CN103354905A - 伤口愈合性准核干细胞及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供鉴定伤口愈合性准核干细胞、鉴定调节准核干细胞增殖和/或移行的分子和治疗伤口愈合病如血管伤口愈合病（包括再狭窄）的分子的方法。本发明还提供了诊断和治疗伤口愈合病如血管伤口愈合病的方法并且还提供了通过使用一种或多种准核干细胞移植治疗伤口的方法。

Description

伤口愈合性准核干细胞及其使用方法

相关申请

本申请要求2010年10月25日提交的美国临时申请号61/406,468的权益。上述申请的全文传授内容通过引用结合在此。

背景技术

伤口和伤口愈合病广泛存在并且降低生活质量。断开神经连通的伤口导致瘫痪。伤口愈合病在创伤性损伤和感染后损害器官和组织中的伤口并且同等地包括手术介入后的伤口和伤口样病状，其中经常因源自进行性病症（如动脉粥样硬化）的血管疾病而需要所述手术介入。例如，血管疾病，如冠状动脉病或颈动脉病，侵袭美国和世界范围内数百万的个人。见，例如，Ma等人，J.Clin.Exp.Med临床和实验医学杂志[].,3(3):192-201（2010）。血管疾病的治疗性介入（如血管移植、支架和血管成形术）可以通过恢复正常血流量而改善血管疾病的衰竭作用。然而，来自这些介入的改善可能仅是短暂的，因为伤口愈合病是常见的并且可以产生并发症如再狭窄（一种在手术介入后由血管壁的平滑肌细胞数目快速增加引起的血管再狭窄）。

这些新观察结果与本领域中产生伤口愈合损害的细胞（如与血管伤口愈合病如术后再狭窄相关的那些细胞）的身份和/或来源的争论直接相关。一些作者已经提出数据：一个从主动脉弓外膜分离的未定义细胞亚组具有某些干细胞样特性（如细胞表达细胞表面标记）和产生可能有助于动脉粥样硬化的细胞的能力。Hu等人，J.Clin.Invest[临床研究杂志].,133(9):1258-65（2004）。对动脉粥样硬化的这些研究与本文所述的伤口愈合事件区分，如术后再狭窄，因为动脉粥样硬化斑块经过数十年缓慢进展在术后再狭窄中重演为只不过数周和数月之内。再狭窄事实上已经表征为“奔马性动脉粥样硬化（gallopingatherosclerosis）”。这些研究没有建立疾病状态中所研究的特定细胞的清晰地位，更不用说有助于细胞鉴定或分类的细胞的任何形态学表征，例如，由医学病理学家或组织学家通过显微镜检验。

其他作者已经描述了具有特定表面抗原和其他特征的细胞的分布，同时表征血管组织和/或血管近旁组织中具有可能的干细胞样特征的细胞的位置。不幸地，已经证实这类抗原性标记或干细胞在不是干细胞的细胞上和其之间广泛分布。所述标记用于从细胞混合物中富集干细胞，但是不允许特异性分离和观察干细胞。见，Pasquinelli等人，Cytotherapy[细胞疗法],12:275-87（2010）。然而，这些研究没有展示具有干细胞样特性的细胞在任何疾病中的作用。具体而言，Pasquinelli等人没有观察到血管壁中准核细胞的对称或非对称无丝分裂并且没有观察到通过准核细胞的非对称无丝分裂产生平滑肌细胞。因此，存在鉴定参与伤口愈合和伤口愈合病的细胞类型的需要。此外，需要鉴定通过调节参与伤口愈合的细胞（即，参与实际疾病状态的干细胞）的生长和/或移行而治疗伤口愈合病的药物。进一步需要鉴定药物以便例如通过杀死作为病理疾病基础的干细胞的分化细胞和/或减缓其移行、增加或产生这些分化细胞，治疗以异常过度组织生成为特征的伤口愈合病的方法。在术后再狭窄的情况下，对于平滑肌细胞尤其如此

发明内容

本发明除其他之外提供用于识别具有伤口愈合作用和在伤口愈合病（如术后再狭窄）中的准核干细胞的方法，以及鉴定治疗这类伤口愈合病的分子的方法。本发明至少部分地基于以下发现：具有钟形胞核的准核细胞在再狭窄损害中通过对称无丝分裂增长并且通过非对称无丝分裂产生平滑肌细胞，其中所述再狭窄损害以手术方式源自患有再狭窄的移植患者。还指出的是，平滑肌胞核不通过有丝分裂或无丝分裂过程进一步增加。平滑肌细胞从准核干细胞的非对称无丝分裂中每次一个增加，所述准核干细胞本身在血管内衬壁中/上增加。这项研究结果与以下的相似观察结果一致：通过对称和非对称无丝分裂分裂的准核干细胞在人胎儿肾动脉的发育期间产生平滑肌细胞。见图2-图4。再狭窄损害中准核干细胞的来源由申请人的以下分开的发现表明：成年小鼠和人的结肠和其他器官的间充组织区域内处于非分裂静息状态下的准核细胞，其数目和细胞学位置与成年间充质干细胞相关。从这些观察结果中，申请人得出结论，与外科连接的血管相关的外膜组织层的成年准核干细胞进入伤口、促进初始愈合，但是令人难以理解地继续增加数字并且增加平滑肌细胞的数目直至出现再狭窄的病理学状态。

在一个方面，本发明提供总体上通过识别具有钟形胞核的细胞和/或合胞体而鉴定伤口愈合性干细胞的方法，所述细胞和/或合胞体通过对称和非对称无丝分裂活跃地分裂。例子包括在角膜移植后准核细胞在伤口边缘处快速出现和准核管状合胞体在骨骼肌伤口愈合期间出现。

在又一个方面，本发明提供鉴定处于非分裂状态的伤口愈合性准核干细胞（在本文中也称作成年间充质相关性准核干细胞）的方法，所述伤口愈合性准核干细胞广泛分布于身体各处组织的间充质区域内。这种识别允许在不依赖于相对非特异的方法（如用除其他之外与干细胞类型和大团胞间材料结合的抗体识别）的情况下，特异性地物理分离（例如激光捕获）成年间充质干细胞。

因此，在另一个方面，本发明提供用于将伤口愈合病诊断为与失调生长和分化相关的病变的方法，其中所述的失调生长和分化所述受准核干细胞对称及非对称分裂驱动。这种疾病的例子是称作术后再狭窄的血管伤口愈合病。这些方法包括使在分离的组织样品中细胞的核可视化的步骤。通过固定含有DNA的细胞核的物理结够，从而可以借助后续显微镜检验识别其形状的方法制备组织样品。在一些实施例中，制备方法基本上保留具有至多到约50微米最大直径的胞核中的胞核结构完整性。这些方法也包括步骤：确定具有异形核形态型的细胞在组织样品中的存在和/或不存在。在再狭窄的情况下，这些方法任选地包括识别渐增数目的平滑肌细胞，所述平滑肌细胞的特征性不规则胞核形成和无丝分裂显示通过非对称无丝分裂从准核细胞产生具有相同不规则胞核集合的平滑肌细胞。见图9-图13、图14A和图15-图17。在除术后再狭窄之外的损害中，存在具有与通过非对称无丝分裂从准核干细胞产生的正常组织相关的某些异形核形态型的细胞显示一种基于失控准核干细胞分裂的伤口愈合病。在一个实施例中，驱动伤口愈合病的细胞是具有大的钟形准核的细胞，其中发现所述细胞充当人器官发生和癌发生的干细胞（Gostjeva等人，Organogenesis[器官发生],5:4,191-200（2009）；Gostjeva等人，Cancer Geneticsand Cytogenetics[癌症遗传学和细胞遗传学],14:16-24（2006））。在另一个实施例中，通过非对称无丝分裂，准核细胞产生作为其中伤口愈合进展成病理损害的组织之特征的封闭真核胞核。在具体的实施例中，准核干细胞正在活跃分裂。在更具体的实施例中，准核干细胞正在发生无丝分裂。在仍更具体的实施例中，无丝分裂是对称无丝分裂。在其他更具体的实施例中，无丝分裂是非对称分裂。

在某些实施例中，伤口愈合病是血管伤口愈合病，如损伤引起的新生内膜增生、吻合后并发症或再狭窄。

在本发明前述方面的更具体的实施例中，血管壁病是再狭窄。

可以将本发明提供的方法中使用的组织样品物理（例如，将样品冷冻）或化学地（例如，用一种或多种选自醇、醛、有机酸及其组合的化学固定剂处理）固定。在一些具体实施例中，组织样品用包含甲醇和乙酸的固定剂固定。在某些实施例中，将组织样品在组织样品中的细胞核降解之前（例如，在分离约20、30、40、50、60、90或120分钟内）固定。在更具体的实施例中，将组织样品在分离30分钟内固定并且在仍更具体的实施例中，在分离15分钟内固定。在一些实施例中，所述组织样品的新鲜、固定或冷冻细胞通过组织离析和铺展部分地解离。在某些实施例中，将组织样品的细胞或大分子染色，因而允许核的可视化。在更具体的实施例中，将DNA染色，因而允许DNA和核的可视化。在一些实施例中，细胞与在适宜条件下染色时的荧光相关。Gostjeva等人，2006，2009。

在本发明的某些实施例中，组织样品从多细胞动物（如脊椎动物）获得。在更具体的实施例中，脊椎动物是哺乳动物，如灵长类、啮齿类、犬、猫、猪、羊、牛或兔。在仍更具体的实施例中，哺乳动物是人。在一些实施例中，多细胞动物死亡，即，组织样品在死后获得。

在具体的实施例中，由本发明提供的方法包括使异形核形态型可视化的其他步骤，所述异形核形态型包括呈不规则纺锤形、雪茄形、稠密球形、球状、卵圆、香肠形、肾形、子弹形和其组合的核。在更具体的实施例中，异形核形态型是准核干细胞核的钟形胞核和平滑肌细胞的特征性不规则胞核。见图9B和图13A-图13C。术语“不规则的”在此意指表征平滑肌核的几种形态学形式，所述形态学形式可以近似于蠕虫样物体（图9B、图13C）或扭曲形式（图13A-图13C）。

在某些实施例中，本发明的方法可以包括确定异形核形态型在组织样品内部的空间和/或数字分布的步骤。在这些实施例中，异形核形态型的空间和/或数字分布进一步表征组织样品。在某些实施例中，异形核形态型含于多核合胞体或含于单核细胞中。在一些实施例中，异形核形态型是钟形胞核并且在更具体的实施例中，钟形胞核与表示无丝分裂性对称核分裂的结构相关。在一些实施例中，异形核形态型是钟形胞核并且在更具体的实施例中，钟形胞核与表示无丝分裂性非对称核分裂的结构相关。

本发明还提供了鉴定一种或多种（例如通过1)阻止不想要的干细胞活性或2)促进某些干细胞活性）治疗伤口愈合病（如血管伤口愈合病）的药物的方法。例如，所述药物可能通过抑制异常产生伤口愈合病的伤口愈合性准核干细胞从间充组织区域中移行、对称无丝分裂和/或非对称无丝分裂来发挥作用。

可能通过以下方式完成所述抑制准核无丝分裂：使准核细胞保持处于非分裂状态、使它们离开伤口区域或杀死参与伤口愈合病的异常生长的准核细胞（如在术后再狭窄的情况下）。在一个更具体的实施例中，通过以下方式完成所述抑制准核无丝分裂：暴露于浓度和持续时间足以杀死参与伤口愈合病的全部准核细胞的试验药物。

这些方法包括以下步骤：用候选药物治疗具有伤口或伤口愈合病（如血管伤口愈合病）的哺乳动物并且随后确定在构成相关组织的分离组织样品和和伤口（例如，来自该哺乳动物的血管壁）内部所含有的细胞的数目和核形态的形式。这些方法进一步包括以下步骤：将来自用候选药物治疗的哺乳动物中的组织样品内部的细胞的数目和核形态与来自患有伤口愈合病但是未用所述候选药物治疗的哺乳动物中的分离组织样品内部所含的细胞比较。相对于未治疗或假性治疗的哺乳动物中的伤口，在术后再狭窄的具体病例中制止伤口愈合病区域内准核干细胞的增加、减少或消除这些细胞或制止平滑肌细胞通过准核干细胞的非对称无丝分裂增加将识别出潜在有价值的治疗药。在一些实施例中，用候选物质治疗的哺乳动物是实验动物如猪、犬或啮齿类，并且在更具体的实施例中，啮齿类是大鼠、小鼠或豚鼠。在某些实施例中，准核钟形胞核排列在多核合胞体中并且准核干细胞的消除与合胞体的破裂、消失或死亡相关。

在另一个方面，本发明提供鉴定一种或多种（例如通过调节准核干细胞增殖和/或移行）治疗伤口愈合病（如血管壁病）的药物的体外方法。这些方法包括使培养细胞与一种或多种候选药物在限定的浓度和暴露持续期接触并且随后评价培养细胞的数目和核形态，所述的培养细胞包含准核干细胞和正常情况下存在于伤口组织中的细胞（如在术后再狭窄的情况下平滑肌细胞）。与不接触于候选药物的对照细胞培养相比，准核干细胞生长或数目的变化表示该药物治疗伤口愈合病（如血管伤口愈合病）的有效性。在仍更具体的实施例中，在细胞培养物中识别潜在有价值的治疗药进一步包括观察到处于非对称无丝分裂的准核干细胞的活性停止变化，其中所述非对称无丝分裂产生与伤口愈合病变相关的细胞（如在术后再狭窄的具体情况下具有平滑肌细胞特征性不规则胞核的细胞）。

在另一个方面，本发明提供鉴定一种或多种（例如通过调节准核干细胞增殖和/或移行）治疗伤口愈合病（如血管壁病）的药物的体外方法。这些方法包括使培养细胞与一种或多种候选药物在限定的浓度和暴露持续期接触并且随后评价培养细胞的数目和核形态，所述的培养细胞包含源自哺乳动物胎儿或肿瘤的准核干细胞。与不接触于候选药物的对照细胞培养相比，准核干细胞生长或数目的变化表示该药物治疗伤口愈合病（如血管伤口愈合病）的有效性。在仍更具体的实施例中，在细胞培养物中识别潜在有价值的治疗药进一步包括观察到处于非对称无丝分裂的准核干细胞的活性停止变化，其中所述非对称无丝分裂产生与伤口愈合病变相关的细胞（如在术后再狭窄的具体情况下具有平滑肌细胞特征性不规则胞核的细胞）。

本发明的又一个方面提供通过以下方式治疗伤口的方法：识别间充质准核干细胞、通过识别其特征性钟形胞核富集以便浓缩间充质准核干细胞、或体外生长长并且在伤口区域接种间充质准核干细胞而增加其数目。用于移植疗法的所述准核干细胞可能从患者、免疫匹配的人供体、非匹配的人供体或从非人动物获得。用于移植疗法的所述准核干细胞可能在用于干细胞移植疗法之前以培养方式扩充。

本发明的又一个方面提供识别试验分子的方法，其中所述试验分子通过调节伤口愈合干细胞的移行、对称无丝分裂和或非对称无丝分裂诱发优势伤口愈合宿主反应。

作为本文所述的申请人的发明结果，现在多种方法方法可用于识别、分离和研究在招募期间（例如，移行）和在伤口愈合期间（例如，增殖）总体上来自组织间充质区域并且具体来自血管间充质外膜（如在术后再狭窄的情况下）的等待招募（例如，“应招”）的伤口愈合性准核细胞（成年干细胞）。

附图说明

本专利或申请文件含有以彩色绘制的至少一张图。

带有彩图的本专利或专利申请公开文件的副本将在要求和支付必要费用时由局方（the Office）提供。

图1显示正常发育和重要病理状况的准核干细胞的作用。

图2A-图2C是显示人胎儿肾动脉（9周）中具有钟形胞核（箭头）的合胞体结构的显微照片。图2A是具有可识别的染色质‘环’的单个钟形胞核。图2B是对称（钟挨钟）核分裂。图2C是合胞体钟形胞核（箭头）、福尔根（紫）和福尔根（绿色）荧光融合图（x20）。

图3A-图3G是显示人胎儿肾动脉（9周）中非合胞体钟形胞核（箭头）的显微照片。观察到新细胞形式（包括具有平滑肌细胞中存在的不规则胞核的细）从准核细胞以非对称无丝分裂产生。

图4A-图4E是9周人胎儿肾动脉的显微照片。图4A显示一种形式的非对称无丝分裂，其中准核钟形胞核产生血管内皮细胞中存在的球状胞核，连同这个过程的形象描述（artists depiction）。图4B显示准核钟形胞核的对称无丝分裂，所述对称无丝分裂刚产生表示准核干细胞净生长的两个钟形准核胞核。图4C显示血管壁内部紫福尔根染色的具有几钟形胞核的胞核（紫色）和具有不同形态学的几个封闭核。图4D是图4C中所示视野的荧光图像，另外在于假定通过与源自钟形胞核或在血管壁中单独存在的未知结构（可能是胞质糖）的福尔根西夫碱反应在此产生的荧光（绿色）。图4E合并图4C和图4D的图像，显示紫色和绿色荧光福尔根染色的结构。

图5A-图5D是显示伤口愈合中出现胎儿样管状合胞体（肌管）的显微照片。图5A是显示在显微镜下再生哺乳动物骨骼（横纹）肌的肌管（箭头）看起来象什么的显微照片。它们与胚性肌肉中存在的肌管十分接近。图5B是显示9周人胎儿骨骼肌中肌管（箭头）的显微照片。图5C和图5D是显示9周人胎儿肌肉肌管中钟挨钟核分裂的显微照片。

图6A-图6D是显示以下情况的显微照片：图6A是显微照片，其显示在正常不患病的人动脉中（在儿童中），带钟形胞核的细胞的分数是低约1x10^-4-1x10^-5。图6B是显示非对称核分裂‘干细胞-平滑肌细胞’（箭头）的显微照片。图6C、图6D是显示架子猪（young adult pig）肺动脉中钟形胞核（箭头）稀少（约1x10^-5）的显微照片。

图7显示正常不患病心脏和儿童心脏（2岁）的失败供体心脏动脉的一系列显微照片。图7A显示用来确定正常心脏中准核细胞的分数是约1×10^-5的样品实例。图7B显示用来确定在失败的供体心脏中准核细胞在斑块内的分数是约1×10^-4的样品实例。图7C、图7D和图7E是示出了移植的心脏中的右（和左）心室心肌细胞被球菌污染的显微照片。发现在这类污染的组织表面中，准核细胞的分数是约2×10^-4。

图8是来自心脏移植后患有移植后再狭窄的儿科患者的活组织检查样品的显微照片。浅品红毛刺是沿血管壁在纤连蛋白纤维上构成“动脉硬化”（在快速再狭窄的情况下又称作“奔马性动脉粥样硬化”）的钙化结构。

图9显示一对显微照片，它们显示患有移植后再狭窄的患者的活组织检查样品中的纤连蛋白。这里，图9A显示与钟形准核胞核和具有不规则胞核特征集合的平滑肌细胞的胞核均相关的新生纤连蛋白纤维。图9B显示具有一个钟形胞核和几个不规则形平滑肌细胞胞核的纤连蛋白厚层。

图10显示一对显微照片，它们显示患有移植后再狭窄的患者的活组织检查样品中的钙化。图10A显示钙化连同纤连蛋白纤维，同时图10B以更高放大率揭示总体上遍及斑块分布的几个钟形胞核。

图11显示来自患有移植后再狭窄的患者的活组织检查样品的显微照片。在右侧见到纤连蛋白块与具有钟形和其他形状核的细胞连接。在左侧，以更高分辨率观察到多种钟形胞核，产生具有其他核形式（包括平滑肌细胞的那些核形式）的细胞，放大图显示如图4A中所绘制的非对称无丝分裂的另一个实例。

图12A-图12E是显示再狭窄斑块中钟形胞核（箭头）的显微照片，其中准核细胞分数估计是约1x10^-3（心脏移植，2岁儿童）。

图13A-图13D是一系列显微照片，它们显示如图12中那样的产生平滑肌细胞核的钟形胞核的额外例子。

图14是在再狭窄斑块（心脏移植，2岁）（图14A）、胎儿肠管（5-7周）（图14B）和HT29癌瘤细胞系（图14C）中成对准核干细胞核的系列显微照片。

图15显示在来自患有移植后再狭窄的患者的活组织检查样品中的一系列显微照片。图15A显示与钟形胞核和其他形状核相连的纤连蛋白纤维。图15B显示最近非对称无丝分裂的结果，其中钟形胞核似乎已经产生具有平滑肌细胞形态学的一个胞核或多个胞核。图15C显示与两个平滑肌细胞胞核紧密毗邻的两个钟形胞核。图15D捕获了从左边钟形准核干细胞胞核起源的最近非对称无丝分裂呈现何种外观，所述最近非对称无丝分裂产生从中纤连蛋白似乎起源的几乎球状的胞核。

图16显示来自患有移植后再狭窄的患者的活组织检查样品的显微照片。在纤连蛋白纤维附近看到两个钟形准核干细胞核（箭头）连同平滑肌细胞胞核和其他胞核不定形式。

图17A-图17D是显示患有持续膀胱息肉导管损伤的患者中血管新生和伤口愈合的显微照片。

图18是细胞的显微照片，所述细胞包括参与6月龄人类儿童皮肤中伤口愈合的准核干细胞。

图19A-图19C是细胞的显微照片，所述细胞包括参与6月龄人类儿童皮肤中伤口愈合的准核干细胞。

图20是细胞的显微照片，所述细胞包括参与6月龄人类儿童皮肤中伤口愈合的准核干细胞。

图21是细胞的显微照片，所述细胞包括参与6月龄人类儿童皮肤中伤口愈合的准核干细胞。

图22A-图22C是说明以下情况的显微照片：图22A显示无准核细胞的正常肺静脉；图22B显示具有许多准核细胞的狭窄右肺静脉和左肺静脉；图22C显示具有许多准核细胞的吻合的汇合。

图23A-图23C是狭窄静脉（平滑肌细胞的非有丝分裂源头）中的非对称核分裂的显微照片；核DNA福尔根紫染色。图23C显示从准核干细胞的非对称无丝分裂新出现后平滑肌细胞胞核的形状（放大图）。

图24显示在左肺静脉和右肺静脉的狭窄部分中的准核干细胞的显微照片，包括通过无丝分裂从准核干细胞中产生的平滑肌细胞的不规则胞核的另一个例子。

图25A-图25D是显示成组平滑肌细胞及其“亲本”准核干细胞的吻合/再狭窄汇合的显微照片。

图26显示在吻合部位处非有丝分裂性非对称核分裂的显微照片，它尤其显示通过非对称无丝分裂从准核干细胞产生的平滑肌细胞的不规则胞核（紫色）。

图27是说明狭窄组织的另一个例子的显微照片；在这张图和全部图中引人注目地缺少通过有丝分裂或无丝分裂正在分裂的平滑肌细胞。

图28提供小鼠结肠的显微照片。图28A显示小鼠升结肠中约256个细胞的完整陷凹。图28B显示这个陷凹的基部的放大部分，其显示在陷凹基部的钟形准核干细胞胞核（红箭头）和来自独立支撑间质层的平滑肌细胞特征性不规则胞核（蓝箭头）。福尔根DNA染色（紫色）。见Gostjeva等人，2006。

图29是显示缺少陷凹的成年小鼠升结肠中的支撑基质的显微照片：蓝箭头指示平滑肌细胞的胞核并且红箭头指示在结肠的上皮部分（陷凹-细胞右侧，黑箭头）下面的间充质部分中具有钟形胞核的准核干细胞。

图30是成年小鼠升结肠的间充质部分中的准核干细胞（红箭头）和平滑肌细胞不规则胞核（蓝箭头）的X100显微照片图像。福尔根DNA染色。

图31是4岁儿童正常膀胱的血管中的准核干细胞（红箭头）和平滑肌细胞纺锤形胞核（蓝箭头）的X100显微照片。福尔根DNA染色（紫色）。

图32A-图32B是膀胱组织的显微照片。图32A显示4岁儿童的正常膀胱中的分支血管：具有钟形胞核的准核干细胞（红箭头）、具有不规则胞核（蓝箭头）的平滑肌细胞和血细胞（绿箭头）。福尔根DNA染色（紫色）。图32B显示4岁儿童的正常膀胱的平滑肌细胞衬层：具有钟形胞核的准核干细胞（红箭头）、具有不规则胞核（蓝箭头）的平滑肌细胞。福尔根DNA染色（紫色）。

图33A-图33B提供在3岁男性的膀胱息肉的血管中具有钟形胞核的准核干细胞（红箭头）和延长的平滑肌细胞不规则胞核（蓝箭头）的一对X100图像。具体实施方式

如下描述本发明的示例实施例。这里报告的发明部分地基于以下发现：具有钟形胞核的成年准核干细胞1)在成年小鼠和人的结肠和其他器官的间充组织区域中处于非分裂静息状态，其数目和细胞学位置由其他人发现与成年间充质干细胞相关，2)通过对称和非对称无丝分裂发生分裂，产生人胎儿主肾动脉的平滑肌细胞和3)通过对称和非对称无丝分裂快速分裂以便在患有致死性术后再狭窄的心脏移植患者中的血管扎线附近导致准核细胞和平滑肌细胞数目增加。这些发现连同申请人的先前发现为提供简单的范式，其中组织间充质的准核干细胞（命名各异，未分化的组织、基质、外膜等）充当用于愈合伤口和用于治疗衍生病理状况如克隆性疾病动脉粥样硬化和术后再狭窄的多克隆病状中平滑肌细胞不利增加的干细胞。本发明提供了通过多种手段（例如包括组织病理学方法）诊断和研究伤口愈合病（例如，再狭窄）的方法。另外，本发明提供体外和体内方法以便鉴定刺激或抑制外膜相关性准核干细胞增殖的药物。

诸位申请人先前已经发现，许多胎儿器官的发育性扩张涉及由合胞体（多核细胞）和具有其中每个胞核具有中空钟形状的单核细胞组成的干细胞谱系。这些细胞在核分裂时不利用有丝分裂，而是在无染色体浓集的情况下分裂，一种称作“无丝分裂”的过程。这些钟形胞核的净生长由对称无丝分裂完成，其中一个钟形胞核分裂以形成形状相同的两个钟形胞核并且每个胞核含有二倍体人类细胞的完整DNA互补物。这些细胞通过非对称无丝分裂过程完成胎儿发育中细胞分化的必需步骤，其中钟形胞核通过无丝分裂分裂以产生新的中空钟形胞核和封闭的胞核。具有这些封闭胞核的细胞随后通过连续有丝分裂增加细胞数目，从而这些有丝分裂细胞类型变成每种组织和器官的绝大部分实质细胞。有趣地，在钟形胞核的对称和非对称无丝分裂中，DNA的基因组互补物在核分裂之前不加倍，但是在这个过程完成期间和之后或多或少地加倍。因为带有钟形胞核的这些细胞并不具有在染色体浓集和核分裂之前数小时复制其DNA的“真核细胞”的特征，所以将它们命名为新细胞类别“准核细胞”。因为将它们鉴定为器官发育期间有丝分裂实质细胞的来源并且重要地作为其衍生肿瘤的来源，所以将准核细胞鉴定为干细胞构成受精卵与成年动物或植物的分化细胞之间的干细胞谱系的重要部分。见Gostjeva等人2005，2006，2009。

已经确立，器官发生和癌发生的生长和分化过程受准核细胞驱动，申请人转向其中细胞生长和分化同时发生的其他疾病，在这些疾病当中包括伤口愈合过程和组织再生的相关现象。

本发明提供诊断伤口愈合病（如再狭窄）的方法。另外，本发明提供体外和体内方法以便鉴定抑制外膜相关性准核干细胞增殖的药物。

在人类中，首先在受精后第四周和第五周观察到具有钟形胞核的准核干细胞，明显地源自不同形式的前体有丝分裂胚胎干细胞无丝分裂。此时，准核细胞在遍及早期发育的器官以放射球状团簇非随机分布的多核合胞体中增加。在妊娠大约12周，合胞体溶解并且全部准核胞核遍及胎儿和幼体发育存在于器官发生性干细胞的预期生态位中，例如，在结肠陷凹中。仅在这些陷凹基部的最低位置处找到单个单核细胞准核细胞。在器官成熟之前的一些时间或在器官成熟时，准核胞核让位于有丝分裂性“维持”干细胞，后者分裂以替代在几乎全部组织中存在的发生“程序”死亡的组织细胞。Gostjeva等人，2009。

评价了术后再狭窄的医学重要性后，申请人力图理解产生这些致命和经常致死性过程的细胞分裂级联。在申请人研究人类器官和肿瘤时，相对少的准核干细胞产生几种不同类型的真核细胞，这些真核细胞随后通过一系列二元有丝细胞分裂产生器官本体。这类器官或肿瘤的生长速率可以有丝分裂频率的差异测量，其中相对于通过凋亡过程发生程序性细胞死亡的细胞的数目校正所述差异。

然而，在术后再狭窄中平滑肌细胞增加期间，观察不到这类正在分裂的有丝分裂性平滑肌细胞。因此，平滑肌细胞增加的意义不清楚。然而，申请人鉴定发生对称无丝分裂（准核细胞的净生长）和非对称无丝分裂的具有钟形胞核的细胞，其中所述非对称无丝分裂本身产生处于平滑肌细胞特征性不规则形式的胞核。见图9-图13、图14A、图15、图16和图17。与全部正在发育的组织和它们衍生的肿瘤相反，再狭窄损害中通过准核无丝分裂产生的平滑肌胞核并不进一步分裂，但似乎仅通过准核细胞的作用增加，即，它们从当前准核前体一次一个细胞增加。

通过准核干细胞非对称无丝分裂产生平滑肌细胞的发现提供了关于术后再狭窄和其他伤口愈合现象中平滑肌细胞行为的两种令人迷惑和矛盾的观察结果的解释。广泛地报道平滑肌细胞数目既缓慢增加数目，如动脉粥样硬化斑块中那样，又快速增加如术后再狭窄中那样，但是没有报道它们借助有丝分裂机制或无丝分裂机制通过平滑肌细胞的分裂增加。然而，当人或实验动物用对DNA特异的生物化学前体如氚化胸苷或溴脱氧尿苷治疗时，观察到许多平滑肌细胞的胞核已经摄取稳定形式（即DNA）的这些特异性DNA前体。这些观察结果由许多科学家用来得出结论：平滑肌细胞活跃地分裂。然而，如上文所示，在本申请人仔细研究后未曾发现平滑肌细胞通过有丝分裂或无丝分裂经历细胞分裂。申请人的其他研究结果现在可以解释这种明显的矛盾。

首先，他们证实，平滑肌细胞专门从准核细胞产生并且不从分裂产生，因为平滑肌细胞解释了没有观察到正在分裂的平滑肌细胞。准核细胞因此在伤口愈合时通过对称无丝分裂增加，如它们在器官发生和癌发生时那样。第二，申请人已经发现准核干细胞不利用由原核和真核细胞使用的DNA复制模式，在所述DNA复制模式中，DNA双螺旋首先以两条双链DNA螺旋的形式复制并且随后在两个子代细胞核中分离。相反，如2011年6月2日提交的美国临时专利申请号61/492,738中所述，诸位申请人已经发现，准核干细胞首先产生其基因组的作为双链RNA/DNA异双链体的两个泛基因组副本，并且正是这些dsRNA/DNA复制中间体通过再狭窄损害的准核干细胞的非对称无丝分裂分离进入衍生的子代胞核。在分离后，通过包括降解RNA泛基因副本和后续在每个子代细胞中拷贝单条DNA链的过程，dsRNA/DNA转变成规范dsDNA双螺旋形式。因此，非分裂性平滑肌细胞将摄取氚化胸苷或溴脱氧尿苷或其他特定DNA前体，甚至它随后将不分裂。这些研究结果解释了摄取DNA前体至非分裂性平滑肌细胞的DNA基因组中的悖论。随后不分裂的细胞中DNA加倍由分离后DNA拷贝引起时，正是拷贝平滑肌基因组的dsRNA/DNA复制中间体的单条DNA链才造成DNA加倍的出现。因此将快速术后再狭窄中平滑肌细胞的明显“增殖”传授为准核干细胞增殖的结果，所述准核干细胞增殖通过非对称无丝分裂“一次一个”产生非分裂平滑肌细胞。

另外，申请人对多个成体器官、尤其人和小鼠结肠的研究发现非分裂准核细胞在与相对杂乱的间充组织组件或“外膜”（由多位作者提出作为“应招”用于伤口愈合的成年间充质干细胞的居留地的组织生态位）结合的组织的非上皮部分中广泛分布。准核细胞中丰富的相似生态位可以作为人肿瘤的“未分化团块”、“外膜”、“间充质”或“基质”存在。经常注意到这类生态位是“粘蛋白状的”，一种由申请人与准核细胞的无核“胞质细胞器”中大量存在的粘蛋白状物质相联系的性质，其中钟形胞核与所述的无核胞质细胞器附着。

此外，申请人指出，干细胞移植物愈合多种伤口的领域取决于分离到就假定其中所含的干细胞的数目和身份而言未定义的组织细胞的混合物。准核细胞形式遍及身体在间充组织区域内分布的发现提供了一种从间充质提取物中大量存在的非干细胞特异性鉴定并且分离准核性伤口愈合干细胞以便在不稀释或抑制的情况下治疗患者的方法，其中将所述间充质提取物针对未鉴定的干细胞“富集”。

申请人传授了，在许多情况下将要求增加和计数活的准核干细胞的方法用于干细胞移植疗法、用于确定哪些药物和这类药物的哪些浓度有效促进这类体内疗法所要求的准核干细胞生长、以及用于确定哪些药物和这类药物的哪些浓度有效杀死引起伤口愈合病（如术后再狭窄）的准核干细胞。

申请人指出，在一些情况下，成功使用基于其特定形态所分离的间充质准核干细胞将足以启动并且促进伤口愈合，但是在其他情况下可以要求较大数目的干细胞用于成功治疗。为此目的，他们传授了，来自组织或肿瘤的准核细胞可以按实验室细胞培养物培育直至产生足够用于治疗目的的众多准核干细胞。尽管表面上可以使用细胞培养中通常使用的方法，但是申请人已经观察到准核细胞在研究实验室中总体上不实施的细胞培养条件下快速生长，其中所述细胞培养条件由申请人设计以便允许轻易扩大准核细胞数目。具体而言，尽管使用众多细胞培养基基本配方的任一种，例如MEM、BME、DMEM，但是申请人已经通过用果糖（5mM-10mM）替换葡萄糖、完全省略添加的碳酸氢钠修改这些配方；申请人传授的含有果糖（或非葡萄糖的其他糖如半乳糖）的所述培养基在仅空气存在下使用并且不象总体上在与二氧化碳混合的空气（例如，5%二氧化碳与95%空气的混合物）存在下所实施那样使用。

准核细胞

准核细胞显示令人印象深刻、然而仅最近才识别的核形态型：中空钟形胞核。综述见Gostjeva和Thilly，Stem Cell Reviews2:243-252（2005）；还见来自美国专利号7,427,502的图1、图2、图3、图6和图7及其描述，这些也通过引用结合。这些细胞还经历对称（产生额外的钟形核）和非对称（产生非钟形核）“无丝分裂”—没有有丝分裂和相关染色体浓集的分裂。通过这些无丝分裂，准核细胞可以产生占据正在发育的组织、前肿瘤损害和肿瘤的实质的异形核形态型，包括钟形、雪茄形、稠密球状、球状、卵圆形、香肠形、肾形、子弹形、不规则纺锤形及其组合。见，例如，图1和来自美国专利号7,427,502。“准核细胞（Metakaryote）”、“准核细胞”、“准核干细胞”、“伤口愈合性准核细胞”等指具有中空钟形胞核的细胞，其中细胞通过无丝分裂—对称或非对称无丝分裂发生分裂。

在实施本发明提供的方法时，技术人员将能够轻易地鉴定准核细胞。例如，本文中提供的筛选、诊断和治疗方法可以包括从组织样品或在培养的细胞中检测准核细胞的步骤。通过本发明方法可视化的培养细胞或来自组织样品内部的细胞以基本上保留具有至多到约10、20、30、40、50、60或70微米—和在更具体的实施例中至多到约50微米最大直径的胞核中胞核结构完整性的方式制备。用于制备细胞的方法也在美国专利号7,427,502中描述，所述专利的传授内容通过引用方式完整结合在此。在某些实施例中，制备物基本上保留约10-15微米的胞核中的胞核结构完整性。例如，在一些实施例中，组织样品可以作为厚度至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500或更多微米的制备物分析。在某些实施例中，将组织样品浸软，例如在制备用于分析时在包含约45%乙酸的溶液中温育。

在一些实施例中，为进一步促进准核细胞的检测，可以将培养的细胞或组织样品染色。在具体的实施例中，染色可以包括用例如西夫碱试剂、福尔根试剂或品红染色。在更具体的实施例中，组织样品可以进一步用第二种染液染色。

在仍更具体的实施例中，第二种染液可以是姬姆萨染液。在某些实施例中，在用非荧光染液如西夫试剂处理后，一些但是并非全部准核细胞可以通过其细胞质的荧光被检测到。见，例如，美国专利申请公开号2010/0075366A1，包括实例5、图20-图27及它们的描述，全部内容均通过引用结合。在本发明中，除了在其他器官和组织、前肿瘤损害和肿瘤的发育中所描述的准核细胞的粘蛋白状巨大气球形细胞质之外（例如，美国专利申请公开号2010/0075366A1），“与伤口愈合病相关的准核干细胞”、“伤口愈合准核细胞”等包括不显示粘蛋白状巨大气球形细胞质的准核干细胞，例如，在术后再狭窄和其他正常状况和病理状况如血管树发育中。申请人特别传授，通过产生平滑肌细胞参与血管新生和再狭窄显的准核干细胞的福尔根荧光显示不同形式的胞质染色，包括不可检测的胞质福尔根荧光。

除它们的独特核形态型和细胞分裂之外，在一些实施例中，准核细胞可以进一步通过检测特定标记基因表征，但是不借此区分。在具体的实施例中，标记基因可以包括一个或多个CD133（prominin1；人基因8842，最长同工型的参考mRNA和参考蛋白质分别是NM_006017.2和NP_006008.1）和CD44（人基因960，同工型1前体的参考mRNA和参考蛋白质序列分别是NM_000610.3和NP_000601.3）。这些标记的用途已经报道用于从人肿瘤富集终端稀释异种移植测定法中所定义的干细胞。申请人传授，这两种特殊标记识别在单核准核细胞中准核胞质细胞器外部上的抗原，但是不识别合胞体形式的多核准核细胞中的任何抗原。申请人和数目日益增加的其他研究者传授了，针对这两种抗原的抗体进一步识别某些真核细胞和在细胞培养物和某些组织样品中普遍存在的非晶性物质。在其他实施例中，用于鉴定和/或进一步表征准核细胞、尤其正在发生细胞分裂的那些准核细胞的标记包括DNA聚合酶β（人基因5423）、DNA聚合酶ζ（人基因5980）和RNA酶H1（人基因246243）。这种标记基因可以在核酸水平（例如，RNA）或蛋白质水平检测到。在更具体的实施例中，这些标记基因可以在准核细胞的气球形细胞质周界检测到。前述基因可以用来从NCBI网站抽取公众可获得的注释的mRNA序列或蛋白质序列。与这些基因ID相关的信息（包括参考序列和它们的相关注释）均通过引用结合在此。来自其他生物的参考序列也可以轻易地从NCBI网站获得。

也可以通过检测正在分裂的准核细胞（例如，通过检测无丝分裂的中间体）鉴定和/或定量准核细胞。无丝分裂的中间体包括例如粗大核形态（例如，在对称无丝分裂情况下分离堆叠的杯）或通过检测包含单链DNA（ssDNA）（其含有基因组）的复制中间体。例如，可以使用作为现有技术标准的技术检测ssDNA。先前已经在处理降解RNA之后的准核细胞中鉴定到含有ssDNA的复制中间体。见，国际公开WO2008/156629A2（例如，图11-图14、图17、和图18和它们的描述）以及WO2007/067795，两份公开的传授内容通过引用结合。在2011年6月2日提交的美国临时专利申请号61/492,738中描述了通过中间体dsRNA/DNA双链体基因组的存在鉴定准核细胞的额外方法。

诊断方法

由本发明提供的诊断方法包含确定来自受试者的组织样品中（例如，测量）准核细胞的存在和/或量和/或移行以便诊断受试者中的伤口愈合病。在一个具体实施例中，确定正在分裂的准核细胞的存在和/或量。

I.疾病

“伤口愈合病”是以手术介入后修复组织和/或器官损伤、从感染（如吃生肉感染）恢复和/或急性创伤期间的异常组织生成特征的疾病或病症，其中异常组织生成是非癌和非前癌的。在一些实施例中，伤口愈合病是以异常过度组织生成为特征。在其他实施例中，伤口愈合病是以异常不充分组织生成为特征。示例性伤口愈合病包括血管伤口愈合病、脊髓伤口愈合病、与器官移植相关的伤口愈合病和与创伤性损伤相关的伤口。在更具体的实施例中，伤口愈合病是在术后。手术，如器官移植（例如，心脏、肝脏、肺、角膜等）或手术介入，如血管成形术，支架放置等，经常导致（动脉或静脉）再狭窄。这类再狭窄是移植受体中常见的死亡原因。急性创伤可以包括例如烧伤、切割伤和枪伤。本发明提供了首份实验证据：平滑肌生成不通过规范有丝分裂，而通过非对称无丝分裂从准核细胞中发生。因此，虽然申请人不希望受理论约束，但是拒信伤口愈合病，如血管伤口愈合病—包括再狭窄—因平滑肌生成而发生，其中所述平滑肌细胞通过准核细胞的非对称无丝分裂产生并且不通过平滑肌细胞的分裂产生。申请人明白，正常伤口愈合和其他伤口愈合病，不同于血管中的术后再狭窄，可以包括从单核和/或多核、合胞体形式的伤口愈合性准核干细胞衍生的真核细胞的后续有丝分裂。

在一些实施例中，伤口愈合病是单克隆的；即，这种疾病因来自单个准核细胞面对面非对称分裂以形成异常过度组织生长（如癌症和动脉粥样化形成中那样）的线性生长而产生。在其他实施例中，伤口愈合病是多克隆的；即，这种疾病因两个或更多个准核细胞通过对称和非对称分裂（如器官发生和再狭窄中那样）而产生。

“血管伤口愈合病”是血管组织中的伤口愈合病，不包括动脉粥样硬化。在某些实施例中，血管壁病以准核细胞在血管组织、尤其内衬表面（如内膜）中异常过度平滑肌生成和/或增殖为特征。示例性血管伤口愈合病包括例如损伤引起的新生内膜增生和再狭窄（例如，在移植、支架术、吻合或创伤后）。在更具体的实施例中，血管壁病是再狭窄。在一些实施例中，血管壁病在手术、感染或急性创伤后发生。在更具体的实施例中，血管壁病是术后的。

“再狭窄”指在手术介入如血管成形术、支架术或移植后动脉的再狭窄，通常因内膜表面增厚所致。

II.受试者和组织样品

待通过本发明提供的方法待诊断、筛查或治疗的受试者包括任何多细胞动物，如脊椎动物。在具体的实施例中，受试者可以是哺乳动物，如灵长类、啮齿类、犬、猫、猪、羊、牛或兔。在仍更具体的实施例中，受试者是灵长类，例如，人。

受试者可以处于任何发育阶段，例如，胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年、成年或老年。在具体的实施例中，受试者是儿童、青少年、成年或老年。在仍更具体的实施例中，受试者是成年或老年。在某些实施例中，受试者是至少约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105岁或更大年岁，例如，约1-5、5-10、10-20、18-25、25-35、35-45、45-55、55-65、65-75、75-110、80-110、90-110、95-110、或100-110岁或更大年岁并且在仍更具体的实施例中是100-104岁。在某些实施例中，受试者死亡，即，这种方法是一种死后诊断方法。

在一些实施例中，受试者疑似患有伤口愈合病。在更具体的实施例中，受试者疑似患有血管伤口愈合病。

在某些实施例中，受试者先前已经经历过手术。在更具体的实施例中，手术是支架术和/或气囊血管成形术。在仍更具体的实施例中，受试者先前已经接受多于一个支架，例如，至少2、3、4、5个或更多个支架。在这些实施例中，支架可以是药物洗脱支架（例如，西罗莫司（sirolimus）或紫杉醇，包括其类似物；雷帕霉素，包括其类似物；以及抗CD-34或抗VEGF抗体涂覆的支架）、非药物洗脱支架或其组合。

在一些实施例中，受试者先前已经接受移植物，例如，异基因移植物、自体移植物或异体移植物。在具体的实施例中，受试者已经获得完整或部分器官移植物（例如，心脏、肝脏、肾、膀胱、皮肤、肺或角膜移植物）或瓣膜或血管移植物。移植的血管可以是动脉和/或静脉。在具体的实施例中，受试者疑似患有手术后再狭窄。

在某些实施例中，手术地获得来自受试者的组织样品，例如，在手术如移植、血管成形术或支架术期间或在活组织检查术时。组织样品可以包括多种组织，如血液、血管组织、脂肪组织、淋巴组织、结缔组织（例如、筋膜、韧带、腱）、外膜、浆膜、腱膜、内分泌组织、粘膜组织、肝、肺、肾、脾、胃、胰、结肠、小肠、膀胱、性腺、乳腺组织、中枢神经组织、外周神经组织、皮肤、平滑肌、心肌或骨骼肌。在一些实施例中，组织样品可以包含1、2、3、4、5或多种以上组织。在更具体的实施例中，组织样品可以主要包含一种组织或基本上由其组成，例如，组织样品具有按重量计约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%的单一组织。在更具体的实施例中，组织样品包含血管组织并且在仍更具体的实施例中，包含血管壁组织。在一些实施例中，组织样品基本上由血管组织组成。在某些实施例中，血管组织进一步包含外膜。在更具体的实施例中，血管组织基本上由外膜和血管组织组成。

待通过本发明提供的方法分析的组织样品可以新鲜地（例如，在不存在任何固定的情况下）或在物理或化学固定后分析。示例性物理固定包括冷冻。化学固定可以使用技术人员已知的任何固定剂，如包含醇、醛、有机酸和其组合的那些，只要这种化学固定保留准核细胞。例如，在具体的实施例中，化学固定剂包含甲醇和冰醋酸，并且在更具体的实施例中以甲醇对冰醋酸约4:1、3:1、2:1、1:1的比率包含。

为有效地检测准核细胞，应当制备组织样品以便既保留与准核细胞相关的异源核形态型（例如，通过从患者分离后旋即固定和/或可视化以避免结构降解），又能够有效地使之可视化（例如，与常见的5微米组织学切片相比，通过提供相对厚的组织学制备物）。技术人员将轻易地能够改造美国专利号7,427,502的实例1和2（它们通过引用结合）以实现这个目的。还见，Gostjeva等人，Organogenesis[器官发生],5:4,191-200（2009）；Gostjeva等人，CancerGenetics and Cytogenetics[癌症遗传学和细胞遗传学]14:16-24（2006）。因此，在一些实施例中，通过本发明的方法在从受试者分离约1、5、10、15、20、25、30、40、50或60分钟内可视化或固定来自受试者的组织样品的细胞。

在某些实施例中，本发明的诊断或预后方法可以进一步包括以下步骤：检测特殊的非准核细胞，如平滑肌细胞特征性的不规则胞核，例如，这些方法可以包括检测平滑肌细胞的步骤，和在更具体的实施例中，检测平滑肌细胞数目的变化，即，这些细胞的数目的增加或减少。

筛选方法

本发明提供用于治疗伤口愈合病（如血管伤口愈合病）的药物的的体外和体内筛选方法。在体外和体内方法中，相对于合适对照（例如，未用候选药物治疗的培养细胞或哺乳动物），评价候选药物调节准核细胞数目、（通过对称或非对称无丝分裂）正在增殖的准核细胞的数目或准核细胞移行的能力。候选药物可以包括任何化学实体，包括小分子药物或生物制品，如蛋白质（例如、生长因子、抗体、或适配体）、核酸（包括反义分子和适配体）、脂质、糖或其组合。这种药物质一般地将以剂量或剂量范围，例如2、3、4、5、6个或更多个剂量施用，从而对培养物或哺乳动物中准核细胞（尤其正在增殖的准核细胞）的数目和/或分布和/或移行产生影响

体外筛选方法包括使包含正在增殖的准核细胞和肌肉细胞的培养细胞与候选药物接触。在更具体的实施例中，细胞从哺乳动物，如灵长类、啮齿类、犬、猫、猪、羊、牛或兔获得。在仍更具体的实施例中，细胞从人获得。在某些实施例中，培养的细胞从脐带、外膜、间充组织或主动脉弓获得。在具体的实施例中，培养的细胞是HT29人结肠腺癌细胞，如美国专利申请公开号2010/0075366A1的实例6中所述那样，包括图28-图30和它们的描述，全部内容均通过引用结合。在具体的实施例中，包含正在增殖的准核细胞和肌肉细胞的培养细胞是原代细胞。在更具体的实施例中，这些原代细胞从脐带、血管外膜或主动脉弓获得。

体内筛选方法包含向哺乳动物施用候选药物。在更具体的实施例中，哺乳动物是非人哺乳动物。在仍更具体的实施例中，哺乳动物是非人灵长类、啮齿类、犬、猫、猪、羊、牛或兔。在仍更具体的实施例中，哺乳动物是啮齿类，如小鼠、大鼠或豚鼠。在仍更具体的实施例中，哺乳动物是豚鼠。在一些实施例中，使哺乳动物预先倾向于（例如，以遗传方式或通过膳食或药物处理）形成伤口愈合病。在某些实施例中，伤口愈合病因手术介入，例如外科损伤，如移植术、血管成形术、支架术或直接有意组织损伤，例如，因化学固定、辐射、过热或过冷、梗死，刺穿、切割或钝伤而产生。在更具体的实施例中，使哺乳动物预先倾向于形成伤口愈合病并且暴露于手术介入。在某些实施例中，伤口愈合病是血管伤口愈合病。在更具体的实施例中，血管伤口愈合病是再狭窄。

在某些实施例中，本发明的体内或在体外筛选方法可以进一步包括以下步骤：检测特殊的非准核细胞，如平滑肌细胞特征性的不规则胞核，例如，这些方法可以包括检测平滑肌细胞的步骤，并且在更具体的实施例中，检测平滑肌细胞数目的变化，即，这些细胞的数目的增加或减少。

治疗方法

上文描述的筛选方法提供可以用来治疗伤口愈合病的药物。因此，本发明也提供治疗患有伤口愈合病的受试者的方法。例如，可以向患有如本文所述的任何伤口愈合病的受试者施用有效量（并持续足够长的时间段）的例如调节准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行的药物。例如，在以异常过度组织生成为特征的伤口愈合病中，向受试者施用减少准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行的药物。相反，在以异常不充分组织生成为特征的伤口愈合病中，向受试者施用有效量的增加准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行的药物。

可以在本发明提供的治疗方法中使用的药物包括通过本发明提供的方法所鉴定的那些药物中的任一种。可能或疑似能够抑制准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行的其他药物在例如美国专利申请公开号2009/0304662和国际申请号WO2008/156629中公开，所述专利的全部传授内容通过引用以其全文结合在此。向受试者施用的药物可以包括任何化学实体，包括小分子药物或生物制品，如蛋白质（例如、生长因子、抗体、或适配体）、核酸（包括反义分子和适配体）、脂质、糖或其组合。在具体的实施例中，本发明提供一种通过施用分离的准核干细胞，治疗患有以异常不充分组织生成为特征的伤口愈合病的受试者的方法。

本发明也包括在有需求的受试者中通过培养或分离伤口愈合性准核干细胞并且向所述受试者以刺激/活化组织生成的有效量直接或间接施用这些准核干细胞，治疗以组织生成不充分为特征的伤口愈合病的方法。例如，可以将准核细胞培养成粘性细胞片并且使其与需要组织生成的受试者的区域接触。

技术人员将理解用于这些方法的细胞来源（如细胞培养物或组织样品）应当包含准核干细胞。在一些实施例中，这些方法可以进一步包括一个或多个步骤：分离和/或扩充准核干细胞，例如，通过培养、通过本文所述和技术人员在不用过多实验情况下轻易理解和实施的手段进行。

如下描述本发明的示例实施例。

示例

以下实例支持物本发明，所述实例涉及用于伤口愈合病（如血管伤口愈合病）的诊断、治疗和筛选方法。示例性血管伤口愈合病包括损伤引起的新生内膜增生和再狭窄。在更具体的实施例中，血管壁病是再狭窄。

材料与方法

这些方法使用了固定并且染色的哺乳动物组织切片，一些切片3mm-5mm厚度，其中以化学或酶方式（解离或浸软）破坏细胞黏附到这样的程度，从而允许组织在显微镜载玻片上有序铺展[Gostjeva等人，2009]。观察到小的形态学结构如染色核和较大的结构如结肠陷凹和血管，伴随组织铺展时固有的一些畸变。

在切除的半小时内，优选地在15分钟内提供手术组织抛弃物[Gostjeva等人，2006]。一旦解剖，则将剥离的上皮组织层、3mm-5mm再狭窄斑块组织和相邻正常间充质区域的片材（至多到1cm²）立即置入新鲜制备的4°C卡诺依固定剂（3:1，乙醇:冰醋酸）中。固定剂的体积至少3倍于组织样品的体积。对于总计3小时的固定，每隔45分钟，更换新鲜固定剂3次。随后将卡诺依固定剂更换为4°C70%乙醇。样品随后可以在4°C至-20°C贮存至多1年。

从完整的固定组织样品切下约1mm²小片用于铺展和DNA染色。将每块小片在蒸馏水中淋洗并且置于试管中，所述试管具有预温至37°C的2ml在蒸馏水中的胶原蛋白酶溶液（在室温将水添加至胶原蛋白酶粉末）。将试管置于37°C摇床水浴中约10分钟（II型胶原蛋白酶，100mg，Calbochem Inc.，273U/mg）。胶原蛋白酶组织解离的持续时间如下：对于上皮组织，3小时；对于斑块组织，4小时；对于动脉的正常平滑肌组织或心肌组织，高达6小时。随后将胶原蛋白酶消化的约1mm切下的组织切片在水中淋洗并且置于2ml管内的45%乙酸中15分钟。在显微镜载玻片上在一滴45%乙酸实施组织铺展术。将每片约1mm²酶消化的切片对切以形成两片约0.5mm x1mm的固定浸软的组织。将每个小片转移至清洁显微镜载玻片上的约5μL乙酸中并用22mm x22mm盖玻片覆盖。通过边缘固定盖玻片，在组织样品上施加轻微压力以便使它定位于载玻片的中央。

用20x相差物镜对每份独立样品检查铺展的质量。良好组织铺展的指示是在完整组织铺展的边缘上不存在受损胞核，同时将立体组织结构（血管、陷凹）压缩成基本上为保留形态学完整性的单层。将每片良好铺展的样品载玻片立即置于干冰表面上。在2分钟后，此时铺展的组织样品彻底地冷冻，在盖玻片的一个边缘下插入剃须刀片并且将盖玻片温和地提起。随后允许载玻片在无尘环境下干燥不超过1小时。

为通过如本文所用的西夫试剂，使用福尔根试剂对胞核染色，需要对显微镜载玻片上的组织铺片进行热酸水解。将载玻片置于Coplin缸中，用预温（60°C）1N氢氯酸溶液覆盖8分钟，随后在蒸馏水中快速淋洗。甩去水滴水并且将载玻片在无尘环境下干燥3小时。载玻片随后即可用于福尔根染色。

染色程序在室温进行。将载玻片置于Coplin缸中并且用西夫试剂（Art.9033，Merck）填充以便与部分脱嘌呤的胞核DNA反应。将载玻片在染色溶液中浸没1小时，在相同Coplin缸中于2x SSC（柠檬酸三钠8.8g/L，氯化钠17.5g/L）淋洗两次，1次30秒和1次迅速。载玻片随后用蒸馏水淋洗。在这个阶段的载玻片适合于观察DNA在胞核中的分布，包括例如通过定量性图像分析测量胞核中福尔根DNA的量或有丝分裂的真核细胞的浓集染色体（Greilhuber和Temsch,Genome44:826-30（2001）；Hardie,Gregory和Hebert,J.Histochem Cytochem[组织细胞化学杂志]50:735-49（2002））。

为了实现优越分辨率和间期胞核成像，将一些载玻片进一步用姬姆萨染色。在2x SSC中淋洗后立即将载玻片置于1%姬姆萨溶液（Giemsa，Art.9204，Merck）中5分钟，随后首先在

缓冲液（二水合磷酸氢二钠11.87g/L，磷酸二氢钾9.07g/L）并且随后在蒸馏水中快速淋洗。如同甩动老式温度计那样，从载玻片甩去水滴以避免染液侵蚀。将载玻片置于无尘环境中以便在室温干燥1小时。随后将它们置于填充有二甲苯的Coplin缸中至少3小时以便除去脂肪。将盖玻片用DePex封片介质粘附于载玻片并且允许干燥3小时，在此时它们即可用于高分辨率扫描。

实例1：胎儿肾动脉中准核细胞的可视化

基本上如上文所述，制备图2-图4中所显示的组织用于准核干细胞的可视化。从人胎儿肾动脉获得组织。

实例2：准核细胞在患有移植后再狭窄的患者中的可视化

一名2岁儿童最近接受过移植，遭遇排异并且在1个月期间出现弥散性冠状动脉粥样硬化的快速进展。该儿童因这种快速进展的冠状动脉病而遭遇心脏骤停。儿童依赖紧急心肺转流术支持稳定6日直至心脏变得可用。移出儿童的患病心脏并且提供一个新的心脏。图6和图7包括从这位受试者制备的新鲜固定组织的显微照片。图6C-图6D是显示猪中主要血管的显微照片。

实例3：血管新生和膀胱息肉导管损伤

图2-图4显示血管新生。图17B包括膀胱息肉损伤的显微照片。

实例4：6月龄人类儿童皮肤中的伤口愈合

图18-图21是6月龄人类儿童皮肤中伤口愈合的显微照片。

实例5：2岁儿童的术后“奔马性动脉粥样硬化”即肺静脉内再狭窄和排异的心脏移植物

如上文所述制备的图6-图16、图10-图13和图16-图18中的显微照片。

实例6：额外的观察结果

图22等尤其包括狭窄静脉、吻合汇合和正常成年小鼠结肠的显微照片。

实例7：鉴定治疗伤口愈合病的药物的体内筛选

按照正确的伦理和实验指南在经批准的设施中维持饲养动物。

对照和实验豚鼠在治疗之前经受血管损伤。向实验动物以0.01mg/kg/日-100mg/kg/日的剂量施用候选药物。模拟治疗对照动物。在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10日后，处死动物，并且通过取出血管组织和相关的外膜，使用保留准核干细胞的方法将组织固定和染色，以组织方式评价遭受血管损伤的区域。在对照动物和实验动物中对含有先前受损血管组织的组织样品评价准核干细胞总数、正在增殖的准核干细胞的总数和准核干细胞的位置（例如，相对于受损血管的内膜表面和相关外膜），例如以便确定对准核细胞从外膜移行至受损血管的内膜表面的影响。减少准核干细胞总数、正在增殖的准核干细胞总数或准核干细胞移行的药物预期有效治疗伤口愈合病，如血管伤口愈合病。

应当理解，对于本申请中描述一些参数的全部数字界限，如“约”、“至少”、“小于”、和“多于”，这种描述也必然地包括由所述值约束的任何范围。因此，例如，描述至少1、2、3、4或5本身也描述范围1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5和4-5等。

本文中引用的全部专利、公布的申请和参考文献的教授内容通过引用以其全文结合在此。

虽然通过参考其实例性的实施例本发明已经进行了具体的展示和说明，本领域普通技术人员应当理解的是在不偏离由所附权利要求所包括的本发明的范围下其中可以在形式和细节方面进行多种改变。

Claims (70)

1.一种鉴定一种或多种调节准核干细胞增殖和/或移行的药物的体外方法，包括使包含准核干细胞的培养的组织细胞与一种或多种候选药物接触并且评价该培养细胞的核形态，其中与不与该候选药物接触的对照细胞相比，正在增殖的准核干细胞或正在迁移的准核干细胞数目的变化表示所述药物调节准核干细胞增殖和/或移行的有效性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养的细胞进一步包含具有核形态的细胞，所述核形态包括：雪茄形核、子弹形核、香肠形核、肾形核、不规则纺锤形核及其组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中该培养的细胞从哺乳动物获得。

4.根据权利要求3所述的方法，其中该哺乳动物具有伤口愈合病。

5.根据权利要求4所述的方法，其中该伤口愈合病是血管伤口愈合病。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该培养的细胞是原代细胞。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该培养的细胞从选自脐带、血管外膜、间充组织、主动脉弓、脊髓和神经元组织的组织获得。

8.根据权利要求2所述的方法，其中该培养的细胞在适宜的染色条件下与荧光相关。

9.根据权利要求8所述的方法，其中该培养物包含发生非对称无丝分裂的准核干细胞。

10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该培养物包含选自平滑肌细胞或骨骼肌细胞的肌肉细胞。

11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该培养物包含心肌细胞。

12.根据权利要求4或5所述的方法，其中该伤口愈合病是以异常过度组织生成为特征的多克隆病。

13.根据权利要求4或5所述的方法，其中该伤口愈合病以异常不充分组织生成为特征。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该方法鉴定了增强准核干细胞增殖和/或移行的药物。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该方法鉴定了抑制准核干细胞增殖和/或移行的药物。

16.一种鉴定一种或多种治疗伤口愈合病的药物的方法，所述方法包括：

a)确定来自用一种候选药物治疗的哺乳动物中的分离组织样品内部所含的细胞的胞核形态，其中通过基本上保留具有至多到约50微米最大直径的胞核中的胞核结构完整性的方法制备该组织样品；和

b)将来自用该候选药物治疗的哺乳动物中的组织样品内部的细胞的核形态与来自未用该候选药物治疗的对照哺乳动物中的分离组织样品内部所含的细胞比较，

其中，与未用所述候选药物治疗的对照哺乳动物的组织样品相比，用所述候选药物治疗的哺乳动物的以下变化：

i)组织样品中准核干细胞数目的变化；

ii)组织样品中正在增殖的准核干细胞数目的变化；或

iii)组织样品中准核干细胞移行的变化，

显示所述药物治疗伤口愈合病的有效性。

17.根据权利要求16所述的方法，其中该组织样品进一步包含具有异形核形态型的细胞，所述异形核形态型包括：雪茄形核、子弹形核、香肠形核、肾形核、不规则纺锤形核及其组合。

18.根据权利要求16所述的方法，其中该哺乳动物是猪。

19.根据权利要求16所述的方法，其中该哺乳动物是啮齿类并且该啮齿类是大鼠、小鼠或豚鼠。

20.根据权利要求17所述的方法，其中该细胞在适宜的染色条件下与荧光相关。

21.根据权利要求16所述的方法，其中该伤口愈合病是血管伤口愈合病。

22.根据权利要求16所述的方法，其中该伤口愈合病是以异常过度组织生成为特征的多克隆病。

23.根据权利要求16所述的方法，其中该伤口愈合病以异常不充分组织生成为特征。

24.根据权利要求16所述的方法，其中正在增殖的准核干细胞数目的减少与细胞的非对称无丝分裂减少相关。

25.根据权利要求24所述的方法，其中该非对称有丝分裂与产生包含平滑肌细胞特征性的不规则胞核的细胞相关。

26.根据权利要求16-25中任一项所述的方法，其中该方法鉴定一种或多种增加准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行的物质。

27.根据权利要求16-25中任一项所述的方法，其中该方法鉴定一种或多种减少准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行的药物。

28.一种用于诊断与正在增殖的准核干细胞相关的伤口愈合病的方法，包括：

a)使包含间充组织的分离组织样品中的细胞的胞核可视化，其中通过基本上保留具有至多到约50微米最大直径的胞核中的胞核结构完整性的方法制备所述组织样品；并且

b)确定正在增殖的准核干细胞在组织样品中的存在和/或不存在，

其中正在增殖的准核干细胞在组织样品中的存在表示伤口愈合病。

29.根据权利要求28所述的方法，其中该组织样品包含血管组织。

30.根据权利要求法28或29所述的方法，其中该伤口愈合病是血管伤口愈合病。

31.根据权利要求30所述的方法，其中该血管伤口愈合病选自由损伤引起的新生内膜增生和再狭窄组成的组。

32.根据权利要求31所述的方法，其中该血管壁病是再狭窄。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中将该细胞物理或化学地固定。

34.根据权利要求33所述的方法，其中将该组织样品冷冻。

35.根据权利要求33所述的方法，其中该组织样品用一种或多种选自由醇、醛、有机酸及其组合组成的组的化学固定剂处理。

36.根据权利要求35所述的方法，其中该固定剂包含甲醇和乙酸。

37.根据权利要求16-32中任一项所述的方法，其中在细胞核降解之前固定该组织样品中的细胞。

38.根据权利要求16-32或37中任一项所述的方法，其中该组织样品的细胞通过组织离析和铺展部分地解离。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中将该细胞染色，因而允许核的可视化。

40.根据权利要求39所述的方法，其中将DNA染色，因而允许核的可视化。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中将该细胞在分离30分钟内固定。

42.根据权利要求16-32或37-38中任一项所述的方法，其中该组织样品从一种多细胞动物获得。

43.根据权利要求42所述的方法，其中该多细胞动物是一种脊椎动物。

44.根据权利要求43所述的方法，其中该脊椎动物是一种哺乳动物。

45.根据权利要求44所述的方法，其中该哺乳动物选自由灵长类、啮齿类、犬、猫、猪、羊、牛和兔组成的组。

46.根据权利要求45所述的方法，其中该哺乳动物是人。

47.根据权利要求16-32、37-38或42-46中任一项所述的方法，其中该组织样品进一步包含具有异形核形态型的细胞，所述异形核形态型包括：雪茄形核、子弹形核、香肠形核、肾形核、不规则纺锤形核及其组合。

48.根据权利要求47所述的方法，其中该组织样品包含外膜。

49.根据权利要求16-32、37-38或42-48中任一项所述的方法，进一步包括：

c)确定该正在增殖的准核干细胞在组织样品内部的空间和/或数字分布，

其中该正在增殖的准核干细胞的空间和/或数字分布进一步表征该组织样品。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中该准核细胞与表示无丝分裂性对称核分裂的结构相关。

51.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中该准核干细胞正在发生非对称无丝分裂，产生不规则纺锤形核。

52.根据权利要求16-32、37-38或42-49中任一项所述的方法，其中该受试者死亡。

53.根据权利要求16-32、37-38或42-49中任一项所述的方法，其中该组织样品基本上由血管组织和外膜组成。

54.根据权利要求45所述的方法，其中该组织样品基本上由血管组织组成。

55.一种鉴定伤口愈合性准核干细胞的方法，包括：

a)使包含间充组织的分离的成年组织样品中的细胞的胞核可视化，其中通过基本上保留具有至多到约50微米最大直径的胞核中的胞核结构完整性的方法制备该组织样品；并且

b)鉴定该组织样品中的准核干细胞，

其中该组织样品中的准核干细胞是伤口愈合性准核干细胞。

56.根据权利要求55所述的方法，其中该组织样品包含器官组织。

57.根据权利要求55所述的方法，其中该组织样品包含外膜。

58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中该组织样品包含血管。

59.根据权利要求55所述的方法，其中该组织细胞包含具有核形态的细胞，所述核形态包括：雪茄形核、子弹形核、香肠形核、肾形核、不规则纺锤形核及其组合。

60.一种在有需求的患者中治疗伤口或伤口愈合病的方法，所述方法包括向该患者施用有效量的调节该患者中准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行的药物，因而治疗该伤口愈合病。

61.根据权利要求60所述的方法，其中该伤口愈合病是以异常过度组织生成为特征的多克隆病。

62.根据权利要求60或61所述的方法，其中该药物减少所述患者中准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行。

63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中通过根据权利要求1-27中任一项所述的方法鉴定该药物。

64.根据权利要求60所述的方法，其中该伤口愈合病以异常不充分组织生成为特征。

65.根据权利要求60或64所述的方法，其中该药物增加该患者中准核干细胞数目、正在增殖的准核干细胞数目或准核干细胞移行。

66.根据权利要求65所述的方法，其中通过根据权利要求1-27中任一项所述的方法鉴定该药物。

67.一种在有需求的患者中治疗以异常不充分组织生成为特征的伤口愈合病的方法，所述方法包括向该患者施用有效量的分离的准核干细胞。

68.根据权利要求67所述的方法，其中将该分离的准核干细胞直接施用至该患者中需要组织生成的部位。

69.根据权利要求67或68所述的方法，其中将准核干细胞在施用至该患者或施用至该患者中需要组织生成的部位之前体外或离体培养。

70.根据权利要求67-69中任一项所述的分离的准核干细胞，用于治疗伤口或伤口愈合病。

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