CN108066361A - 一种外泌体，其制备方法及其在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途 - Google Patents

一种外泌体，其制备方法及其在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途 Download PDF

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CN108066361A CN201711346522.7A CN201711346522A CN108066361A CN 108066361 A CN108066361 A CN 108066361A CN 201711346522 A CN201711346522 A CN 201711346522A CN 108066361 A CN108066361 A CN 108066361A
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Abstract

公开了一种由疟原虫感染宿主分泌到血浆或培养上清中的外泌体，其制备方法及其在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。

Description

一种外泌体，其制备方法及其在制备抗肿瘤的药物或者制剂 中的用途
技术领域
本发明涉及一种由疟原虫感染宿主分泌到血浆中的外泌体，其制备方法及其在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
背景技术
细胞外膜泡(extracellular vesicles)，例如外泌体(exosomes)和微泡(有时两者被统称为膜泡)，它们由不同类型的细胞所分泌参与生理和病理过程。外泌体介导了细胞间和胞内的通讯，靶细胞可以接受这一信号。基于这些特点，外泌体可能可以作为一种新的工具应用于不同的治疗当中，包括：抗肿瘤治疗；疫苗；免疫调节和修复治疗；药物递送等。目前科学家已经在临床上试用膜泡对肿瘤病人进行治疗，参见Lener T,Gimona M,AignerL等人的Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials–an ISEV position paper.Journal of Extracellular Vesicles.2015；4:10doi:10.3402/jev.v4.30087。
目前国内外将膜泡用于治疗肿瘤的研究已经开展一段时期，但是用于专门针对肿瘤血管生成抑制的研究报道很少。
发明内容
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种外泌体，其特征在于，所述外泌体是由疟原虫感染宿主分泌到血浆或培养上清中的外泌体。
在本发明中，所述外泌体的大小为50nm-200nm。
在本发明中，所述宿主为感染疟原虫的动物和人。
根据本发明的第二方面，本发明提供了如第一方面所述的外泌体的制备方法，其特征在于，采集疟原虫感染宿主的血浆并从所述血浆分离出所述外泌体，或者采集疟原虫感染的细胞培养上清并从所述上清中分离出所述外泌体。
在本发明中，通过外泌体提取试剂盒或超速离心方法从所述血浆分离出所述外泌体。
根据本发明的第三方面，本发明提供了如第一方面所述的外泌体在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
在本发明中，所述外泌体通过抑制肿瘤组织中的血管生成或发育达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
在本发明中，所述外泌体通过抑制肿瘤组织中的血管的管腔形成达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
在本发明中，所述外泌体通过抑制肿瘤中的血管内皮细胞的迁移达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
在本发明中，所述外泌体通过抑制肿瘤中内皮细胞的调节血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的基因的表达或抑制内皮细胞的血管内皮细胞生长因子受体2的表达达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
在本发明中，所述外泌体通过其中所含的miRNA抑制肿瘤血管生成、发育、血管的管腔形成、血管内皮细胞的迁移、肿瘤中内皮细胞的调节血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的基因的表达和抑制内皮细胞的血管内皮细胞生长因子受体2的表达中的一项或多项达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
在本发明中，所述miRNA为miR16-5p、miR17-5p、miRNA322-5p和miRNA497-5p中的一种或多种。
在本发明中，所述肿瘤为有肿瘤血管生成的实体肿瘤，优选肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌。
由疟原虫感染宿主分泌到血浆的外泌体源于生物体本身，与非生物来源的治疗相比更容易被机体所接受。
附图说明
图1示出在鼠疟原虫(Py)感染的路易斯肺癌(LLC)荷瘤小鼠模型中，提取血浆中外泌体，检测外泌体，a：发现Py感染小鼠血浆中外泌体蛋白显著增加。b，c：粒径分析和透射电镜结果显示外泌体大小在50nm-200nm左右。
图2示出a：注射方式；b：肿瘤大小观察，其中*p<0.05。
图3示出a：剥瘤大体观察；b：肿瘤皮下血管形成数量；c：IHC分析CD31肿瘤组织表达情况，其中*p<0.05，***p<0.01。
图4示出a：管腔形成实验；b：transwell实验；c：划痕试验，其中*p<0.05，***p<0.01。
图5示出单独肺癌荷瘤小鼠(LLC组)的外泌体和疟原虫感染的荷瘤小鼠(Py+LLC组)外泌体分别作用于内皮细胞(MS1)后，RNA-seq聚类分析。
图6示出外泌体与MS1共孵育后，血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)表达水平，a：qPCR检测mRNA表达；b：蛋白质免疫印迹检测vegfR2蛋白水平表达，其中*p<0.05。
图7示出a：检测不同组外泌体中miRNAs表达；b：信息学分析miRNAs靶点；c：双荧光素酶报告系统验证miRNAs靶点；d：miRNAs对MS1细胞VEGFR2mRNA表达水平影响；e：miRNAs对MS1细胞VEGFR2表达影响；f：miRNAs对MS1细胞管腔形成影响，其中*p<0.05。
图8示出a：qPCR检测不同外泌体及miRNAs抑制剂加入MS1中VEGFR2mRNA表达；b：蛋白质印迹法检测不同外泌体及miRNAs抑制剂加入MS1中VEGFR2表达；c：不同外泌体及miRNAs抑制剂加入对MS1细胞管腔形成的影响。
图9示出不同来源的外泌体影响HUVEC中vegfR2mRNA表达的水平。
具体实施方式
发明人在动物实验中观察到疟原虫(Py)感染的小鼠肿瘤外观苍白，更容易发生肿瘤溃烂，推测疟原虫感染可能抑制血管生成。在路易斯(Lewis)肺癌细胞(LLC)肺癌模型中观察到Py感染小鼠肿瘤组织血管内皮染色微血管密度显著降低。在Py感染的LLC荷瘤小鼠模型中，提取血浆中外泌体，检测外泌体，发现Py感染小鼠血浆中外泌体蛋白显著增加。粒径分析和投射电镜结果显示外泌体大小在50nm-200nm左右，符合外泌体大小特征。
将C57小鼠分成5组，给予如下处理：感染Py疟原虫(Py组)，皮下接种LLC肺癌细胞(LLC组)，接种LLC同时感染Py(Py+LLC组)，注射磷酸缓冲液(PBS)对照，未经任何处理的单纯对照(空白组)。处理17天后采血分离血浆外泌体，对LLC荷瘤小鼠进行瘤内注射，观察肿瘤的生长和血管生成情况，发现来源于Py感染小鼠血浆的外泌体显著抑制LLC的生长。处死小鼠取肿瘤观察到Py组和Py+LLC组小鼠血浆外泌体瘤内注射的肿瘤苍白，血管生成明显降低，肿瘤组织CD31血管内皮组化染色也证明这两组动物肿瘤的血管密度显著下降。
利用小鼠内皮细胞MS1的迁移抑制实验发现来源于Py和Py+LLC组的外泌体显著地抑制了MS1的迁移，检测管腔形成也证明Py感染动物血浆外泌体显著抑制管腔形成。
来源于单纯LLC荷瘤小鼠和Py+LLC小鼠的外泌体与内皮细胞MS1共孵育后，对MS1进行表达谱测序。把两组差异显著的基因进行聚类分析后，发现来源于Py+LLC小鼠的外泌体处理的MS1细胞中与细胞增殖迁移和血管新生相关的基因，血管发育和形态相关的基因显著下调，调节血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的基因表达明显下降。
进一步检测Py感染小鼠外泌体对内皮细胞MS1的血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的表达的影响，在mRNA和蛋白水平观察到外泌体明显抑制VEGFR2的表达。
为了探究外泌体的哪种成分在VEGF/VEGFR2通路起作用，据以往报道，外泌体内容物里非编码RNA含量丰富，用qPCR检测后发现miR16-5p、miR17-5p、miRNA322-5p和miRNA497-5p的表达在疟原虫感染后外泌体中显著升高，生物信息学分析发现，这几个miRNAs的靶点都集中在VEGF/VEGFR2通路上。用双荧光素酶报告系统确定了这几个miRNAs的靶点是VEGFR2。MS1细胞中用lip3000转染miRNAs，24h后在mRNA和蛋白水平观察到明显抑制VEGFR2的表达；检测管腔形成也证明miRNAs显著抑制管腔形成。
最后为了确定是否是这几个miRNAs在外泌体中起抑制血管生成作用，用miRNAs的抑制剂与不同组外泌体和MS1共孵育24h，mRNA和蛋白水平观察到Py、Py+LLC外泌体组中VEGFR2的表达明显升高，与未加抑制剂组比较有显著性差异。管腔形成实验也发现，miRNAs的抑制剂加入能够解除Py、Py+LLC外泌体对管腔形成的抑制。
这些发现提示疟原虫感染宿主血浆中的外泌体有抑制肿瘤血管生成的作用，这一抑制作用能通过这些外泌体中miRNAs实现。
实施例
实施例1动物实验外泌体提取鉴定
实验分组：
外泌体提供组(供体组)：
A.Py+LLC(7只)(Py和LLC同时接种)
B.Py(7只)(只接种Py)
C.LLC(7只)(只接种LLC)
外泌体作用验证组【实验组(所有C57小鼠皮下注射LLC，待成瘤后进行实验)】
D：Py+LLC组获取外泌体注射到瘤内
E：Py组获取外泌体注射到瘤内
F：LLC组获取外泌体注射到瘤内
实验材料：
游标卡尺，台秤，烧杯，剪刀，镊子，滤纸，液氮，冻存管，离心管，相机，10％福尔马林，PBS，血液外泌体提取试剂盒(System Biosciences(SBI))，细胞计数器。
实验方法：
1.供体组处理
在小鼠右肩部颈窝皮下(部位、深度一致)接种LLC细胞。5×105个LLC细胞/只小鼠溶于0.1ml PBS。注射5×105疟原虫感染的红细胞/只小鼠或未感染Py的小鼠RBC。每两天观察小鼠体重，感染率，肿瘤大小，17天后采集外周血提取外泌体。
2.外泌体提取试剂盒(SBI)
小鼠眼眶取血，取血于EDTA抗凝管，反复摇动管子，防止血凝，之后按照外泌体操作说明书进行操作，提取外泌体，置于-80℃保存。用时冰上溶解后进行实验。BCA检测蛋白浓度，粒径仪和透射电镜检测外泌体大小。如图1所示。
实施例2观察外泌体对小鼠肿瘤生长影响
实验材料：
C57BL/6小鼠雌性，LLC细胞，胰岛素注射器，镊子，酒精，游标卡尺，台秤，烧杯，剪刀，滤纸，离心管，PBS，外泌体。
实验方法：
实验组(所有C57小鼠皮下注射LLC，第7天已经成瘤)
A：Py+LLC组获取外泌体50μg注射到瘤内(8只)
B：Py组获取外泌体50μg注射到瘤内(8只)
C：LLC组获取外泌体50μg注射到瘤内(8只)
E：空白组获取外泌体50μg注射到瘤内(8只)
D：PBS对照组50μLPBS注射到瘤内(8只)
结果：
注射方式，第7天开始注射外泌体，每隔一天注射一次，连续观察肿瘤大小如图2所示。
实施例3剥瘤检测不同组外泌体处理后肿瘤血管形成情况
材料和仪器
10％福尔马林，PBS，游标卡尺，台秤，烧杯，剪刀，镊子，滤纸，液氮，冻存管，离心管，相机。
实验步骤
1)小鼠放置烧杯中称取体重；
2)抓住小鼠尾部用游标卡尺测瘤径；
3)剥瘤，先对手术器械进行高压灭菌，50℃烘干，小鼠颈部脱臼处死，拍照；表面喷酒精润湿毛；镊子提起表皮，剪刀小心剪开，出去包裹在肿瘤组织上的粘膜组织，尽可能去除干净；小心剥离肿瘤，遇到表面已经溃破的肿瘤，就去除表面溃破部分，放入PBS中清洗后，若体积较大则剪成小块放入已编号的冻存管中，立即放入液氮。一部分肿瘤放入10％福尔马林固定，送动物中心HE染色。
结果
处死小鼠取肿瘤观察到Py组和Py+LLC组小鼠血浆外泌体瘤内注射的肿瘤苍白，血管生成明显降低，肿瘤组织CD31血管内皮组化染色也证明这两组动物肿瘤的血管密度显著下降。如图3所示。
实施例4外泌体对MS1管腔形成与迁移影响
1.管腔形成
实验目的
外泌体对MS1血管形成的影响
实验材料
Matrigel(BD)(Becton,Dickinson and Company)，MS1细胞(ATCC)，外泌体，96孔板
实验步骤：
50uL Matrigel铺到96孔板中，37℃放置30min，MS1细胞以2*104/孔种入96孔板，种板同时加入不同外泌体，6-8小时拍照。
分组：
空白(不加外泌体)
首次参加试验的小鼠(naive mice)外泌体
LLC外泌体
Py外泌体
Py+LLC外泌体
2.MS1在不同外泌体作用下的迁移情况
实验内容
研究MS1细胞的迁移
实验目的
不同外泌体对MS1细胞的影响
实验方法
材料：移液枪、枪头、离心管、24孔板(8μm)、上室、EP管。
LLC以2*104/孔种入24孔板中，培养24h后，加入外泌体(50ug)
A：空白单纯培养基
B：LLC下室，MS1上室
C：LLC下室，MS1上室(培养体系含有Py+LLC小鼠外泌体)
D：LLC下室，MS1上室(培养体系含有Py小鼠外泌体)
E：LLC下室，MS1上室(培养体系含有LLC小鼠外泌体)
F：LLC下室，MS1上室(培养体系含有正常小鼠外泌体)
步骤：
1)将上室放入下室中，每个上室内加2滴无血清培养基(Gibco(Thermo FisherScientific))，使膜亲水，放入培养箱内；
2)常规消化细胞，离心弃上清，加入无血清培基，混匀，尽量吹成单细胞悬液；
3)再次离心，弃上清，加入无血清培基，混匀，吹打；(重复一次)
4)计数：1×105个细胞/100ul无血清培基/0.5mlEP管中
5)将24孔板取出，吸掉上室的培基，下室中加入500ul培基(Gibco(Thermo FisherScientific))，上室移入下室中；(注：两室接触面不要有气泡)
6)混匀EP管中细胞，移入小室中(垂直加入)，温箱培养。
7)次日，显微镜下观察下室是否有细胞，有一定数量穿过时，准备收细胞。收细胞：
1)将Transwell小室自24孔板中取出，置于另一个清洁24孔板中，做好标记。因很容易被甲醇洗掉，最好标记两个，标记后倒置，如可置于24孔板的盒子内倒置；
2)取出另一24孔板，每孔加入500ul甲醇，盖上盖子，待用；
3)自制棉签后，(1)用棉签将上室轻轻擦干，目的是将液体、死细胞、未穿过膜的细胞擦干；(2)用移液枪加少量PBS于上室中，换棉签擦干，重复一次；3)置500ulPBS于24孔板中，轻微洗涤一次外室，晾干；(4)换棉签，再擦干内室；
4)将上室放入甲醇固定15min，取出，倒置，晾干(室温下5min)；
5)苏木素染色15min，伊红染色2min；
6)取出倒置，如只有1个上室，直接用ddH2O洗一下，如上室较多，其余倒置一个一个洗，晾干。
7)切膜、将细胞面朝上，放在载玻片上，滴几滴二甲苯，中性树胶封片。3.划痕实验
在培养板的外面绘出细胞划痕标记线，以2×10 6个/孔血管平滑肌细胞(VSMC)种入6孔板中，培养24h，细胞同步化后，用100μL的无菌枪头在培养板内沿标记线对细胞进行划痕，划痕一次，要求划痕直，洗净刮掉的细胞，用无血清培养液轻轻吹打划痕附近，倒掉培养液，反复3次，尽量将刮掉的细胞冲洗干净，拍照，记录划痕宽度。之后加入条件培养基(Gibco(Thermo Fisher Scientific))继续培养细胞24h后拍照，再次测量划痕宽度，比较条件培养基作用前后的划痕宽度值差异。
结果：
管腔形成实验证明Py感染动物血浆外泌体显著抑制管腔形成，小鼠内皮细胞MS1的迁移抑制实验也发现来源于Py和Py+LLC组的外泌体显著地抑制了MS1的迁移，如图4所示。
实施例5MS1进行表达谱测序
来源于单纯LLC荷瘤小鼠和Py+LLC小鼠的外泌体与内皮细胞MS1共孵育后，对MS1进行表达谱测序。把两组差异显著的基因进行聚类分析后，发现来源于Py+LLC小鼠的外泌体处理的MS1细胞中与细胞增殖迁移和血管新生相关的基因、血管发育和形态相关的基因显著下调，调节VEGF信号通路的基因表达明显下降。如图5所示。
实施例6外泌体对MS1细胞VEGFR2表达影响
1.MS1细胞分别与不同外泌体共培养后VEGFR2mRNA表达
实验内容
qPCR检测vegfR2mRNA表达水平
实验材料
不同组细胞(ATCC)，RNA提取试剂盒(Megene)(Megene)，RNase free EP管(Axygen)(1.5mL、200uL)，SYBR绿(Promega)，去核酸酶ddH2O(Promega)。
实验方法
MS1细胞分别以2*104/孔种入24孔板中，培养24h后，加入外泌体(50ug)与MS1分别共培养，24h后提取RNA，qPCR检测vegfR2表达。
1)总RNA提取，24孔板中细胞PBS洗两遍后，用megeneRNA提取试剂盒操作，提取RNA；
2)RT-PCR&qPRC。
2.1RT-PCR
a.将RNA样品稀释为20ng/μL；
b.反应体系(TaKaRa Code：D6110A)如下(总体积为10μl)。
c.将上述各试剂依次加入至去RNA酶离心管中，混匀离心后，放入PCR仪，反转录条件为：37℃15min，85℃5sec，4℃保持。
2.2实时PCR
vegfR2(Mus)
F：5’CAGTGGGATGGTCCTTGCAT3’(Invitrogen)
R：5’ACTGGGCATCATTCCACCAA3’(Invitrogen)
实时PCR检测目的基因表达
a.10.0μL反应体系(Promega)如下：
b.实时PCR反应条件：
1个循环：95℃，5min；
40个循环：95℃，15sec；60℃，30sec；
81个循环：65-95℃，5sec
c.VEGFR2mRNA表达量经实时PCR仪器检测，PCR产物作熔解曲线分析。根据Ct值通过公式2－(△△CT)进行相对定量分析计算可得目的基因相对表达量。
2.蛋白质印迹(Western blot)检测vegfR2表达
实验目的
检测MS1经miRNA处理后vegfR2表达
实验材料
bio-Red电泳仪，电转仪，Tris，甘氨酸，氯化钠，吐温20，脱脂奶粉，一抗，二抗(Cell Signaling Technology)，稀释液(5％脱脂奶粉)，AP 10％，SDS(sigama)，甲醇，ddH2O。
实验步骤
蛋白质印迹法检测vegfR2蛋白表达
1)SDS-聚丙烯酰胺凝胶配制：装配胶板，配制10mL 8％分离胶，将配制好的分离胶倒入胶板夹缝中，胶面上加1mL ddH2O，待胶凝固后，用滤纸吸出残留的ddH2O；再加入5％积层胶，插入梳子，室温放置30min使胶凝固；
2)加样：倒入电泳缓冲液(1×)，拔去梳子，将含相同蛋白量(一般上样30μg左右)的各样品分别与5×SDS裂解液混合后，煮沸5min，加样，每孔10μL左右，同时在旁边一孔加入彩色预染标记物(Marker)(Thermo Fisher Scientific)2μL；
3)电泳：先用80V恒压跑上层胶，带过两层胶分界线时，换用100V恒压；
4)转膜：准备好适当大小的滤纸和0.45μm PVDF膜(甲醇中预处理5min)，膜的大小要大于凝胶和滤纸，滤纸、PVDF膜和海绵都要提前在电转缓冲液中充分浸润，切下目的蛋白所在位置的凝胶，制作转膜三明治：在转膜板中从负极到正极依次放入转膜材料，注意各层之间不得有气泡，将转模板放入电转槽，冰浴条件下电转恒流用350mA，120min，4℃；
5)封闭：将含有目的蛋白的PVDF膜用5％的脱脂奶粉室温摇床封闭1h。
6)一抗孵育：vegfR2一抗稀释比例1:1000，β-肌动蛋白一抗稀释比例1:1000，抗体均用一抗稀释液稀释，4℃条件下孵育过夜。用TBST洗涤，重复三次，每次10min。
7)二抗孵育：TBST稀释二抗，稀释比例均为1:10000，羊抗兔二抗室温孵育1h，TBST洗涤三次，每次10min。
8)ECL发光：将ECL A液和B液按需要等体积混合，将膜在A、B混合液中反应约1min后，在凝胶成像系统上曝光。
结果
Py感染小鼠外泌体对内皮细胞MS1的VEGFR2的表达的影响，在mRNA和蛋白水平观察到外泌体明显抑制VEGFR2的表达。如图6所示。
实施例7外泌体内miRNA表达及对VEGFR2的影响
1.qPCR检测不同组外泌体miRNA表达(方法同实施例6-1)
miR16-5p、miR17-5p、miRNA322-5p和miRNA497-5p的表达
2.生物信息学分析发现，这几个miRNAs靶点都集中在VEGF/VEGFR2通路上
3.miRNAs的vegfR2-3’UTR靶标
实验内容：验证miRNAs的vegfR2-3’UTR靶标
实验目的：不同miRNA模拟物(mimic)对vegfR2-3’UTR的抑制
材料与方法
1)材料：
293T细胞(ATCC)，miR-16-5p、miR322-5p、miR-497-5p模拟物(广州锐博合成)以及各自的抑制剂(RiboBio)，模拟物阴性对照，lip3000转染试剂(Thermo)，质粒psicheck2-KDR-3’UTR，质粒psicheck2-KDR-3’UTR-mut(Promega)，96孔板，无双抗1640培养基(Gibco(Thermo Fisher Scientific))，无血清无双抗1640培养基(Gibco(Thermo FisherScientific))，Promega荧光素酶检测试剂盒(Promega)，酶标仪
2)分组
●psicheck2
●psicheck2-KDR-3’UTR
●psicheck2-KDR-3’UTR+模拟物阴性对照
●psicheck2-KDR-3’UTR+miR16/322/497
●psicheck2-KDR-3’UTR+miR16/322/497+抑制剂
●psicheck2-KDR-3’UTR+Py外泌体
●psicheck2-KDR-3’UTR+Py+LLC外泌体
●psicheck2-KDR-3’UTR-mut+miR16/322/497
3)方法：
297T细胞以3*104/孔种入96孔板中，培养24h后，
miRNA用无菌无核酸酶水稀释至终浓度20μM；
psicheck2-KDR-3’UTR：100ng
lipo3000：5μL(无血清无双抗培养基)+0.3μL lipo3000
miRNA：5μL(无血清无双抗培养基)+0.25μL miRNA
miRNA抑制剂：5μL(无血清无双抗培养基)+0.5μL miRNA
Py、Py+LLC外泌体50ug
分别与lip3000 1:1混合室温共孵育5min
加入96孔板中，用完全培养基补足至100μL
24h用Promega-E-2920-双荧光素酶测定系统方案(Promega-E-2920-dualgloluciferase assay system protocol)检测荧光强度
4)qPCR检测不同miRNAs对MS1细胞VEGFR2mRNA表达影响(方法同实施例6-1)。
5)蛋白印迹法检测不同miRNAs对MS1细胞VEGFR2表达的影响(方法同实施例6-2)。
6)管腔形成实验验证miRNAs对MS1细胞管腔形成的影响(方法同实施例4-1)。
结果：
用qPCR检测后发现miR16-5p、miR17-5p、miRNA322-5p和miRNA497-5p表达在疟原虫感染后外泌体中显著升高，生物信息学分析发现，这几个miRNAs靶点都集中在VEGF/VEGFR2通路上。用双荧光素酶报告系统确定了这几个miRNAs靶点是VEGFR2。MS1细胞中用lip3000转染miRNAs，24h后在mRNA和蛋白水平观察到明显抑制VEGFR2的表达；检测管腔形成也证明miRNAs显著抑制管腔形成。如图7所示。
实施例8验证外泌体中miRNAs起作用
1.qPCR检测不同外泌体及miRNAs抑制剂加入对MS1细胞VEGFR2mRNA表达的影响(方法同实施例6-1)。
2.蛋白质印迹法检测不同外泌体及miRNAs抑制剂加入对MS1细胞VEGFR2表达的影响(方法同实施例6-2)。
3.管腔形成实验验证外泌体及miRNAs抑制剂加入对MS1细胞管腔形成的影响(方法同实施例4-1)。
结果：
miRNAs在外泌体中起抑制血管生成作用，用miRNAs的抑制剂与不同组外泌体和MS1共孵育24h，mRNA和蛋白水平观察到Py、Py+LLC外泌体组中VEGFR2的表达明显升高，与未加抑制剂组比较有显著性差异。管腔形成实验也发现，miRNAs的抑制剂加入能够抵消Py、Py+LLC外泌体对管腔形成的抑制。如图8所示。
实施例9人恶性疟原虫Pf3D7分泌的外泌体对血管生成影响
有研究发现人恶性疟原虫感染宿主红细胞(iRBC)后，宿主iRBC会分泌膜泡影响血管内皮细胞，其作用是通过宿主miRNA实现的。(Mantel P-Y,Hjelmqvist D,Walch M,Kharoubi-Hess S,Nilsson S,Ravel D et al.Infected erythrocyte-derivedextracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNAcomplexes in malaria.Nature Communications 2016；7.)
膜泡准备
1.Pf3D7完全培养基(complete Malaria-Culture Medium,CMCM)
1L成分包括
用高压过的双蒸水(用前平衡到室温)定容至1L，用0.22um滤器过滤除菌，-20℃保存(常用的4℃保存)。
2.Pf3D7培养
Pf3D7在25cm2的细胞培养瓶中，加50％压积的红细胞250uL，原虫完全培养基7ml，混匀，静置CO2培养箱中培养。
3.正常人红细胞培养
正常红细胞用原虫完全培养基7ml，静置CO2培养箱中培养。
4.人非小细胞肺癌细胞株A549与Pf共培养
6孔板Transwell体系，A549以2*105种入下室，上室Pf3D7以2*107加入，原虫完全培养基共培养
分离外泌体
实验内容：超速离心方法分离A549与Pf3D7共培养体系中外泌体
实验材料：正常人红细胞培养上清，感染率为6-7％的Pf3D7培养上清，A549与Pf共培养上清，OptiPrep(Axis-Shield)分离液，TBS(140mM NaCl,Tris 10mM，pH7.4)，超速离心管(Beckman)，Beckman离心机(SW41rotor)，天平，15mL离心管，移液管，移液器
实验步骤：
1)配制TBS稀释液
140mM NaCl,Tris 10mM，pH7.4
2)配制10-30％OptiPrep(Axis-Shield)连续分离液
3)Pf3D7
3)分离外泌体
吸取培养上清2mL于10mL分离液上方；配平后，放置于SW41转头上，210000xg,4℃，21h，离心完毕后吸取第4-5mL做后续实验。
Pf3D7分泌的外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养
实验目的：分泌的外泌体是否会影响HUVEC细胞vegfR2mRNA表达
材料与方法：
1)材料：分离Pf3D7分泌的外泌体，HUVEC细胞系，1640培养基，巴氏吸管，六孔板，移液枪，吸量管
2)方法：
分组：
A：HUVEC+RBC外泌体(红细胞ex)
B：HUVEC+Pf外泌体(Pf ex)
C：HUVEC+Pf co A549外泌体(Pf+A549共培养ex)
a)HUVEC细胞以2*105个/孔细胞，种入6孔板中，培养24h；分离的Pf3D7分泌的外泌体取1.5mL加入6孔板中，然后加入0.5mL 1640完全培养基，培养24h，提取Total RNA，qPCR分析vegfR2mRNA表达。
结论：
结果显示Pf3D7感染的红细胞分泌的外泌体、Pf3D7和A549共培养后产生的外泌体都能使HUVEC中vegfR2mRNA表达水平下降(*P<0.05)。(见图9)
人疟Pf感染宿主，产生的外泌体能抑制血管内皮细胞VEGFR2mRNA表达，能对肿瘤血管生成产生抑制。

Claims (13)

1.一种外泌体，其特征在于，所述外泌体是由疟原虫感染宿主分泌到血浆或培养上清中的外泌体。
2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体的大小为50nm-200nm。
3.根据权利要求1或2所述的外泌体，其特征在于，所述宿主为感染疟原虫的动物和人。
4.权利要求1至3中任一项所述的外泌体的制备方法，其特征在于，采集疟原虫感染宿主的血浆并从所述血浆分离出所述外泌体，或者采集疟原虫感染的细胞培养上清并从所述上清中分离出所述外泌体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，通过外泌体提取试剂盒或超速离心方法从所述血浆分离出所述外泌体。
6.权利要求1至3中任一项所述的外泌体在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述外泌体通过抑制肿瘤组织中的血管生成或发育达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述外泌体通过抑制肿瘤组织中的血管的管腔形成达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述外泌体通过抑制肿瘤组织中的血管内皮细胞的迁移达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
10.根据权利要求6所述的用途，其中，所述外泌体通过抑制肿瘤组织中内皮细胞的调节血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的基因的表达或抑制内皮细胞的血管内皮细胞生长因子受体2的表达达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
11.根据权利要求6所述的用途，其中，所述外泌体通过其中所含的miRNA抑制肿瘤血管生成、发育、血管的管腔形成、血管内皮细胞的迁移、肿瘤中内皮细胞的调节血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的基因的表达和抑制内皮细胞的血管内皮细胞生长因子受体2的表达中的一项或多项达到抗肿瘤的目的，从而实现在制备抗肿瘤的药物或者制剂中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述miRNA为miR16-5p、miR17-5p、miRNA322-5p和miRNA497-5p中的一种或多种。
13.根据权利要求6-12中任一项所述的用途，其中，所述肿瘤为有肿瘤血管生成的实体肿瘤，优选肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌。
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