肝脏组织中的Caspase-8、IFN-γ的mRNA水平显著升高(P＜0.05)，VEGF的mRNA显著降低(P＜0.05)。酵母小dsRNA Pool优于poly(I:C)(P＜0.05)(如图22所示)，表明酵母小dsRNAPool和poly(I:C)均刺激了肿瘤细胞内的细胞凋亡死亡受体信号通路，抑制了肿瘤细胞的增殖。

结果显示，酵母小dsRNAPool的肿瘤抑制效果是由于dsRNA激活了细胞天然免疫应答的TLR3的信号通路，引发了细胞内IFN-γ、NF-κB、Caspase-3、Caspase-8的表达上调，启动了细胞凋亡的死亡受体信号通路。

Claims (14)

1.一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用。

2.根据权利要求1所述的一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的序列与SEQ ID NO：1同源。

3.根据权利要求2所述的一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子长度为15-100bp。

4.根据权利要求3所述的一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子长度为19-25bp。

5.根据权利要求1所述的一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用，其特征在于，所述的酵母M-dsRNA可以激活细胞内天然免疫系统TLR3的信号通路，引发下游相关基因的表达上调。

6.根据权利要求5所述的一种酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂的应用，其特征在于，所述的下游相关基因为IFN-γ、NF-κB、Caspase-3或Caspase-8。

7.一种权利要求1-6中任意一项所述酵母M-dsRNA作为TLR3激动剂在制备防癌、抗癌及抗病毒医学健康保健品中的应用。

8.一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，通过RNA酶消化法或柱层析法从酵母总RNA中分离制得小分子dsRNA群，即酵母M-dsRNA。

9.根据权利要求8所述的一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，所述的RNA酶为RNase T1、RNaseA或两者的混合物。

10.根据权利要求8所述的一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，所述的酵母为嗜杀酵母，含有大分子dsRNA和中等分子dsRNA中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，所述的嗜杀酵母为啤酒酵母或热带假丝酵母。

12.根据权利要求8所述的一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，所述的柱层析法为CF11纤维素层析。

13.根据权利要求8所述的一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子长度为15-100bp。

14.根据权利要求13所述的一种酵母M-dsRNA的制备方法，其特征在于，所述酵母M-dsRNA的分子长度为19-25bp。

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