JP2013540276A - 創傷を治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、およびその使用方法 - Google Patents

創傷を治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を同定する方法、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を調節する分子および再狭窄を含む血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害を処置する分子を同定する方法、を提供する。本発明はまた、血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害を診断および処置し、さらにメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞移植片（単数または複数）の使用により創傷を処置する方法も提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１０年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／４０６，４６８号明細書の利益を主張する。上記の出願の本教示内容はすべて本明細書に援用する。
創傷および創傷治癒障害が広がっており、生活の質を損ねている。神経の連絡を切断する創傷は麻痺を引き起こす。創傷治癒障害は、外傷性損傷および感染症後の臓器および組織の創傷に見られ、さらにアテローム性動脈硬化症などの進行性の障害に起因する血管疾患に必要とされることが多い外科的介入後の創傷および創傷様の状態にも同様に見られる。たとえば、米国では冠動脈または頸動脈疾患などの血管疾患に数百万人が、世界全体ではより多くの人が罹患している。たとえば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，３（３）：１９２−２０１（２０１０）を参照されたい。血管移植、ステントおよび血管形成術など血管疾患の治療介入は、通常の血流量を回復させることにより血管疾患の消耗作用を軽減することができる。しかしながら、こうした介入による好転は、創傷治癒障害がよく見られる障害であり、再狭窄（外科的介入後に血管壁の平滑筋細胞数の急増により起こる血管の再狭小化）などの合併症を引き起こすため、一時的に過ぎない可能性がある。
これらの新たな観察結果は、術後の再狭窄など血管の創傷治癒障害に関係する細胞のような、創傷治癒障害を引き起こす細胞の正体および／または源に関する当該技術分野における議論に直接関係する。一部の著者らは、大動脈弓の外膜から単離された不確定の細胞のサブセットが、ある種の幹細胞様の性質（細胞表面マーカーの細胞発現など）、およびアテローム性動脈硬化症を促進し得る細胞を産生する能力を有するというデータを提出している。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１３３（９）：１２５８−６５（２００４）。これらのアテローム性動脈硬化症の研究は、本明細書に記載した術後の再狭窄などの創傷治癒現象と区別される。数十年にわたる動脈硬化性プラークのゆっくりとした進行は、術後の再狭窄においては数週および数ヶ月で再現されるためである。再狭窄は実際に、「ギャロッピング（急速に進む）アテローム性動脈硬化症」として特徴付けられる。これらの研究からは、病状について研究された特定の細胞の明確な役割はもちろん、たとえば、医学病理学者または組織学者の顕微鏡検査による細胞の同定または分類に役立つ細胞の任意の形態学的特徴付けも証明されない。
他の著者らは、特定の表面抗原および他の特徴を有する細胞の分布について記載しながら、血管および／または血管に近接する組織において幹細胞様の特徴を有すると考えられる細胞の位置の特徴付けを行っている。残念ながら、こうした抗原マーカーまたは幹細胞は、幹細胞でない細胞上および細胞間に広く分布することが立証されている。前記マーカーは、細胞混合物から幹細胞を濃縮するのに有用であるとはいえ、幹細胞を特異的に単離および観察することはできない。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１２：２７５−８７（２０１０）を参照されたい。一方、これらの研究は、任意の疾患で幹様特性を有する細胞の役割を立証していない。特に、Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．は、血管壁のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）の対称または非対称無糸分裂について述べておらず、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の非対称無糸分裂による平滑筋細胞の発生についても述べなかった。したがって、創傷治癒および創傷治癒障害に関与する細胞型を同定することが求められている。さらに、創傷治癒に関連する細胞、すなわち、実際の病状に関与する幹細胞の増殖および／または遊走を調節することにより、創傷治癒障害を処置する作用物質を同定することも求められている。さらに、たとえば、病理学的障害の根底にある幹細胞が分化した細胞を死滅させる、および／または、その遊走、増加または産生を遅らせることにより、異常かつ過剰な組織発生を特徴とする創傷治癒障害を処置する作用物質を同定する方法も求められている。このことは特に、術後の再狭窄の場合に平滑筋細胞に当てはまる
本発明は特に、創傷治癒のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、および術後の再狭窄などの創傷治癒障害におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を認識する方法と、こうした創傷治癒障害を処置するための分子を同定する方法を提供する。本発明の少なくとも一部は、再狭窄を起こした移植患者から外科的に採取した再狭窄病変において対称無糸分裂により増加し、かつ非対称無糸分裂により平滑筋細胞を生じる、釣鐘状の核を持つメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の発見に基づくものである。また、平滑筋核が有糸分裂プロセスでも、または無糸分裂プロセスでもそれ以上増加しないことも特筆された。平滑筋細胞は、血管腔壁内／上で増加するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞自体の非対称無糸分裂から１つずつ生じた。この知見は、ヒト胎児の腎動脈の発生において平滑筋細胞を生じる対称および非対称無糸分裂で分裂しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の同様の観察結果と一致する。図２〜４を参照されたい。再狭窄病変におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の供給源は、成体マウスおよびヒトの結腸および他の臓器の間葉系組織領域において非分裂の休止状態にあるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の、成体間葉系幹細胞の数および細胞学的位置における、本出願人らによる別の発見により示唆された。これらの観察結果から、本出願人らは、外科的につないだ血管と関連する外膜組織層のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）成体幹細胞は創傷に入り込み、初期の治癒を促進するものの、説明はできないことだが、数が増加し、再狭窄の病理学的状態が生じるまで平滑筋細胞の数を増加させると結論した。
一態様では、本発明は一般に、対称無糸分裂および非対称無糸分裂の両方で活発に分裂している、釣鐘状の核を持つ細胞および／またはシンシチウムを認識することにより創傷治癒の幹細胞を同定する方法を提供する。例として、角膜移植後の創縁に急速に出現するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞、および骨格筋創傷の治癒の過程で出現するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）管状シンシチウムが挙げられる。
さらなる態様では、本発明は、非分裂状態で全身の組織の間葉領域に広く分布している、創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞（本明細書では成体間葉関連メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞ともいう）を同定する方法を提供する。こうした認識により、特に非幹細胞型および多くの細胞間物質に結合する抗体を用いた認識など、比較的非特異的な方法に頼らずに、特定の成体間葉系幹細胞を物理的に分離することができる（たとえば、レーザーキャプチャー）。
したがって、別の態様では、本発明は、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の対称分裂および非対称分裂に起因する制御不能な増殖および分化に関係する病態としての創傷治癒障害を診断する方法を提供する。こうした障害の例として、術後の再狭窄として知られる血管の創傷治癒障害がある。本方法は、単離された組織サンプル中の細胞の核を可視化するステップを含む。組織サンプルは、ＤＮＡを含む細胞核の物理的構造を固定する方法により調製するため、その後の顕微鏡検査によりその形状を認識することができる。いくつかの実施形態では、調製方法は実質的に、約５０ミクロンまでの最大直径を有する核内の核構造物の完全性を保持する。本方法はまた、組織サンプル中で異形の核の形態型を持つ細胞の存在および／または非存在を判定するステップを含む。再狭窄の場合には、本方法は任意選択的に、不規則な特徴的な核の形態と、同一セットの不規則な核を持つ平滑筋細胞の発生を示す、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の非対称無糸分裂による無糸分裂とを有する平滑筋細胞の数の増加を認識することを含む。図９〜１３、１４Ａおよび１５〜１７を参照されたい。術後の再狭窄以外の病変では、非対称無糸分裂によりメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞から生じる、正常組織と関連するある種の異形の核の形態型を持つ細胞の存在から、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の非制御分裂に基づく創傷治癒障害が示唆される。一実施形態では、創傷治癒障害を引き起こす細胞は大型であり、釣鐘状のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）核が、ヒトの器官形成および発癌の幹細胞として働くことが分かっている（Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，５：４，１９１−２００（２００９）；Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：１６−２４（２００６））。別の実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、非対称無糸分裂により、創傷治癒が病理学的病変に進行する組織に特徴的である核膜に包まれた真核細胞核を生じる。特定の実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は活発に分裂している。より詳細な実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は、無糸分裂を起こしている。さらにより詳細な実施形態では、無糸分裂は、対称無糸分裂である。他のより詳細な実施形態では、無糸分裂は非対称分裂である。
ある種の実施形態では、創傷治癒障害は、損傷により誘発される新生内膜過形成、吻合（ａｎａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）後の合併症または再狭窄などの血管の創傷治癒障害である。
前述の本発明の態様のより詳細な実施形態では、血管壁障害は再狭窄である。
本発明により提供される方法に使用される組織サンプルは、物理固定しても（たとえば、サンプルを凍結させる）、または化学固定してもよい（たとえば、アルコール、アルデヒド、有機酸およびこれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の化学固定剤で処理する）。いくつかの特定の実施形態では、メタノールおよび酢酸を含む固定剤で組織サンプルを固定する。ある種の実施形態では、組織サンプル中の細胞の核分解前に（たとえば、単離から約２０分以内、３０分以内、４０分以内、５０分以内、６０分以内、９０分以内または１２０分以内に）組織サンプルを固定する。より詳細な実施形態では、単離から３０分以内に、さらにより詳細な実施形態では、単離から１５分以内に組織サンプルを固定する。いくつかの実施形態では、組織サンプルの新鮮な細胞、固定細胞または凍結細胞を、組織分解および展開により部分的に分離する。ある種の実施形態では、組織サンプルの細胞または巨大分子を染色し、それにより核の可視化を可能にする。より詳細な実施形態では、ＤＮＡを染色し、それによりＤＮＡおよび核の可視化を可能にする。いくつかの実施形態では、細胞は、適切な条件下で染色すると蛍光を発する。Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６、２００９。
本発明のある種の実施形態では、組織サンプルは脊椎動物などの多細胞動物から採取される。より詳細な実施形態では、脊椎動物は霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシまたはウサギなどの哺乳動物である。さらにより詳細な実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、多細胞動物は死亡している、すなわち、組織サンプルは死亡後に採取される。
特定の実施形態では、本発明により提供される方法はさらに、不規則な紡錘状、葉巻状、縮合した球状、球状、卵状、ソーセージ状、腎臓状、弾丸状およびこれらの組み合わせである核を含む異形の核の形態型を可視化するステップを含む。より詳細な実施形態では、異形の核の形態型はメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞核の釣鐘状の核、および平滑筋細胞の不規則な特徴的な核である。図９Ｂおよび１３Ａ〜Ｃを参照されたい。本明細書で「不規則な」という用語は、蠕虫様の体（図９Ｂ、１３Ｃ）または捻れた形態（図１３Ａ〜Ｃ）に似ていてもよい平滑筋核のいくつかの形態学的形態の特徴を表すことを意味する。
ある種の実施形態では、本発明の方法は、組織サンプル中の異形の核の形態型の空間分布および／または数分布を判定するステップを含んでもよい。こうした実施形態では、異形の核の形態型の空間分布および／または数分布は、組織サンプルをさらに特徴付ける。ある種の実施形態では、異形の核の形態型は多核シンシチウムまたは単核細胞に含まれる。いくつかの実施形態では、異形の核の形態型は釣鐘状の核であり、より詳細な実施形態では、釣鐘状の核は、無糸分裂の対称核分裂を示唆する構造と関連する。いくつかの実施形態では、異形の核の形態型は釣鐘状の核であり、より詳細な実施形態では、釣鐘状の核は、無糸分裂の非対称核分裂を示唆する構造と関連する。
本発明はまた、たとえば、１）望ましくない幹細胞活性を停止させるか、または２）ある種の幹細胞活性を促進することにより血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害を処置する１つまたは複数の作用物質を同定する方法を提供する。たとえば、前記作用物質は、間葉系組織領域からの遊走、創傷治癒障害を異常に引き起こす創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の対称無糸分裂および／または非対称無糸分裂を阻害することにより作用してもよい。
メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）無糸分裂の前記阻害は、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）を非分裂状態に保ち、創傷領域から遊離させることにより達成しても、または術後の再狭窄の場合であれば、創傷治癒障害の異常な増殖に関与するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を死滅させることにより達成してもよい。より詳細な実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）無糸分裂の前記阻害は、創傷治癒障害に関与するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞をすべて死滅させるのに十分な濃度および期間で被検作用物質に曝露することにより達成する。
これらの方法は、血管の創傷治癒障害などの創傷または創傷治癒障害を有する哺乳動物を候補作用物質を用いて処置し、その後、当該組織および創傷を含む単離された組織サンプル中、たとえば、哺乳動物由来の血管壁中に含まれる細胞の核の形態の数および形状を判定するステップを含む。この方法は、候補作用物質で処置した哺乳動物由来の組織サンプル中の細胞の数および核の形態を、創傷治癒障害を有するが、候補作用物質で処置していない哺乳動物由来の単離された組織サンプル中に含まれる細胞と比較するステップをさらに含む。未処置または偽処置哺乳動物の創傷と比較して、創傷治癒障害の領域におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増加の停止、減少もしくは消失、または特定の術後の再狭窄の場合であれば、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の非対称無糸分裂による平滑筋細胞の増加の停止から、有用であると考えられる治療薬が認識されることになる。いくつかの実施形態では、候補作用物質で処置される哺乳動物は、ブタ、イヌ、または齧歯動物などの実験動物であり、より詳細な実施形態では、齧歯動物はラット、マウスまたはモルモットである。ある種の実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）釣鐘状の核は多核シンシチウム内に配置され、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の消失はシンシチウムの破壊、消滅または死に関連する。
別の態様では、本発明は、血管壁障害などの創傷治癒障害を処置する（たとえば、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を調節することにより）１つまたは複数の作用物質を同定するインビトロ法を提供する。この方法は、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、および術後の再狭窄の場合の平滑筋細胞など創傷の組織に通常存在する細胞を含む培養細胞を、１つまたは複数の候補作用物質と、曝露の規定の濃度および期間で接触させ、その後培養細胞の数および核の形態を評価することを含む。候補作用物質と接触していない対照細胞培養と比較してメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖または数に変化があれば、血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害を処置する作用物質の有効性が示される。さらにより詳細な実施形態では、細胞培養に有用と考えられる治療薬の認識には、特定の術後の再狭窄の場合であれば、平滑筋細胞に特徴的である不規則な核を持つ細胞など創傷治癒病態に関連する細胞を生じる非対称無糸分裂の際にメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の活性が停止するようになるのを観察することがさらに含まれる。
別の態様では、本発明は、血管壁障害などの創傷治癒障害を処置する（たとえば、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を調節することにより）１つまたは複数の作用物質を同定するインビトロ法を提供する。この方法は、哺乳動物胎仔由来のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞または腫瘍を含む培養細胞を、１つまたは複数の候補作用物質と、曝露の規定の濃度および期間で接触させ、その後培養細胞の数および核の形態を評価することを含む。候補作用物質と接触していない対照細胞培養と比較してメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖または数に変化があれば、血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害を処置する作用物質の有効性が示される。さらにより詳細な実施形態では、細胞培養に有用と考えられる治療薬の認識には、特定の術後の再狭窄の場合であれば、平滑筋細胞に特徴的である不規則な核を持つ細胞など創傷治癒病態に関連する細胞を生じる非対称無糸分裂の際にメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の活性が停止するようになるのを観察することがさらに含まれる。
本発明のさらなる態様は、間葉系メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を認識し、それらの特徴的な釣鐘状の核を認識しそれらの濃度を高めてそれらを濃縮するか、またはインビトロでの増殖によりそれらの数を増加させ、創傷領域にそれらを播種することにより創傷を処置する方法を提供する。移植療法のための前記メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は、患者、免疫学的に適合するヒトドナー、適合しないヒトドナーまたは非ヒト動物から採取してもよい。移植療法のための前記メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は、幹細胞移植療法に使用する前に培養で増殖させてもよい。
本発明のさらなる態様は、創傷治癒する幹細胞の遊走、対称無糸分裂およびまたは非対称無糸分裂を調節することにより、優れた創傷治癒宿主応答を誘発する被検分子を認識する方法を提供する。
本明細書に記載の本出願人の発明の結果、組織全般の間葉領域からの、術後の再狭窄の場合であれば特に血管の間葉系外膜からのリクルートメントを待っている（たとえば、「待機中」）、リクルートメント（たとえば、遊走）中、さらに創傷治癒（たとえば、増殖）中の創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）（成体幹細胞）を認識、単離および研究する方法が今や利用可能である。
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正常発生および重要な病理学的状態におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の役割を図示する。 釣鐘状の核を持つヒト胎児腎動脈（９週）のシンシチウムの構造（矢印で示す）を示す顕微鏡写真である。図２Ａは、認識可能なクロマチンの「リング」を持つ単一の釣鐘状の核である。図２Ｂは、対称（釣鐘対釣鐘）核分裂である。図２Ｃは、シンシチウムの釣鐘状の核（矢印で示す）、フォイルゲン（紫色）およびフォイルゲン（緑色）蛍光の合成画像である（×２０）。 非シンシチウムの釣鐘状の核（矢印）のヒト胎児腎動脈（９週）を示す顕微鏡写真である。平滑筋細胞に認められる不規則な核を持つ細胞を含む新しい細胞形態が、非対称無糸分裂をしたメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞から生じるのが見られる。 ヒト胎児腎動脈（９週）の顕微鏡写真である図４Ａは、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）釣鐘状の核が血管の内皮細胞に認められるような球状の核を生じる非対称無糸分裂の形態を、このプロセスのイメージ図と共に示す。図４Ｂは、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の正味の数の増殖を示す、２つの釣鐘状のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）核をちょうど生じたメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）釣鐘状の核の対称無糸分裂を示す。図４Ｃは、血管壁内に複数の釣鐘状の核、および様々な形態を有する複数の核膜に包まれた核を持つ紫色にフォイルゲン染色した核（紫色）を示す。図４Ｄは、図４Ｃに示した領域の蛍光画像である。だたし、この場合、釣鐘状の核から生じるまたは血管壁にのみに存在する未知の構造体（おそらく細胞質の糖類）との、フォイルゲンのシッフ塩基反応により発生したと考えられる蛍光（緑色）を除いてある。図４Ｅは図４Ｃおよび４Ｄの画像を組み合わせたものであり、紫色および緑色の両方で蛍光フォイルゲン染色した構造物を示す。 創傷治癒における胎児と同様の管状シンシチウム（ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）（筋管）の外観を示す顕微鏡写真である。図５Ａは、哺乳動物の再生骨格（横紋）筋の筋管（矢印）が顕微鏡下でどのように見えるかを示す顕微鏡写真である。これらの筋管は、胚の筋肉に見られる筋管によく似ている。図５Ｂは、ヒト胎児骨格筋（９週）の筋管（矢印）を示す顕微鏡写真である。図５ＣおよびＤは、筋肉９週のヒト胎児筋管の釣鐘対釣鐘の核分裂を示す顕微鏡写真である。 以下を示す顕微鏡写真である。図６Ａは、正常な非疾患ヒト動脈では（釣鐘状の核を持つ細胞（小児）の割合が約１×１０−４〜１×１０−５と低い）ことを示す顕微鏡写真である。図６Ｂは、非対称核分裂の「幹細胞−平滑筋細胞」（矢印）を示す顕微鏡写真である。図６Ｃ、Ｄは、若年成体ブタ肺動脈で釣鐘状の核（矢印で示す）が稀である（約１×１０−５）ことを示す顕微鏡写真である。 正常な非疾患心臓、および小児心臓（２歳）の機能不全のドナー心臓動脈の一連の顕微鏡写真を示す。図７Ａは、正常心臓におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の割合が約１×１０−５であることを判定するのに使用したサンプルの一例を示す。図７Ｂは、機能不全のドナー心臓のプラークにおけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の割合が約１×１０−４であることを判定するのに使用したサンプルの例を示す。図７Ｃ、ＤおよびＥは、移植心臓の右（および左）室心筋細胞が球菌に汚染されたことを示す顕微鏡写真である。こうした汚染された組織表面におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の割合は、約２×ｉｎ １０−４であることが明らかになった。 心臓移植後に移植後の再狭窄を起こした小児科患者の生検標本の顕微鏡写真である。明るい赤紫色の針状のものは、血管壁に沿って分布するフィブロネクチン繊維上の石灰化構造物であり、このような急速な再狭窄の場合「ギャロッピング（急速に進む）アテローム性動脈硬化症」とも呼ばれる「動脈の硬化」を引き起こす。 移植後の再狭窄を起こした患者の生検標本のフィブロネクチンを示す一対の顕微鏡写真を示す。ここで、図９Ａは、釣鐘状のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）核、および特徴的な不規則な核のセットを持つ平滑筋細胞の核の両方に関連する新生のフィブロネクチン繊維を示す。図９Ｂは、フィブロネクチンの平滑筋細胞の１つの釣鐘状の核、および複数の不規則な形状の核を有する厚いマットを示す。 移植後の再狭窄を起こした患者の生検標本の石灰化を示す一対の顕微鏡写真を示す。図１０Ａは、フィブロネクチン繊維に沿った石灰化を示し、一方、拡大した図１０Ｂでは、一般にプラーク全体に分布する複数の釣鐘状の核が見られる。 移植後の再狭窄を起こした患者の生検標本の顕微鏡写真を示す。釣鐘および他の形状の核を持つ細胞が結合した多くのフィブロネクチンが右側に見られる。左側には、平滑筋細胞の核の形状を含む他の核の形状を持つ細胞を生じる様々な釣鐘状の核が見られ、より高い解像度の引き伸ばし写真は、図４Ａに示した非対称無糸分裂の別の例を示す。 メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の割合が約１×１０−３と推定される再狭窄プラークの釣鐘状の核（矢印）を示す顕微鏡写真である（心臓移植、２歳小児）。 図１２のような平滑筋細胞核を生じる釣鐘状の核の別の例を示す一連の顕微鏡写真である。 再狭窄プラーク（心臓移植、２歳）（図１４Ａ）、胎児腸（５〜７週）（図１４Ｂ）、およびＨＴ２９癌細胞株（図１４Ｃ）におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞核の対の一連の顕微鏡写真である。 移植後の再狭窄を起こした患者の生検標本の一連の顕微鏡写真を示す。図１５Ａは、釣鐘状および他の形状の核に結合したフィブロネクチン繊維を示す。図１５Ｂは、釣鐘状の核が、平滑筋細胞の形態を持つ核（単数または複数）を生じたと思われる、起きたばかりの非対称無糸分裂の結果を示す。図１５Ｃは、平滑筋細胞の２つの核に隣接する２つの釣鐘状の核を示す。図１５Ｄは、左側の釣鐘状のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞核から非対称無糸分裂し、フィブロネクチンが由来するように見えるほぼ球状の核を生じたばかりと思われるものを示す。 移植後の再狭窄を起こした患者の生検標本の顕微鏡写真を示す。２つの釣鐘状のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞核（矢印）が、フィブロネクチン繊維の近傍に平滑筋細胞の核および他の核の不定（ｉｎｄｅｔｅｒｎｉｎａｎｔ）形態と共に見られる。 膀胱ポリープのカテーテル損傷を受けた患者の血管新生および創傷治癒を示す顕微鏡写真である。 生後６ヶ月のヒト小児の皮膚における創傷（ｗｏｕｌｄ）治癒に関与するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含む細胞の顕微鏡写真である。 生後６ヶ月のヒト小児の皮膚の創傷（ｗｏｕｌｄ）治癒に関与する、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含む細胞の顕微鏡写真である。 生後６ヶ月のヒト小児の皮膚の創傷（ｗｏｕｌｄ）治癒に関与する、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含む細胞の顕微鏡写真である。 生後６ヶ月のヒト小児の皮膚の創傷（ｗｏｕｌｄ）治癒に関与する、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含む細胞の顕微鏡写真である。 以下を示す顕微鏡写真である。図２２Ａは、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を含まない正常な肺静脈を示す。図２２Ｂは、多数のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を含む狭窄右肺静脈および左肺静脈を示す。図２２Ｃは、多数のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を含む吻合の融合を示す。 狭窄静脈の非対称核分裂の顕微鏡写真である（平滑筋細胞の非有糸分裂の起源）；核ＤＮＡに対する紫色のフォイルゲン染色。図２３Ｃは、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の非対称無糸分裂から現れた平滑筋細胞核の形状を示す（引き伸ばし写真）。 無糸分裂によりメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞から生じた平滑筋細胞の不規則な核の別の例を含む、左肺静脈および右肺静脈の狭窄部分におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の顕微鏡写真を示す。 平滑筋細胞群およびそれらの「親」メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞群を示す吻合／再狭窄の融合の顕微鏡写真である。 吻合の部位の非有糸分裂の非対称核分裂の顕微鏡写真を示し、特にメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の非対称無糸分裂により生じる平滑筋細胞の不規則な核（紫色）を示す。 狭窄組織の別の例を示す顕微鏡写真である。この図およびすべての図に有糸分裂または無糸分裂により分裂している平滑筋細胞が存在しないことが注目される。 マウス結腸の顕微鏡写真である。図２８Ａは、マウス上行結腸の約２５６細胞の陰窩全体を示す。図２８Ｂは、この陰窩の底部を拡大した部分を示し、離れた支持間質層由来の陰窩底部の釣鐘状のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹核（赤色矢印）および平滑筋細胞の不規則な特徴的な核（青色矢印）を示す。フォイルゲンＤＮＡ染色（紫色）。Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６を参照されたい。 陰窩がない成体マウス上行結腸の支持間質を示す顕微鏡写真である。結腸の上皮部の下にある間葉部であり、青色矢印は平滑筋細胞の核を示し、赤色矢印は釣鐘状の核を持つメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を示す（陰窩−右側の細胞、黒色矢印）。 成体マウス上行結腸の間葉部におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞（赤色矢印）および平滑筋細胞の不規則な核（青色矢印）の×１００顕微鏡写真像である。フォイルゲンＤＮＡ染色。 ４歳小児の正常膀胱の血管におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞（赤色矢印）および平滑筋細胞の紡錘状の核（青色矢印）の×１００マイクロ写真である。フォイルゲンＤＮＡ染色（紫色）。 膀胱組織の顕微鏡写真である。図３２Ａは、４歳小児の正常膀胱の分枝血管を示し、釣鐘状の核を持つメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞（赤色矢印）、不規則な核を持つ平滑筋細胞（青色矢印）および血液細胞（緑色矢印）である。フォイルゲンＤＮＡ染色（紫色）。図３２Ｂは、４歳小児の正常膀胱の内側を覆っている平滑筋細胞を示し、釣鐘状の核を持つメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞（赤色矢印）、不規則な核を持つ平滑筋細胞（青色矢印）である。フォイルゲンＤＮＡ染色（紫色）。 ３歳男児の膀胱ポリープの血管における釣鐘状の核を持つメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞（赤色矢印）および平滑筋細胞の不規則な細長い核（青色矢印）の一対の×１００画像である。
本発明の例示的実施形態について以下に記載する。本明細書に報告される本発明の一部は、１）他の研究者により、成体マウスおよびヒトの結腸および他の臓器の間葉系組織領域において非分裂の休止状態にある成体間葉系幹細胞に関連する数および細胞学的位置における、２）対称および非対称無糸分裂により分裂してヒト胎児の主腎動脈の平滑筋細胞を生じる、および３）致死性の術後の再狭窄を起こした心臓移植患者において対称および非対称無糸分裂により急速に分裂して血管結紮部の近傍にあるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞および平滑筋細胞を生じてそれらの数を増加させる、釣鐘状の核を持つ成体メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の発見に基づく。これらの発見を出願人らの以前の発見と合わせると、組織の間充織（未分化組織、間質、アドヴェンティア（ａｄｖｅｎｔｉａ）など様々に呼ばれる）のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は、創傷治癒と、クローン性疾患アテローム性動脈硬化症および術後の再狭窄の多クローン性の状態における有害な平滑筋細胞の増加など創傷治癒から派生する病理学的状態との幹細胞として働く単純なパラダイムが生まれる。本発明は、たとえば、病理組織学的方法などにより、たとえば再狭窄などの創傷治癒障害の診断および研究の方法を提供する。加えて、本発明は、外膜関連メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖を刺激するか、または阻害する作用物質を同定するインビトロ法およびインビボ法の両方も提供する。
本出願人らは以前に、多くの胎児臓器の発生発育には、各核が凹みのある釣鐘状を有するシンシチウム（多核細胞）および単核細胞からなる幹細胞系譜が関わっていることを発見していた。これらの細胞は、核分裂で有糸分裂を行わないが、染色体凝縮を起こさずに分裂した（「無糸分裂」と呼ばれる分裂方法）。こうした釣鐘状の核の正味の数の増殖は、１つの釣鐘状の核が同一形状の２つの釣鐘状の核を形成し、各々が２倍体のヒト細胞の全ＤＮＡ一揃いを含む対称無糸分裂により達成された。これらの細胞では、胎児の発生における細胞分化に必要なステップは、釣鐘状の核が無糸分裂により分裂して新しい凹みのある釣鐘状の核および核膜に包まれた核を生じる非対称無糸分裂プロセスにより、達成された。これらの核膜に包まれた核を持つ細胞は、その後連続的な有糸分裂により細胞数が増加するため、これらの有糸分裂の細胞型が各組織および臓器の実質細胞の大多数となった。興味深いことに、釣鐘状の核の対称無糸分裂および非対称無糸分裂のどちらも、ゲノムＤＮＡ一揃いは核分裂の前には２倍にならなかったが、このプロセスの間、およびやや後に完了した。釣鐘状の核を持つこれらの細胞は、染色体凝縮および核分裂の数時間前にそのＤＮＡを複製する「真核」細胞の特徴を有していなかったため、新規な細胞クラス、「メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）」と命名された。メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は臓器の発生において有糸分裂の実質細胞と、そして重要なことだが、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞由来の腫瘍との供給源であると特定されたため、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、受精卵と成体動物または植物の分化細胞との間の幹細胞系譜の重要な部分を含む幹細胞であることも特定された。Ｇｏｓｔｊｅｖａ，ｅｔ ａｌ．２００５，２００６，２００９を参照されたい。
器官形成（ｏｒｇａｎｏｇｅｓｉｓ）および発癌における成長および分化プロセスがメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞により引き起こされることが確認されたため、本出願人らは、創傷治癒および関連する組織再生現象のプロセスが存在して、細胞増殖および分化が同時に起こる他の疾患に目を向けた。
本発明は、たとえば再狭窄などの創傷治癒障害の診断方法を提供する。加えて、本発明は、外膜関連メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖を阻害する作用物質を同定するインビトロ法およびインビボ法の両方を提供する。
ヒトでは、受精後４週および５週目に釣鐘状の核を持つメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞が最初に観察され、それらは前駆体有糸分裂胚性幹細胞の別の形態の無糸分裂から生じるように見える。このときメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、初期に発生する臓器全体に放射球状のクラスター状態で非ランダムに分布する多核シンシチウムとして増加する。妊娠１２週目および１２週目頃にシンシチウムは溶解し、すべてのメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）核は、胎児および乳児の発育を通じて器官形成幹細胞に予想されるニッチ、たとえば、結腸陰窩に認められる。単一の単核メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、これらの陰窩の底部の最も低い位置でのみ見られる。臓器の成熟前のある時期、または臓器の成熟時にメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）核は有糸分裂「維持」幹細胞に移行し、これらの細胞は分裂して、ほぼすべての組織で見られる正常な「プログラム」死を起こす組織細胞に置き換わる。Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００９。
本出願人らは、術後の再狭窄の医学的重要性を知っているため、これらの生命を脅かし、死に至ることも多いプロセスを生じる一連の細胞分裂を理解しようと努めた。そのヒト臓器および腫瘍の研究では、比較的少ないメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞がいくつかの異なる種類の真核細胞を生じ、この細胞がその後一連の有糸分裂の二細胞分裂により臓器の大部分を生じる。こうした臓器または腫瘍の増殖速度は、アポトーシスのプロセスによりプログラムされた細胞死を起こした細胞の数で補正した有糸分裂の頻度の差により測定し得る。
しかしながら、術後の再狭窄における平滑筋細胞の増加の過程で、こうした分裂している有糸分裂の平滑筋細胞は観察されなかった。このため、平滑筋細胞の増加の手段は、不明であった。ところが、本出願人らは、対称無糸分裂（メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の正味の数の増殖）と、特に平滑筋細胞に特徴的である不規則な形状の形態で核を生じる非対称無糸分裂とを行う釣鐘状の核を持つ細胞を同定した。図９〜１３、１４Ａ、１５、１６および１７を参照されたい。再狭窄病変のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）無糸分裂により生じる平滑筋核は、すべての発生中の組織およびそれに由来する腫瘍と異なり、それ以上分割しなかったが、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の作用によってのみ増加する、すなわち、それらは、直前のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）前駆体から１細胞ずつ増加するようであった。
平滑筋細胞がメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の非対称無糸分裂により生じるという発見により、術後の再狭窄および他の創傷治癒現象における平滑筋細胞の挙動に関する２つの不可解で矛盾する観察結果が説明された。平滑筋細胞数は一般に、動脈硬化性プラークの場合にはゆっくりと、術後の再狭窄の場合には急速に、どちらの場合も数が増えると報告されているものの、有糸分裂機構あるいは無糸分裂機構による平滑筋細胞の分裂で平滑筋細胞数が増加する報告は存在しない。しかしながら、ヒトまたは実験動物をトリチウム標識チミジンまたはブロモデオキシウリジンなどのＤＮＡに特異的な生化学的前駆体で処置した場合、多くの平滑筋細胞の核がこれらの特異的ＤＮＡ前駆体を安定な形で、すなわちＤＮＡに、取り込むことが観察された。これらの観察結果は多くの科学者により、平滑筋細胞が活発に分裂したと結論するのに使用された。しかしながら、上述のように平滑筋細胞は、本出願人らによる綿密な研究後も有糸分裂または無糸分裂により細胞分裂を起こすことが認められていない。本出願人らの他の知見により今回、この明らかな矛盾を説明することができる。
第１に、平滑筋細胞は平滑筋細胞の分裂からではなくメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞から特異的に生じるという本出願人らの証明により、分裂している平滑筋細胞の観察結果が得られないことが説明される。したがってメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、器官形成および発癌におけるのと同様に創傷治癒においても対称無糸分裂により増加する。第２に、本出願人らは、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞が、原核細胞および真核細胞で用いられるＤＮＡ複製の機序（ＤＮＡの二重らせんが、最初に２つの二本鎖ＤＮＡらせんの形態で複製され、その後２つの娘細胞核に分離される）を用いないことを発見した。代わりに、本出願人らは、２０１１年６月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４９２，７３８号明細書に記載されているように、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞が最初にそのゲノムの２つのパンゲノムコピーを二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二本鎖として生じ、これらのｄｓＲＮＡ／ＤＮＡ複製中間体こそが、再狭窄病変のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の非対称無糸分裂により形成される娘核に分離されることを発見した。分離後、ｄｓＲＮＡ／ＤＮＡは、各娘細胞におけるＲＮＡパンゲノムコピーの分解、およびその後の単一ＤＮＡ鎖のコピーを含むプロセスにより標準的なｄｓＤＮＡらせん形態に変換される。したがって非分裂の平滑筋細胞はその後分裂しなくても、トリチウム標識チミジンもしくはブロモデオキシウリジンまたは他の特異的なＤＮＡ前駆体を取り込むことになる。これらの知見により、ＤＮＡ前駆体が非分裂の平滑筋細胞のＤＮＡゲノムに取り込まれるという逆説が説明される。ＤＮＡ倍加の出現が、その後分裂しなかった細胞内で分離後のＤＮＡコピーにより引き起こされたとき、それをもたらしたのは、平滑筋ゲノムのｄｓＲＮＡ／ＤＮＡ複製中間体の単一ＤＮＡ鎖のコピーである。したがって、術後の急性再狭窄における平滑筋細胞の見かけの「増殖」は、非対称無糸分裂により「１つずつ」非分裂の平滑筋細胞を生じるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖の結果であると教示される。
さらに、成体の複数の臓器、特にヒトおよびマウスの結腸に関する本出願人らの研究から、創傷治癒に備えて「待機する」成体間葉系幹細胞の滞留場所として多くの著者らにより示唆される組織ニッチである、比較的無秩序な間葉系組織の成分または「外膜」に関連する組織の非上皮部分に、非分裂のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞が広く分布することが分かった。メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞に富んだ同様のニッチは、ヒト腫瘍の「未分化状態の塊」、「外膜」、「間充織」または「間質」として認められることもある。こうしたニッチは、釣鐘状の核があるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の非核性「細胞質オルガネラ」に豊富に見られるムチン様物質に本出願人らにより関連付けられた特性である「ムチン様」である認められる場合が多い。
さらに、本出願人らは、多種多様な創傷を治癒する幹細胞移植の分野が、含まれていると仮定される幹細胞の数および同一性について不確定の組織細胞の混合物の単離に依存してきたことを指摘した。メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞形態が体中の間葉系組織領域に分布するという本出願人らの発見により、未同定の幹細胞に「富んだ」間充織抽出物中に豊富に存在する非幹細胞から、希釈または阻害せずに患者の処置に使用される創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を特異的に同定および単離する方法が提供される。
本出願人らは、幹細胞移植療法と、こうしたインビボ療法に必要とされるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖にどの薬剤およびそうした薬剤のどの濃度が効果的であるかを判定することと、術後の再狭窄などの創傷治癒障害に関与するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を殺すのに、どの薬剤およびそうした薬剤のどの濃度が効果的であるかを判定することとには、多くの場合、生メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を増加させ、計数する方法が必要とされることを教示する。
本出願人らは、その特定の形態に基づき単離された間葉系メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の使用に成功すれば、創傷治癒を誘発および促進するのに十分である場合もあるが、療法の成功により多くの幹細胞が必要とされ得る場合もあることを指摘する。そこで、本出願人らは、多くのメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞が治療目的に十分に生じるまで、組織または腫瘍由来のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を実験室での細胞培養で増殖し得ることを教示する。細胞培養に一般に利用される方法を利用できそうであるが、本出願人らは、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞数を容易に増殖できるように自らが設計した、研究室で一般に行われていない細胞培養条件でメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の急速な増殖を観察した。本出願人らは特に、細胞培養基、たとえばＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭのいくつかの基本的な処方のいずれかを使用する一方で、グルコースの代わりにフルクトース（５〜１０ｍＭ）を用い、添加された炭酸水素ナトリウムを完全に取り除いて、それらの処方を改変した。本出願人らが教示するフルクトース（またはガラクトースなど他のグルコース以外の糖類）を含む前記培地は、空気単独の存在下で利用し、一般に行われるように二酸化炭素と混合した空気、たとえば、５％二酸化炭素と９５％空気と混合物の存在下では利用しない。
メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞
メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、つい最近認識されたばかりの目を引く核の形態型、すなわち凹みのある釣鐘状の核を持つ。概説については、Ｇｏｓｔｊｅｖａ ａｎｄ Ｔｈｉｌｌｙ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２：２４３−２５２（２００５）を参照されたい。また、さらに援用する米国特許第７，４２７，５０２号明細書の図１、２、３、６および７およびそれらの説明も参照されたい。これらの細胞はまた、対称（新たな釣鐘状の核を生じる）「無糸分裂」（有糸分裂および関連する染色体凝縮を起こさない分裂）および非対称（非釣鐘状の核を生じる）「無糸分裂」の両方を行う。これらの無糸分裂により、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、発生中の組織、前腫瘍病変および腫瘍の実質に分布する、釣鐘状、葉巻状、縮合した球状、球状、卵状、ソーセージ状、腎臓状、弾丸状、不規則な紡錘状およびこれらの組み合わせなど異形の核の形態型を生じることができる。たとえば、米国特許第７，４２７，５０２号明細書の図１を参照されたい。「メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）」、「メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞」、「メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞」、「創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）」および同種のものは、無糸分裂（対称無糸分裂あるいは非対称無糸分裂のどちらか）により分裂する、凹みのある釣鐘状の核を持つ細胞をいう。
当業者は、本発明により提供される方法を実施すれば、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を容易に同定することができるであろう。たとえば、本明細書で提供されるスクリーニング、診断および処置の方法は、組織サンプル由来または培養細胞中のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を検出するステップを含んでもよい。本発明の方法により可視化される培養細胞または組織サンプル中の細胞は、最大直径約１０ミクロン、２０ミクロン、３０ミクロン、４０ミクロン、５０ミクロン、６０ミクロンまたは７０ミクロンまで、より詳細な実施形態では約５０ミクロンまでを有する核内の核構造物の完全性を実質的に保持するように調製する。細胞を調製する方法は、その教示内容の全体を本明細書に援用する米国特許第７，４２７，５０２号明細書にも記載されている。ある種の実施形態では、調製により約１０〜１５ミクロンの核内の核構造物の完全性が実質的に保持される。たとえば、いくつかの実施形態では 組織サンプルを、少なくとも厚さ約２０ミクロン、３０ミクロン、４０ミクロン、５０ミクロン、６０ミクロン、７０ミクロン、８０ミクロン、９０ミクロン、１００ミクロン、１５０ミクロン、２００ミクロン、２５０ミクロン、３００ミクロン、３５０ミクロン、４００ミクロン、４５０ミクロン、５００ミクロン、７５０ミクロン、１０００ミクロン、１２５０ミクロン、１５００ミクロンまたはより大きなミクロン調製物として解析してもよい。ある種の実施形態では、解析のための調製の際に、たとえば約４５％酢酸を含む溶液中のインキュベーションにより組織サンプルを分解する（ｍａｃｅｒａｔｅｄ）。
いくつかの実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）をさらに検出しやすくするため、培養細胞または組織サンプルを染色してもよい。特定の実施形態では、染色は、たとえば、シッフ塩基試薬、フォイルゲン試薬またはフクシンで染色することを含んでもよい。より詳細な実施形態では、組織サンプルを第２の染色でさらに染色してもよい。さらにより詳細な実施形態では、第２の染色はギムザ染色であってもよい。
ある種の実施形態では、すべてではなく一部のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞をシッフ試薬などの非蛍光染色で処理後、その細胞質の蛍光により検出することができる。たとえば、全部を援用する米国特許出願公開第２０１０／００７５３６６Ａ１号明細書の実施例５、図２０〜２７およびそれらの説明などを参照されたい。本発明では、「創傷治癒障害に関連するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞」、「創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）」および同種のものは、他の臓器および組織、前腫瘍病変および腫瘍の発生において記載したメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の大きなムチン様のバルーン状細胞質に加えて、たとえば、術後の再狭窄、および血管樹の発達など他の正常および病理学的状態における大きなムチン様のバルーン状細胞質を持たないメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含む。たとえば、米国特許出願公開第２０１０／００７５３６６号Ａ１明細書を参照されたい。本出願人らは、平滑筋細胞を生じることにより血管発生および再狭窄に関与するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞のフォイルゲン蛍光が、検出不可能な細胞質のフォイルゲン蛍光を含む細胞質の染色の異なる形態を示すことを具体的に教示する。
いくつかの実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）は、その独特の核の形態型および細胞分裂だけでなく、特定のマーカー遺伝子を検出することによってもさらに特付けを行うことができるが、識別することができない。特定の実施形態では、マーカー遺伝子は、ＣＤ１３３（ｐｒｏｍｉｎｉｎ １；ヒトＧｅｎｅＩＤ ８８４２、最も長いアイソフォームのリファレンスｍＲＮＡおよびタンパク質はそれぞれＮＭ＿００６０１７．２およびＮＰ＿００６００８．１である）およびＣＤ４４（ヒトＧｅｎｅＩＤ ９６０、アイソフォーム１前駆体のリファレンスｍＲＮＡおよびタンパク質配列はそれぞれＮＭ＿０００６１０．３およびＮＰ＿０００６０１．３であるの１つまたは複数を含んでもよい。これらのマーカーの使用は、ヒト腫瘍の最終希釈異種移植アッセイで検出された幹細胞の濃縮に有用であると報告されている。本出願人らは、これらの２つの特定のマーカーが、単核メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞質オルガネラの外面では抗原を認識するが、シンシチウム形態の多核メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）では抗原をまったく認識しないことを教示する。本出願人ら、およびますます多くの他の研究者は、これらの２つの抗原に対する抗体が、細胞培養物およびある種の組織サンプルに広く見られるある種の真核細胞および無定形物質をさらに認識することを教示する。他の実施形態では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞、特に細胞分裂を行うメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を同定する、および／または、さらに特徴付けを行うためのマーカーとして、ＤＮＡポリメラーゼβ（ヒトＧｅｎｅＩＤ ５４２３）、ＤＮＡポリメラーゼζ（ヒトＧｅｎｅＩＤ ５９８０）、およびＲＮＡｓｅＨ１（ヒトＧｅｎｅＩＤ ２４６２４３）などがある。マーカー遺伝子は、核酸（たとえば、ＲＮＡ）またはタンパク質レベルで検出することができる。より詳細な実施形態では、マーカー遺伝子は、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）のバルーン状細胞質の周辺で検出することができる。前述のＧｅｎｅＩＤを使用すれば、公表されているアノテーション付きｍＲＮＡ配列またはタンパク質配列をＮＣＢＩウェブサイトから検索することができる。参照配列およびそれに関連するアノテーションを含む、これらのＧｅｎｅＩＤに関連する情報についてはすべて援用する。他の生物の参照配列も同様にＮＣＢＩウェブサイトからから取得することができる。
メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞はまた、分裂しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を検出することにより、たとえば、無糸分裂の中間体を検出することにより同定および／または定量することもできる。無糸分裂の中間体は、たとえば、核の外部形態（たとえば、対称無糸分裂の場合、分離しつつある積み重なったカップ）を含み、または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むゲノムを含む複製中間体を検出することによる。たとえば、ｓｓＤＮＡは、当該技術分野において標準な技術を用いて検出することができる。ｓｓＤＮＡを含む複製中間体は以前、ＲＮＡを分解処理した後のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）内で同定されている。どちらの公報の教示内容も援用する国際公開第２００８／１５６６２９Ａ２号パンフレット（たとえば、図１１〜１４、１７および１８およびそれらの説明）および国際公開第２００７／０６７７９５号パンフレットを参照されたい。メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）を中間体ｄｓＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ゲノムの存在により同定する別の方法は、２０１１年６月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４９２，７３８号明細書に記載されている。
診断方法
本発明により提供される診断方法は、被検体由来の組織サンプル中のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の存在および／または量および／または遊走を判定して（たとえば、測定して）、被検体の創傷治癒障害を診断することを含む。特定の実施形態では、分裂しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の存在および／または量を判定する。
Ｉ． 障害
「創傷治癒障害」とは、外科的介入後の組織および／または臓器の損傷の修復の際の、感染症（人喰いバクテリア感染症など）からの回復の際の、および／または、急性外傷における、異常な組織発生を特徴とし、異常な組織発生が非癌性かつ非前癌性である疾患または障害である。いくつかの実施形態では、創傷治癒障害は、異常かつ過剰な組織発生を特徴とする。他の実施形態では、創傷治癒障害は、異常かつ不十分な組織発生を特徴とする。例示的な創傷治癒障害には、血管の創傷治癒障害、脊髄の創傷治癒障害、臓器移植に関連する創傷治癒障害、および外傷性損傷に関連する創傷が挙げられる。より詳細な実施形態では、創傷治癒障害は、手術後の障害である。臓器移植（たとえば、心臓、肝臓、肺、角膜など）などの手術、または血管形成術、ステント留置などの外科的介入は、多くの場合、再狭窄（動脈または静脈）を引き起こす。こうした再狭窄は、移植レシピエントの頻度の高い死因である。急性外傷としては、たとえば、熱傷、切り傷および銃創を挙げることができる。本発明は、平滑筋発生が標準的な有糸分裂により起こるのではなく、むしろメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の非対称無糸分裂により起こるという最初の実験的証拠を提供する。したがって、本出願人らは理論に拘泥するわけではないが、再狭窄を含む血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害は、平滑筋発生により起こり、平滑筋細胞は、平滑筋細胞の分裂ではなく、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の非対称無糸分裂により生み出されると考えられる。本出願人らは、通常の創傷治癒障害、および血管の術後の再狭窄とは異なる他の創傷治癒障害には、単核形態および／または多核のシンシチウム形態の創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞由来の真核細胞のその後の有糸分裂が関与し得ることを知っている。
いくつかの実施形態では、創傷治癒障害は単クローン性である、すなわち、この障害は、たとえば、癌およびアテローム形成の場合のように異常かつ過剰な組織増殖を形成する非対称分裂に対する単一メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の直線増殖により起こる。他の実施形態では、創傷治癒障害は多クローン性である、すなわち、この障害は、たとえば、器官形成および再狭窄の場合のように対称分裂および非対称分裂の両方による、２つ以上のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞により起こる障害である。
「血管の創傷治癒障害」は、アテローム性動脈硬化症を除き血管組織の創傷治癒障害である。ある種の実施形態では、血管壁障害は、血管組織、特に内膜など管腔表面の異常かつ過剰な平滑筋発生および／またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の増殖を特徴とする。例示的な血管の創傷治癒障害には、たとえば、損傷により誘発される新生内膜過形成および再狭窄（たとえば、移植、ステント留置、吻合または外傷の後）がある。より詳細な実施形態では、血管壁障害は再狭窄である。いくつかの実施形態では、血管壁障害は手術、感染または急性外傷の後に起こる。より詳細な実施形態では、血管壁障害は術後の障害である。
「再狭窄」とは、典型的には血管形成術、ステント留置または移植などの外科的介入後の内膜表面の肥厚による動脈の再狭小化をいう。
ＩＩ． 被検体および組織サンプル
本発明により提供される方法により診断、スクリーニングまたは処置を受ける被検体としては、脊椎動物などの任意の多細胞動物がある。特定の実施形態では、被検体は、霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシまたはウサギなどの哺乳動物であってもよい。さらにより詳細な実施形態では、被検体は霊長類、たとえばヒトである。
被検体は、任意の発達段階、たとえば、胎児、新生児、乳児、小児、青年、成人または老人であってもよい。特定の実施形態では、被検体は、小児、青年、成人または老人である。さらにより詳細な実施形態では、被検体は、成人または老人である。ある種の実施形態では、被検体は、少なくとも約１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、１０歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、１００歳、１０５歳またはそれ以上、たとえば、約１〜５歳、５〜１０歳、１０〜２０歳、１８〜２５歳、２５〜３５歳、３５〜４５歳、４５〜５５歳、５５〜６５歳、６５〜７５歳、７５〜１１０歳、８０〜１１０歳、９０〜１１０歳、９５〜１１０歳または１００〜１１０歳またはそれ以上であり、さらにより詳細な実施形態では、１００〜１０４歳である。ある種の実施形態では、被検体は死亡している、すなわち、本方法は、死亡後の診断方法である。
いくつかの実施形態では、被検体は創傷治癒障害を有する疑いがある。より詳細な実施形態では、被検体は血管の創傷治癒障害を有する疑いがある。
ある種の実施形態では、被検体は以前手術を受けたことがある。より詳細な実施形態では、手術はステント留置および／またはバルーン血管形成術である。さらにより詳細な実施形態では、被検体は以前、２回以上のステント留置、たとえば、少なくとも２回、３回、４回、５回またはそれ以上のステント留置を受けたことがある。こうした実施形態では、ステントは薬剤溶出性（たとえば、シロリムスまたはパクリタキセル（そのアナログを含む）溶出性；ラパマイシン（そのアナログを含む）溶出性、さらに抗ＣＤ−３４抗体または抗ＶＥＧＦ抗体をコーティングしたステント）でも、非薬剤溶出性でも、またはこれらの組み合わせでもよい。
いくつかの実施形態では、被検体は以前、移植、たとえば、同種移植、自家移植または異種移植を受けたことがある。特定の実施形態では、被検体は、全または部分臓器移植（たとえば、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、皮膚、肺、または角膜の移植）、または弁もしくは血管移植を受けたことがある。移植された血管は動脈および／または静脈のいずれかである。特定の実施形態では、被検体は、手術後の再狭窄を有する疑いがある。
ある種の実施形態では、たとえば、移植、血管形成術またはステント留置などの手術中に、あるいは、生検法において、被検体から組織サンプルを外科的に採取する。組織サンプルは、血液、血管組織、脂肪組織、リンパ組織、結合組織（たとえば、筋膜、靭帯、腱）、外膜、漿膜、腱膜、内分泌組織、粘膜組織、肝臓、肺、腎臓、脾臓、胃、膵臓、結腸、小腸、膀胱、生殖腺、乳腺組織、中枢神経組織、末梢神経組織、皮膚、平滑筋、心筋または骨格筋などの組織を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組織サンプルは、上記の組織１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くを含んでもよい。より詳細な実施形態では、組織サンプルは、主に１つの組織を含んでもよいし、または主に１つの組織から本質的になってもよく、たとえば、組織サンプルは単一組織の約１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％または１００重量％である。より詳細な実施形態では、組織サンプルは血管組織を含み、さらにより詳細な実施形態では、血管壁組織を含む。いくつかの実施形態では、対象となるサンプルは、血管組織から本質的になる。ある種の実施形態では、血管組織は外膜をさらに含む。より詳細な実施形態では、血管組織は、外膜および血管組織から本質的になる。
本発明により提供される方法により解析される組織サンプルは、新鮮な状態（たとえば、任意の固定なし）で解析しても、または物理もしくは化学固定後に解析してもよい。例示的な物理固定は凍結を含む。化学固定は、化学固定がメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を保持するのであれば、アルコール、アルデヒド、有機酸およびこれらの組み合わせを含むものなど、当業者に公知のどのような固定液を使用してもよい。たとえば、特定の実施形態では、化学固定液はメタノールおよび氷酢酸を含み、より詳細な実施形態では、メタノールと氷酢酸約４：１、３：１、２：１、１：１の比でメタノールおよび氷酢酸を含む。
メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を効率的に検出するには、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞に関連する不均一な核の形態型を保持する（たとえば、構造の分解を避けるため患者から単離後すぐに固定化および／または可視化する）と同時に、それらを効率的に可視化する（たとえば、典型的な５ミクロンの組織スライスと比較して比較的厚い組織調製物を用意する）ように、組織サンプルを調製すべきである。当業者であれば、この目的を達成するために米国特許第７，４２７，５０２号明細書（援用する）の実施例１および２の教示内容を容易に適合させることができる。また、Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，５：４，１９１−２００（２００９）；Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：１６−２４（２００６）も参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、被検体から単離して約１分以内、５分以内、１０分以内、１５分以内、２０分以内、２５分以内、３０分以内、４０分以内、５０分以内または６０分以内に本発明の方法により被検体由来の組織サンプルの細胞を可視化するか、または固定する。
ある種の実施形態では、本発明の診断方法または予後診断方法は、平滑筋細胞に特徴的である不規則な核など、特定の非メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を検出するステップをさらに含んでもよく、たとえば、この方法は、平滑筋細胞を検出するステップ、より詳細な実施形態では、平滑筋細胞の数の変化、すなわち、これらの細胞の数の増加または減少を検出するステップをさらに含んでもよい。
スクリーニング方法
本発明は、血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害を処置する作用物質のインビトロおよびインビボの両方のスクリーニング方法を提供する。インビトロ法およびインビボ法ではどちらも、候補作用物質を好適な対照、たとえば、候補作用物質で処置していない培養細胞または哺乳動物と比較して、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の数、増殖している（対称または非対称無糸分裂による）メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の遊走のいずれかを調節するその能力について評価する。候補作用物質は、小分子医薬品または生物製剤、たとえばタンパク質（たとえば、増殖因子、抗体またはアプタマー）、核酸（アンチセンス分子およびアプタマーを含む）、脂質、炭水化物またはこれらの組み合わせを含む任意の化学物質を含んでもよい。作用物質は典型的には、培養物または哺乳動物のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞、特に増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の数および／または分布および／または遊走に対して作用を誘発するような用量または用量範囲で、たとえば、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上投与する
インビトロスクリーニング方法は、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞および筋細胞を含む培養細胞を候補作用物質と接触させることを含む。より詳細な実施形態では、霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシまたはウサギなどの哺乳動物から細胞を採取する。さらにより詳細な実施形態では、細胞をヒトから採取する。ある種の実施形態では、培養細胞を臍帯、外膜、間葉系組織または大動脈弓から採取する。特定の実施形態では、培養細胞は、そのすべてを援用する、図２８〜３０およびそれらの説明を含む米国特許出願公開第２０１０／００７５３６６号Ａ１明細書の実施例６に記載されているようなＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞である。特定の実施形態では、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞および筋細胞を含む培養細胞は、初代細胞である。より詳細な実施形態では、初代細胞を臍帯、血管の外膜または大動脈弓から採取する。
インビボスクリーニング法は、候補作用物質を哺乳動物に投与することを含む。より詳細な実施形態では、哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。さらにより詳細な実施形態では、哺乳動物は非ヒト霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシまたはウサギである。なおさらにより詳細な実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラットまたはモルモットなどの齧歯動物である。さらにより詳細な実施形態では、哺乳動物はモルモットである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は創傷治癒障害を（たとえば、遺伝的にまたは食事もしくは薬剤処置により）発症しやすい。ある種の実施形態では、創傷治癒障害は、外科的介入、たとえば、移植、血管形成術、ステント留置、または化学固定、放射線、過剰な加熱もしくは冷却、梗塞、穿刺、切断または鈍的外傷による直接的、意図的な組織損傷などの外科的侵襲により起こる。より詳細な実施形態では、哺乳動物は創傷治癒障害を発症しやすく、同時に外科的介入を受ける。ある種の実施形態では、創傷治癒障害は血管の創傷治癒障害である。より詳細な実施形態では、血管の創傷治癒障害は再狭窄である。
ある種の実施形態では、本発明のインビトロスクリーニング法またはインビボスクリーニング法は、平滑筋細胞に特徴的である不規則な核など、特定の非メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞を検出するステップをさらに含んでもよく、たとえば、この方法は平滑筋細胞を検出するステップを含んでもよく、より詳細な実施形態では、平滑筋細胞の数の変化、すなわちこれらの細胞の数の増加または減少を検出するステップを含んでもよい。
処置方法
上述のスクリーニング方法は、創傷治癒障害を処置するのに使用できる作用物質を提供する。したがって、本発明はまた、創傷治癒障害を有する被検体を処置する方法も提供する。たとえば、本明細書に記載するような任意の創傷治癒障害の被検体に、たとえば、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を調節する作用物質を有効量で（かつ十分な期間）投与してもよい。たとえば、異常かつ過剰な組織発生を特徴とする創傷治癒障害では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を減少させる作用物質を被検体に投与する。逆に、異常かつ不十分な組織発生を特徴とする創傷治癒障害では、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を増加させる有効量の作用物質を被検体に投与する。
本発明により提供される治療方法に使用できる作用物質は、本発明により提供される方法により同定される作用物質のいずれかを含む。メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を抑制できる、または抑制できるのではないかと思われる他の作用物質は、たとえば、その教示内容を全体を援用する米国特許出願公開第２００９／０３０４６６２号明細書および国際公開第２００８／１５６６２９号パンフレット開示されている。対象作用物質に投与される作用物質は、小分子医薬品または生物製剤、たとえばタンパク質（たとえば、増殖因子、抗体またはアプタマー）、核酸（アンチセンス分子およびアプタマーを含む）、脂質、炭水化物またはこれらの組み合わせを含む任意の化学物質を含んでもよい。特定の実施形態では、本発明は、単離されたメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を投与することにより、異常かつ不十分な組織発生を特徴とする創傷治癒障害の被検体を処置する方法を提供する。
さらに、創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を培養または単離して、それらを組織発生を刺激する／活性化する有効量で直接的または間接的に被検体に投与することにより、不十分な組織発生を特徴とする創傷治癒障害の処置を必要とする被検体の不十分な組織発生を特徴とする創傷治癒障害を処置する方法も本発明に包含される。たとえば、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、凝集した細胞のシートとして培養して、組織発生を必要とする被検体の領域と接触させてもよい。
当業者であれば、上述の方法の細胞の供給源（細胞培養または組織サンプル）がメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含むべきであること理解するであろう。そうした方法は、いくつかの実施形態では、たとえば、本明細書に記載され、過度の実験なしで当業者によりすぐに理解および実行される手段で培養によってメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を単離および／または増殖する１つまたは複数のステップをさらに含んでもよい。
本発明の例示的実施形態の説明を以下に記載する。
例証
以下の例証は、血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害の診断方法、治療方法およびスクリーニング方法を対象とする本発明を裏付ける。例示的な血管の創傷治癒障害は、損傷により誘発される新生内膜過形成および再狭窄を含む。より詳細な実施形態では、血管壁障害は再狭窄である。
材料および方法
本手順は、顕微鏡用スライド上に組織をきちんと展開できる程度に細胞接着を化学的または酵素的に破壊し（分離または分解し）、固定および染色した約３〜５ｍｍ厚の哺乳動物組織切片を使用した［Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．２００９］。組織の展開に固有の歪みがある程度あるが、染色核などの小さな形態学的構造物、および結腸陰窩および血管などのより大きな構造物が観察された。
外科手術時に廃棄される組織を切除から半時間以内、好ましくは１５分以内に用意した［Ｇｏｓｔｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６］。取り除いた組織の上皮層のシート（最大１ｃｍ２）、３〜５ｍｍの再狭窄プラーク組織、および隣接する正常な間葉領域を、解剖時に新たに調製した４℃のカルノア固定液（３：１、エタノール：氷酢酸）に直ちに入れた。固定液の量は組織サンプルの量の少なくとも３倍であった。新鮮な固定液を合計３時間の固定の間に４５分毎に３回交換した。次いでカルノア固定液を４℃の７０％エタノールに交換した。その後サンプルは、４℃〜−２０℃で最大１年保存し得る。
展開およびＤＮＡ染色のため全固定組織サンプルから、約１ｍｍ２の小片を切り取った。各小片を蒸留水中でリンスし、３７℃に予め温めておいた２ｍｌのコラゲナーゼを含む蒸留水溶液（コラゲナーゼ粉末に水を室温で加えた）の入った試験管に入れた。チューブを３７℃の水浴振盪機に約１０分間入れた（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ、１００ｍｇ、Ｃａｌｂｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．，２７３Ｕ／ｍｇ）。コラゲナーゼの組織解離の時間は、以下の通りである：上皮組織が３時間、プラーク組織が４時間、動脈または心筋組織の正常平滑筋組織が最大６時間。次いで、コラゲナーゼ消化した約１ｍｍの切断組織切片を水中でリンスし、２ｍｌチューブ中で１５分間４５％酢酸に浸した。組織展開の手順は、顕微鏡スライド上の４５％酢酸の液滴中で行った。酵素消化した約１ｍｍ２の切片をそれぞれ２等分して、約０．５×１ｍｍの固定分解組織の２つの小片を形成した。各小片を清浄な顕微鏡用スライド上の約５μＬの酢酸に移し、２２×２２ｍｍカバースリップを被せた。カバースリップの辺縁を押さえ、組織サンプルに軽い圧力をかけて、これをスライドの中央に配置した。
２０×位相差対物レンズを用いて、各個別サンプルの展開の質を調べた。良質な組織展開の指標として、全組織展開の辺縁に損傷した核が存在しなった一方、３Ｄ組織構造物（血管、陰窩）は加圧されて基本的に形態学的完全性を保持する単層になった。十分に展開されたサンプルのスライドをそれぞれ直ちにドライアイス表面に置いた。組織サンプルが完全に凍結された２分後、カバースリップの一端の下にカミソリの刃を挿入し、穏やかに持ち上げた。スライドを１時間以上無塵環境で乾燥させた。
フォイルゲン試薬を用いて本明細書で使用するようにシッフ試薬で核を染色するには、顕微鏡スライド上の展開組織の熱酸加水分解を行う必要があった。スライドをコプリンジャーに入れ、予め温めておいた（６０℃）１Ｎの塩酸溶液で８分間覆い、次いで蒸留水中で手早くリンスした。水滴を振り落とし、スライドを無塵環境で３時間乾燥させた。これでスライドは、フォイルゲン染色の準備ができた。
染色手順は室温で行った。スライドをコプリンジャーに入れ、シッフ試薬（Ａｒｔ．９０３３，Ｍｅｒｃｋ）で満たして、核の一部脱プリン化したＤＮＡと反応させた。スライドを染色溶液に１時間浸し、同じコプリンジャー中、２×ＳＳＣ（クエン酸三ナトリウム８．８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１７．５ｇ／Ｌ）で１回は３０秒、もう１回は手早く、２回リンスした。次いでスライドを蒸留水でリンスした。この段階のスライドは、たとえば、定量画像解析による有糸分裂真核細胞の核または凝縮染色体内のフォイルゲンＤＮＡ量の測定など核内のＤＮＡの分布の観察に好適であった（Ｇｒｅｉｌｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｔｅｍｓｃｈ，Ｇｅｎｏｍｅ ４４：８２６−３０（２００１）；Ｈａｒｄｉｅ，Ｇｒｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｈｅｂｅｒｔ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ５０：７３５−４９（２００２））。
間期核の優れた解像度および画像処理を達成するため、一部のスライドをギムザでさらに染色した。２×ＳＳＣでリンスした直後、スライドを１％ギムザ溶液（Ｇｉｅｍｓａ，Ａｒｔ．９２０４，Ｍｅｒｃｋ）に５分浸し、その後最初にセーレンセン緩衝液（リン酸水素二ナトリウム二水和物１１．８７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム９．０７ｇ／Ｌ）で、次いで蒸留水で手早くリンスした。染色の減弱を回避するため旧式の温度計を振るように、スライドから水滴を振り落とした。スライドを無塵環境に置き、室温で１時間乾燥させた。次いでスライドを、キシレンで満たしたコプリンジャーに少なくとも３時間浸して脂肪を除去した。ＤｅＰｅｘ封入剤を用いてスライドにカバースリップを固定し、３時間乾燥させ、この間に高解像度スキャニングの準備ができた。
実施例１：胎児腎動脈のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の可視化
実質的に上記のようなメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を可視化するため、図２〜４に示す組織を調製した。組織は、ヒト胎児腎動脈から採取した。
実施例２：移植後の再狭窄の患者のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞の可視化。
移植を受けて間もない２歳の小児が、拒絶反応を起こし、１ヶ月にわたってびまん性冠状動脈アテローム性動脈硬化症が急速に進行した。小児は、この急速に進行する冠疾患のため心停止を起こした。小児は、心臓が利用可能になるまで６日間緊急心肺バイパス術で安定した。小児の疾患に侵された心臓を摘出し、新しい心臓を移植した。図６および図７は、本被検体から調製した新たに固定した組織の顕微鏡写真を含む。図６Ｃ〜Ｄは、ブタの大血管を示す顕微鏡写真である。
実施例３：血管発生および膀胱のポリープのカテーテル損傷。
図２〜４は、血管発生（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｓｉｓ）を示す。図１７Ｂは、膀胱のポリープの損傷の顕微鏡写真である。
実施例４：生後６ヶ月のヒト小児の皮膚の創傷治癒
図１８〜２１は、生後６ヶ月のヒト小児の皮膚の創傷治癒の顕微鏡写真である。
実施例５：２歳の小児の術後の「ギャロッピング（急速に進む）アテローム性動脈硬化症」、すなわち肺静脈の再狭窄および拒絶反応心臓移植
図６〜１６、１０〜１３および１６〜１８の顕微鏡写真は上記のように作成した。
実施例６：追加の観察結果
図２２以下は、特に、狭窄静脈、吻合の融合および正常な成体マウス結腸の顕微鏡写真を含む。
実施例７：創傷治癒障害を処置する作用物質を同定するためのインビボスクリーニング
動物を、適切な倫理および実験ガイドラインに従い承認された施設に収容する。
処置の前に対照および実験モルモットに血管損傷を施す。実験動物に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で候補作用物質を投与する。対照動物を模擬処置する。１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後または１０日後、動物を屠殺し、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を保持する方法を用いて血管組織および関連する外膜を除去し、組織を固定し、染色することにより、血管損傷を施した領域を組織学的に評価する。対照および実験動物の既に損傷がある血管組織を含む組織サンプルについて、たとえば、損傷血管の内膜表面および関連する外膜に関してメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の総数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の総数、およびメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の位置を評価して、たとえば、損傷血管の外膜から内膜表面へのメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｅ）の遊走に対する作用を判定する。メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の総数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の総数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を減少させる作用物質は、血管の創傷治癒障害などの創傷治癒障害の処置に有効であると予想される。
「約」、「少なくとも」、「未満」および「超」など、本出願のあるパラメーターを説明する数値範囲では、その説明は必ず、記載した各値により限定される任意の範囲も包含することを理解すべきである。したがって、たとえば、少なくとも１、２、３、４または５と記載される場合は、特に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５および４〜５などの各範囲も表現する。
本明細書に引用するすべての特許、公開された出願および参考文献の教示内容は、その全体を援用する。
本発明について、その例示的実施形態を参照しながら詳細に図示して記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱しない範囲で、本発明の形式および細部に様々な変更が可能であるであることを理解しよう。

Claims (70)

  1. メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を調節する１つまたは複数の作用物質を同定するインビトロ法であって、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含む培養組織細胞を１つまたは複数の候補作用物質と接触させること、および前記培養細胞の核の形態を評価することを含み、前記候補作用物質と接触していない対照細胞と比較した、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、または遊走するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数の変化から、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を調節する前記作用物質の有効性が示唆される方法。
  2. 前記培養細胞は、葉巻状の核、弾丸状の核、ソーセージ状の核、腎臓状の核、不規則な紡錘状の核およびこれらの組み合わせなどの核の形態を持つ細胞をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記培養細胞は哺乳動物から採取される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記哺乳動物は創傷治癒障害を有する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記創傷治癒障害は血管の創傷治癒障害である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記培養細胞は初代細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記培養細胞は臍帯、血管の外膜、間葉系組織、大動脈弓、脊髄およびニューロン組織から選択される組織から採取される、請求項１〜６のいずれか１項の方法。
  8. 前記培養細胞は適切な染色条件下で蛍光を発する、請求項２に記載の方法。
  9. 前記培養物は非対称無糸分裂を行うメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記培養物は平滑筋細胞または骨格筋細胞から選択される筋細胞を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記培養物は心筋細胞を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記創傷治癒障害は異常かつ過剰な組織発生を特徴とする多クローン性障害である請求項４または５に記載の方法。
  13. 前記創傷治癒障害は異常かつ不十分な組織発生を特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
  14. 前記方法はメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を増強する作用物質を同定する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記方法はメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を阻害する作用物質を同定する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 創傷治癒障害を処置する１つまたは複数の作用物質を同定する方法であって、
    ａ） 候補作用物質で処置された哺乳動物から単離された組織サンプル中に含まれる細胞の核の形態を判定することを含み、前記組織サンプルは、実質的に約５０ミクロンまでの最大直径を有する核内の核構造物の完全性を保持する方法により調製され；さらに
    ｂ） 前記候補作用物質で処置された前記哺乳動物由来の前記組織サンプル中の前記細胞の前記核の形態を、前記候補作用物質で処置されていない対照哺乳動物から単離された組織サンプル中に含まれる細胞と比較すること
    を含み、
    前記候補作用物質で処置されていない前記対照哺乳動物の前記組織サンプルと比較して前記候補作用物質で処置された前記哺乳動物の
    ｉ）前記組織サンプル中のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数の変化；
    ｉｉ）前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数の変化；または
    ｉｉｉ）前記組織サンプル中のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走の変化
    から、創傷治癒障害を処置する前記作用物質の有効性が示唆される方法。
  17. 前記組織サンプルは、葉巻状の核、弾丸状の核、ソーセージ状の核、腎臓状の核、不規則な紡錘状の核およびこれらの組み合わせなどの異形の核の形態型を持つ細胞をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記哺乳動物はブタである、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記哺乳動物は齧歯動物であり、前記齧歯動物はラット、マウスまたはモルモットである、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記細胞は適切な染色条件下で蛍光を発する、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記創傷治癒障害は血管の創傷治癒障害である、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記創傷治癒障害は異常かつ過剰な組織発生を特徴とする多クローン性障害である、請求項１６に記載の方法。
  23. 前記創傷治癒障害は異常かつ不十分な組織発生を特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  24. 増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数の減少は前記細胞の非対称無糸分裂の減少に関連する、請求項１６に記載の方法。
  25. 前記非対称有糸分裂は、平滑筋細胞に特徴的である不規則な核を含む細胞の産生に関連する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記方法は、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を増加させる１つまたは複数の作用物質を同定する、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記方法は、メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を減少させる１つまたは複数の作用物質を同定する、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞に関連する創傷治癒障害を診断する方法であって、
    ａ） 間葉系組織を含む単離された組織サンプル中の細胞の核を可視化することを含み、前記組織サンプルは実質的に約５０ミクロンまでの最大直径を有する核内の核構造物の完全性を保持する方法により調製され；さらに
    ｂ） 前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の存在および／または非存在を判定すること
    を含み、
    前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の前記存在から、創傷治癒障害が示唆される
    方法。
  29. 前記組織サンプルは血管組織を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記創傷治癒障害は血管の創傷治癒障害である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記血管の創傷治癒障害は、損傷により誘発される新生内膜過形成および再狭窄からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記血管壁障害は再狭窄である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記細胞は物理固定または化学固定される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記組織サンプルは凍結される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記組織サンプルは、アルコール、アルデヒド、有機酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の化学固定剤で処理される、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記固定剤はメタノールおよび酢酸を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記組織サンプル中の前記細胞は、細胞の核分解の前に固定される、請求項１６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記組織サンプルの前記細胞は組織分解（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）および展開により部分的に分離される、請求項１６〜３２または３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記細胞は染色され、それにより核の可視化を可能にする、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. ＤＮＡは染色され、それにより核の可視化を可能にする、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記細胞は単離から３０分以内に固定される、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記組織サンプルは多細胞動物から採取される、請求項１６〜３２または３７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記多細胞動物は脊椎動物である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記脊椎動物は哺乳動物である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記哺乳動物は、霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびウサギからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記哺乳動物はヒトである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記組織サンプルは、葉巻状の核、弾丸状の核、ソーセージ状の核、腎臓状の核、不規則な紡錘状の核およびこれらの組み合わせなどの異形の核の形態型を持つ細胞をさらに含む、請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記組織サンプルは外膜を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. ｃ） 前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の空間分布および／または数分布を判定すること
    をさらに含み、
    増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の前記空間分布および／または数分布は、前記組織サンプルをさらに特徴付ける
    請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞は、無糸分裂の対称核分裂を示唆する構造と関連する、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は、不規則な紡錘状の核を生じる非対称無糸分裂を行う、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記被検体は死亡している、請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記組織サンプルは血管組織および外膜から本質的になる、請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記組織サンプルは血管組織から本質的になる、請求項４５に記載の方法。
  55. 創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を同定する方法であって、
    ａ） 間葉系組織を含む単離された成体組織サンプル中の細胞の核を可視化することを含み、前記組織サンプルは実質的に約５０ミクロンまでの最大直径を有する核内の核構造物の完全性を保持する方法により調製され；さらに
    ｂ） 前記組織サンプル中のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を同定すること
    を含み、
    前記組織サンプル中の前記メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は創傷治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞である
    方法。
  56. 前記組織サンプルは臓器組織を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記組織サンプルは外膜を含む、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記組織サンプルは血管を含む、請求項５５〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. 前記組織細胞は、葉巻状の核、弾丸状の核、ソーセージ状の核、腎臓状の核、不規則な紡錘状の核およびこれらの組み合わせなどの核の形態を持つ細胞を含む、請求項５５に記載の方法。
  60. 創傷または創傷治癒障害の処置を必要とする被検体の創傷または創傷治癒障害を処置する方法であって、前記被検体におけるメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を調節する有効量の作用物質を前記患者に投与し、それにより前記創傷治癒障害を処置することを含む方法。
  61. 前記創傷治癒障害は異常かつ過剰な組織発生を特徴とする多クローン性障害である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記作用物質は前記被検体のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を減少させる、請求項６０または６１に記載の方法。
  63. 前記作用物質は請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法により同定される、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記創傷治癒障害は異常かつ不十分な組織発生を特徴とする、請求項６０に記載の方法。
  65. 前記作用物質は前記被検体のメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数、増殖しているメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の数またはメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の遊走を増加させる、請求項６０または６４に記載の方法。
  66. 前記作用物質は請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法により同定される、請求項６５に記載の方法。
  67. 異常かつ不十分な組織発生を特徴とする創傷治癒障害の処置を必要とする被検体の異常かつ不十分な組織発生を特徴とする創傷治癒障害を処置する方法であって、有効量の単離されたメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞を前記患者に投与することを含む方法。
  68. 前記単離されたメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は、前記被検体の組織発生を必要とする部位に直接投与される、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞は、前記被検体、または前記被検体の組織発生を必要とする部位への投与前にインビトロまたはエキソビボで培養される、請求項６７または６８に記載の方法。
  70. 創傷または創傷治癒障害を処置するための、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の単離されたメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞。
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