CN101432432A

CN101432432A - 核酸向细胞的胞外体转移

Info

Publication number: CN101432432A
Application number: CNA2007800154690A
Authority: CN
Inventors: 扬·奥洛夫·洛特温尔; 哈迪·瓦拉迪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-05-03
Filing date: 2007-05-02
Publication date: 2009-05-13

Abstract

本发明涉及一种通过胞外体将核酸引入细胞的方法，该方法用于如基因沉默的基因调控与治疗，并且将遗传物质引入细胞以补偿异常基因、或诱导或抑制在受体细胞中的进程。

Description

核酸向细胞的胞外体转移

相关技术描述

胞外体是由多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中的内吞源性的小膜囊泡。胞外体的直径大小在30和100nm之间。其表面由来自供体细胞细胞膜的脂双层构成，而且其含有来自产生该胞外体的细胞的胞浆，并且从表面的亲本细胞表达膜蛋白。

胞外体根据其衍生细胞的细胞类型而表现不同的组成和功能。不存在“胞外体特异性”蛋白；然而在这些囊泡内鉴定出的几种蛋白质与反映其来源的内含体和溶酶体有关。多数胞外体富含MHC I和MHC II(主要组织相容性复合体I和II；其对于将抗原提呈给如T-淋巴细胞等免疫活性细胞很重要)、四跨膜蛋白(tetraspanins)、几种热休克蛋白、细胞骨架成分(如肌动蛋白和微管蛋白)、细胞膜融合相关蛋白、信号转导蛋白和胞浆酶。

胞外体由多种细胞产生，包括上皮细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)及树突细胞(DC)。在人类中，胞外体已经在血浆、尿、支气管肺泡灌洗液、肠上皮细胞和肿瘤组织中发现。

胞外体的所有功能并未全部阐明，但数据强烈显示了它们介导细胞间通讯。这种通讯能以不同方式发生。首先，胞外体能以细胞与细胞间相互作用相似的方式结合到细胞表面受体。其次，胞外体能粘附至细胞膜上并为细胞提供新的受体和特性。因此，胞外体也能与靶细胞融合并在两种细胞类型间交换膜蛋白和胞浆。

我们对了解特定的由肥大细胞释放的胞外体的内含物及生物学功能方面做了特别的努力。在蛋白质组分析中，我们发现这些胞外体含有比先前所了解的更多的蛋白质。然而，我们研究中的独特发现是我们发现源自肥大细胞的胞外体中含有大量选择性RNA。此外，不同的受体细胞的使用表现出胞外体RNA的吸收，这表明了遗传物质从胞外体向受体细胞内的转移，这种转移将依次导致靶细胞内特定蛋白质的翻译。

考虑到胞外体蛋白内含物及其与不同受体细胞通讯的能力，尤为有用的是能够修改胞外体的基因内含物，以便添加或调节受体细胞的基因。本申请描述了利用胞外体携带特定遗传物质和将其转移到受体细胞的能力的方法。在该方法中，受体的功能及其保持存活、进一步发育、增殖或成熟的能力受到影响。

该方法独特，且不同于任何先前所描述的方法。一些专利和专利申请经由胞外体蛋白与免疫细胞之间的相互作用，通过其刺激或抑制功能利用胞外体来影响免疫系统，并通过影响免疫系统来治疗病毒性疾病。已经表明胞外体蛋白质能通过突变来修饰以影响免疫系统。然而，我们尚未发现任何专利或专利申请或任何公开可用的信息描述或表明了胞外体向细胞转移遗传物质或核酸的用途。

发明概述

本发明公开了通过胞外体向受体细胞递送核酸构建体的新方法。本发明的方法包括利用亲本细胞将RNA和DNA构建体转移到胞外体内(亲本细胞的转化、转染、或修饰)，或使用如转化和转染等传统方法，直接将核酸引入胞外体。本发明的方法是一种非常好的基因治疗手段，该手段通过向受体细胞引入遗传物质来补偿异常基因或引入产生蛋白质的RNA或DNA，该蛋白质影响受体细胞功能或存活能力或发育能力或成熟能力。对于基因治疗来说，通常使用病毒或脂质体作为载体来转移遗传物质，这是由于它们能通过感染细胞来递送新的基因。与传统方法相比，使用胞外体有很多优势，最重要地是，胞外体源自细胞，甚至可能是受体本身的细胞，因此对于免疫系统来说不是外来个体，从而能避免不利的免疫反应。因此对于用于基因调控和治疗来说，胞外体容易产生、分离和修饰。

通过以下内容和随附的权利要求书，本发明的其它目的和特征将更加明显。

发明详细说明及其优选实施方式

正如本发明所述，利用胞外体囊泡向细胞的胞质或核转移遗传物质、核酸能治疗遗传疾病、细胞或身体功能障碍、诱导或抑制细胞死亡(细胞凋亡)、改变细胞老化、诱导耐受、重新导向现有的免疫应答、改变胞内活性或细胞行为。它还能用于遗传病症、恶性肿瘤疾病或涉及如下细胞的疾病的各种基因治疗：免疫细胞或身体内的任何其它细胞类型，包括脉管组织、上皮细胞、间质细胞、肌肉组织、骨骼系统、神经系统、肝细胞、肾细胞、肠细胞、肺细胞、皮肤细胞或身体内的任何其它细胞。

本发明中描述的能通过胞外体转移的遗传物质是：microRNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、调节RNA、非编码和编码RNA、DNA片段、和DNA质粒，包括各类核酸。将遗传物质(DNA或RNA的构建体、或各类核酸)直接转移至胞外体的方法是转化、转染和显微注射。

遗传性不同的胞外体可以利用其供体细胞或者通过向其中引入特定核酸进行分离，以用于进一步向受体细胞递送。产生含有一组遗传物质的不同方法描述如下。

利用胞外体产生细胞来产生遗传性不同的胞外体以用于进一步向受体细胞递送的不同过程包括：

(a)来自不同供体细胞的胞外体

含有不同组遗传物质的胞外体可以从不同的供体细胞分离(如B淋巴细胞和T淋巴细胞、肥大细胞和树突细胞)以用于进一步向受体细胞递送。由于供体细胞的作用和环境不同而引起其基因型不同，因此来自不同细胞类型的分离胞外体产生了不同基因型的胞外体。

(b)来自不同条件的胞外体

胞外体产生细胞在某种条件下的生长会引起细胞改变，随后形成经遗传修饰的胞外体。然后这些胞外体可用于将一组核酸转移到受体细胞。

(c)来自不同人或疾病的胞外体

来自不同人或疾病的胞外体包含不同组的核酸。由于供体细胞来源和条件不同使得胞外体的基因型不同。含有单一组核酸的胞外体能被分离以用于进一步向受体细胞递送核酸。

(d)来自经遗传修饰的供体细胞的胞外体

胞外体产生细胞内的基因破坏或突变引起经遗传修饰的胞外体，这种胞外体能用于向受体细胞递送其核酸。胞外体内存在的各种核酸的表达可能受到胞外体产生细胞的基因操作的影响(消除或上调/下调)。例如，胞外体产生细胞内的基因破坏导致胞外体内缺少相应的mRNA。同时，胞外体产生细胞内基因的上调或下调影响胞外体内相应mRNA的量。

特定核酸构建体(克隆基因、DNA片段和质粒、microRNA、siRNA、编码或非编码的DNA和RNA)能通过经遗传修饰的胞外体转移到受体细胞。核酸构建体可以使用标准技术来制造，如克隆、分离和RNA或DNA序列的扩增，以用于进一步到向胞外体内转化。

(a)利用其供体细胞将特定构建体插入胞外体

新的构建体(RNA和DNA)能利用其供体细胞而引入胞外体。核酸构建体能被引入供体细胞(胞外体产生细胞)，从而通过细胞内功能将其自身的转录物或构建体转位至胞外体内。

(b)特定构建体直接插入胞外体

胞外体能从不同的来源分离，如体外生长的细胞、人体或源于人和动物的细胞。RNA或DNA的基因构建体能通过如体外转化、转染和显微注射等传统的分子生物技术直接引入这些胞外体。经遗传修饰的胞外体能进一步用于向受体细胞转移核酸。

本发明还涉及不包含任何实质量核酸的空胞外体。这些胞外体可以用来插入感兴趣的DNA。

本发明还涉及包含至少一种外加异源核酸的胞外体，此处“异源”一词表示添加的核酸或酸不是衍自原胞外体本身。因此添加的核酸可能源自其它物种；或来自胞外体以外的其它器官或组织或来自不同供体细胞、不同条件下、不同人或疾病或来自经遗传修饰的供体细胞。

核酸可以是上述能被转移的任何遗传物质。

本发明还涉及包含至少一种外加异源核酸的胞外体在制备药物中的应用。

制备经遗传修饰的胞外体的方法

遗传物质转化或转染至胞外体内

在分子生物学中，术语“转化”和“转染”更普遍地用于描述DNA和RNA转移的机制，其是1944年由Oswald Avery、ColinMacleod和Maclyn McCarty首次提出(Lederberg J.，Genetics.1944Feb；136(2)：423-6)。

(a)电穿孔

利用这种方法，通过经由100-200V/cm的电场短暂电击，在细胞或胞外体上形成许多孔。DNA/RNA能通过电场形成的孔进入细胞或胞外体。

(b)脂质体转染

该方法通常称作转染，能用于经含有期望基因构建体的囊泡介导的DNA/RNA的细胞或胞外体转化。囊泡与细胞膜融合(类似于肉汤表面两个油滴的融合)且囊泡与细胞中的内含物相结合。市场上有许多即可使用的转染试剂盒，如来自Panomics的DeliverX siRNA转染试剂盒(目录号DX0002)、来自Roche的FuGENE

HD转染试剂和来自Invitrogen的LIPOFECTAMINE^TM2000(目录号11668-027)。

(c)利用热激转化

在二价阳离子如Ca²⁺(在CaCl₂中)存在下冷却细胞/胞外体，使其膜对于RNA或DNA质粒/片段具有渗透性。将细胞/胞外体与DNA一起孵育，然后短暂热激(42℃，30～120秒)使DNA进入细胞。该方法对环状质粒DNA效果更好。

以上方法简单描述了如何实现经遗传修饰的胞外体向受体细胞转移RNA和DNA。分离含有RNA/DNA或经修饰含有感兴趣基因的胞外体并将其移位到受体细胞以影响其生物学功能或存活。因此，胞外体将其中的内含物释放到靶细胞的细胞质中，这继而导致mRNA在靶细胞内通过细胞自身蛋白机器翻译为特定蛋白质。此外，胞外体能够携带并转移编码和非编码的小RNA，如能调控特定基因翻译的microRNA和siRNA。

本发明所述的作为DNA或RNA载体囊泡的胞外体可以用来治疗造血、非造血、干细胞和器官的遗传性疾病。胞外体囊泡还能用作DNA或RNA构建体的载体以用于治疗人或动物的微生物感染或疾病或功能障碍，或转移任何生物膜的遗传物质。

由于人CD4 T细胞是HIV感染的靶细胞，可以用胞外体向被感染的T细胞运载和转移的，尤其被设计用于沉默病毒RNA翻译的RNA或DNA构建体(siRNA、RNAi或DNA)来治疗被感染细胞。因此，本发明公开了能将其核酸转移到CD4T细胞的胞外体可以用于治疗HIV感染的T细胞及T细胞恶性瘤如淋巴瘤或淋巴细胞性白血病。

通过改变胞外体产生细胞的条件来改变或修饰胞外体的遗传物质是通过改变PH、温度、生长条件，或使用针对胞外体产生细胞的抗体/化学品来实现的。这会导致核酸内含物的变化。另外，胞外体产生细胞中细胞因子、趋化因子及其它基因的过度表达或抑制可用于改变或修饰胞外体的基因内含物。

利用胞外体囊泡向特定细胞转移正义或反义RNA来关闭基因而不是添加新的基因引起特定基因下调(减缓)或翻译的阻止。这种方法称作RNA干扰(siRNA)。

本发明使得在给病人或受体人或动物给药干细胞之前，在体外将遗传物质传递到从患者或供体获得的干细胞成为可能。

为了将核酸给予受体细胞或组织，可以通过将胞外体添加至体外细胞培养物中或静脉注射这些胞外体或以该领域已知的任何其它体内途径将含有DNA或RNA的胞外体给予细胞。胞外体能靶向体内的任何细胞，包括心血管系统细胞、骨骼肌细胞、关节细胞、神经细胞、肠细胞、肺细胞、肝细胞或肾细胞、或免疫系统细胞、或人或动物体内具有任何功能或功能障碍的各种类型细胞，包括恶性肿瘤细胞。

如本发明所公开的，胞外体可用来递送遗传物质到受体细胞，以便在人或动物的任何细胞中利用细胞本身的蛋白质机能产生任何药物或任何药物前体，或者影响任何药物的功能或代谢。

为了避免不期望的或无关遗传物质的干扰，优选利用不含遗传物质的胞外体。空胞外体可用于直接转移到受体细胞或者将特定基因(RNA或DNA)直接转染或转化到胞外体中。

源自肥大细胞的胞外体的检测

分离自鼠肥大细胞系MC/9(ATCC Manassas，VA，USA，编号：CRL-8306)释放的胞外体，将其吸附在经碳涂覆的栅格上，用电子显微镜进行检测。为了检测胞外体特异性表面蛋白CD63，还从原代骨髓肥大细胞(BMMC)和细胞系MC/9二者中纯化了胞外体。胞外体粘附在醛珠上并用CD63抗体，随后用连接PE的二抗染色。使用流式细胞仪分析这些珠子，确定在源自BMMC和MC9的胞外体二者的表面均存在CD63。

胞外体蛋白的鉴定

为了解源自肥大细胞的胞外体的生物学功能，利用nano-flowLC-MS/MS分析蛋白质内含物。从分离的胞外体中提取总蛋白质内含物并在SDS-PAGE胶上收集。将蛋白质带进行胰蛋白酶切后通过LC-MS/MS分析。通过MASCOT(Matrix Science，London)程序检索所有串联质谱的结果来鉴定。结果显示，这些胞外体含有比先前所知的更大量的蛋白质。约鉴定出150种蛋白，其中的许多与细胞转录、翻译和蛋白质折叠有关。鉴定出的蛋白包括一些核糖体蛋白以及热休克蛋白、分子伴侣、膜联蛋白(annexin)、细胞骨架蛋白、膜结合蛋白质，如CD63、CD54、CD43和I类MHC。

源自肥大细胞的胞外体的DNA和RNA的检测

由于一定数目的鉴定蛋白与RNA和转录机制有关，我们假设胞外体中也含有DNA和/或RNA。为了验证这一点，我们进行了对胞外体和完整的胞外体产生肥大细胞中的RNA和DNA提取。利用分光光度技术并在琼脂凝胶上检测DNA和RNA的存在。在胞外体样品中未检测到DNA，但是却能从胞外体中检测到大量的选择性RNA。具体地，胞外体RNA中含有极低量或检测不出的核糖体RNA，这表示存在其它类型的RNA，即mRNA。

胞外体RNA的微阵列分析

为了表征源自肥大细胞的胞外体中的RNA，使用来自肥大细胞及其胞外体的RNA来施用Affymetrix小鼠DNA微阵列(Affymetrix)。结果显示胞外体携带来自约2500种基因的mRNA，其是在母肥大细胞中表达的基因的约10％。此外，基因图谱分析显示胞外体与其亲本细胞之间的mRNA有实质不同。胞外体中最丰富的转录物与其亲本细胞中丰富的转录物不同，这显示了胞外体RNA的选择性。有趣的是，胞外体携带了来自180种转录物在其母肥大细胞中并不存在的基因的mRNA。结果表明mRNA以高度选择的方式被转运至胞外体，并且亲本细胞似乎只表达一定数目专门用于胞外体运载的基因。

来自BMMC胞外体的RNA的检测

为了鉴定来自非细胞系源的胞外体中的RNA，从小鼠中收获骨髓细胞，培养成肥大细胞(骨髓源性肥大细胞：BMMC)达4周。在最后48小时，细胞在放射性尿嘧啶存在下培养(参见实施例1)。分离来自培养物的胞外体，用闪烁计数检测经由放射性标记的RNA。结果表明在胞外体中能检测到结合到细胞RNA的放射性尿嘧啶。源自骨髓的胞外体的RNA量不如肥大细胞系中的丰富，这可以通过用于收获的BMMC细胞数量较少以及这些细胞的体外生长条件来解释。

通过胞外体在细胞间转移RNA

为了验证胞外体是否能将其所含的mRNA转移到另一细胞，将含有放射性尿嘧啶mRNA的源自肥大细胞的胞外体添加到培养的树突细胞(DC)、CD4 T细胞和MC/9肥大细胞中。在不同的间隔时间取培养物样品，并通过离心分离并洗涤细胞。分离来自受体细胞的RNA并用闪烁体测定放射性尿嘧啶。最重要的是，暴露于胞外体的DC、CD4和MC/9含有增加量的放射性尿嘧啶，因此是从胞外体吸收的。结果表明源自肥大细胞的胞外体能将RNA转移至其它细胞，例如DC、CD4和MC/9细胞。

数据显示mRNA能通过胞外体在两个哺乳动物细胞间转移。生物学上，这表示一个细胞能通过经由胞外体的信号影响其它细胞蛋白质的产生。由于胞外体可用作载体将mRNA或DNA探针递送到靶细胞，如恶性肿瘤细胞或免疫系统细胞，因此这具有实质性的生物技术用途。因此，根据本发明，胞外体提供了一种基因调控和治疗的载体，其可能没有其它基因治疗载体的副作用，如病毒或其它类型的脂质体。

参考以下实施例将更清楚地理解本发明的特征，但不能解释为对本发明的限定。

实施例1

细胞制备

按照制造商的建议培养MC/9细胞(ATCC)，用Ti70转子(Beckman optima LE-80k超速离心机)在120,000g超速离心90分钟来去除血清、大鼠T-Stim和FBS中存在的胞外体。人肥大细胞系HMC-1(Joseph Butterfield医生，梅奥诊所(Mayo Clinic)，USA)在含有10％ FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺和1.2mMα-硫代甘油的IMDM中培养。将HMC-1细胞在1μM钙离子载体存在下培养30min以释放胞外体。按照先前所述的方法(Razin，E.et al.Interleukin 3：A differentiation andgrowth factor for the mouse mast cell that contains chondroitin sulfateE proteoglycan.J Immunol.132，1479-1486(1984))通过在IL-3(R&D系统)存在下培养来自7～10周龄的雄性BALB/c的股骨的骨髓细胞来制备骨髓肥大细胞(BMMC)。培养4周后收获细胞，根据形态分析其中含有96％的纯MCs。在最后48小时，在完全培养基中以3×10⁶个细胞/ml培养BMMC，该完全培养基中含有补充了10ng/ml IL-4(R&D-系统)的经超速离心的FBS，在一些实验中存在1μl/ml的³H-尿嘧啶(Amersham Biosciences)。为培养CD4⁺T细胞，收集小鼠脾脏，通过70μm的过滤器，然后通过30μm的过滤器。按照制造商的说明书，通过使用富含SPINCEP

小鼠CD4⁺T细胞的鸡尾酒(Stemcell Technologies)的阴性选择纯化CD4⁺T细胞。通过流式细胞仪分析，CD4⁺T细胞的纯度介于89～91％之间。在平底48孔板上，在含有10％ FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640中以1×10⁶个细胞/ml来培养这些细胞。

实施例2

胞外体纯化

按照先前所描述的方法(Raposo，G.et al.B lymphocytes secreteantigen-presenting vesicles.J.Exp.Med.183，1161-1172(1996))，通过差速离心自MC/9、BMMC和HMC-1的上清液制备胞外体。收获细胞，在500g离心10min去除细胞，然后在16,500g离心20min，随后通过0.22μm的过滤器除去细胞碎片。通过在120,000g超速离心(Beckman Ti70转子)70min使胞外体形成小球。将胞外体小球用PBS洗涤一次以用于质谱。利用BCA^TM蛋白检测试剂盒(Pierce)测定胞外体中蛋白质的含量。将120,000g胞外体小球悬浮在蔗糖梯度液中(0.25～2M蔗糖，20mM Hepes/NaOH，PH7.2)进行密度梯度实验。将胞外体溶解在2.5M蔗糖中，并将梯度液置于胞外体悬浮液上。按照(Rapso et al 1996)将梯度液在100,000g离心15h。简单地，从试管底部快速收集梯度部分(10×3.8ml)，用10ml PBS稀释后在150,000g超速离心2h(Beckman Ti70转子)，通过

(Invitrogen)提取小球。

实施例3

RNA、DNA和蛋白质的分离

按照制造商的方案，用

(Invitrogen)或

小型试剂盒(Qiagen)分离RNA、DNA和蛋白质。对于microRNA和总RNA的共纯化，先后用Trizol和

小型试剂盒提取RNA。将细胞和胞外体在RLT缓冲液(Qiagen)中破坏并均质化，向样品中添加3.5体积的100％甲醇，然后使用小型旋转柱。其它过程按照制造商的方案进行。

实施例4

向胞外体中引入DNA/RNA片段或构建体

特定构建体直接插入胞外体

胞外体能从不同的来源分离得到，如体外生长细胞、人体、或源自人或动物的细胞。可以利用传统分子生物学技术(如体外转化、转染和显微注射)将RNA或DNA的基因构建体直接引入这些胞外体中。

实施例5

将含有DNA或RNA的胞外体给予细胞

转移实验

在分离胞外体前，细胞在补充有1μl/ml ³H-尿嘧啶的完全培养基中培养72h以标记MC/9胞外体RNA。按照分离方案分离胞外体，通过超滤(10kDa，Millipore)洗涤除去游离的核苷。标记开始时以供体细胞与受体之间8：1的比率将胞外体添加到MC/9、CD4⁺和HMC-1细胞中。在0h和24h收获细胞并将其洗涤两次，通过

小型试剂盒分离RNA，并用闪烁计数测量放射性RNA的信号。不使用补充有1μl/ml³H-尿嘧啶的培养基的供体细胞用相同的方法处理，并用作阴性对照。

在生物体外翻译

总胞外体RNA用小型试剂盒纯化，其中0.5μg用于翻译。按照制造商的建议，使用体外兔裂解物翻译试剂盒(Promega Corporation)将胞外体mRNA翻译成蛋白质。不含胞外体RNA的样品以同样的方式处理，并用作阴性对照。翻译过程完成后，用丙酮沉淀总蛋白质，并用RCDC蛋白质检测(BioRad)进行测定。利用2D-PAGE、BioRad仪器(

3cell)及建议比较样品(含有和不含胞外体RNA)的蛋白质内含物。用SyproRuby(BioRad)使2D-溶胶显像，并用磷光影像分析仪(phosphoimager)使其数字化。比较样品的蛋白质点，并用LC-MS/MS和MASCOT先后对新产生蛋白质的选择物进行切割、胰蛋白酶切和鉴定。比较小鼠来源的新产生蛋白质与DNA微阵列分析鉴定出的基因。

在生物体内翻译

在三个不同时间点(0h、3h、6h)，将MC/9胞外体(1000μg)添加到HMC-1细胞(8×10⁶)中，并将细胞培养约24h。收获HMC-1细胞，洗涤，根据蛋白质组核心设施(Proteomics Core facility)通过2D-PAGE分离细胞的总蛋白质。不含胞外体的样品做相同处理，并用作阴性对照。用PDQUEST检测新产生的蛋白质，切出96个点，用MALDI-tof进行鉴定，然后根据蛋白质组核心设施(哥德堡大学)通过MASCOT程序检索。

随后胞外体将核酸递送至受体细胞，从而影响它们的生物学功能或存活。

实施例6

不含遗传物质的胞外体的制备

空胞外体用于直接向受体细胞转移或将特定基因(RNA或DNA)直接转染/转化到胞外体内。如本领域技术人员所知，制备空胞外体(不含遗传物质)的方法有多种，包括紫外曝露、携带RNA进入胞外体的蛋白质的突变，以及电穿孔和化学处理以胞外体膜上开孔。这些方法包括能修饰任何核酸向胞外体的运载的任何蛋白质的突变/缺失。

实施例7

小鼠MC/9胞外体转移后在人肥大细胞中产生小鼠蛋白

为了测试转移小鼠MC/9胞外体后能否在人肥大细胞内产生小鼠蛋白，我们先后用2D-PAGE和MALDI-tof测定了受体细胞中小鼠蛋白的存在。将人细胞与小鼠MC/9胞外体一起培养24h后，鉴定出96个新的或增强的点。有趣的是，从人细胞中鉴定出三种在MC/9胞外体中不存在的明显的小鼠蛋白。这三种蛋白质是：小鼠CDC6(O89033)、小鼠锌指蛋白271(P15620)和小鼠CX7A2(P48771)。前两种蛋白的mRNA出现在两个微阵列实验中，最后一种蛋白出现在实施的所有四个微阵列中，这暗示胞外体向受体细胞递送的mRNA能被翻译成蛋白质。

人肥大细胞HMC-1与小鼠MC/9胞外体共同孵育不到24小时时，MC/9胞外体向HMC-1细胞递送的蛋白质组结果表明小鼠蛋白能在人肥大细胞中产生。将两种凝胶间的蛋白质进行比对，通过MALDI-tof鉴定出96种新产生的蛋白质，并且小鼠蛋白是由胞外体mRNA生成的。

实施例8

胞外体用作恶性肿瘤疾病的基因治疗

胞外体是由取自患有恶性肿瘤疾病患者的恶性细胞产生的。这些胞外体经过处理包含各种类型或特异性的基因构建体以重新导入患者。然后来自恶性肿瘤细胞的胞外体优选与同类型的将DNA和/或RNA构建体特异性递送到恶性肿瘤细胞的细胞融合，从而作为恶性肿瘤疾病的基因治疗。该过程按照实施例1-6进行，但胞外体是由恶性肿瘤细胞产生的。

尽管本发明通过引用具体实施方式进行了描述，应该了解允许有大量的变换、修改和实施方式；相应地，所有这些变换、修改和实施方式应被看作是在本发明的精神和范围内。

Claims

1、一种转移遗传物质的方法，包括：

a)提供含有选择的遗传物质的胞外体；和

b)将选择的遗传物质从胞外体转移到受体细胞。

2、如权利要求1的方法，其中，所述选择的遗传物质选自由mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、调节RNA、非编码和编码的RNA、DNA片段、和DNA质粒组成的组。

3、如权利要求1的方法，其中，所使用的受体细胞选自由来自患有造血、非造血、干细胞和器官的遗传性疾病的受体的细胞组成的组。

4、如权利要求1的方法，其中，所述选择的物质包括核酸且所述受体细胞包括用于治疗HIV感染的T-细胞的CD4T-细胞。

5、如权利要求1的方法，其中，所述选择的遗传物质被转移以用于治疗疾病、诱导或抑制细胞死亡、改变细胞老化、诱导耐受、重新导向现有的免疫应答或改变胞内活性或细胞行为。

6、如权利要求1的方法，其中，提供胞外体还包括a)制备不含遗传物质的胞外体；和b)向不含遗传物质的胞外体中添加选择的遗传物质。

7、如权利要求6的方法，其中，所述选择的遗传物质选自由mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、调节RNA、非编码和编码的RNA或、DNA片段和DNA质粒组成的组。

8、如权利要求7的方法，其中，使用选自由下列方法组成的组的方法将所述选择的遗传物质添加到不含遗传物质的胞外体中：将挑选的遗传物质转化、转染和显微注射至胞外体内。

9、如权利要求1的方法，其中，所述胞外体是通过选自由下列方法组成的组的方法制备的：从选择的供体细胞类型中分离；从患特定疾病或病况的人分离；从经遗传修饰的供体细胞分离。

10、如权利要求9的方法，还包括遗传修饰供体细胞以消除核酸的产物，或上调或下调核酸的产物。

11、如权利要求1的方法，还包括通过将选择的遗传物质引入供体细胞，然后通过遗传物质的胞内转位进入胞外体来将选择的遗传物质引入胞外体。

12、如权利要求1的方法，还包括使用选自由下列方法组成的组的方法将选择的遗传物质引入胞外体：将选择的遗传物质转化、转染和显微注射至胞外体内。

13、如权利要求1的方法，其中，通过选自由下列方法组成的组的方法将选择的遗传物质转移到受体细胞：添加胞外体至体外细胞培养物；静脉注射胞外体；体内给药和靶向体内特定细胞的给药。

14、如权利要求1的方法，其中，所述含有选择的遗传物质的胞外体取自患有恶性肿瘤疾病的患者；且经进一步处理以包含特定的基因构建体，然后重新导入患者。

15、一种空胞外体，其特征在于，不含任何实质量的核酸。

16、一种胞外体，其特征在于，其包含至少一种外加的异源核酸。

17、一种包含至少一种外加的异源核酸的胞外体在制备药物中的应用。