CN115105602A - 米托蒽醌在制备治疗il6r高表达头颈鳞癌的药物中的应用 - Google Patents

米托蒽醌在制备治疗il6r高表达头颈鳞癌的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了米托蒽醌在制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物中的应用。本发明首次发现IL6R可以作为米托蒽醌治疗头颈鳞癌的生物标志物，IL6R的表达量越高，头颈鳞癌细胞对米托蒽醌越敏感。基于此，本发明提供了米托蒽醌的一种新用途：米托蒽醌可以用于制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物。同时，本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌患者对米托蒽醌的敏感性的试剂盒，该试剂盒可以在头颈鳞癌患者治疗前预先检测其是否适合使用米托蒽醌进行治疗，从而可以针对不同的患者制定个性化治疗方案，提高治疗效果，改善患者的生存质量。

Description

米托蒽醌在制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及米托蒽醌在制备治疗头颈鳞癌的药物中的应用。
背景技术
头颈癌是世界第六大常见癌症类型，包括起源于鼻窦、鼻腔、口腔、咽、喉等部位的上皮性恶性肿瘤，全球每年的发病人数超过55万，死亡人数超过30万，其中95％以上的头颈癌均为头颈鳞癌。目前，手术、放疗和化疗仍是头颈鳞癌的主要治疗手段，但这些治疗方法会造成头颈部器官及功能的损害，导致患者的生活质量下降。近年来，随着测序技术及多组学分析技术的进展，靶向治疗已经显示出高效、低毒等特点，成为多种癌症类型治疗的主流。然而，由于头颈鳞癌主要以抑癌基因突变为主，可供干预的致癌驱动基因较少，因此其靶向药物的治疗仍存在极度匮乏的现状。
米托蒽醌(CAS:70476-82-3)是一种历史悠久的具有抗肿瘤作用的蒽环类复合物，因其无氨基糖结构，不产生自由基，且有抑制脂质过氧化作用，故心脏毒性较低。米托蒽醌抗肿瘤活性相当或略高于阿霉素，明显高于阿糖胞苷、环磷酰胺、氟尿嘧啶等，主要用于治疗急性髓系白血病、恶性淋巴瘤和乳腺癌，对膀胱癌、卵巢癌、消化道肿瘤、恶性间皮瘤、多发性硬化等多种癌症类型。然而，对于头颈鳞癌来说，米托蒽醌的药物响应率较低，因而一直未能在头颈鳞癌中进行临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供米托蒽醌在制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了米托蒽醌的一种新用途：米托蒽醌可以用于制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物。
可选的，上述治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物包含IL6R激动剂。
本发明还提供了一种用于制备治疗头颈鳞癌的药物组合物，该药物组合物至少包含IL6R激动剂和米托蒽醌。
本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌患者对米托蒽醌的敏感性的试剂盒，该试剂盒至少包含检测IL6R表达水平的试剂。
可选的，该试剂盒通过RT-PCR检测头颈鳞癌组织中IL6R的表达水平。
可选的，上述试剂包括与IL6R基因结合的核酸，所述核酸可以是扩增IL6R基因的引物。
可选的，该试剂盒通过免疫组化检测头颈鳞癌组织中IL6R的表达水平。
可选的，上述试剂包括与IL6R蛋白结合的物质，所述物质可以是与IL6R蛋白特异性结合的抗体。
与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
本发明首次发现IL6R可以作为米托蒽醌治疗头颈鳞癌的生物标志物，IL6R的表达量越高，头颈鳞癌细胞对米托蒽醌越敏感。基于此，本发明提供了米托蒽醌的一种新用途：米托蒽醌可以用于制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物。同时，本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌患者对米托蒽醌的敏感性的试剂盒，该试剂盒可以在头颈鳞癌患者治疗前预先检测其是否适合使用米托蒽醌进行治疗，从而可以针对不同的患者制定个性化治疗方案，提高治疗效果，改善患者的生存质量。
附图说明
图1为本发明使用2248个药物对13株肿瘤原代细胞进行高通量药物筛选的结果图。
图2为本发明2248个药物中，能够在一株肿瘤原代细胞中引起50％以上细胞杀伤效果的300个药物的高通量药物筛选结果图。
图3为米托蒽醌对10株肿瘤原代细胞进行药效测试的结果图。
图4为药物基因组学分析中，排名前7的基因在米托蒽醌敏感与耐药两组细胞间的表达结果图。
图5为利用小干扰RNA敲减肿瘤原代细胞PDC_52、及商品化细胞系HSC3和TU686中IL6R表达后，细胞中IL6R的表达水平结果图。图5的A为小干扰RNA敲减PDC_52中IL6R表达后，PDC_52中IL6R的表达水平结果图。图5的B为小干扰RNA敲减HSC3中IL6R表达后，HSC3中IL6R的表达水平结果图。图5的C为小干扰RNA敲减TU686中IL6R表达后，TU686中IL6R的表达水平结果图。
图6为在PDC_52、HSC3和TU686中敲减IL6R后，各组细胞在0.5μM浓度米托蒽醌作用72h后的相对细胞存活率。图6的A为敲减IL6R的PDC_52细胞在0.5μM浓度米托蒽醌作用72h后的相对细胞存活率。图6的B为敲减IL6R的HSC3细胞在0.5μM浓度米托蒽醌作用72h后的相对细胞存活率。图6的C为敲减IL6R的TU686细胞在0.5μM浓度米托蒽醌作用72h后的相对细胞存活率。
图7为米托蒽醌药物处理与溶剂对照处理PDX_14的移植瘤结果图。图7的A为米托蒽醌药物处理PDX_14与溶剂对照处理PDX_14的统计图。图7的B为米托蒽醌药物处理PDX_14与溶剂对照处理PDX_14的移植瘤实物图。
图8为米托蒽醌药物处理与溶剂对照处理PDX_31的移植瘤结果图。图7的A为米托蒽醌药物处理PDX_31与溶剂对照处理PDX_31的统计图。图7的B为米托蒽醌药物处理PDX_31与溶剂对照处理PDX_31的移植瘤实物图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂、商品化细胞系均可从商业渠道获得。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
IL6R(Interleukin-6receptor，白细胞介素-6受体)是一种80kDa糖蛋白，也称为gp80和CD126。IL6R通过结构域2和结构域3内的残基与IL-6结合，招募gp130形成能够进行信号转导的高亲和力IL6/IL6R/gp130复合物，从而导致下游信号传导的激活，目前已有研究表明IL6/IL6R通路的异常活化与多种癌症的预后不良相关，包括及直肠癌、肝癌、乳腺癌等。
本发明的发明人选取2248种药物(包括美国食品与药品监督管理局批准药物、临床试验评估药物及临床前候选化合物)对来源于患者肿瘤的头颈鳞癌细胞(patient-derived cell,PDC)和商品化头颈鳞癌细胞系进行三轮高通量药物筛选，最终筛选出米托蒽醌对IL6R高表达头颈鳞癌细胞具有杀伤效果，且IL6R的表达量越高，米托蒽醌对头颈鳞癌细胞的杀伤效果越好。
实施例1
构建头颈鳞癌患者来源的异种移植瘤模型(patient-derived xenograft,PDX)，以用于后续体内移植瘤验证实验。
对于本发明构建PDX模型的对应患者，记录其临床信息，包括基本资料(性别、年龄、烟酒史等)、临床病理诊断(肿瘤大小及位置、TNM分期、HPV感染情况)、既往治疗史(手术、放治疗情况)、复发和转移等预后信息等。收集患者的肿瘤、癌旁及血液样本。对肿瘤样本进行病理组织形态学鉴定和遗传学信息鉴定。
肿瘤组织经手术切除后，观察组织颜色、形态、质地，切除坏死组织，选择病灶中央部分进行取材。因头颈鳞癌一般生长于口腔、鼻腔黏膜等污染部位，因此样本接种移植到小鼠前需要用0.05％次氯酸钠除菌，1％青霉素-链霉素双抗的PBS快速清洗30秒。轻轻刮除组织样本外周组织，将肿瘤切成1～2mm3大小的小块，在无菌条件下将患者组织移植到免疫缺陷小鼠血供、淋巴结较丰富的区域(如双侧腋窝)构建皮下PDX模型，或接种于动物双侧颌下间隙构建原位PDX模型。为提高接种成功率，可将Matrigel胶与患者肿瘤组织混合后接种，每个患者组织接种3-5只小鼠。建模1-2周后开始追踪PDX模型生长轨迹，当肿瘤体积超过800mm3或肿瘤体积两周无明显增长时，对移植瘤进行序列传代，一般移植瘤传代至3代以上时认为该模型可以稳定传代，并将各模型命名为PDX_N(N为大于零的整数)。
实施例2
构建头颈鳞癌患者来源的肿瘤原代细胞(patient-derived cell,PDC)，以用于后续体外验证试验。
头颈鳞癌肿瘤组织在4℃运输回实验室后，消毒外包装，通过无菌传递仓进入细胞房，利用无菌显微剪，显微镊进行组织分离剪碎。配置组织消化液(1mg/ml四型胶原酶，200U/ml透明质酸酶，200U/ml DNase I型酶，1×无酚红胰蛋白酶)，组织消化液体积约为肿瘤体积的5-10倍。
将剪碎的组织1500rpm，离心3min后，用组织消化液重悬后，加入组织解离管，放置于美天旎组织处理器，按照组织韧度选择不同分离模式进行分离。碾碎组织后，放入37℃环境内摇床上消化30-60min，其间每10min将组织解离管进行上下摇晃，混匀组织，避免组织成团，影响消化。待消化液浑浊，无明显组织剩余时，即可终止消化。利用含10％胎牛血清的培养基中和消化，并分别通过100μm和40μm的滤网后，收集未消化团块，收集细胞悬液。1500rpm，离心3min后，若发现较多红细胞污染，可以加入1ml红细胞裂解液，静置3min后，加入10ml PBS稀释后，1500rpm，3min离心。
弃去上清，添加5ml完全培养基重悬，完全培养基配方为高糖DMEM培养基：DMEM/F12培养基＝3:1；胰岛素，5μg/ml；两性霉素B，250ng/ml；庆大霉素，10μg/ml；霍乱毒素，0.1nM；EGF，0.125ng/ml；氢化可的松，25ng/ml；ROCK抑制剂Y-27632，10μM。0.22μm无菌过滤器对溶液进行消毒，并在4℃下保存2个月。细胞悬液置于37℃、5％CO2加湿培养箱中持续培养。成功传代5次以上仍然保持较高细胞增殖活性的PDC细胞即为构建成功，并将各PDC细胞命名为PDC_N(N为大于零的整数)。
实施例3利用头颈鳞癌肿瘤原代细胞及细胞系开展以“老药新用”为目的的高通量药物筛选
考虑到新药研发的高成本、长周期以及极高的失败率，重新利用已知适应症的药物来治疗其他疾病正日益成为一个极具潜力的药物研发方式，俗称“老药新用”。“老药新用”与全新药物研发相比，具有以下优点：1.较高的成功率，上市药物已进行系统的安全性评价；2.研发周期短，上市药物具有全面的临床前药代动力学和毒理学参数，在前期研究基础上做新适应症的开发，研发周期会大大缩短。3.开发成本较低，与同一适应症的新药开发相比，“老药新用”在临床前及临床Ⅰ期和Ⅱ期中可大大节省研发成本。
为了挖掘头颈鳞癌“老药新用”策略，本发明选取了2248个小分子化合物，以美国食品与药品监督管理局批准的药物为主(1800/2248)，还纳入了319个临床试验评估药物以及129个临床前化合物。非抗肿瘤药物占了50％以上(1419/2248)，剩余药物为靶向药物718个，治疗药物111个。包扩了常见癌基因靶点的抑制剂，包括PI3K抑制剂，mTOR抑制剂，CDK抑制剂，以及HDAC抑制剂等，总计覆盖了286个不同的药物靶点。
随后本发明先选取13株患者肿瘤原代细胞(PDC)，以单剂量(1μM)对2248个化合物进行三次重复筛选，测定药物作用72小时后细胞的增殖活力(图1)。根据初筛结果，选取能够在一个以上的细胞模型中引起50％以上的细胞杀伤效果的300个药物，进行5株肿瘤原代细胞的3浓度药物筛选(5μM、1μM、0.2μM)(图2)。
其中，总共有171种化合物被排除，原因是它们没有浓度梯度依赖性，或者在一个以上的细胞模型中不能减少至少50％的活细胞数量。最后，筛选出129个化合物具有较好的抗头颈鳞癌活性的药物，这些药物形成了本发明的“老药新用”集合。
实施例4对“老药新用”集合开展药物基因组学研究，筛选药效敏感生物标志物
本发明对129个药物组成的“老药新用”集合开展了54株头颈鳞癌细胞模型(包括40株肿瘤原代细胞和14株商品化细胞系)进行10浓度梯度的响应曲线分析。药物处理72小时后，利用R package GRmetrics计算药物响应指标IC50，Emax和AUC，以及对应的GR50，GRmax和GRAOC。
为了进行药物基因组学分析，所有肿瘤原代细胞和商品化细胞系均进行了全外显子组测序和转录组测序。为了寻找药物反应相关特征并建立预测模型，将药效数据，结合使用基因组改变、拷贝数变异和基因表达特征来评估它们对药物反应的贡献。描绘各个指标作为生物标志物指导药物使用的潜力。通过Spearman相关性及P值评价预测效果。
实施例5药物基因组学分析预测米托蒽醌对IL6R高表达头颈鳞癌具有高敏感性
对上述129个药物组成的头颈鳞癌“老药新用”集合进行分析，我们发现米托蒽醌(CAS：70476-82-3，分子式：C22H30Cl2N4O6，购自Selleck公司)在非靶向药中药效最好，具有极高的头颈鳞癌“老药新用”潜力。鉴于此，本发明对其进行药物基因组学分析，表1展示根据生物学功能挑选出的有潜力的候选标志物。
表1各基因作为生物标志物指导米托蒽醌使用的潜力结果表
预测标志物 药物名称 p值
SNRPD3 米托蒽醌 2.45E<sup>-10</sup>
AHSA1 米托蒽醌 1.90E<sup>-09</sup>
IL16 米托蒽醌 1.86E<sup>-08</sup>
KLF7 米托蒽醌 1.72E<sup>-07</sup>
HECA 米托蒽醌 4.24E<sup>-06</sup>
SEMA4B 米托蒽醌 1.13E<sup>-05</sup>
SUMO4 米托蒽醌 1.40E<sup>-05</sup>
RUNX2 米托蒽醌 3.04E<sup>-05</sup>
PPT1 米托蒽醌 3.04E<sup>-05</sup>
IL6R 米托蒽醌 0.000372348
FGF18 米托蒽醌 0.000427904
GPR157 米托蒽醌 0.000546867
ATF5 米托蒽醌 0.000696705
AURKAIP1 米托蒽醌 3.06E<sup>-08</sup>
RHOF 米托蒽醌 0.000713372
本发明随后选取未进行过药物筛选的独立的6株肿瘤原代细胞和4株商品化细胞系组成验证细胞集合进行米托蒽醌药效测试，将细胞分成米托蒽醌敏感与耐药细胞(图3)。如图3所示，HN13、PDC_54、PDC_55、PDC_56为米托蒽醌耐药细胞，其余为米托蒽醌敏感细胞。
本发明随后检测在上述10株细胞中7个药效标志物表达情况，结果如图4所示，IL6R高表达与米托蒽醌的敏感性存在显著相关性(P＝0.049)。
实施例6体外实验证实米托蒽醌对IL6R高表达头颈鳞癌细胞具有更高敏感性
小干扰RNA设计和合成：
委托吉玛基因生物公司合成出目的小干扰RNA序列，具体小干扰RNA序列见表2。
表2小干扰RNA序列
sense(5'-3') antisense(5'-3')
si-IL6R-1 CCUCAGCAAUGUUGUUUGUTT ACAAACAACAUUGCUGAGGTT
si-IL6R-2 GGCACUUACUACUAAUAAATT UUUAUUAGUAGUAAGUGCCTT
si-IL6R-3 GCCCUUAUGACAUCAGCAATT UUGCUGAUGUCAUAAGGGCTT
si-NC UUCUCCGAACGUGUCACGUTT ACGUGACACGUUCGGAGAATT
小干扰RNA转染：
转染前一天，在孔板中每个孔内播种目的细胞(肿瘤原代细胞PDC_52、及商品化细胞系HSC3和TU686)，每孔放2.5mL不含抗生素的生长培养基。从细胞中去除生长培养基，加入1.5mL新鲜的不含血清的生长培养基。在250μL的无血清生长培养基中加入100pmol小干扰RNA，轻柔混匀。在250μL生长培养基中加入5μL的转染试剂进行稀释，室温下温育5min。混合前两步稀释好的小干扰RNA和转染试剂，室温下温育20min。将混合物加入前一天播种的含有细胞的孔板中。在37℃培养箱中培养细胞5-6h。更换含有血清的培养基并培养细胞24-48h，进行转染后的其它检测步骤。培养3-4天后检测蛋白表达量。
实时荧光定量PCR(Real-time PCR)：
为了检测目的基因的敲减效率，本实施例将提取各组细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得检测IL6R基因的表达水平。结果显示，相比对照组，小干扰RNA处理组的目的基因表达显著降低(图5)。
细胞增殖实验：
将头颈鳞癌细胞以3000细胞/孔的密度接种到96孔板中，培养箱培养过夜。随后进行小干扰RNA转染，再用米托蒽醌进行药物处理，72小时后用Cell Counting Kit-8检测细胞增殖情况。结果显示，相比于IL6R敲减组细胞，米托蒽醌显著抑制了对照组细胞增殖，表明IL6R高表达头颈鳞癌细胞对米托蒽醌更敏感(图6)。
实施例7体内移植瘤实验证实米托蒽醌对IL6R高表达的头颈鳞癌具有更高敏感性
选择两例头颈鳞癌PDX模型(PDX_14,PDX_31)用于评价米托蒽醌对不同IL6R表达水平头颈鳞癌的体内治疗效果。每个PDX模型构建15只子代模型，待肿瘤体积达到100-200mm3后选择10-12只小鼠进行分组，分别分到米托蒽醌药物处理组和对照组。
给药方案如下：
①米托蒽醌药物处理组，静脉注射，3mg/kg，溶剂为生理盐水，一周两次。
②对照组：静脉注射，对应药物溶剂(生理盐水)，一周两次。
持续测量模型肿瘤体积及体重直到肿瘤体积达到1000-1500mm3。
PDX_14为IL6R高表达模型，表达水平为FKPM＝13.08。在PDX_14模型中米托蒽醌药物处理组相比于对照组显著抑制了肿瘤生长(图7)。PDX_31为IL6R低表达模型，表达水平为FKPM＝6.48。在PDX_31模型中米托蒽醌药物处理组相比于对照组对肿瘤生长无明显影响(图8)。可见，异种移植瘤模型中，IL6R表达水平FKPM＞13.08，可视为该模型中IL6R高表达。
一些实施例中，本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌患者对米托蒽醌的敏感性的试剂盒，所述试剂盒至少包含检测IL6R表达水平的试剂，可以通过RT-PCR或免疫组化检测头颈鳞癌组织中IL6R的表达水平。其中，通过RT-PCR检测头颈鳞癌组织中IL6R的表达水平时，所述试剂包括与IL6R基因结合的核酸，所述核酸包括扩增IL6R基因的引物。其中，通过免疫组化检测头颈鳞癌组织中IL6R的表达水平时，所述试剂包括与IL6R蛋白结合的物质，所述物质包括与IL6R蛋白特异性结合的抗体。
综上所述，本发明首次发现IL6R可以作为米托蒽醌治疗头颈鳞癌的生物标志物，IL6R的表达量越高，头颈鳞癌细胞对米托蒽醌越敏感。基于此，本发明提供了米托蒽醌的一种新用途：米托蒽醌可以用于制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物，并同时在体内及体外进行了实验验证。同时，本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌患者对米托蒽醌的敏感性的试剂盒，该试剂盒可以在头颈鳞癌患者治疗前预先检测其是否适合使用米托蒽醌进行治疗，从而可以针对不同的患者制定个性化治疗方案，提高治疗效果，改善患者的生存质量。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.米托蒽醌在制备治疗IL6R高表达头颈鳞癌的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含IL6R激动剂。
3.一种用于治疗头颈鳞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物至少包含IL6R激动剂和米托蒽醌。
4.一种用于检测头颈鳞癌患者对米托蒽醌的敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含检测IL6R表达水平的试剂。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过RT-PCR检测头颈鳞癌组织中IL6R的表达水平。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括与IL6R基因结合的核酸。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸包括扩增IL6R基因的引物。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过免疫组化检测头颈鳞癌组织中IL6R的表达水平。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括与IL6R蛋白结合的物质。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述物质包括与IL6R蛋白特异性结合的抗体。
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