CN116004722A - 肝母细胞瘤类器官及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了肝母细胞瘤类器官及其应用，该肝母细胞瘤类器官以胚肝类器官为基础制备获得，所述胚肝类器官采用YAP1基因进行激活处理，以便获得所述肝母细胞瘤类器官。根据本发明实施例所述的肝母细胞瘤类器官可以较好的模拟婴幼儿肝母细胞瘤发病的过程并以此模型为基础进行科学研究。

Description

肝母细胞瘤类器官及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及肝母细胞瘤类器官及其应用。

背景技术

肝母细胞瘤(Hepatoblastoma，HB)是一种恶行的儿童肝脏肿瘤，通常发生在0至4岁，其发病率为2.16/1,000,000。肝母细胞瘤起源于胚胎发生过程中肝细胞前体细胞(成肝细胞)的异常分化。虽然联合化疗及转移瘤切除术的最常规的治疗方法，但仍然很大一部分肝母细胞瘤患者会再次复发。大约20％的肝母细胞瘤儿童被诊断有肺转移，这标志着更加不良的预后。虽然联合化疗及转移瘤切除术的最常规的治疗方法，但仍然很大一部分肝母细胞瘤患者会再次复发。因此，应探索针对肝母细胞瘤发病机制的研究，继而开发新型的靶向的治疗方法有助于延长患者的生存期并提高其生活质量。

研究肝母细胞瘤进展的分子机制是开发靶向治疗的关键环节，但由于缺乏更加真实地模拟肝母细胞瘤发生发展的疾病模型，其疾病发展机理还未得到更好的阐述。当前，建立肝母细胞瘤模型是在成年小鼠肝脏中共同过表达组成型激活的β-连环蛋白(β-catenin，肝母细胞瘤最常见的突变基因)及其下游靶标Yap1基因。但该模型与真实的肝母细胞瘤病理及生物学特征具有很大差异：1.该模型是成年鼠发病模型，而不能模拟婴幼儿发病模型；2.小鼠与人存在的物种间差异，因而小鼠模型不能完全模拟人类的疾病。

类器官是一种干细胞在体外3D培养条件下通过增殖、分化和自组织形成的与对应体内正常/疾病组织器官在细胞类型、结构和功能接近的微型组织培养物。类器官在适当的条件下，可以在培养中保持数天到数周甚至数月，并能够在基于患者个体差异的基础上进行治疗评估及药物的临床前研发，同时还与病人的病理组织保持组织病理学结构与细胞分子特性的一致性，进而用于病程机制研究。因此，研究肝母细胞瘤的类器官可以为肝母细胞瘤的发生、发展、治疗提供研究模型。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

目前，建立肝母细胞瘤模型是利用成年小鼠肝脏进行的，但该模型无法完全真实地模拟儿童肝母细胞瘤的发生和发展，而类器官技术具有独特模拟体内外组织生长微环境的优势。发明人经过大量的实验研究，建立了基于胚肝类器官的人肝母细胞瘤发生模型，且对其培养体系进行了优化，发明人利用所获得的人肝母细胞瘤发生模型进行药物筛选后，获得了可以有效抑制人肝母细胞瘤发生模型的药物。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备肝细胞瘤类器官的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将胚肝类器官进行激活突变处理。根据本发明实施例所述的方法可以将胚肝类器官激活为肝细胞瘤类器官，所述肝细胞瘤类器官可以较好的模拟婴幼儿肝母细胞瘤发病的过程并以此模型为基础进行科学研究的可靠性较高。

根据本发明的实施例，所述胚肝类器官是采用胚肝细胞培养获得的，所述胚肝细胞为购买或分离废弃的受精后发育8-12周的流产后的人胚肝细胞群组织获得，将所述胚肝细胞放入合适条件下进行培养，随着培养时间的延长，活细胞会逐渐生长为具有3D结构的胚肝类器官。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述采用突变激活型YAP1基因(Yap1^5SA)进行激活处理，以便获得所述肝细胞瘤类器官。肝细胞瘤为起源于肝细胞的癌症，Hippo-YAP激活会诱导肝细胞中的代谢重编程，当所述胚肝类器官与所述YAP1基因进行接触时，YAP1基因激活胚肝类器官的一碳单位代谢，如S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被下调，而S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)在YAP1激活的类器官中被上调，激活肝细胞瘤的代谢变化，使得胚肝类器官逐渐生长为肝细胞瘤类器官。

根据本发明的实施例，所述YAP1基因(Yap1^5SA)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

atggatcccgggcagcagccgccgcctcaaccggccccccagggccaagggcagccgccttcgcagcccccgcaggggcagggcccgccgtccggacccgggcaaccggcacccgcggcgacccaggcggcgccgcaggcaccccccgccgggcatcagatcgtgcacgtccgcggggactcggagaccgacctggaggcgctcttcaacgccgtcatgaaccccaagacggccaacgtgccccagaccgtgcccatgaggctccggaagctgcccgactccttcttcaagccgccggagcccaaatcccactcccgacaggccGCtactgatgcaggcactgcaggagccctgactccacagcatgttcgagctcatGccGctccagctGctctgcagttgggagctgtttctcctgggacactgacccccactggagtagtctctggcccagcagctacacccacagctcagcatcttcgacagGctGcttttgagatacctgatgatgtacctctgccagcaggttgggagatggcaaagacatcttctggtcagagatacttcttaaatcacatcgatcagacaacaacatggcaggaccccaggaaggccatgctgtcccGgatgaacgtcacagcccccaccagtccaccagtgcagcagaatatgatgaactcggcttcaggtcctcttcctgatggatgggaacaagccatgactcaggatggagaaatttactatataaaccataagaacaagaccacctcttggctagacccaaggcttgaccctcgttttgccatgaaccagagaatcagtcagagtgctccagtgaaacagccaccacccctggctccccagagcccacagggaggcgtcatgggtggcagcaactccaaccagcagcaacagatgcgactgcagcaactgcagatggagaaggagaggctgcggctgaaacagcaagaactgcttcggcaggtgaggccacaggagttagccctgcgtagccagttaccaacactggagcaggatggtgggactcaaaatccagtgtcttctcccgggatgtctcaggaattgagaacaatgacgaccaatagctcagatcctttccttaacagtggcacctatcactctcgagatgagGCtacagacagtggactaagcatgagcagctacagtgtccctcgaaccccagatgacttcctgaacagtgtggatgagatggatacaggtgatactatcaaccaaagcaccctgccctcacagcagaaccgtttcccagactaccttgaagccattcctgggacaaatgtggaccttggaacactggaaggagatggaatgaacatagaaggagaggagctgatgccaagtctgcaggaagctttgagttctgacatccttaatgacatggagtctgttttggctgccaccaagctagataaagaaagctttcttacatggtta(SEQ ID NO：1)。

YAP1基因编码的蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：

MDPGQQPPPQPAPQGQGQPPSQPPQGQGPPSGPGQPAPAATQAAPQAPPAGHQIVHVRGDSETDLEALFNAVMNPKTANVPQTVPMRLRKLPDSFFKPPEPKSHSRQAATDAGTAGALTPQHVRAHAAPAALQLGAVSPGTLTPTGVVSGPAATPTAQHLRQAAFEIPDDVPLPAGWEMAKTSSGQRYFLNHIDQTTTWQDPRKAMLSRMNVTAPTSPPVQQNMMNSASGPLPDGWEQAMTQDGEIYYINHKNKTTSWLDPRLDPRFAMNQRISQSAPVKQPPPLAPQSPQGGVMGGSNSNQQQQMRLQQLQMEKERLRLKQQELLRQVRPQELALRSQLPTLEQDGGTQNPVSSPGMSQELRTMTTNSSDPFLNSGTYHSRDEATDSGLSMSSYSVPRTPDDFLNSVDEMDTGDTINQSTLPSQQNRFPDYLEAIPGTNVDLGTLEGDGMNIEGEELMPSLQEALSSDILNDMESVLAATKLDKESFLTWL(SEQ ID NO：2)。

根据本发明的实施例，所述肝细胞瘤类器官为肝母细胞瘤类器官。肝母细胞瘤是一种具有多种分化方式的恶性胚胎性肿瘤，根据本发明实施例所述的肝母细胞瘤类器官可以较好的模拟幼儿肝母细胞瘤发病的过程，进行有效的科学研究。

根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将胚肝组织进行消化处理，以便获得胚肝细胞；2)将所述胚肝细胞进行第一培养(3D)，以便获得所述胚肝类器官；以及3)将病毒感染液与所述胚肝类器官进行混合处理，所述病毒携带YAP1基因；4)将步骤3)获得的产物进行第二培养(3D)，以便获得所述肝细胞瘤类器官。根据本发明实施例所述的方法，采用可以将胚肝类器官激活为肝细胞瘤类器官，所述肝细胞瘤类器官可以较好的模拟婴幼儿肝母细胞瘤发病的过程并以此模型为基础进行科学研究的可靠性较高。

根据本发明的实施例，将所述胚肝细胞进行培养，所述胚肝细胞为商业购买所得，将所述胚肝细胞放入合适条件下进行培养，随着培养时间的延长，活细胞会逐渐生长为具有3D结构的胚肝类器官。

根据本发明的实施例，所述病毒为慢病毒。根据本发明实施例的慢病毒不受特别限制，任何种类的慢病毒均可使用。

根据本发明的实施例，所述慢病毒的滴度为10⁷-10⁹TU/mL。根据本发明实施例所述的慢病毒滴度可以较好的进行感染，感染效率较高。

根据本发明的实施例，所述第二培养包括采用含有如下成分的培养基进行培养的步骤：Blebbistatin、A83-01、DAPT、LDN193189和Forskolin。所述第二培养过程中肝细胞瘤类器官逐渐长成，包含Blebbistatin、A83-01、DAPT、LDN193189和Forskolin小分子的培养基在培养肝母细胞瘤类器官时培养效率得到显著提高。

根据本发明的实施例，所述Blebbistatin的浓度为8-12μM，优选为10μM。

根据本发明的实施例，所述A83-01的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM。

根据本发明的实施例，所述DAPT的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM。

根据本发明的实施例，所述LDN193189的浓度为0.05-0.2μM，优选为0.1μM。

根据本发明的实施例，所述Forskolin的浓度为16-23μM，优选为20μM。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种肝母细胞瘤类器官。根据本发明的实施例，所述肝母细胞瘤类器官采用第一方面所述的方法构建的。根据本发明实施例的肝母瘤类器官与体内肝母瘤在细胞类型、结构以及功能等方面非常接近，以此肝母瘤类器官为模型可以较好的模拟婴幼儿肝母细胞瘤发病的过程。

在本发明的第三方面，本发明提出了第二方面所述肝母细胞瘤类器官在药物筛选中的用途。根据本发明的实施例，所述药物筛选为药物高通量筛选。根据本发明实施例所述的肝母细胞瘤类器官可以有效的作为筛选模型，如进行高药物高通量筛选。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：Blebbistatin、A83-01、DAPT、LDN193189和Forskolin。

根据本发明的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述Blebbistatin的浓度为8-12μM，优选为10μM。

根据本发明的实施例，所述A83-01的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM。

根据本发明的实施例，所述DAPT的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM。

根据本发明的实施例，所述LDN193189的浓度为0.05-0.2μM，优选为0.1μM。

根据本发明的实施例，所述Forskolin的浓度为16-23μM，优选为20μM。

根据本发明的实施例，进一步包括DMEM/F12培养基。

根据本发明的实施例，进一步包括：B27、GlutaMAX^TM、链霉素、青霉素和N-乙酰半胱氨酸。

在本发明的第五方面，本发明提出了所述培养基在培养类器官中的用途。根据本发明的实施例，所述类器官为肝细胞瘤类器官。根据本发明实施例所述的培养基培养获得的肝细胞瘤类器官生长状态良好，培养效率得到显著提高。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述类器官为肝母细胞瘤类器官。根据本发明的实施例的培养基培养出的肝母细胞瘤类器官生长状态良好，培养效率得到显著提高。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，包括：将待筛选的药物与第二方面所述的肝母细胞瘤类器官进行接触，比较接触前后，所述肝母细胞瘤类器官的体积，以确定目标药物。根据本发明实施例所述的方法，将待筛选的药物与所述肝母细胞瘤类器官进行接触后，根据所述肝母细胞瘤类器官体积的变化，可以筛选出使肝母细胞瘤类器官体积增大或减小的药物。

根据本发明的实施例，上述筛选药物的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述肝母细胞瘤的体积低于所述接触前肝母细胞瘤的体积，是待筛选药物为目标药物的指示。所述待筛选药物使得本发明实施例的肝母细胞瘤体积低于所述待筛选药物接触前肝母细胞瘤的体积时，即所述待筛选药物可以抑制肝母细胞瘤的生长或杀死肝母细胞瘤，则待筛选药物为目标药物。

根据本发明的实施例，所述肝母细胞瘤的体积不高于所述接触前肝母细胞瘤的体积的70％，是待筛选药物为目标药物的指示。当所述肝母细胞瘤的体积相较于所述接触前肝母细胞瘤的体积的减小至少30％时，所述待筛选药物为目标药物，本文中所述肝母细胞瘤的体积相较于所述接触前肝母细胞瘤的体积的减小的比例不受特殊限制，可根据需求确定所述比例。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例分离的人胚肝细胞培养18天的类器官的明场图，左图为新鲜分离的胚肝细胞团(Freshly isolated fetal liver cell clusters)，右图为3D培养18天后的形成的胚肝类器官(fetal liver organoid-18-day culture)比例尺200μm；

图2是根据本发明实施例的慢病毒绿色荧光蛋白(GFP)、β-catenin^Δex3或YAP1^5SA转染的21天培养的胚肝类器官的明场图像，并通过类器官面积增长比例(Fold change oforganoid area)来量化类器官的生长速率，其中iWnt表示施加5μM的IWP-2(Wnt抑制剂)处理作为对比，图像中比例尺为200μm；

图3是根据本发明实施例的慢病毒绿色荧光蛋白(GFP)、β-catenin^Δex3或YAP1^5SA转染的类器官培养60天的结果图，比例尺250μm；

图4是根据本发明实施例的GFP或YAP1^5SA转染的类器官中肝母细胞瘤标志基因的相对表达水平(relative mRNA level)qRT-PCR结果分析图，其中H3用作内参，Means±SD(n＝3)；

图5是根据本发明实施例的移植了GFP和YAP1激活胚肝类器官的M-NSG小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(survival rate，存活率)结果图；

图6是根据本发明实施例的YAP1激活的肝母细胞瘤类器官被移植到NSG小鼠的肝包膜中XX天后，YAP1激活型类器官的结果图，其中，6-A表示经YAP1激活后类器官可在肝脏中形成肿瘤，6-B表示在所形成的肿瘤在肺中形成转移灶，比例尺100μm；

图7是根据本发明实施例的以肝母细胞瘤为模型筛选高通量药物的操作流程图；

图8是根据本发明实施例的BIX 01294的结构图；以及

图9是根据本发明实施例的NGS小鼠被移植了YAP1激活的肝母细胞瘤类器官进行药物筛选的结果图，通过测量肿瘤的大小(tumor size)定量小分子对肿瘤生长和迁移的抑制作用。其中，Means±SD(n＝5)，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

术语“任选地”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。由此，限定有“任选地”的特征可以明示或者隐含地包括或不包括该特征。

本文中，“药物高通量筛选”指基于分子水平或细胞水平的筛选模型，以微孔板为反应载体，结合自动化的操作系统以及灵敏快速的检测方法，高效的完成对数以千万待测样品的检测，如，本文中以肝母细胞瘤类器官为筛选模型，建立96/384孔通量矩阵，加入待测的小分子化合物，如BIX 01294，检测类器官的存活率，以获得目标药物。

本发明中发明人采用胚肝细胞培养建立了人源化的胚肝类器官模型，所述胚肝细胞为购买或分离废弃的受精后发育8-12周的流产后的人胚肝细胞群组织获得，并在此基础上开发了一种人源化胚肝类器官的全小分子培养体系，进而基于Hippo-YAP信号通路的激活建立了肝母细胞瘤类器官模型，并且在小鼠体内进行了肝母细胞瘤类器官原位移植后，可产生肝母细胞瘤的发生及肺转移，因此，所述肝母细胞瘤可以较好的模拟婴幼儿肝母细胞瘤发生、发展的过程，可以作为肝母细胞瘤的研究模型。

进一步地，发明人基于人胚肝来源诱导的肝母细胞瘤类器官进行药物筛选，以验证肝母细胞瘤类器官模型的功能，发现BIX 01294可以特异性地减弱YAP1激活的类器官的生长，BIX 01294可以在体内靶向肝母细胞瘤，因此，肝母细胞瘤类器官模型可以用来筛选多种药物，如：作为G9a抑制剂筛选的模型用于临床前药物研发。

下面将对实施例作具体介绍，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的。

实施例1胚肝组织细胞的分离、培养、传代、冻存和复苏

1、胚肝组织细胞的分离和培养

(1)所述胚肝细胞由购买或分离废弃的受精后发育8-12周的流产后的人胚肝组织获得，基于此，若分离废弃的受精后发育8-12周的流产后的人胚肝组织获得所述胚肝细胞，涉及人源组织取材的研究必须遵守政府法律和所有相关机构的规定，并在取材和试验前获得患者的知情同意。样本要求总体积大于等于5mm³，样本应在取材后迅速转移至在含有运输缓冲液的离心管中，运输过程中样本储存管应置于0-4℃的低温环境中，例如冰盒等容器，并在24小时内运至实验室，胚肝组织运送到实验室后，在生物安全柜内将组织转移至无菌磷酸盐缓冲溶液(组织洗液)中并清洗2遍，拍照记录胚肝组织的原始形态；

(2)将清洗好的胚肝组织转移至无菌培养皿中，尽可能清理掉所有非上皮组织后(例如肌肉或脂肪)，用提前灭菌的组织剪将组织剪碎至约为0.5-2mm³大小；

(3)按照表1中所示的参数配置消化液待用，将剪碎的组织用消化液重悬，并转移至离心管内，于37℃，100rpm条件下的恒温振荡培养箱中，消化60分钟，使用不同规格(顺序从大到小如10mL，5mL，1mL)的移液器吹打组织消化悬液，直至类器官产生肉眼可见的分散，达到充分消化；

表1：

添加试剂	工作浓度
		基础细胞培养基或DMEM/F12减血清培养基	1×
小分子化合物Y-27632	10μM
		胶原蛋白水解酶(Collagenase I)	400U/mL
脱氧核糖核酸酶(DnaseⅠ)	10U/mL

(4)在消化完成的组织悬液中加入10％的FBS以减缓消化作用，同时轻轻吹打数次；

(5)用100μm细胞过滤器将上述组织悬液进行过滤，收集消化下来的单细胞或组织碎片，将收集到的滤液于150g的离心力离心5分钟，弃去上清液，保留沉淀，对于未通过滤网的组织块，可以进行收集再次消化；

(6)用含有抗生素的PBS或基础培养基分别清洗细胞2次(混匀后150g离心力离心，3分钟，弃上清)以除去FBS。若所获细胞中包含红细胞，则可在清洗前在沉淀中加入红细胞裂解液(低渗氯化铵溶液)裂解红细胞。取少量悬液进行活细胞检测和计数，并按照100,000-500,000个细胞/mL的密度加入细胞外基质并在冰上混匀，混匀后置于冰上；

(7)吸取细胞外基质和细胞的混合液移至细胞培养孔板中，如24孔细胞培养板每孔点20-30μL混合悬液；

(8)将培养板放入37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育15分钟，待细胞外基质凝固完全后，沿孔壁缓缓加入完全培养基，以24孔为例，加500μL完全培养基，原代培养需包含小分子化合物Y-27632和真菌抗生素)，P0代培养3-4天换液(GF培养基，其成分如表2所示)，在第7天将培养基更换为化学成分确定的培养基(5C培养基，其成分如表3所示)，连续培养18天后，并进行拍照记录。

表2：

添加试剂	工作浓度
		DMEM/F12减血清培养基	1×
B27添加物	1×
		链霉素和青霉素混合抗生素	1×
N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine)	1.25mM
		烟酰胺(Nicotinamide)	10mM
小分子化合物Blebbistatin	10μM
		小分子化合物Y-27632	10μM
小分子化合物Forskolin	10μM
		重组人R-spondin蛋白	500ng/mL
重组人Noggin蛋白	100ng/mL
		重组人胃泌素	10nM
重组人EGF蛋白*	50ng/mL
		重组人FGF10蛋白	100ng/mL
重组人HGF	50ng/mL

表3：

添加试剂	工作浓度
		DMEM/F12减血清培养基	1×
B27添加物	1×
		<![CDATA[GlutaMAX<sup>TM</sup>添加剂]]>	2mM
链霉素和青霉素混合抗生素	1×
		N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine)	1.25mM
小分子化合物Blebbistatin	10μM
		小分子化合物A83-01	1μM
小分子化合物DAPT	1μM
		小分子化合物LDN193189	0.1μM
小分子化合物Forskolin	20μM

拍照后得到的结果如图1所示，培养18天后即可获得形态完整的胚肝类器官。

2、胚肝类器官的传代

(1)待类器官培养到一定的大小(直径为100-500μm)时(P0代约1-3周，Pn代约1-2周)，即可进行类器官的传代或冻存。在保留原培养液的条件下(或者吸去培养液加入等体积的PBS)，用细胞刮刀或者移液器吸头尖端轻轻刮下(或吹打)细胞外基质和类器官混合物，转移至1.5mL或15mL离心管中，吹打5-10次，使类器官和细胞外基质分离，于300g条件下离心3分钟；

(2)离心后，去除上清液，加入5倍于细胞外基质和类器官混合物体积的含蛋白酶(如：非动物源性重组蛋白酶TrypLE^TM)和EDTA(1mM)的组织消化液，混匀后置于37℃培养箱中消化；

(3)类器官消化时间3-6分钟，期间每隔2分钟吹打混匀一次，直至类器官被消化成小的细胞团块。如果消化时间超过5分钟则可加入50％消化悬液体积的FBS以终止消化反应；

(4)将本实施例中步骤3获得产物中再加入5倍于消化悬液体积的PBS或基础培养基稀释消化后的类器官悬液，混匀后于300g条件下离心3分钟，离心后用PBS或基础培养基洗两次以除去残留的消化液；

(5)离心后，去除上清液，将离心沉淀中的细胞进行传代培养，用细胞外基质重悬细胞后充分混匀(30,000-150,000个活细胞/mL)，吸取混合液移至细胞培养板中；

(6)放入CO₂培养箱静置15分钟，确认细胞外基质凝固完全后加入完全培养基，培养基的组成如表4所示，以24孔为例，加500μL完全培养基，每1-2天观察一次、拍照，每3-4天更换完全培养基。

表4：

3、胚肝类器官的冻存

(1)准备好细胞冻存程序降温盒置于室温平衡温度；

(2)选择类器官生长状态良好的培养孔，弃去培养基，用移液吸头将细胞外基质和类器官混合物轻轻刮下，转移至离心管中吹打混匀，加入1mL的PBS清洗类器官1-2遍，充分除去残留的基质胶后将类器官200g离心5分钟去除上清；

(3)向准备冻存的类器官中加入500μL-1000μL预冷的冻存液，吹打混匀后迅速移至低温冻存管中；

(4)将低温冻存管放入细胞冻存程序降温盒内，随后迅速将细胞冻存程序降温盒放入-80℃超低温冰箱中，次日将冻存管转移至液氮中长期保存。

4、胚肝类器官的复苏

(1)提前准备好所用培养基和试剂，打开水浴锅，将温度调至37℃，并预热基础培养基。从液氮罐中取出冻存管，将冻存管快速放入37℃水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化，在冰块完全融化前停止水浴，将类器官冻存悬液转移至15mL离心管中，缓缓加入5倍体积37℃预热的基础培养基稀释冻存悬液；

(2)将步骤(1)获得的类器官和37℃预热的基础培养基稀释冻存悬液的混合悬液于300g离心3分钟，充分去除上清液，加入1mL基础培养基重悬，转移到1.5mL离心管中离心，重复洗1-2次以除去残留冻存液；

(3)在细胞沉淀中加入适量细胞外基质并在冰上混匀，混匀后置于冰上；

(4)吸取细胞外基质和细胞的混合液移至细胞培养孔板中，如24孔细胞培养板每孔点20-30μL混合悬液，混合悬液须点至培养孔底部，其铺开后不可接触培养孔侧壁；

(5)将24孔细胞培养板放入37摄氏度，5％二氧化碳细胞培养箱中静置15分钟，确认细胞外基质凝固完全后加入完全培养基；

(6)将细胞培养板放入37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中进行培养，每1-2天观察一次、拍照，每2-4天更换完全培养基。一般情况下，在倒置显微镜下观察到表面明亮且光滑的细胞为活细胞，而黯淡不透光且表面粗糙的细胞为死细胞或者活力较低的细胞。随着培养时间的延长，活细胞会将逐渐生长成3D类器官。

实施例2YAP1肝母细胞瘤模型的建立

本实施例中共设置3组，包括对照组(GFP组)、β-catenin^Δex3组及Yap1^5SA组，其中，对照组用表达GFP的慢病毒感染人胚肝细胞，β-catenin^Δex3及Yap1^5SA组用表达β-catenin^Δex3及Yap1^5SA的慢病毒感染人胚肝细胞，具体的处理方式如下：

(1)β-catenin^Δex3即β-连环蛋白的活性结构域，Yap1^5SA是Yes相关蛋白1蛋白的活性结构域，β-catenin^Δex3及Yap1^5SA编码基因通过对人肝细胞基因文库酶切产生，进而将β-catenin^Δex3和Yap1^5SA克隆到pLVX-P2A-EGFP(Addgene)载体中；

(2)复苏一支状态较好的293T细胞，于DMEM培养基(含有10％胎牛血清)中进行培养，使转染时细胞达到70％-90％的密度；

(3)在转染前1-2小时，细胞更换无抗生素的含有10％胎牛血清(货号：F8318，公司：Sigma)的DMEM(货号：12800017，公司：Gibco)培养基培养基；

(4)取5～8μg DNA(起始用量5μg)，加入稀释液中至总体积为100μL，轻轻混匀，室温放置，其中，按照如下质量比核心质粒：psPAX2(PH1)：pMD2.G(PH2)＝7:5:2，如10cm皿分别加7μg，5μg，2μg构建；

(5)取真核转染试剂(VigoFect)4μL(起始用量2μL)，加入稀释液中至总体积为100μL，轻轻混匀，室温放置5分钟，将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟，然后轻柔、均匀的滴入细胞中，最后轻晃混匀，将细胞放入培养箱培养；

(6)转染16-20h后，弃培养基，更换新鲜含FBS的DMEM培养基，收集换液后36h的病毒上清，于4℃、1000rpm条件下离心10分钟，取上清分装到1.5mL离心管。暂时保存于4℃或长期保存于-80℃；

(7)收取病毒后，将类器官消化5-10分钟，利用40μm滤器过滤，获得单细胞悬液，冰上放置备用。准备感染培养基：在类器官培养基(5C培养基)中加入100μL病毒液助转染试剂polybrene(10μg/mL)，总体积250μL的混合液，重悬细胞沉淀后混合均匀，加入到48孔板中，用封口膜封住孔板。移至孔板离心机中32℃，于600g条件下离心60分钟后，转移至37℃培养箱中继续培养5-6h。接着将感染5-6h后的胚肝细胞室温离心，1000rpm离心3分钟，弃上清。用30μL体积的基质胶重悬细胞，并将转染后的类器官铺到24孔板里，接上500μL体积的类器官培养基于37℃培养。

显微镜下拍照后利用imageJ统计并计算类器官扩增面积，具体结果如图2所示，β-catenin^Δex3和Yap1^5SA组的类器官扩增面积明显高于对照GFP组，其中Yap1^5SA组扩增效果最明显；转染后类器官的生长状况如图3所示，从肉眼即可看出Yap1^5SA组的类器官生长状态明显优于β-catenin^Δex3组和对照组；并利用RT-PCR技术检测肝母细胞瘤特异性的标志物的表达情况，具体结果如图4所示，Yap1^5SA组中的肝母细胞瘤的标志物基因DKK1，COL2A1，TNFRSF1等10个标志基因相比于对照组GFP有明显的升高，因此，在肝母细胞中表达Yap1^5SA能够模拟肝母细胞瘤。

实施例3 YAP1肝母细胞瘤异种移植模型的建立

本实施例实验分组及构建YAP1肝母细胞瘤异种移植模型的具体操作步骤如下：

选取66只NOD-Prkdcscid Il2rgem1/Smoc(M-NSG)(M-NSG)品系的5-7周龄，体重为18-24g的重度免疫缺陷小鼠进行实验，包括对照组(GFP组)和YAP1^5SA组，每组22只小鼠，对照组小鼠的处理为将感染了GFP慢病毒的胚肝类器官注射至NSG小鼠肝包膜下，YAP1^5SA组小鼠进行肝母细胞瘤移植，将感染了Yap15SA慢病毒的胚肝类器官注射至NSG小鼠肝包膜下，其中，YAP1^5SA组小鼠的处理方式如下；

(1)在接种前，收集类器官(约2×10⁵个细胞)，用培养基进行洗涤、离心，以去除所有上清液并重悬于15μL基质胶中，置于冰上待用；

(2)配置1％戊巴比妥钠，施加40mg/kg药量腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，呼吸平稳，利用灭菌手术器械，剪开小鼠腹腔，充分暴露肝脏；

(3)将基质胶及类器官混合物注射到小鼠的肝包膜下，缝合创口，并给小鼠注射抗生素以防感染。

连续观察小鼠状态，统计小鼠生存状况，具体实验结果如图5所示，当达到P25时，YAP1^5SA组小鼠的存活率开始下降，P40时，YAP1^5SA组小鼠的存活率下降到80％以下。解剖后进一步观测成瘤性及远端器官是否出现转移，具体结果如图6所示，注射了感染Yap1^5SA慢病毒的胚肝类器官的小鼠肝脏出现了明显的癌症病灶，并且发生了转移，而对照组仅在注射的位置出现了局部的扩增。综上所述，感染Yap1^5SA慢病毒的胚肝类器官模拟了肝母细胞瘤的特征，即在肝脏中形成病灶并能够模拟癌症病灶的迁移。

实施例4 YAP1肝母细胞瘤模型的应用

采用实施例1所述的方法对购买的胚肝组织细胞进行分离、培养，采用实施例2获得的YAP1肝母细胞瘤模型进行药物筛选，实验操作流程图如图7所示。

1、建立人胚肝类器官的YAP1激活促进肝母细胞瘤的抑制剂筛选模型

YAP1激活促进肝母细胞瘤模型的建立方法参考实施例1和2。

2、BIX 01294对体内外肝母细胞瘤的影响

本实验在体外，基于3D培养的肝母细胞瘤模型，通过高内涵筛选系统对能够抑制肝母细胞瘤类器官生长的小分子药物进行筛选；在体内，基于YAP1肝母细胞瘤异种移植模型，通过腹腔注射给药的方式对该药物抑制肿瘤生成的效果进行评价。具体实验操作如下：

选取NOD-Prkdcscid Il2rgem1/Smoc(M-NSG)(M-NSG)品系5-7周龄，体重18-24g之间的重度免疫缺陷小鼠，分为2组，包括对照组(Mock)和实验组(BIX 01294)，实验组每天用腹腔注射给药BIX 01294(5mg/kg)连续治疗10天，其中，BIX 01294的组成及结构如图8所示，对照组小鼠每天腹腔注射同等体积的生理盐水，进行药物筛选，具体实验操作如下：

(1)收集类器官(约2×10⁵个细胞)，培养基洗涤，离心以去除所有上清液并重悬于15μL基质胶中，置于冰上待用；

(2)配置1％戊巴比妥钠，施加40mg/kg药量腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，呼吸平稳，利用灭菌手术器械，剪开小鼠腹腔，充分暴露肝脏；

(3)将基质胶及类器官混合物注射到小鼠的肝包膜下，缝合创口，并给小鼠注射抗生素以防感染；

(5)NGS小鼠被移植了YAP1激活的肝母细胞瘤类器官后，实验组每天用腹腔注射给药BIX 01294(5mg/kg)连续治疗10天，对照组给予同体积的生理盐水注射；

(6)连续观察小鼠状态，安乐死小鼠后，解剖后观测成瘤性，计算瘤体积。

具体实验结果如图9所示，由9-A可知，对照组(Mock)出现了明显的肝脏肿瘤，而BIX01294组的肝脏则没有出现明显的肿瘤。经过对肿瘤大小的统计分析，由9-B可知，BIX01294组小鼠的肿瘤体积极显著低于对照组，由此可知，以YAP1肝母细胞瘤异体移植为模型，小分子BIX 01294处理后有效地抑制了肝母细胞瘤的生长。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (16)

1.一种制备肝细胞瘤类器官的方法，其特征在于，将胚肝类器官进行激活处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用YAP1基因进行激活处理，以便获得所述肝细胞瘤类器官。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述YAP1基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肝细胞瘤类器官为肝母细胞瘤类器官。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)将胚肝组织进行消化处理，以便获得胚肝细胞；

2)将所述胚肝细胞进行第一培养，以便获得所述胚肝类器官；以及

3)将病毒感染液与所述胚肝类器官进行混合处理，所述病毒携带YAP1基因；

4)将步骤3)获得的产物进行第二培养，以便获得所述肝细胞瘤类器官；

任选地，所述病毒为慢病毒。

6.根据权利要求5述的方法，其特征在于，所述慢病毒的滴度为10⁷-10⁹TU/mL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二培养包括采用含有如下成分的培养基进行培养的步骤：Blebbistatin、A83-01、DAPT、LDN193189和Forskolin。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Blebbistatin的浓度为8-12μM，优选为10μM；

任选地，所述A83-01的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM；

任选地，所述DAPT的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM；

任选地，所述LDN193189的浓度为0.05-0.2μM，优选为0.1μM；

任选地，所述Forskolin的浓度为16-23μM，优选为20μM。

9.一种肝母细胞瘤类器官，其特征在于，所述肝母细胞瘤类器官采用权利要求1-8任一项所述的方法构建的。

10.权利要求9所述肝母细胞瘤类器官在药物筛选中的用途，任选地，所述药物筛选为药物高通量筛选。

11.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括：Blebbistatin、A83-01、DAPT、LDN193189和Forskolin。

12.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于，所述Blebbistatin的浓度为8-12μM，优选为10μM；

任选地，所述A83-01的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM；

任选地，所述DAPT的浓度为0.8-1.2μM，优选为1μM；

任选地，所述LDN193189的浓度为0.05-0.2μM，优选为0.1μM；

任选地，所述Forskolin的浓度为16-23μM，优选为20μM。

13.根据权利要求11或12所述的培养基，其特征在于，进一步包括DMEM/F12培养基；

任选地，进一步包括：B27、GlutaMAX^TM、链霉素、青霉素和N-乙酰半胱氨酸。

14.权利要求11-13任一项所述培养基在培养类器官中的用途，所述类器官为肝细胞瘤类器官，

任选地，所述类器官为肝母细胞瘤类器官。

15.一种筛选药物的方法，其特征在于，包括：

将待筛选的药物与权利要求9所述的肝母细胞瘤类器官进行接触，

比较接触前后，所述肝母细胞瘤类器官的体积，以确定目标药物。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述接触后，所述肝母细胞瘤的体积低于所述接触前肝母细胞瘤的体积，是待筛选药物为目标药物的指示；

任选地，所述肝母细胞瘤的体积不高于所述接触前肝母细胞瘤的体积的70％，是待筛选药物为目标药物的指示。

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