CN110760518B - 分子标志物penk及其在三阴性乳腺癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分子标志物penk及其在三阴性乳腺癌药物中的应用，通过Oncomine数据库收集筛选以及基于qRT‑PCR技术的患者组织样本检验，证实penk在TNBC中的表达显著下调，在数据库中平均下调倍数为3.69，在病人组织样本中平均下调98.05％。表明了penk作为TNBC分子标记物的可靠性以及可重复性。本发明证实penk显著抑制TNBC癌细胞的增殖、转移和侵袭，促进细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而影响肿瘤的发展。本发明同时证实了penk过表达体系在动物体内对TNBC肿瘤的治疗效果。过表达penk能显著抑制肿瘤生长，抑瘤率为37.5％，并显著下调肿瘤转移相关因子、炎症因子和信号通路相关因子。组织病理学分析penk治疗后肿瘤组织有明显坏死。以上都说明了penk药物在动物体内对TNBC肿瘤的治疗效果显著。

Description

分子标志物penk及其在三阴性乳腺癌药物中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤学与分子生物学领域，具体涉及penk基因作为TNBC分子标志物及在制备治疗TNBC药物中的应用。
背景技术
据发表在Pharmacogenomics期刊上的文章(PMID:29095114，DOI:10.2217/pgs-2017-0117)报道，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，女性终身患病率高达12.5％。目前乳腺癌的最佳治疗方式是通过手术切除乳腺组织，但由于乳腺癌容易转移，会引起身体其他组织的癌变，最终只能通过化疗维持生命。三阴性乳腺癌(triple negative breastcancer，TNBC)是雌激素受体、孕激素受体以及人类表皮因子受体均为阴性的乳腺癌亚型，占乳腺癌总数的15％-20％。由于TNBC缺乏上述靶点，因此常规的靶向治疗难以发挥作用，至今尚无明确有效的治疗方案，细胞毒性化疗是目前临床上应用最为广泛的治疗方法。但即便接受最佳的化疗后，TNBC患者的五年存活率也只有不到30％，而且化疗产生的副作用对患者的身心都造成了巨大伤害。因此，寻找诊断和治疗TNBC的有效靶点就显得尤为重要。
前脑啡肽(proenkephalin，penk)是内源性阿片样多肽激素的一种，经蛋白酶切割后可产生脑啡肽，脑啡肽在中枢神经系统中起着至关重要的作用。脑啡肽可与中枢神经系统的受体相结合，通过下丘脑-垂体-肾上腺的信号轴调控机体的生命活动，增加自然杀伤细胞和巨噬细胞活性，提高机体的免疫反应能力及抗肿瘤能力。据发表在Journal ofClinical Oncology的文章(PMID:26169618，DOI:10.1200/JCO.2014.59.7682)报道，女性血浆中penk表达量与乳腺癌发生率呈负相关，penk表达量低的中老年和绝经后妇女乳腺癌风险显著增加，penk可作为乳腺癌预防和治疗的潜在靶点。Penk高表达会通过激活p53和NF-κB的活性，从而促进细胞凋亡。流行病学研究表明，乳腺癌患者发生脑转移概率约为10～16％，而penk表达降低则会促进细胞运动和粘附，大幅提高脑转移的风险。目前penk在肿瘤领域的研究相对较少，乳腺癌领域更鲜少报道。申请人前期研究结果表明penk在TNBC患者中的表达显著下调，推测penk可能在TNBC中发挥重要作用。
基于此，研究penk表达变化对TNBC发生和发展的影响，对诊断和治疗TNBC的方法，具有重要意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是：针对TNBC缺乏明确的分子靶标，为实现准确诊断和有效治疗TNBC，本发明的目的之一为提供penk基因作为TNBC的分子标记物。本发明的又一目的在于提供penk在制备治疗TNBC药物中的应用。
本发明的技术方案是：一种分子标志物penk，所述penk的基因序列的Gene ID为5179。
本发明的进一步技术方案是：分子标志物penk在三阴性乳腺癌药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、构建penk-pcDNA过表达载体以及设计penk-siRNA敲除序列作为基因药物，提高或降低TNBC细胞内penk表达量；
步骤二、将上述penk-pcDNA过表达载体以及penk-siRNA序列基因药物转染入三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到提高或降低细胞内penk含量的目的，进而达到影响癌细胞生物学功能的目的；
步骤三、将penk-pcDNA过表达载体构建局部缓释体系，作用于裸鼠乳腺癌模型，达到提高细胞内penk含量的目的，进而达到抑制肿瘤进展的目的。
发明效果
本发明的技术效果在于：本发明的有益效果如下：
[1]本发明通过Oncomine数据库收集筛选以及基于qRT-PCR技术的患者组织样本检验，证实penk在TNBC中的表达显著下调，在数据库中平均下调倍数为3.69，在病人组织样本中平均下调98.05％。表明了penk作为TNBC分子标记物的可靠性以及可重复性。
[2]本发明证实过表达penk在TNBC中显著抑制癌细胞的增殖、转移和侵袭，促进细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而影响肿瘤的发展。本发明同时证实了penk过表达体系在动物体内对TNBC肿瘤的治疗效果。过表达penk能显著抑制肿瘤生长，抑瘤率为37.5％，并显著下调肿瘤转移相关因子、炎症因子和信号通路相关因子。组织病理学分析penk治疗后肿瘤组织有明显坏死。以上都说明了过表达penk在动物体内对TNBC肿瘤的治疗效果显著。
[3]因此利用penk作为标志物能够快速有效的检测TNBC和预后，并为基因治疗等临床应用提供治疗靶点和重要理论依据。
附图说明
图1为Oncomine数据库中不同样本中penk的表达变化结果。
图2为TNBC患者组织中penk基因表达变化结果。
图3为penk表达对MDA-MB-231细胞增殖的影响。
图4为penk表达对MDA-MB-231细胞周期的影响。
图5为penk表达对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。
图6为penk表达对MDA-MB-231细胞迁移的影响。
a、细胞不同时间段的迁移情况；b、细胞不同时间段的迁移距离统计图。
图7为Penk表达对MDA-MB-231细胞侵袭的影响。
a、对照质粒对MDA-MB-231细胞侵袭的影响；b、转染penk-pcDNA对MDA-MB-231细胞侵袭的影响；c、转染penk-siRNA对MDA-MB-231细胞侵袭的影响；d、细胞侵袭能力的统计。
图8为对照组与penk-pcDNA治疗组裸鼠肿瘤组织HE染色切片。
图9为对照组与penk-pcDNA治疗组裸鼠肿瘤组织Tunel染色结果。
具体实施方式
参见图1—图9，下面结合实例为本发明提供详细的说明，但以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明做出进一步的说明，本发明的实施方式不限于此，且本发明的申请范围不受以下说明所限。若未有其它说明，下述实施例中所使用的技术方法均为本领域人员所熟知的常规方法，或试剂、仪器制造厂家所提供的方法。所用的仪器、试剂、材料等实验用品如无特殊说明，均为从商业公司购买获得。
本发明利用Oncomine数据库收集筛选得到penk以及在TNBC病人组织中进行PCR检验penk的表达变化情况。构建penk-pcDNA过表达载体以及设计penk-siRNA敲除序列以提高或降低TNBC细胞内penk表达量。通过细胞功能性实验检验penk提高或降低对TNBC细胞的影响。通过裸鼠乳腺癌模型检验penk-pcDNA过表达载体构建的局部缓释体系对TNBC肿瘤的影响。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种作为诊断TNBC的分子标志物penk。所述penk的基因序列的Gene ID为5179。所述penk在TNBC中的表达下调。其特征在于采用以下步骤：
步骤一、利用Oncomine数据库对乳腺癌样本信息进行收集，将检索的数据汇总并经过分类统计处理。筛选出的基因再在PubMed数据库中检索调研其作为标志物的可能性及其在肿瘤中的可能作用。得到penk表达量显著异常。
本发明扩增的人源Penk 3’UTR序列
TATCTTTTCCCACTAGTGGCCCCAGGCCCCAGCAAGCCTCCCTCCATCCTCCAGTGGGAAACTGTTGATGGTGTTTTATTGTCATGTGTTGCTTGCCTTGTATAGTTGACTTCATTGTCTGGATAACTATACAACCTGAAAACTGTCATTTCAGGTTCTGTGCTCTTTTTGGAGTCTTTAAGCTCAGTATTAGTCTATTGCAGCTATCTCGTTTTCATGCTAAAATAGTTTTTGTTATCTTGTCTCTTATTTTTGACAAACATCAATAAATGCTTACTTGTATATAGAGATAATAAACCTATTACCCCAAGTGCATAA。
步骤二、提取病人组织总RNA，反转录PCR以及qPCR得到病人组织内的penk表达量显著降低。证实penk可作为TNBC标志物。
Penk基因在TNBC药物中的应用。其特征在于采用以下步骤：
步骤一、构建penk-pcDNA过表达载体以及设计penk-siRNA敲除序列作为基因药物，以提高或降低TNBC细胞内penk表达量。
步骤二、将上述penk-pcDNA过表达载体以及penk-siRNA序列基因药物转染入三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到提高或降低细胞内penk含量的目的，进而达到影响癌细胞生物学功能的目的。
步骤三、将penk-pcDNA过表达载体构建局部缓释体系，作用于裸鼠乳腺癌模型，达到提高细胞内penk含量的目的，进而达到抑制肿瘤进展的目的。
实施例1penk作为TNBC标志物的发现。
1、利用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)对乳腺癌样本信息进行收集，将检索的数据汇总并经过分类统计处理。之后根据不同样本中基因的表达差异量和p值进行筛选。筛选出的基因再在PubMed数据库中检索调研其作为标志物的可能性及其在肿瘤中的可能作用。最终确定一个待研究的基因。
Oncomine数据库的检索范围设置为“Analysis Type＞Cancer vs.NormalAnalysis＞Cancer Type＞Breast Cancer＞Data Type＞mRNA＞Molecular Subtype＞Triple Negative Status”。
2、提取病人组织总RNA
a、将病人的肿瘤组织置于研磨器内，之后加入1mL TRIzol，用力研磨至组织破碎，将混合液收集到新的1.5mL离心管中。
b、每个离心管中加入氯仿0.2mL，轻轻翻转摇晃15s，室温静置2～3min后离心，离心条件为12000g、4℃、15min。
c、取出离心管，可看到溶液分为三层，小心吸取上层水相并转移至1.5mL离心管中。吸取过程中不能触碰到中间层。
d、在每个离心管中加入0.5mL预冷的异丙醇，混合均匀。-20℃环境中放置30min后离心，离心条件为12000g，4℃，10min。
e、去上清，沿离心管壁缓慢加入75％的乙醇溶液1mL，小心吹打混匀，7500g，4℃，10min。
f、取出离心管，去上清，室温下干燥沉淀10～20min，待沉淀中不含液体后加入30μL DEPC水溶解RNA。分装出3μL测RNA浓度。
3、反转录
a、实验所用RNA模板的量为1μg，根据所测RNA模板浓度计算所需的体积，向无RNA酶的离心管中加入模板RNA。之后加入4μL 4ⅹgDNA wiper Mix，最后加入RNase freeddH2O至总体积为16μL。
b、轻吹打混匀。置于42℃水浴锅中2min以去除基因组DNA。
c、之后向离心管中加入4μL 5ⅹHIScript qRT SuperMixⅡ，至总体积为20μL。
d、PCR程序设置为50℃15min 85℃5sec 4℃∞，进行反转录
4、qPCR
a、避光条件下，在-4℃冰盒上，每管中先加0.8μL的前引物和0.8μL的后引物，再加8.4μL的cDNA模板和10ul qPCR酶，加完后用锡纸包裹避光。该实验使用的内参基因为GAPDH。所用引物如表1所示：
表1 GAPDH和penk的qPCR引物
Figure BDA0002176592190000071
b、使用qPCR仪进行qPCR反应。设置qPCR反应程序为95℃30sec 95℃10sec(56℃30sec 72℃30sec 95℃15sec)60℃60sec 95℃15sec。其中括号内的为循环段，共循环40次。
c、采用2-ΔΔCT(Livak法)对qPCR实验结果进行分析处理。
结果分析
1、在Oncomine数据库中获得的32个数据集中，24个数据集中Penk的表达具有显著差异。其中，21组样本penk表达下调，3组样本penk表达上调。如图1所示，3组上调倍数分别为27.46、1.12、1.12，21组下调倍数分别为2.20、2.06、2.08、2.09、1.93、1.81、2.17、1.81、6.15、6.33、1.97、8.87、3.71、10.85、3.62、3.15、2.56、4.31、6.61、1.27、1.98。可初步推断TNBC中penk基因表达下调。
2、如图2所示，三例TNBC病人组织样本中肿瘤组织中penk的表达量比癌旁组织降低了94.45％，99.93％和99.75％，平均降低98.05％。证实penk在几乎全部数据库样本和患者的肿瘤组织中的表达量均显著下降，因此，penk可作为潜在的诊断TNBC的标记物。
实施例2penk对TNBC细胞功能的影响检测
1、penk过表达载体的构建及penk-siRNA序列的设计
a、以penk-PCMV质粒为模板，在penk基因序列的5’端和3’端分别添加EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点，通过PCR进行penk序列的扩增。
b、在LB液体培养基中接种含有penk-pcDNA质粒的菌株，于37℃，225rpm的摇床中培养12小时，之后离心收集菌体，并使用质粒提取试剂盒提取质粒。
c、琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒并做胶回收，并将PCR扩增得到的penk序列进行双酶切反应，在37℃环境中孵育12小时。反应体系如表2所示：
表2 双酶切反应体系
Figure BDA0002176592190000081
d、琼脂糖凝胶核酸电泳验证双酶切后的基因片段及质粒并进行胶回收，于16℃环境中进行连接反应2～4h。
e、将连接产物转化感受态细胞DH5α中。测序菌液，检测是否成功构建penk-pcDNA过表达载体。
f、查阅文献获取penk基因的siRNA序列(5’-3’)：F-CCTGCAAGGAGCTCCTGCATTR-TGCAGGAGCTCCTTGCAGGTT。
g、将penk-siRNA和penk-pcDNA分别转染到MDA-MB-231细胞中，提取细胞RNA检测penk表达变化。
2、Penk对MDA-MB-231细胞增殖的影响
a、设置对照组、penk-pcDNA组和penk-siRNA组三个组。按照所需的孔数在96孔板中每孔接种2×103个细胞。24小时后，细胞按照
Figure BDA0002176592190000082
20000.2μL，penk-pcDNA0.1μg，RNA 0.5μL的量进行转染，转染后5h后换液。
b、将每孔中的原培养基吸出弃去并加入100μL新的生长培养基，避光条件下再向每孔中加入10μL MTT溶液，37℃培养箱孵育4h。孵育后吸出孔内混合液，加入100μL DMSO，摇晃10min，酶标仪检测570nm和650nm波长处的吸光值，并进行分析。
3、Penk对MDA-MB-231细胞周期的影响
a、设置对照组、penk-pcDNA组和penk-siRNA组三个组。按照所需的孔数在六孔板中每孔接种1×106个细胞并分别转染对照、penk-pcDNA和penk-siRNA。转染后48小时，分别收集2×106个细胞，70％的乙醇固定24h。
b、将已固定好的细胞用PBS溶液洗涤两遍，加入1mL碘化丙啶(PI)染液，4℃环境中静置30min。
c、流式细胞仪检测细胞周期。
4、Penk对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
a、设置对照组、penk-pcDNA组和penk-siRNA组三个组。按照所需的孔数在六孔板中每孔接种1×106个细胞并分别转染对照、penk-pcDNA和penk-siRNA，并同时设置B lank组、PI单染组和AnnexinV-FITC单染组。转染后48小时，分别收集1×105个细胞。
b、使用凋亡试剂盒染色细胞。每个样品加入195μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞。
c、实验组及对照组各组各加入5μL AnnexinV-FITC，轻混匀；之后加入10μL PI染色液，轻混匀。Blank组不加两种染液，AnnexinV-FITC单染组只加5μL Anne xinV-FITC染色液，PI单染组只加10μL PI染色液。
e、室温环境中，避光孵育10～20min，Blank及单染组需56℃加热7min诱导凋亡。
f、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
5、Penk对MDA-MB-231细胞迁移的影响
a、设置对照组、penk-pcDNA组和penk-siRNA组三个组。按照所需的孔数在六孔板中每孔接种1×106个细胞并分别转染对照、penk-pcDNA和penk-siRNA。转染48h后，使用划痕笔垂直划线。划线后，用PBS溶液将划下的细胞清洗干净。使用无血清L-15培养基、37℃培养箱培养。
b、划线后第0h、12h、24h、36h、48h后分别拍照，使用ImageJ软件计算细胞迁移距离的均值。
6、Penk对MDA-MB-231细胞侵袭的影响
a、设置对照组、penk-pcDNA组和penk-siRNA组三个组。按照所需的孔数在六孔板中每孔接种1×106个细胞并分别转染对照、penk-pcDNA和penk-siRNA。5h后更换培养基。
b、转染36h后，将完全培养基更换为无血清培养基，培养12h。
c、基质胶用预冷的PBS溶液稀释成300μg/mL，滴加100μL基质胶于transwel l小室聚碳酸酯膜上，37℃培养箱中放置12h，使其聚合成凝胶，使用时将PBS溶液吸出。
d、转染48h后，胰酶消化细胞。每组计数收集2×104个细胞于200μL无血清培养基，并加入到transwell小室的上室中。下室中加入500μL含10％血清的培养基，37℃培养箱培养24h。
e、培养24h后，吸出上室残留液体，小心取出上室，擦去上室内基质胶以及未穿过膜的细胞。
f、使用4％中性甲醛固定细胞10min，结晶紫染液染色10min，PBS清洗干净，干燥，于正置显微镜下计数穿过膜的细胞。
结果分析
penk-pcDNA和penk-siRNA分别转染细胞以构建penk过表达和低表达体系。通过向MDA-MB-231细胞分别转染penk-pcDNA和penk-siRNA，研究penk过表达和低表达对癌细胞功能的影响。
1、如图3所示，与对照组相比，转染后第3d，penk-pcDNA组的活细胞数量减少了13.62％，penk-siRNA组增加了40.13％。转染后第4d，penk-pcDNA组的活细胞数量减少了24.31％(p＝0.004<0.01)，具有显著性差异，penk-siRNA组的活细胞数量增加了12.13％。转染后第5d，penk-pcDNA组活细胞数减少了19.36％(p＝0.034<0.05)，具有显著性差异，penk-siRNA组的活细胞数量增加了11.99％。转染penk-pcDNA后细胞增殖有所下降，而转染penk-siRNA后细胞增殖有所增加。因此，penk的过表达能够显著抑制癌细胞增殖。
2、如图4所示，与对照组相比，penk-pcDNA组的G1期细胞减少了6.79％，S期细胞增加了30.64％，G2期细胞减少了47.51％；penk-siRNA组的G1期细胞减少了1.92％，S期细胞增加了3.88％，G2期细胞增加了0.61％，由此可以得到penk-pcDNA对细胞周期影响较大，penk-siRNA对细胞周期几乎没有影响。因此，penk主要通过阻滞细胞周期的S期来抑制细胞周期进展与细胞分裂。
3、如图5所示，转染penk-pcDNA后细胞凋亡指数相对于对照组增加了48.32％(p＝0.007<0.01)，差异具有显著性；转染penk-siRNA后细胞凋亡指数相对于对照组增加了11.18％。因此，penk过表达能够显著促进细胞凋亡。
4、如图6所示，转染penk-pcDNA和penk-siRNA的细胞迁移能力显著差异，penk-pcDNA使MDA-MB-231细胞系的迁移能力降低，penk-siRNA使细胞迁移能力增加。与对照组相比，转染penk-pcDNA后细胞12h迁移距离减少21.46％，24h迁移距离减少16.15％，36h迁移距离减少33.05％，48h迁移距离减少29.39％，均具有显著性差异。因此，penk过表达能显著降低细胞的迁移能力。
5、如图7所示，与对照组相比，penk-pcDNA与penk-siRNA的两组细胞穿过膜的数量有明显差异。Penk过表达使MDA-MB-231细胞的侵袭能力下降了47.22％(p＝0.041<0.05)；penk的低表达则使细胞的侵袭能力增加了25.68％(p＝0.025<0.05)。因此，penk过表达能显著促进细胞侵袭。
实施例3penk药物在动物体内对肿瘤的影响
1、构建裸鼠乳腺癌模型
a、培养足量的处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，胰酶消化并收集到同一离心管中。
b、取预冷的3mg/ml的基质胶溶液重悬细胞，使细胞悬液的密度为每100μL悬液中含2×107个细胞。
c、准备3～4周龄，体重16～18g的BABL/c雌性裸鼠，耳标标记并称重记录。
d、从裸鼠右侧腹部进针，将100μL细胞悬液注射到左胸第二对乳房垫下，缓慢注射。
d、注射后密切观察裸鼠状态，并每日记录体重和肿瘤体积。
2、裸鼠给药与处死检测
a、待裸鼠接种2周后，分为对照组和penk-pcDNA治疗组两组，每只裸鼠按照以下的量配制缓释载体：取4μL
Figure BDA0002176592190000122
2000加入到5μL Opti-MEM，取1.2μL 1μg/μL的penk-pcDNA/对照加入到4μL Opti-MEM,轻弹混匀，静置5min。将penk-pcDNA/对照溶液加入到
Figure BDA0002176592190000121
2000溶液中，室温静置20min。将上述混合物与经紫外杀菌处理的纳米凝胶微球混匀，4℃静置1h备用。
b、使用1mL预冷的注射器吸取120μL微球混合液，在每只裸鼠的肿瘤周围进行注射。
c、注射后，密切观察裸鼠状况，称重并记录肿瘤体积。
d、注射20天后，处死裸鼠。小心剥离肿瘤，称重并记录，测量肿瘤长短径并记录。将剥离下来的肿瘤组织置于生理盐水中。
e、提取对照组和penk-pcDNA治疗组肿瘤的RNA，qPCR检测瘤组织中penk的表达水平，并同时检测肿瘤标志物ST6GALNAC5、COX-2、MMP1、Vimentin(VIM)、P5
3、FN1、CDH1，炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-13、IL-6，信号通路相关分子Akt、β-catenin、ERK、NF-κB2、FOS、RACGAP的表达水平。
f、在对照组和penk-pcDNA治疗组中各随机取一只裸鼠的肿瘤组织进行HE染色。然后在10倍镜及20倍镜下观察并拍照，比较治疗组与对照组肿瘤组织的形态，进行病理学分析。
将对照组和penk-pcDNA治疗组肿瘤组织做Tunel染色，以检测治疗后对肿瘤组织细胞凋亡的影响。
结果分析
1、测量裸鼠最终的肿瘤净体积和净重能够排除在活体测量时由于注射的纳米微球导致的测量误差。对照组肿瘤平均净体积为535.9mm3，注射penk-pcDNA的肿瘤平均净体积为373.2mm3，治疗组肿瘤生长受到抑制，且具有显著性；对照组肿瘤平均净重为0.53g，penk-pcDNA治疗组的肿瘤平均净重分别为0.45g。因此，注射penk-pcDNA能够显著抑制肿瘤的生长。
2、penk-pcDNA治疗组的肿瘤组织中penk的表达水平均有所增加。与对照组相比，penk-pcDNA治疗组中COX2基因表达量下调35.06％，MMP1基因下调65.75％，ST6基因下调80.8％，VIM基因下调79.25％，P53基因上调213.4％，CDH1基因上调45.39％，IL-1β基因下调66.04％；TNF-α基因下调22.49％。可以得出，治疗组裸鼠肿瘤脑转移相关因子表达量下降，脑转移的风险降低；EMT途径相关因子的表达受到影响，抑制肿瘤的侵袭和转移；肿瘤细胞的增殖活性降低；相关炎症因子的表达也降低，能够抑制肿瘤的发展进程。另外，肿瘤组织中β-catenin、RACGAP、FOS和ERK等分子表达明显下调，说明penk可能通过MAPK和Wnt/β-catenin信号通路影响TNBC的发生发展。
3、如图8所示，对照组癌细胞核仁明显，蓝紫色的细胞核密集，表明组织生长状态良好。penk-pcDNA治疗组的癌细胞核数量显著减少，且核之间的排列松散，表明肿瘤组织生长状态不良，有较大范围的组织坏死。
4、如图9所示，对照组癌细胞状态良好，凋亡细胞的数量极少；penk-pcDNA治疗组的癌组织细胞凋亡极为明显，表明penk-pcDNA作为药物进行治疗时能够显著诱导癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。
在上文中的叙述中对本发明作了一般性说明以及列出了较佳的具体实施方案，但相关人员在此基础上进行一些修改和改进，这是很容易做到的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的任何变动、改进、简化、优化、替代，均应为等效的替换方式，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.分子标志物penk在制备三阴性乳腺癌药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、构建penk-pcDNA过表达载体以及设计penk-siRNA敲除序列作为基因药物，提高或降低TNBC细胞内penk表达量；
步骤二、将上述penk-pcDNA过表达载体以及penk-siRNA序列基因药物转染入三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到提高或降低细胞内penk含量的目的，进而达到影响癌细胞生物学功能的目的；
步骤三、将penk-pcDNA过表达载体构建局部缓释体系，作用于裸鼠乳腺癌模型，达到提高细胞内penk含量的目的，进而达到抑制肿瘤进展的目的。
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