CN110583569B

CN110583569B - 建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法

Info

Publication number: CN110583569B
Application number: CN201910789577.8A
Authority: CN
Inventors: 曾和松; 刘婉君; 王洪杰
Original assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN110583569A

Abstract

本发明涉及动物模型的构建，具体地指一种建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，该方法间断缺氧模拟仓中采用皮下埋泵持续灌注血管紧张素Ⅱ建立小鼠动物模型，本发明的方法建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型，其结合模拟重度OSAS成年患者IHR曲线和利用Ang II诱导的AD小鼠模型，在评估这一新的小鼠模型后，我们能够证明与对照组相比，IH组有更高的AD形成率、更大的最大主动脉直径和更低的累积生存率。这些表型数据与人类的发现一致。因此，我们建立了一个可靠且易于使用的小鼠模型来研究OSAS在AD中的作用。

Description

建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法

技术领域

本发明涉及动物模型的构建，具体地指一种建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法。

背景技术

主动脉夹层(Aortic dissection)是指各种原因导致的主动脉内膜突然撕裂，循环血液进入血管壁中层并导致其分层，随着血流压力驱动，逐渐在主动脉中层内扩展形成夹层。急性起病，突然剧烈胸痛、休克并累及相应的主动脉分支血管导致脏器的急性缺血是该病的特点。在我国随着人口老龄化和饮食结构的改变，AD的发病率在迅速攀升。流行病学发现许多心血管危险因素例如吸烟、男性、年龄、高血压和动脉粥样硬化都与AD的发病密切相关。尽管目前的各种治疗手段不断改进，但是AD的发病率和死亡率依然居高不下，并且如果不进行恰当和及时的治疗，AD死亡率极高。目前临床上对AD缺乏有效的药物干预手段，主要采用外科手术进行血管置换、介入手术进行主动脉腔内支架植入以及两者结合应用，但是手术风险大，费用高，并且远期的复发率和再手术率仍然较高。主动脉夹层的发病机制目前仍不明确。

阻塞性睡眠呼吸暂停(Obstructive sleep apnea,OSA)是一种病因不明的睡眠呼吸疾病，患者在睡眠状态下由于上呼吸道完全或不完全的堵塞引起反复出现的呼吸暂停和低通气，并导致间歇性低氧以及惊醒，进而引发一系列呼吸及心血管系统的病理改变。大量回顾性资料研究分析OSA是高血压，心衰，心律失常等一系列的心血管病变的重要发病因素，不仅如此OSA同时还能够参与主动脉疾病的发病及进展。间断缺氧复氧(intermittenthypoxia and re-oxygenation,IHR)是OSA最重要的病理特点之一，而IHR被认为可能是诱发心血管疾病(例如动脉粥样硬化)的重要危险因素，不仅如此更有研究表明AD患者IHR发生率更高，并且AD与IHR的频率之间独立相关。

动物模型对于明确疾病的病理机制有着至关重要的作用，虽然许多临床研究报道了OSA在AD发生发展中的潜在病理生理作用。但具体的作用机制仍不明确，尤其是动物研究相对缺乏，主要原因是缺乏经典有效的实验小鼠模型。由于OSA是动脉高压、心肌梗死、动脉粥样硬化、心力衰竭、心律失常和中风等心血管疾病(CVD)的独立危险因素，IHR已被广泛应用于OSAS相关CVD的研究。Fletcher EC等人建立于20世纪90年代初的IH大鼠模型，雄性大鼠被置于缺氧室中，每隔30秒接受间歇性缺氧(3-5％的最低环境氧气)，每天7小时，持续35天。此后他们发现OSAS可以长期增加血压和左心室体重比。在另一个大鼠IH模型中，连续14天每天8小时执行40s的缺氧(5％氧气)和20s的常氧(21％氧气)循环。发现OSAS可以增加急性心肌梗死模型的血压和梗死面积。为了更接近地模拟人类OSAS长期慢性化的特点，Cortese R等人分析了中度至重度OSAS成年患者的血氧饱和度记录，并得出了一个更好的小鼠IH曲线，包括90秒6.1％的氧气与常氧(21％的氧气)交替90秒，12小时的光照时间(上午7:00–下午7:00)和夜间12小时，持续20周。在这个新的IH小鼠模型中，发现OSAS在即使没有致动脉粥样硬化环境(即遗传倾向或饮食操作)的情况下，仍会导致CD36(+)巨噬细胞向主动脉壁募集，并引发动脉粥样硬化[26]。我们在进行动物模型的选择时发现许多文献报道的腹主动脉瘤均伴有夹层的发生，并且这种现象均在较早的时间(7天左右)就已经出现，而夹层的发生原理与腹主动脉瘤有着非常密切的关系。AngⅡ(angiotensinⅡ,ANGⅡ)微泵灌注诱导ApoE基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠是目前使用范围最广的一种动脉瘤模型，由于其操作简单并且其致病机制与人更为相似，包括男性疾病发病率更高，高脂血症以及轻微的高血压存在等。AngⅡ同样可以诱导血脂正常小鼠产生动脉瘤，但是成功率就要远远低于血脂异常的小鼠。许多文献报道了提前使用β-氨基丙腈处理后明显提升了小鼠主动脉夹层的发生率。

目前关于主动脉夹层的模型研究不少，包括手术制作、药物刺激等方法，但仍然缺乏经典统一有效的主动脉夹层动物模型，尤其是合并OSA共同研究的更为缺乏，因此间断缺氧下影响主动脉夹层的形成的病理生理研究迫切需要能够模拟更为接近人类主动脉夹层伴OSA病理解剖及病理生理的实验动物模型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，首次公开的AD伴OSA的动物模型为进一步深入应用基础研究与干预治疗研究创造条件。

为了实现上述目的，本发明提供了一种建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，包括以下步骤：

1)使用质量分数为0.1～0.3％的氨基丙腈溶液对8周龄的ApoE^-/-雄性小鼠进行喂养；

2)喂养期间，当小鼠到达第9周龄时候置于间断缺氧培养仓中，模拟阻塞性睡眠呼吸暂停间断缺氧培养4周；其中，间断缺氧培养仓中培养条件如下：

每一次间断性缺氧循环中，有氧条件下氧浓度为20.9％，缺氧条件下氧浓度为6～8％，缺氧持续时间为20s，每小时循环30次，光照时间与夜间时间均为12小时(光照阶段(07:00a.m.–07:00p.m.)和夜间12小时)，

3)当间断缺氧培养第二周且小鼠为11周龄时，停止对小鼠喂养氨基丙腈溶液并从间断缺氧培养仓取出小鼠，将小鼠腹部向下固定在无菌手术操作台上，暴露颈后皮肤，脱毛处理，小心切开4～6mm皮肤，钝性分离皮下组织，制作囊袋；

4)再将血管紧张素II溶液(AngⅡ)注入微泵中，最后将微泵植入囊袋中并缝合伤口；然后将小鼠放入间断缺氧培养仓中，按2500ng/min/kg速度将微泵中血管紧张素II灌注小鼠体内，持续处理14天；得到阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型。

进一步地，所述步骤1)中，氨基丙腈溶液的质量分数为0.1％。

再进一步地，所述步骤2)中，缺氧条件下氧浓度为8％。

再进一步地，所述步骤4)中，微泵使用之前需用在温度为37℃的生理盐水中浸泡激活。

利用B超检测上述得到阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的主动脉病变，实验结束后处死动物，小心分离主动脉周围脂肪及结缔组织，大体观察是否有血栓，直径有无明显的增粗，并留取相关组织样品进行后续检测。主动脉组织切片进行HE染色，观察病理变化(包括双腔结构和壁间血肿等)，并计算模型成功率。

本发明的有益效果在于：

本发明的方法建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型，其结合模拟重度OSAS成年患者IHR曲线和利用Ang II诱导的AD小鼠模型，在评估这一新的小鼠模型后，我们能够证明与对照组相比，IH组有更高的AD形成率、更大的最大主动脉直径和更低的累积生存率。这些表型数据与人类的发现一致。因此，我们建立了一个可靠且易于使用的小鼠模型来研究OSAS在AD中的作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中动物实验流程图；

图2为本发明实施例1小鼠解剖后主动脉大体结构图；

图3为本发明实施例1小鼠主动脉组织病理切片的HE及EVG染色；

图4为本发明实施例1小鼠主动脉夹层发生率、最大主动脉直径、小鼠生存曲线；

图4A为本发明实施例1小鼠主动脉夹层发生率，图4B为本发明实施例1小鼠最大主动脉直径，图4C为本发明实施例1小鼠生存曲线；

图5为本发明实施例1Western bloting及免疫组化染色检测对照组、模型组MMPs及氧化应激等相关蛋白表达情况；

图5A为本发明实施例1用免疫组化染色检测对照组、模型组HIF-1α、MMPs及氧化应激等相关蛋白表达情况,图5B和C为本发明实施例1用Western bloting检测对照组、模型组HIF-1α、MMPs及氧化应激等相关蛋白表达情况。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：

1、实验动物

本项目的所有动物实验方案都按照中国科学院实验动物管理规范和NIH实验动物管理和使用指南的标准。8周龄雄性ApoE缺陷小鼠(ApoE^-/-)48只(购自北大医学部动物中心)，体重约20-24克，置于华中科技大学同济医学院动物中心的26-28℃SPF级动物房，灯光模拟昼夜变化，小鼠标准饲料购自南京华阜康公司，正常饮水喂养。

2、如图1所示的建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，包括以下步骤：

1)使用质量分数为0.1％的氨基丙腈溶液对8周龄的ApoE^-/-雄性小鼠进行喂养；

每一次间断性缺氧循环中，有氧条件下氧浓度为20.9％，缺氧条件下氧浓度为8％，缺氧持续时间为20s，每小时循环30次，光照时间与夜间时间均为12小时(光照阶段(07:00a.m.–07:00p.m.)和夜间12小时)，

3、病理标本的采集及分析

B超检测小鼠主动脉病变，实验结束后处死各组小鼠。在显微镜下用显微镊小心分离小鼠的主动脉，观察是否有夹层形成，拍摄照片并记录。游离主动脉后测量血管直径。留取小鼠血液，尿液和主动脉组织标本以供后续试验检测。血液离心后留取血清-80℃冻存，尿液离心后-80℃冻存。主动脉组织标本取一部分(大约0.5cm)固定于OTC冰冻切片固定液中以备冰冻切片，一部分(大约0.8cm)置于新鲜配置的4％甲醛溶液(福尔马林)中固定、脱水、石蜡包埋后以备石蜡切片，剩下的冻存于-80℃，供后续检测。

4、实验结果

结果发现AngⅡ成功的诱导了小鼠主动脉夹层的形成，主动脉夹层的解剖图片见图2。小鼠主动脉可见明显的形态变化，包括主动脉的明显扩张和血肿形成。经组织切片的组织学HE染色和弹性纤维的EVG染色，可见到明显的夹层表现(图3)。可以明显见到中膜被分成两部分，一部分为完整的真腔结构，还有一部分被分离扩大形成假腔，两部分之间有明显的血栓形成。血管外膜显著增厚，结构松散，主要成分是胶原沉积、炎症细胞浸润以及部分增生的成纤维细胞。而间断缺氧诱导OSA下主动脉夹层的发生率更高，平均最大主动脉直径更大，并且生存率越低(图4)。同时我们用Western bloting及免疫组化染色检测对照组、模型组HIF-1α、MMPs及氧化应激等相关蛋白表达情况,发现在Ang II+IH组HIF-1α、MMPs及氧化应激等相关蛋白表达更高(图5)

实验结论证实了本发明所涉及的间断缺氧诱导OSA伴发主动脉夹层动物模型的建立方法有效。

应当指出，以上所述具体实施方式可以使本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。因此，本领域技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或者等同替换；而一切不脱离本发明的精神和技术实质的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明专利的保护范围当中。

Claims

1.一种建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)使用质量分数为0.1~0.3％的氨基丙腈溶液对8周龄的ApoE^-/-雄性小鼠进行喂养；

每一次间断性缺氧循环中，有氧条件下氧浓度为20.9％，缺氧条件下氧浓度为6~8％，缺氧持续时间为20s，每小时循环30次，光照时间与夜间时间均为12小时；

3)当间断缺氧培养第二周且小鼠为11周龄时，停止对小鼠喂养氨基丙腈溶液并从间断缺氧培养仓取出小鼠，将小鼠腹部向下固定在无菌手术操作台上，暴露颈后皮肤，脱毛处理，小心切开4~6mm皮肤，钝性分离皮下组织，制作囊袋；

4)再将血管紧张素II溶液注入微泵中，最后将微泵植入囊袋中并缝合伤口；然后将小鼠放入间断缺氧培养仓中，按2500ng/（kg∙min）速度将微泵中血管紧张素II溶液灌注小鼠体内，持续处理14天；得到阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型。

2.根据权利要求1所述建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，其特征在于：所述步骤1)中，氨基丙腈溶液的质量分数为0.1％。

3.根据权利要求1所述建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，其特征在于：所述步骤2)中，缺氧条件下氧浓度为8％。

4.根据权利要求1所述建立阻塞性睡眠呼吸暂停伴主动脉夹层小鼠模型的方法，其特征在于：所述步骤4)中，微泵使用之前需在温度为37℃的生理盐水中浸泡激活。