CN105838739A - 核酸向细胞的胞外体转移 - Google Patents
核酸向细胞的胞外体转移 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105838739A CN105838739A CN201511022904.5A CN201511022904A CN105838739A CN 105838739 A CN105838739 A CN 105838739A CN 201511022904 A CN201511022904 A CN 201511022904A CN 105838739 A CN105838739 A CN 105838739A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- born
- same parents
- ectosome
- cell
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种通过胞外体将核酸引入细胞的方法,该方法用于如基因沉默的基因调控与治疗,并且将遗传物质引入细胞以补偿异常基因、或诱导或抑制在受体细胞中的进程。
Description
本申请是申请日为2007年5月2日、发明名称为“核酸向细胞的胞外体转移”的中国专利申请No.200780015469.0的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求于2006年5月3日提交的第60/797,149号美国临时申请的优先权,在此引入作为参考。
发明背景
发明领域
本发明是基于释放到细胞外环境的胞外体能从亲本细胞携带选择性RNA的意外发现。根据本发明,该发现可以用于通过胞外体向受体细胞转移遗传物质。通过向受体细胞转移核酸,胞外体会影响其它细胞(受体细胞)的蛋白质机能,并因此影响蛋白质内含物。本发明首次证明利用胞外体能够将核酸,如RNA、DNA在细胞或器官之间有意地转移,从而可以用于哺乳动物细胞的基因调控和治疗。
相关技术描述
胞外体是由多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中的内吞源性的小膜囊泡。胞外体的直径大小在30和100nm之间。其表面由来自供体细胞细胞膜的脂双层构成,而且其含有来自产生该胞外体的细胞的胞浆,并且从表面的亲本细胞表达膜蛋白。
胞外体根据其衍生细胞的细胞类型而表现不同的组成和功能。不存在“胞外体特异性”蛋白;然而在这些囊泡内鉴定出的几种蛋白质与反映其来源的内含体和溶酶体有关。多数胞外体富含MHC I和MHC II(主要组织相容性复合体I和II;其对于将抗原提呈给如T-淋巴细胞等免疫活性细胞很重要)、四跨膜蛋白(tetraspanins)、几种热休克蛋白、细胞骨架成分(如肌动蛋白和微管蛋白)、细胞膜融合相关蛋白、信号转导蛋白和胞浆酶。
胞外体由多种细胞产生,包括上皮细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)及树突细胞(DC)。在人类中,胞外体已经在血浆、尿、支气管肺泡灌洗液、肠上皮细胞和肿瘤组织中发现。
胞外体的所有功能并未全部阐明,但数据强烈显示了它们介导细胞间通讯。这种通讯能以不同方式发生。首先,胞外体能以细胞与细胞间相互作用相似的方式结合到细胞表面受体。其次,胞外体能粘附至细胞膜上并为细胞提供新的受体和特性。因此,胞外体也能与靶细胞融合并在两种细胞类型间交换膜蛋白和胞浆。
我们对了解特定的由肥大细胞释放的胞外体的内含物及生物学功能方面做了特别的努力。在蛋白质组分析中,我们发现这些胞外体含有比先前所了解的更多的蛋白质。然而,我们研究中的独特发现是我们发现源自肥大细胞的胞外体中含有大量选择性RNA。此外,不同的受体细胞的使用表现出胞外体RNA的吸收,这表明了遗传物质从胞外体向受体细胞内的转移,这种转移将依次导致靶细胞内特定蛋白质的翻译。
考虑到胞外体蛋白内含物及其与不同受体细胞通讯的能力,尤为有用的是能够修改胞外体的基因内含物,以便添加或调节受体细胞的基因。本申请描述了利用胞外体携带特定遗传物质和将其转移到受体细胞的能力的方法。在该方法中,受体的功能及其保持存活、进一步发育、增殖或成熟的能力受到影响。
该方法独特,且不同于任何先前所描述的方法。一些专利和专利申请经由胞外体蛋白与免疫细胞之间的相互作用,通过其刺激或抑制功能利用胞外体来影响免疫系统,并通过影响免疫系统来治疗病毒性疾病。已经表明胞外体蛋白质能通过突变来修饰以影响免疫系统。然而,我们尚未发现任何专利或专利申请或任何公开可用的信息描述或表明了胞外体向细胞转移遗传物质或核酸的用途。
发明概述
本发明公开了通过胞外体向受体细胞递送核酸构建体的新方法。本发明的方法包括利用亲本细胞将RNA和DNA构建体转移到胞外体内(亲本细胞的转化、转染、或修饰),或使用如转化和转染等传统方法,直接将核酸引入胞外体。本发明的方法是一种非常好的基因治疗手段,该手段通过向受体细胞引入遗传物质来补偿异常基因或引入产生蛋白质的RNA或DNA,该蛋白质影响受体细胞功能或存活能力或发育能力或成熟能力。对于基因治疗来说,通常使用病毒或脂质体作为载体来转移遗传物质,这是由于它们能通过感染细胞来递送新的基因。与传统方法相比,使用胞外体有很多优势,最重要地是,胞外体源自细胞,甚至可能是受体本身的细胞,因此对于免疫系统来说不是外来个体,从而能避免不利的免疫反应。因此对于用于基因调控和治疗来说,胞外体容易产生、分离和修饰。
通过以下内容和随附的权利要求书,本发明的其它目的和特征将更加明显。
发明详细说明及其优选实施方式
正如本发明所述,利用胞外体囊泡向细胞的胞质或核转移遗传物质、核酸能治疗遗传疾病、细胞或身体功能障碍、诱导或抑制细胞死亡(细胞凋亡)、改变细胞老化、诱导耐受、重新导向现有的免疫应答、改变胞内活性或细胞行为。它还能用于遗传病症、恶性肿瘤疾病或涉及如下细胞的疾病的各种基因治疗:免疫细胞或身体内的任何其它细胞类型,包括脉管组织、上皮细胞、间质细胞、肌肉组织、骨骼系统、神经系统、肝细胞、肾细胞、肠细胞、肺细胞、皮肤细胞或身体内的任何其它细胞。
本发明中描述的能通过胞外体转移的遗传物质是:microRNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、调节RNA、非编码和编码RNA、DNA片段、和DNA质粒,包括各类核酸。将遗传物质(DNA或RNA的构建体、或各类核酸)直接转移至胞外体的方法是转化、转染和显微注射。
遗传性不同的胞外体可以利用其供体细胞或者通过向其中引入特定核酸进行分离,以用于进一步向受体细胞递送。产生含有一组遗传物质的不同方法描述如下。
利用胞外体产生细胞来产生遗传性不同的胞外体以用于进一步向受体细胞递送的不同过程包括:
(a)来自不同供体细胞的胞外体
含有不同组遗传物质的胞外体可以从不同的供体细胞分离(如B淋巴细胞和T淋巴细胞、肥大细胞和树突细胞)以用于进一步向受体细胞递送。由于供体细胞的作用和环境不同而引起其基因型不同,因此来自不同细胞类型的分离胞外体产生了不同基因型的胞外体。
(b)来自不同条件的胞外体
胞外体产生细胞在某种条件下的生长会引起细胞改变,随后形成经遗传修饰的胞外体。然后这些胞外体可用于将一组核酸转移到受体细胞。
(c)来自不同人或疾病的胞外体
来自不同人或疾病的胞外体包含不同组的核酸。由于供体细胞来源和条件不同使得胞外体的基因型不同。含有单一组核酸的胞外体能被分离以用于进一步向受体细胞递送核酸。
(d)来自经遗传修饰的供体细胞的胞外体
胞外体产生细胞内的基因破坏或突变引起经遗传修饰的胞外体,这种胞外体能用于向受体细胞递送其核酸。胞外体内存在的各种核酸的表达可能受到胞外体产生细胞的基因操作的影响(消除或上调/下调)。例如,胞外体产生细胞内的基因破坏导致胞外体内缺少相应的mRNA。同时,胞外体产生细胞内基因的上调或下调影响胞外体内相应mRNA的量。
特定核酸构建体(克隆基因、DNA片段和质粒、microRNA、siRNA、编码或非编码的DNA和RNA)能通过经遗传修饰的胞外体转移到受体细胞。核酸构建体可以使用标准技术来制造,如克隆、分离和RNA或DNA序列的扩增,以用于进一步到向胞外体内转化。
(a)利用其供体细胞将特定构建体插入胞外体
新的构建体(RNA和DNA)能利用其供体细胞而引入胞外体。核酸构建体能被引入供体细胞(胞外体产生细胞),从而通过细胞内功能将其自身的转录物或构建体转位至胞外体内。
(b)特定构建体直接插入胞外体
胞外体能从不同的来源分离,如体外生长的细胞、人体或源于人和动物的细胞。RNA或DNA的基因构建体能通过如体外转化、转染和显微注射等传统的分子生物技术直接引入这些胞外体。经遗传修饰的胞外体能进一步用于向受体细胞转移核酸。
本发明还涉及不包含任何实质量核酸的空胞外体。这些胞外体可以用来插入感兴趣的DNA。
本发明还涉及包含至少一种外加异源核酸的胞外体,此处“异源”一词表示添加的核酸或酸不是衍自原胞外体本身。因此添加的核酸可能源自其它物种;或来自胞外体以外的其它器官或组织或来自不同供体细胞、不同条件下、不同人或疾病或来自经遗传修饰的供体细胞。
核酸可以是上述能被转移的任何遗传物质。
本发明还涉及包含至少一种外加异源核酸的胞外体在制备药物中的应用。
制备经遗传修饰的胞外体的方法
遗传物质转化或转染至胞外体内
在分子生物学中,术语“转化”和“转染”更普遍地用于描述DNA和RNA转移的机制,其是1944年由Oswald Avery、Colin Macleod和Maclyn McCarty首次提出(Lederberg J.,Genetics.1944Feb;136(2):423-6)。
(a)电穿孔
利用这种方法,通过经由100-200V/cm的电场短暂电击,在细胞或胞外体上形成许多孔。DNA/RNA能通过电场形成的孔进入细胞或胞外体。
(b)脂质体转染
该方法通常称作转染,能用于经含有期望基因构建体的囊泡介导的DNA/RNA的细胞或胞外体转化。囊泡与细胞膜融合(类似于肉汤表面两个油滴的融合)且囊泡与细胞中的内含物相结合。市场上有许多即可使用的转染试剂盒,如来自Panomics的DeliverX siRNA转染试剂盒(目录号DX0002)、来自Roche的HD转染试剂和来自Invitrogen的LIPOFECTAMINETM2000(目录号11668-027)。
(c)利用热激转化
在二价阳离子如Ca2+(在CaCl2中)存在下冷却细胞/胞外体,使其膜对于RNA或DNA质粒/片段具有渗透性。将细胞/胞外体与DNA一起孵育,然后短暂热激(42℃,30~120秒)使DNA进入细胞。该方法对环状质粒DNA效果更好。
以上方法简单描述了如何实现经遗传修饰的胞外体向受体细胞转移RNA和DNA。分离含有RNA/DNA或经修饰含有感兴趣基因的胞外体并将其移位到受体细胞以影响其生物学功能或存活。因此,胞外体将其中的内含物释放到靶细胞的细胞质中,这继而导致mRNA在靶细胞内通过细胞自身蛋白机器翻译为特定蛋白质。此外,胞外体能够携带并转移编码和非编码的小RNA,如能调控特定基因翻译的microRNA和siRNA。
本发明所述的作为DNA或RNA载体囊泡的胞外体可以用来治疗造血、非造血、干细胞和器官的遗传性疾病。胞外体囊泡还能用作DNA或RNA构建体的载体以用于治疗人或动物的微生物感染或疾病或功能障碍,或转移任何生物膜的遗传物质。
由于人CD4 T细胞是HIV感染的靶细胞,可以用胞外体向被感染的T细胞运载和转移的,尤其被设计用于沉默病毒RNA翻译的RNA或DNA构建体(siRNA、RNAi或DNA)来治疗被感染细胞。因此,本发明公开了能将其核酸转移到CD4 T细胞的胞外体可以用于治疗HIV感染的T细胞及T细胞恶性瘤如淋巴瘤或淋巴细胞性白血病。
通过改变胞外体产生细胞的条件来改变或修饰胞外体的遗传物质是通过改变PH、温度、生长条件,或使用针对胞外体产生细胞的抗体/化学品来实现的。这会导致核酸内含物的变化。另外,胞外体产生细胞中细胞因子、趋化因子及其它基因的过度表达或抑制可用于改变或修饰胞外体的基因内含物。
利用胞外体囊泡向特定细胞转移正义或反义RNA来关闭基因而不是添加新的基因引起特定基因下调(减缓)或翻译的阻止。这种方法称作RNA干扰(siRNA)。
本发明使得在给病人或受体人或动物给药干细胞之前,在体外将遗传物质传递到从患者或供体获得的干细胞成为可能。
为了将核酸给予受体细胞或组织,可以通过将胞外体添加至体外细胞培养物中或静脉注射这些胞外体或以该领域已知的任何其它体内途径将含有DNA或RNA的胞外体给予细胞。胞外体能靶向体内的任何细胞,包括心血管系统细胞、骨骼肌细胞、关节细胞、神经细胞、肠细胞、肺细胞、肝细胞或肾细胞、或免疫系统细胞、或人或动物体内具有任何功能或功能障碍的各种类型细胞,包括恶性肿瘤细胞。
如本发明所公开的,胞外体可用来递送遗传物质到受体细胞,以便在人或动物的任何细胞中利用细胞本身的蛋白质机能产生任何药物或任何药物前体,或者影响任何药物的功能或代谢。
为了避免不期望的或无关遗传物质的干扰,优选利用不含遗传物质的胞外体。空胞外体可用于直接转移到受体细胞或者将特定基因(RNA或DNA)直接转染或转化到胞外体中。
源自肥大细胞的胞外体的检测
分离自鼠肥大细胞系MC/9(ATCC Manassas,VA,USA,编号:CRL-8306)释放的胞外体,将其吸附在经碳涂覆的栅格上,用电子显微镜进行检测。为了检测胞外体特异性表面蛋白CD63,还从原代骨髓肥大细胞(BMMC)和细胞系MC/9二者中纯化了胞外体。胞外体粘附在醛珠上并用CD63抗体,随后用连接PE的二抗染色。使用流式细胞仪分析这些珠子,确定在源自BMMC和MC9的胞外体二者的表面均存在CD63。
胞外体蛋白的鉴定
为了解源自肥大细胞的胞外体的生物学功能,利用nano-flow LC-MS/MS分析蛋白质内含物。从分离的胞外体中提取总蛋白质内含物并在SDS-PAGE胶上收集。将蛋白质带进行胰蛋白酶切后通过LC-MS/MS分析。通过MASCOT(Matrix Science,London)程序检索所有串联质谱的结果来鉴定。结果显示,这些胞外体含有比先前所知的更大量的蛋白质。约鉴定出150种蛋白,其中的许多与细胞转录、翻译和蛋白质折叠有关。鉴定出的蛋白包括一些核糖体蛋白以及热休克蛋白、分子伴侣、膜联蛋白(annexin)、细胞骨架蛋白、膜结合蛋白质,如CD63、CD54、CD43和I类MHC。
源自肥大细胞的胞外体的DNA和RNA的检测
由于一定数目的鉴定蛋白与RNA和转录机制有关,我们假设胞外体中也含有DNA和/或RNA。为了验证这一点,我们进行了对胞外体和完整的胞外体产生肥大细胞中的RNA和DNA提取。利用分光光度技术并在琼脂凝胶上检测DNA和RNA的存在。在胞外体样品中未检测到DNA,但是却能从胞外体中检测到大量的选择性RNA。具体地,胞外体RNA中含有极低量或检测不出的核糖体RNA,这表示存在其它类型的RNA,即mRNA。
胞外体RNA的微阵列分析
为了表征源自肥大细胞的胞外体中的RNA,使用来自肥大细胞及其胞外体的RNA来施用Affymetrix小鼠DNA微阵列(Affymetrix)。结果显示胞外体携带来自约2500种基因的mRNA,其是在母肥大细胞中表达的基因的约10%。此外,基因图谱分析显示胞外体与其亲本细胞之间的mRNA有实质不同。胞外体中最丰富的转录物与其亲本细胞中丰富的转录物不同,这显示了胞外体RNA的选择性。有趣的是,胞外体携带了来自180种转录物在其母肥大细胞中并不存在的基因的mRNA。结果表明mRNA以高度选择的方式被转运至胞外体,并且亲本细胞似乎只表达一定数目专门用于胞外体运载的基因。
来自BMMC胞外体的RNA的检测
为了鉴定来自非细胞系源的胞外体中的RNA,从小鼠中收获骨髓细胞,培养成肥大细胞(骨髓源性肥大细胞:BMMC)达4周。在最后48小时,细胞在放射性尿嘧啶存在下培养(参见实施例1)。分离来自培养物的胞外体,用闪烁计数检测经由放射性标记的RNA。结果表明在胞外体中能检测到结合到细胞RNA的放射性尿嘧啶。源自骨髓的胞外体的RNA量不如肥大细胞系中的丰富,这可以通过用于收获的BMMC细胞数量较少以及这些细胞的体外生长条件来解释。
通过胞外体在细胞间转移RNA
为了验证胞外体是否能将其所含的mRNA转移到另一细胞,将含有放射性尿嘧啶mRNA的源自肥大细胞的胞外体添加到培养的树突细胞(DC)、CD4 T细胞和MC/9肥大细胞中。在不同的间隔时间取培养物样品,并通过离心分离并洗涤细胞。分离来自受体细胞的RNA并用闪烁体测定放射性尿嘧啶。最重要的是,暴露于胞外体的DC、CD4和MC/9含有增加量的放射性尿嘧啶,因此是从胞外体吸收的。结果表明源自肥大细胞的胞外体能将RNA转移至其它细胞,例如DC、CD4和MC/9细胞。
数据显示mRNA能通过胞外体在两个哺乳动物细胞间转移。生物学上,这表示一个细胞能通过经由胞外体的信号影响其它细胞蛋白质的产生。由于胞外体可用作载体将mRNA或DNA探针递送到靶细胞,如恶性肿瘤细胞或免疫系统细胞,因此这具有实质性的生物技术用途。因此,根据本发明,胞外体提供了一种基因调控和治疗的载体,其可能没有其它基因治疗载体的副作用,如病毒或其它类型的脂质体。
参考以下实施例将更清楚地理解本发明的特征,但不能解释为对本发明的限定。
实施例1
细胞制备
按照制造商的建议培养MC/9细胞(ATCC),用Ti70转子(Beckman optima LE-80k超速离心机)在120,000g超速离心90分钟来去除血清、大鼠T-Stim和FBS中存在的胞外体。人肥大细胞系HMC-1(Joseph Butterfield医生,梅奥诊所(Mayo Clinic),USA)在含有10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和1.2mMα-硫代甘油的IMDM中培养。将HMC-1细胞在1μM钙离子载体存在下培养30min以释放胞外体。按照先前所述的方法(Razin,E.et al.Interleukin 3:A differentiation and growth factor for themouse mast cell that contains chondroitin sulfate E proteoglycan.JImmunol.132,1479-1486(1984))通过在IL-3(R&D系统)存在下培养来自7~10周龄的雄性BALB/c的股骨的骨髓细胞来制备骨髓肥大细胞(BMMC)。培养4周后收获细胞,根据形态分析其中含有96%的纯MCs。在最后48小时,在完全培养基中以3×106个细胞/ml培养BMMC,该完全培养基中含有补充了10ng/ml IL-4(R&D-系统)的经超速离心的FBS,在一些实验中存在1μl/ml的3H-尿嘧啶(Amersham Biosciences)。为培养CD4+T细胞,收集小鼠脾脏,通过70μm的过滤器,然后通过30μm的过滤器。按照制造商的说明书,通过使用富含小鼠CD4+T细胞的鸡尾酒(Stemcell Technologies)的阴性选择纯化CD4+T细胞。通过流式细胞仪分析,CD4+T细胞的纯度介于89~91%之间。在平底48孔板上,在含有10%FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中以1×106个细胞/ml来培养这些细胞。
实施例2
胞外体纯化
按照先前所描述的方法(Raposo,G.et al.B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.J.Exp.Med.183,1161-1172(1996)),通过差速离心自MC/9、BMMC和HMC-1的上清液制备胞外体。收获细胞,在500g离心10min去除细胞,然后在16,500g离心20min,随后通过0.22μm的过滤器除去细胞碎片。通过在120,000g超速离心(Beckman Ti70转子)70min使胞外体形成小球。将胞外体小球用PBS洗涤一次以用于质谱。利用BCATM蛋白检测试剂盒(Pierce)测定胞外体中蛋白质的含量。将120,000g胞外体小球悬浮在蔗糖梯度液中(0.25~2M蔗糖,20mM Hepes/NaOH,PH 7.2)进行密度梯度实验。将胞外体溶解在2.5M蔗糖中,并将梯度液置于胞外体悬浮液上。按照(Rapso et al 1996)将梯度液在100,000g离心15h。简单地,从试管底部快速收集梯度部分(10×3.8ml),用10ml PBS稀释后在150,000g超速离心2h(Beckman Ti70转子),通过(Invitrogen)提取小球。
实施例3
RNA、DNA和蛋白质的分离
按照制造商的方案,用(Invitrogen)或小型试剂盒(Qiagen)分离RNA、DNA和蛋白质。对于microRNA和总RNA的共纯化,先后用Trizol和小型试剂盒提取RNA。将细胞和胞外体在RLT缓冲液(Qiagen)中破坏并均质化,向样品中添加3.5体积的100%甲醇,然后使用小型旋转柱。其它过程按照制造商的方案进行。
实施例4
向胞外体中引入DNA/RNA片段或构建体
特定构建体直接插入胞外体
胞外体能从不同的来源分离得到,如体外生长细胞、人体、或源自人或动物的细胞。可以利用传统分子生物学技术(如体外转化、转染和显微注射)将RNA或DNA的基因构建体直接引入这些胞外体中。
实施例5
将含有DNA或RNA的胞外体给予细胞
转移实验
在分离胞外体前,细胞在补充有1μl/ml3H-尿嘧啶的完全培养基中培养72h以标记MC/9胞外体RNA。按照分离方案分离胞外体,通过超滤(10kDa,Millipore)洗涤除去游离的核苷。标记开始时以供体细胞与受体之间8∶1的比率将胞外体添加到MC/9、CD4+和HMC-1细胞中。在0h和24h收获细胞并将其洗涤两次,通过小型试剂盒分离RNA,并用闪烁计数测量放射性RNA的信号。不使用补充有1μl/ml 3H-尿嘧啶的培养基的供体细胞用相同的方法处理,并用作阴性对照。
在生物体外翻译
总胞外体RNA用小型试剂盒纯化,其中0.5μg用于翻译。按照制造商的建议,使用体外兔裂解物翻译试剂盒(Promega Corporation)将胞外体mRNA翻译成蛋白质。不含胞外体RNA的样品以同样的方式处理,并用作阴性对照。翻译过程完成后,用丙酮沉淀总蛋白质,并用RC DC蛋白质检测(BioRad)进行测定。利用2D-PAGE、BioRad仪器及建议比较样品(含有和不含胞外体RNA)的蛋白质内含物。用SyproRuby(BioRad)使2D-溶胶显像,并用磷光影像分析仪(phosphoimager)使其数字化。比较样品的蛋白质点,并用LC-MS/MS和MASCOT先后对新产生蛋白质的选择物进行切割、胰蛋白酶切和鉴定。比较小鼠来源的新产生蛋白质与DNA微阵列分析鉴定出的基因。
在生物体内翻译
在三个不同时间点(0h、3h、6h),将MC/9胞外体(1000μg)添加到HMC-1细胞(8×106)中,并将细胞培养约24h。收获HMC-1细胞,洗涤,根据蛋白质组核心设施(ProteomicsCore facility)通过2D-PAGE分离细胞的总蛋白质。不含胞外体的样品做相同处理,并用作阴性对照。用PDQUEST检测新产生的蛋白质,切出96个点,用MALDI-tof进行鉴定,然后根据蛋白质组核心设施(哥德堡大学)通过MASCOT程序检索。
随后胞外体将核酸递送至受体细胞,从而影响它们的生物学功能或存活。
实施例6
不含遗传物质的胞外体的制备
空胞外体用于直接向受体细胞转移或将特定基因(RNA或DNA)直接转染/转化到胞外体内。如本领域技术人员所知,制备空胞外体(不含遗传物质)的方法有多种,包括紫外曝露、携带RNA进入胞外体的蛋白质的突变,以及电穿孔和化学处理以胞外体膜上开孔。这些方法包括能修饰任何核酸向胞外体的运载的任何蛋白质的突变/缺失。
实施例7
小鼠MC/9胞外体转移后在人肥大细胞中产生小鼠蛋白
为了测试转移小鼠MC/9胞外体后能否在人肥大细胞内产生小鼠蛋白,我们先后用2D-PAGE和MALDI-tof测定了受体细胞中小鼠蛋白的存在。将人细胞与小鼠MC/9胞外体一起培养24h后,鉴定出96个新的或增强的点。有趣的是,从人细胞中鉴定出三种在MC/9胞外体中不存在的明显的小鼠蛋白。这三种蛋白质是:小鼠CDC6(O89033)、小鼠锌指蛋白271(P15620)和小鼠CX7A2(P48771)。前两种蛋白的mRNA出现在两个微阵列实验中,最后一种蛋白出现在实施的所有四个微阵列中,这暗示胞外体向受体细胞递送的mRNA能被翻译成蛋白质。
人肥大细胞HMC-1与小鼠MC/9胞外体共同孵育不到24小时时,MC/9胞外体向HMC-1细胞递送的蛋白质组结果表明小鼠蛋白能在人肥大细胞中产生。将两种凝胶间的蛋白质进行比对,通过MALDI-tof鉴定出96种新产生的蛋白质,并且小鼠蛋白是由胞外体mRNA生成的。
实施例8
胞外体用作恶性肿瘤疾病的基因治疗
胞外体是由取自患有恶性肿瘤疾病患者的恶性细胞产生的。这些胞外体经过处理包含各种类型或特异性的基因构建体以重新导入患者。然后来自恶性肿瘤细胞的胞外体优选与同类型的将DNA和/或RNA构建体特异性递送到恶性肿瘤细胞的细胞融合,从而作为恶性肿瘤疾病的基因治疗。该过程按照实施例1-6进行,但胞外体是由恶性肿瘤细胞产生的。
尽管本发明通过引用具体实施方式进行了描述,应该了解允许有大量的变换、修改和实施方式;相应地,所有这些变换、修改和实施方式应被看作是在本发明的精神和范围内。
Claims (12)
1.一种体外生产含有选择的核酸构建体的胞外体的方法,包括:
a)从体外生长的细胞或从已经获自人或动物的细胞中分离大小在30和100nm之间的胞外体;和
b)将所述选择的核酸构建体直接导入分离的胞外体。
2.权利要求1的方法,其中所述选择的核酸构建体选自由mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、调节RNA、非编码RNA、编码RNA、DNA片段和DNA质粒组成的组。
3.权利要求1的方法,其中所述选择的核酸构建体是RNA。
4.权利要求1的方法,其中所述选择的核酸构建体是siRNA。
5.权利要求1的方法,其中使用选自由下列方法组成的组的方法将所述选择的核酸构建体直接导入所述胞外体:转化胞外体、转染胞外体和将选择的遗传物质显微注射至胞外体内。
6.权利要求1的方法,其另外包括以下步骤:
c)将所述选择的核酸构建体从所述胞外体转移到体外受体细胞。
7.权利要求6的方法,其中通过添加所述胞外体至体外细胞培养物,将所述选择的核酸构建体转移到所述受体细胞。
8.权利要求6的方法,其中所述受体细胞是先前获自供体的干细胞。
9.权利要求6的方法,其中所述受体细胞包括能够用于治疗HIV感染的T-细胞以及T-细胞恶性肿瘤的方法中的CD4T-细胞。
10.权利要求9的方法,其中导入胞外体的所述选择的核酸构建体包括特别被设计用于沉默HIV RNA翻译的RNA或DNA构建体。
11.权利要求1的方法,其中所述胞外体是从恶性肿瘤细胞中分离的。
12.权利要求1的方法,其另外包括使用所述胞外体制备药物的步骤。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US79714906P | 2006-05-03 | 2006-05-03 | |
US60/797,149 | 2006-05-03 | ||
US11/799,148 US9085778B2 (en) | 2006-05-03 | 2007-04-30 | Exosome transfer of nucleic acids to cells |
US11/799,148 | 2007-04-30 | ||
CNA2007800154690A CN101432432A (zh) | 2006-05-03 | 2007-05-02 | 核酸向细胞的胞外体转移 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2007800154690A Division CN101432432A (zh) | 2006-05-03 | 2007-05-02 | 核酸向细胞的胞外体转移 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105838739A true CN105838739A (zh) | 2016-08-10 |
Family
ID=38655808
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201511022904.5A Pending CN105838739A (zh) | 2006-05-03 | 2007-05-02 | 核酸向细胞的胞外体转移 |
CN201511027801.8A Pending CN105886535A (zh) | 2006-05-03 | 2007-05-02 | 核酸向细胞的胞外体转移 |
CN201511020635.9A Pending CN105821081A (zh) | 2006-05-03 | 2007-05-02 | 核酸向细胞的胞外体转移 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201511027801.8A Pending CN105886535A (zh) | 2006-05-03 | 2007-05-02 | 核酸向细胞的胞外体转移 |
CN201511020635.9A Pending CN105821081A (zh) | 2006-05-03 | 2007-05-02 | 核酸向细胞的胞外体转移 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US9085778B2 (zh) |
EP (3) | EP2905339A1 (zh) |
CN (3) | CN105838739A (zh) |
ES (1) | ES2539760T3 (zh) |
WO (1) | WO2007126386A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10959952B2 (en) | 2015-06-10 | 2021-03-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Use of exosomes for the treatment of disease |
Families Citing this family (88)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9085778B2 (en) | 2006-05-03 | 2015-07-21 | VL27, Inc. | Exosome transfer of nucleic acids to cells |
US20110053157A1 (en) * | 2008-02-01 | 2011-03-03 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions |
CA2742324A1 (en) | 2008-10-30 | 2010-06-03 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Methods for assessing rna patterns |
EP2350320A4 (en) | 2008-11-12 | 2012-11-14 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | METHODS AND SYSTEMS FOR USING EXOSOMES TO DETERMINE PHENOTYPES |
WO2010105277A1 (en) | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Egen, Inc. | Compositions and methods for the delivery of biologically active rnas |
EP3569254B1 (en) * | 2009-04-17 | 2022-07-20 | Oxford University Innovation Limited | Composition for delivery of genetic material |
WO2011031877A1 (en) | 2009-09-09 | 2011-03-17 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles |
US20130029339A1 (en) | 2009-09-09 | 2013-01-31 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in analyzing kras mutations |
WO2011049059A1 (ja) * | 2009-10-22 | 2011-04-28 | 国立大学法人岐阜大学 | Rna内包キャリア組成物 |
WO2011062244A1 (ja) * | 2009-11-18 | 2011-05-26 | Kuroda Masahiko | キャリア、その製造方法およびその用途 |
ES2713852T3 (es) | 2009-12-01 | 2019-05-24 | Translate Bio Inc | Derivado de esteroides para la administración de ARNm en enfermedades genéticas humanas |
WO2011106376A2 (en) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in the treatment of medical conditions |
CA2791905A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Biomarkers for theranostics |
JP2013526852A (ja) | 2010-04-06 | 2013-06-27 | カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス | 疾患に対する循環バイオマーカー |
CN102858375B (zh) | 2010-05-26 | 2016-08-10 | 江苏命码生物科技有限公司 | 载有干扰核糖核酸的细胞微粒子、其制备方法及其应用 |
EP2578236B1 (en) * | 2010-05-26 | 2016-03-30 | Micromedmark Biotech Co., Ltd | PREPARATION OF MICROVESICLE-siRNA COMPLEXES AND USE THEREOF IN AIDS TREATMENT |
WO2012020308A2 (en) * | 2010-08-13 | 2012-02-16 | The University Court Of The University Of Glasgow | Cellular and molecular therapies |
WO2012031008A2 (en) | 2010-08-31 | 2012-03-08 | The General Hospital Corporation | Cancer-related biological materials in microvesicles |
US20130295574A1 (en) | 2010-11-10 | 2013-11-07 | Exosome Diagnostics, Inc. | Method for Isolation of Nucleic Acid Containing Particles and Extraction of Nucleic Acids Therefrom |
US8853377B2 (en) | 2010-11-30 | 2014-10-07 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | mRNA for use in treatment of human genetic diseases |
WO2012091136A1 (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-05 | 学校法人東京医科大学 | 発現ベクター、それを用いたキャリアの製造方法およびその用途 |
WO2012162563A2 (en) | 2011-05-24 | 2012-11-29 | The Regents Of The University Of California | Method for exosomal biomarker detection by electric field-induced release and measurement |
IL280771B2 (en) | 2011-06-08 | 2024-03-01 | Shire Human Genetic Therapies | Preparations of lipid nanoparticles and methods for administration of mRNA |
GB201121070D0 (en) * | 2011-12-07 | 2012-01-18 | Isis Innovation | composition for delivery of biotherapeutics |
US10227593B2 (en) | 2011-12-13 | 2019-03-12 | Henry Ford Health System | Methods, systems, and compositions for cell-derived/vesicle-based microRNA delivery |
EP3336190B1 (en) * | 2011-12-13 | 2021-02-24 | Henry Ford Health System | Methods, systems, and compositions for cell-derived/vesicle-based microrna delivery |
EP2859102A4 (en) | 2012-06-08 | 2016-05-11 | Shire Human Genetic Therapies | NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF |
WO2014041087A1 (en) | 2012-09-12 | 2014-03-20 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Muscle secretome and uses thereof |
US9512425B2 (en) * | 2012-10-23 | 2016-12-06 | Cornell University | Inhibiting migration of cancer cells |
CN103865942A (zh) * | 2012-12-18 | 2014-06-18 | 常州碳宇纳米科技有限公司 | 一种可提高基因转染效率的纳米粒子和基于该粒子的基因转染试剂的制备 |
US10308959B2 (en) | 2013-01-18 | 2019-06-04 | Henry Ford Health System | Methods, systems, and compositions relating to MiRNA-146a |
WO2014113822A1 (en) | 2013-01-18 | 2014-07-24 | Henry Ford Health System | Methods, systems, and compositions relating to mirna-146a |
WO2014159662A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | University Of Miami | Method for isolation and purification of microvesicles from cell culture supernatants and biological fluids |
DK2970955T3 (en) | 2013-03-14 | 2019-02-11 | Translate Bio Inc | METHODS FOR CLEANING MESSENGER RNA |
KR20210122917A (ko) | 2013-03-14 | 2021-10-12 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | Cftr mrna 조성물 및 관련 방법 및 사용 |
US10538570B2 (en) * | 2013-09-30 | 2020-01-21 | Northwestern University | Targeted and modular exosome loading system |
EA034103B1 (ru) | 2013-10-22 | 2019-12-27 | Транслейт Био, Инк. | СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК |
US11224642B2 (en) | 2013-10-22 | 2022-01-18 | Translate Bio, Inc. | MRNA therapy for argininosuccinate synthetase deficiency |
US10036018B2 (en) | 2014-03-10 | 2018-07-31 | Carlo M. Croce | Compositions and methods for treating cachexia |
WO2015161184A1 (en) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | University Of Massachusetts | Exosomal loading using hydrophobically modified oligonucleotides |
EP3134506B1 (en) | 2014-04-25 | 2019-08-07 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
CA2962081A1 (en) * | 2014-09-26 | 2016-03-31 | Exerkine Corporation | Exosomes useful to treat lysosomal storage disease |
EP3250706A4 (en) | 2015-01-30 | 2018-09-05 | The Johns Hopkins University | Extracellular vesicles for agent delivery |
US10624849B2 (en) * | 2015-09-28 | 2020-04-21 | Northwestern University | Targeted extracellular vesicles comprising membrane proteins with engineered glycosylation sites |
WO2017054086A1 (en) * | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Exerkine Corporation | Treatment of genetic myopathies using bioengineered exosomes |
WO2017124000A1 (en) | 2016-01-14 | 2017-07-20 | The Regents Of The University Of California | 3d-exoquant method for the analysis of surface molecules and quantification of tissue-specific exosomes in biological fluids |
WO2017147720A1 (en) * | 2016-03-04 | 2017-09-08 | Exerkine Corporation | Method for treating a central nervous system disorder |
MX2018011202A (es) * | 2016-03-15 | 2019-03-28 | Codiak Biosciences Inc | Vesiculas de membrana terapeuticas. |
ES2861650T3 (es) | 2016-05-06 | 2021-10-06 | Unicyte Ev Ag | Portadores farmacéuticos que contienen miARN para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas provocadas por hiperglucemia |
US10590171B2 (en) | 2016-10-28 | 2020-03-17 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Exosomes and methods of making and using the same |
AU2018224326B2 (en) | 2017-02-27 | 2024-01-04 | Translate Bio, Inc. | Novel codon-optimized CFTR mRNA |
WO2018170332A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Nutech Ventures | Extracellular vesicles and methods of using |
KR20200034668A (ko) | 2017-05-08 | 2020-03-31 | 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. | 막 융합을 촉진시키기 위한 조성물 및 그의 용도 |
EP3624824A1 (en) | 2017-05-16 | 2020-03-25 | Translate Bio, Inc. | Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr |
US10709797B2 (en) | 2017-08-16 | 2020-07-14 | City University Of Hong Kong | Isolation of extracellular vesicles (EVs) from red blood cells for gene therapy |
WO2019040920A1 (en) | 2017-08-25 | 2019-02-28 | Codiak Biosciences, Inc. | PREPARATION OF THERAPEUTIC EXOSOMES USING MEMBRANE PROTEINS |
EP3724334A1 (en) | 2017-12-14 | 2020-10-21 | Unicyte EV AG | Pharmaceutical carriers containing mirnas for use in the treatment of renal cancer |
MX2020006672A (es) | 2017-12-28 | 2020-08-31 | Codiak Biosciences Inc | Exosomas para inmunooncologia y terapia antiinflamatoria. |
CN112272706A (zh) | 2018-02-17 | 2021-01-26 | 旗舰先锋创新V股份有限公司 | 用于膜蛋白递送的组合物和方法 |
CA3095136A1 (en) * | 2018-03-28 | 2019-10-03 | Board Of Regents,The University Of Texas System | Use of exosomes for targeted delivery of therapeutic agents |
US20210238552A1 (en) | 2018-08-10 | 2021-08-05 | Unicyte Ev Ag | Extracellular vesicles loaded with an exogenous molecule |
CA3108544A1 (en) | 2018-08-24 | 2020-02-27 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
US20230068547A1 (en) | 2018-11-14 | 2023-03-02 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Compositions and methods for compartment-specific cargo delivery |
US11766484B2 (en) | 2019-01-03 | 2023-09-26 | International Business Machines Corporation | Exosome vessels for delivery of molecular cargo |
JP2022524951A (ja) | 2019-02-27 | 2022-05-11 | アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド | 腫瘍、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境にコロニー形成するよう操作した免疫刺激性細菌 |
WO2021041473A1 (en) * | 2019-08-27 | 2021-03-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Engineered exosomes for targeted delivery |
EP4025698A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Cd24-associated particles and related methods and uses thereof |
EP4041308A1 (en) | 2019-10-07 | 2022-08-17 | University of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
CA3164176A1 (en) | 2020-01-13 | 2021-07-22 | Carmine Therapeutics Pte. Ltd. | Nucleic acid loaded red blood cell extracellular vesicles |
EP4093426A1 (en) | 2020-01-24 | 2022-11-30 | University of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
EP4099984A4 (en) | 2020-02-05 | 2024-05-01 | Diadem Biotherapeutics Inc | ARTIFICIAL SYNAPSES |
IL296621A (en) | 2020-03-31 | 2022-11-01 | Sana Biotechnology Inc | Targeted lipid particles and their preparations and uses |
US20210330760A1 (en) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Methods and materials for treating osteoarthritis |
KR20230074475A (ko) | 2020-08-21 | 2023-05-30 | 더 유니버시티 오브 마이애미 | 골수-유래 중간엽 줄기 세포로부터의 미세소포를 사용한 치료의 조성물 및 방법 |
GB2603454A (en) | 2020-12-09 | 2022-08-10 | Ucl Business Ltd | Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders |
AU2022280957A1 (en) | 2021-05-28 | 2023-11-30 | Sana Biotechnology, Inc. | Lipid particles containing a truncated baboon endogenous retrovirus (baev) envelope glycoprotein and related methods and uses |
AU2022315530A1 (en) | 2021-07-20 | 2024-01-18 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses |
WO2023068770A1 (ko) * | 2021-10-18 | 2023-04-27 | 주식회사 엠디뮨 | 핵산 전달용 복합체 및 이의 용도 |
WO2023102550A2 (en) | 2021-12-03 | 2023-06-08 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for efficient in vivo delivery |
GB202117758D0 (en) | 2021-12-09 | 2022-01-26 | Ucl Business Ltd | Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders |
WO2023147348A1 (en) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | Hc Bioscience, Inc. | Universal suppressor trnas and uses thereof |
WO2023144127A1 (en) | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon administration, and uses |
US20230390341A1 (en) | 2022-04-19 | 2023-12-07 | University Of Miami | Methods and compositions for prevention and treatment of graft versus host disease |
WO2023232976A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses |
WO2024044655A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Sana Biotechnology, Inc. | Delivery of heterologous proteins |
WO2024064838A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Sana Biotechnology, Inc. | Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof |
WO2024081820A1 (en) | 2022-10-13 | 2024-04-18 | Sana Biotechnology, Inc. | Viral particles targeting hematopoietic stem cells |
WO2024088808A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-02 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon intranasal administration, and uses thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1325441A (zh) * | 1998-11-05 | 2001-12-05 | 法国国家卫生及研究医学协会 | 经修饰的胞外体及其用途 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2766205B1 (fr) * | 1997-07-16 | 2002-08-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procede |
GB9927320D0 (en) * | 1999-11-18 | 2000-01-12 | Chiron Spa | Exosome separation |
US6812023B1 (en) * | 2000-04-27 | 2004-11-02 | Anosys, Inc. | Methods of producing membrane vesicles |
US7318928B2 (en) | 2000-08-01 | 2008-01-15 | The Johns Hopkins University | Molecular vaccine linking intercellular spreading protein to an antigen |
EP1381276A4 (en) * | 2001-04-13 | 2005-02-02 | Univ Pennsylvania | METHOD FOR TREATMENT OR DEVELOPMENT SLUDGE DEGRADATION |
DE10136902A1 (de) | 2001-07-28 | 2003-02-06 | Opel Adam Ag | Kopfaufpralloptimierte Frontstruktur |
FR2827872A1 (fr) * | 2001-07-30 | 2003-01-31 | Roussy Inst Gustave | Vesicules membranaires de fluide biologique preleve in vivo, leur preparation et utilisation dans la stimulation d'une reponse immunitaire |
JP4662708B2 (ja) | 2001-08-17 | 2011-03-30 | エクソセラ・エルエルシー | エクソゾームにタンパク質を標的化する方法および組成物 |
AU2002359403A1 (en) * | 2001-11-15 | 2003-06-10 | The Regents Of The University Of California | METHODS AND COMPOSITIONS FOR REGULATION OF GENE EXPRESSION THROUGH MODULATION OF mRNA TURNOVER |
US7405292B2 (en) * | 2002-02-19 | 2008-07-29 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Cellular genes regulated by HIV-1 infection and methods of use thereof |
EP1766053A4 (en) | 2004-06-02 | 2007-12-12 | Sourcepharm Inc | MICROVESICLES CONTAINING RNA AND METHODS |
US9085778B2 (en) | 2006-05-03 | 2015-07-21 | VL27, Inc. | Exosome transfer of nucleic acids to cells |
EP3569254B1 (en) | 2009-04-17 | 2022-07-20 | Oxford University Innovation Limited | Composition for delivery of genetic material |
-
2007
- 2007-04-30 US US11/799,148 patent/US9085778B2/en active Active - Reinstated
- 2007-05-02 CN CN201511022904.5A patent/CN105838739A/zh active Pending
- 2007-05-02 ES ES07748459.0T patent/ES2539760T3/es active Active
- 2007-05-02 CN CN201511027801.8A patent/CN105886535A/zh active Pending
- 2007-05-02 EP EP15158949.6A patent/EP2905339A1/en not_active Withdrawn
- 2007-05-02 EP EP07748459.0A patent/EP2010663B1/en not_active Revoked
- 2007-05-02 WO PCT/SE2007/050298 patent/WO2007126386A1/en active Application Filing
- 2007-05-02 CN CN201511020635.9A patent/CN105821081A/zh active Pending
- 2007-05-02 EP EP18158203.2A patent/EP3378942A1/en not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-06-25 US US14/750,457 patent/US9629929B2/en active Active
-
2017
- 2017-03-31 US US15/476,844 patent/US9889210B2/en active Active
- 2017-12-28 US US15/857,539 patent/US20180236104A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-11-27 US US16/201,937 patent/US10695443B2/en active Active
-
2020
- 2020-06-18 US US16/905,719 patent/US20210000976A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1325441A (zh) * | 1998-11-05 | 2001-12-05 | 法国国家卫生及研究医学协会 | 经修饰的胞外体及其用途 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10959952B2 (en) | 2015-06-10 | 2021-03-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Use of exosomes for the treatment of disease |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150290343A1 (en) | 2015-10-15 |
US9085778B2 (en) | 2015-07-21 |
EP2010663B1 (en) | 2015-03-18 |
US9889210B2 (en) | 2018-02-13 |
CN105821081A (zh) | 2016-08-03 |
US20190111155A1 (en) | 2019-04-18 |
US10695443B2 (en) | 2020-06-30 |
EP2010663A4 (en) | 2010-11-17 |
EP2905339A1 (en) | 2015-08-12 |
EP3378942A1 (en) | 2018-09-26 |
ES2539760T3 (es) | 2015-07-03 |
US9629929B2 (en) | 2017-04-25 |
US20210000976A1 (en) | 2021-01-07 |
CN105886535A (zh) | 2016-08-24 |
WO2007126386A1 (en) | 2007-11-08 |
US20070298118A1 (en) | 2007-12-27 |
US20170258938A1 (en) | 2017-09-14 |
US20180236104A1 (en) | 2018-08-23 |
EP2010663A1 (en) | 2009-01-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105838739A (zh) | 核酸向细胞的胞外体转移 | |
Wilfinger et al. | Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity | |
CN104956226B (zh) | 用于选择性富集靶细胞的方法、组合物、试剂盒及系统 | |
Worst et al. | miR-10a-5p and miR-29b-3p as extracellular vesicle-associated prostate cancer detection markers | |
US8999714B2 (en) | Mitochondrial enhancement of cells | |
Soares et al. | Highlights of the São Paulo ISEV workshop on extracellular vesicles in cross-kingdom communication | |
CN101869715A (zh) | 载有干扰核糖核酸的细胞微粒子、其制备方法及其应用 | |
CN109762903A (zh) | miR-1246和/或TERF2IP在诊治胶质瘤中的应用 | |
Teng et al. | The hidden link of exosomes to head and neck cancer | |
Tardivon et al. | Notch signaling promotes disease initiation and progression in murine chronic lymphocytic leukemia | |
CN101432432A (zh) | 核酸向细胞的胞外体转移 | |
Jin et al. | NK cells lose their cytotoxicity function against cancer stem cell-rich radiotherapy-resistant breast cancer cell populations | |
Rossi et al. | RNA flow cytometry for the study of T cell metabolism | |
CN103354905A (zh) | 伤口愈合性准核干细胞及其使用方法 | |
Baeza-Kallee et al. | Deciphering the action of neuraminidase in glioblastoma models | |
Goldfarb et al. | Stromal inhibition of megakaryocytic differentiation correlates with blockade of signaling by protein kinase C-ε and ERK/MAPK | |
CN112656805A (zh) | 抑制ythdf1活性的物质在制备预防或治疗胃癌产品中的应用 | |
CN105473710A (zh) | 同源盒转录因子VentX调控人树突状细胞的分化和成熟 | |
Li et al. | A Novel Allogeneic Rituximab-Conjugated Gamma Delta T Cell Therapy for the Treatment of Relapsed/Refractory B-Cell Lymphoma | |
CN112662725A (zh) | 秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法 | |
CN107541495A (zh) | 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 | |
Fang et al. | Unlocking glioblastoma vulnerabilities with CRISPR-based genetic screening | |
CN117070566A (zh) | CD38基因敲除的Raji-Luc细胞系构建方法及其细胞系 | |
CN115105602A (zh) | 米托蒽醌在制备治疗il6r高表达头颈鳞癌的药物中的应用 | |
CN108066361A (zh) | 一种外泌体,其制备方法及其在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160810 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |