CN107541495A - 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 - Google Patents
一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107541495A CN107541495A CN201610487846.1A CN201610487846A CN107541495A CN 107541495 A CN107541495 A CN 107541495A CN 201610487846 A CN201610487846 A CN 201610487846A CN 107541495 A CN107541495 A CN 107541495A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liver cancer
- cell
- human liver
- cancer cell
- fgf19
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种FGF19过表达的人肝癌细胞系及其应用。该FGF19过表达的人肝癌细胞保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C201663。该人肝癌细胞性状稳定,可稳定多次传代,成瘤率高,潜伏期短,均一性好,为肝癌研究提供了新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。同时其具有接种于裸小鼠体内后成瘤的能力,与传代亲本肿瘤相比较,可用来分析体外、体内药物敏感性,进而建立药物筛选平台,是人肝癌基础研究和临床前期应用的理想细胞。
Description
技术领域
本发明属于细胞领域,特别涉及一种FGF19过表达的人肝癌细胞系及其应用。
背景技术
原发性肝癌是消化道常见恶性肿瘤之一,全世界每年新发肝癌大约100万人,是全球第六位最常见癌症,全球第3位癌症致死原因。原发性肝癌的发病有明显的区域性,我国是该疾病的高发国家,其发病率占全球55%,死亡率占全球45%,目前每年约有32万例肝癌患者死亡。在我国,原发性肝癌在恶性肿瘤发病中居第二位,近年来并有逐渐上升趋势,具有发病率高、死亡率高及治愈率低等特点,多数患者就诊时已是晚期,进展迅速,缺少有效治疗方案,总体预后不佳。
在我国,引起原发性肝癌的原因主要是以下四个因素:1、病毒性肝炎:主要为乙型肝炎病毒(HBV)与丙型肝炎病毒(HCV)引起。其中,我国肝癌病人HBV标记阳性的病人达到85%~90%。2、黄曲霉毒素。3、饮水污染。4、饮酒与吸烟。在上述四个因素中病毒性肝炎是最主要的原因。
原发性肝癌起病多较隐匿,早期一般多无临床症状,或仅有肝病的症状与体征,很难早期发现。一旦出现典型的临床表现,如肝区疼痛,消瘦,黄疸或腹水等,通常已属于中晚期。因此,在初诊的肝癌病人中仅有10%-15%的病人有进行根治性切除手术的机会,而其他绝大部分病人由于肿瘤的大小,部位,数目以及肝脏储备功能的影响,不能耐受手术切除,只能进行介入,射频,放疗和中医等姑息性治疗。
而且肝癌容易发生转移和复发,如大肝癌切除术后5年复发、转移率为60%~80%,小肝癌也有40%~50%。肝癌最早在肝内转移,很容易侵犯门静脉及分支并形成瘤栓,脱落后在肝内引起多发性转移灶;或者通过血行转移, 形成肺转移和淋巴转移。因此,原发性肝癌病人总的预后不佳,迫切需要寻求更加有效的治疗方法。
目前缺少用于肝癌发生机理及抗肝癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的实验材料。而运用临床肿瘤组织直接建立细胞的成功率较低,因此,通过运用临床肿瘤标本先建立动物模型,进而通过原代培养建立的人源肿瘤细胞具有更接近于肿瘤的临床生物学特性,对药物的耐药性及敏感性将具有更好的预测性,是研究肝癌发生分子机制和抗肿瘤药物筛选的理想实验材料。
肝癌中FGF通路的变异近年来收到越来越多的重视。其中FGF19更是被证明可以促进肝癌的生长。靶向FGF19的药物目前已经进入临床。目前FGF19过表达的肝癌细胞有限,尤其亟需来自中国病人的、FGF19过表达的肝癌细胞。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的FGF19过表达的肝癌细胞有限,尤其亟需来自中国病人的FGF19过表达的肝癌细胞的不足,而提供一种新的FGF19过表达的人肝癌细胞系及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种FGF19过表达的人肝癌细胞,其保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C201663。
本发明还提供上述的FGF19过表达的人肝癌细胞的子代细胞。
本发明还提供上述的FGF19过表达的人肝癌细胞的用途,其用于制备在非人类的哺乳动物中产生肝癌肿瘤并过表达FGF19的试剂。
本发明中,所述的非人类的哺乳动物为本领域常规的非人类的哺乳动物,较佳地为免疫缺陷小鼠。所述的免疫缺陷小鼠为本领域常规的免疫缺陷小鼠。较佳地为改造的免疫缺陷小鼠,如免疫功能重建的免疫缺陷小鼠。更佳地包括Nu/Nu裸小鼠或SCID鼠。所述的肝癌为本领域常规的肝癌,较佳地为低分化或中分化肝细胞癌。
本发明还提供一种上述的FGF19过表达的人肝癌细胞的建立方法,其包括以下的步骤,
1)获得新鲜的临床肝癌手术切除标本,切成20~50mg的小块,皮下穿刺接种哺乳动物;
2)穿刺接种70~90天后,将荷瘤动物处死,取出肿瘤组织,进行癌细胞的原代培养和传代培养。
其中,所述的哺乳动物、所述的肝癌都如上所述。
本发明中,所述的新鲜的临床肝癌手术切除标本较佳地用哺乳动物细胞培养液或生理盐水漂洗后再进行接种。更佳地用新鲜的HBSS缓冲液漂洗,所述HBSS缓冲液含有500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B。
所述的接种的方式可以是皮下穿刺接种或原位接种。对于肝癌较佳地是进行皮下穿刺接种。
所述的原代培养方法可以是常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳地包括以下步骤:将肿瘤组织剪切成小块,置入培养瓶中,于37℃孵箱5%(v/v)CO2条件下培养;次日,将培养瓶慢慢翻转平放,向瓶内加入RPMI-1640培养液静置培养。所述RPMI-1640培养液包含10%(w/w)胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B。待细胞铺展到占培养瓶表面70%满时进行传代培养和纯化。
本发明中,所述的纯化是本领域常规的哺乳动物细胞的纯化方法。较佳地为利用肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,将消化下来的细胞接种于新的培养瓶后静置培养20分钟,由于细胞悬液中的成纤维细胞大部分贴壁生长,从而使细胞悬液中的肿瘤细胞得到了纯化,将上述步骤重复多次,即达到了纯化肿瘤细胞的目的。
本发明中,所述的传代培养方法是本领域常规的哺乳动物细胞的传代培养方法。较佳地,其包括以下步骤:吸弃旧培养液,向瓶中加入新鲜的0.25% (w/w)胰蛋白酶溶液,待细胞脱落后,加入新鲜的RPMI-1640培养液,所述RPMI-1640培养液包含10%(w/w)胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B,仔细吹打,使之脱离瓶壁形成细胞悬液;收集全部细胞,离心,分别接种于新的培养瓶。
本发明还提供一种筛选治疗肝癌的候选药物的方法,其包括以下步骤:将测试化合物施用于动物模型,施用后导致肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肝癌的候选化合物,其中所述的动物模型具有上述的FGF19过表达的人肝癌细胞所导致的肝癌肿瘤。
具体的,本发明的筛选治疗肝癌的候选药物的方法包括以下步骤:
(1)将上述的FGF19过表达的人肝癌细胞或其子代细胞制备成细胞悬液,接种于哺乳动物皮下,进行饲养,获得人肝癌动物模型;
(2)将测试化合物施用于动物模型,施用后导致肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肝癌的候选化合物。
其中,所述的动物模型为本领域常规的动物模型,较佳地为裸小鼠。所述的裸小鼠为本领域常规的裸小鼠,较佳地为Nu/Nu裸小鼠。建立动物模型的方法为本领域常规的方法。较佳地,可采用细胞悬液注射来建立动物模型。在施用步骤中,将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于肝癌荷瘤动物。较佳地,所述方法还包括使用对照的步骤。所述对照为本领域常规的对照,较佳地,为不含所述测试化合物的溶剂施用于肝癌荷瘤动物。
本发明中,上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外,均市售可得。
相比于现有技术,本发明的有益效果如下:本发明的人肝癌细胞性状稳定,可稳定多次传代,并且乙肝病毒标记阳性,为肝癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。具有成瘤性,可以成功制备肝癌动物模 型,所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选。通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较,可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性,进而可以建立体外、体内两个相关联的抗肝癌药物筛选平台。也可用于研究肝癌转移的发病机理、肝癌的耐药机理,进而可以寻找肝癌转移和耐药的特征生物标志物。是人肝癌基础研究和临床前期应用的理想细胞。
生物材料保藏信息
本发明的人肝细胞癌细胞,于2016年4月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址:中国武汉武汉大学邮编430072,保藏编号为CCTCC NO:C201663,培养物名称为人肝癌细胞LIXC-501。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1A~图1C为肝细胞癌人源小鼠模型LIXC-501中FGF19通路过表达的结果。
图2A~图2B为LIXC-501细胞的形态学观察(分别为100×和200×)的结果。
图3A~图3C为LIXC-501细胞的染色体分析的结果。
图4A~图4I为LIXC-501细胞的短片段重复序列(STR)分析结果,其中A~I分别为STR位点Amelogenin、THO1、TPOX、D13S317、vWA、D16S539、D5S818、CSF1PO和D7S820。
图5A~图5E为细胞免疫组化染色(DAB法,200×)的结果,其中A为阴性对照;B为癌胚抗原(CEA);C为甲胎蛋白(AFP);D为角蛋白(CK);E为肝细胞特异性标记物(HEP)。
图6为LIXC-501细胞倍增时间曲线。
图7为LIXC-501细胞生长曲线。
图8为LIXC-501细胞周期分析的结果。
图9A~图9F为体外测试多个抗癌药物对LIXC-501细胞增殖的抑制作用的结果。其中A为索拉非尼,B为多西紫杉醇,C为阿霉素,D为长春花碱,E为5-氟尿嘧啶,F为厄洛替尼。
图10为LIXC-501细胞的成瘤性的结果。
图11A~图11C为LIXC-501细胞在裸小鼠体内成瘤的病理组织切片(100×)。其中A为正常肝组织;B为对应标本移植瘤块;C为LIXC-501细胞接种瘤块。
图12A~图12B为体内测试索拉非尼、FGFR4选择性抑制剂BLU9931对LIXC-501细胞裸小鼠模型的肿瘤生长抑制作用的结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1LIXC-501细胞的制备
A、LIXC-501肝细胞癌人源小鼠模型的制备
(1)、从上海东方医院获得一系列新鲜的临床肝癌切除标本,临床诊断结果为肝癌复发,病理诊断为肝细胞癌,部分为透明细胞亚型。
用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液)漂洗上述标本后,切成20~50mg的小块,皮下穿刺接种于免疫缺陷动物SCID鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司);待成瘤后,即制得肝细胞癌人源小鼠模型,并分别命名。肿瘤继续在体内传代并冻存。
(2)、通过二代测序,对步骤(1)制得的不同的肝细胞癌人源小鼠模型进行了RNA-seq分析[参见ERICA V.TOOD,MICHAEL A.BLACK and NEIL J.GEMMELL(2016)The powerand priomise of RNA-seq in ecology and evolution.Molecular Ecology,25,1224-1241]。结果发现,其中肝细胞癌人源 小鼠模型LIXC-501显示出FGF19通路(包括FGF19和其受体FGFR4)的过表达(参见图1和表1)。其中,肝细胞癌人源小鼠模型LIXC-501对应的临床肝癌切除标本的来源为上海东方医院患者(肝癌复发,男,汉族,中国人,65岁)。
表1 肝细胞癌人源小鼠模型中FGF19通路过表达的结果
B、LIXC-501细胞的制备
由于FGF19通路在肝癌的发病和发展中的重要性,尝试建立LIXC-501细胞,为肝癌药物的研发及机理的研究提供有效的工具。
在肝细胞癌人源小鼠模型LIXC-501对应的临床肝癌切除标本用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液)漂洗后,切成20~50mg的小块,皮下穿刺接种于免疫缺陷动物SCID鼠。接种70~90天后,用过量二氧化碳气体麻醉处死,无菌解剖,取出肿瘤组织,进行癌细胞的原代培养和传代培养。
原代培养:将肿瘤组织剪切成小块,置入培养瓶中,于37℃孵箱5%(v/v)CO2条件下培养。次日,将培养瓶慢慢翻转平放,向瓶内加入RPMI-1640培养液[含有10%(w/w)胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B],静置培养。待细胞铺展到培养瓶表面70%满时进行传代培养和纯化,纯化的方法是将消化下来的细胞接种于新的培养瓶后,在37℃、5%CO2的条件下静置培养20分钟后吸取上清转移到新的培养瓶,重复2-3次,去除成纤维细胞。
传代培养:吸弃旧培养液,向瓶中加入2mL新鲜的0.25%(w/w)胰蛋白酶溶液,观察到细胞质回缩、细胞间隙增大,待细胞脱落后,终止消化, 加入5mL新鲜的RPMI-1640培养液,吹打使之脱离瓶壁形成细胞悬液;少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞,用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面,收集全部细胞,离心,计数,分别接种于新的培养瓶。细胞生长良好,形态较为均一。传代至30代以上。
在本发明中,来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞呈上皮样,主体为扁平不规则多角形,中有圆形核,呈覆层生长,细胞贴壁且彼此紧密相连,生长时呈膜状延展。将该细胞命名为LIXC-501,于2016年4月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:201663,培养物名称为人肝癌细胞LIXC-501。其中,提交保藏的是传代30代后的细胞。
实施例2LIXC-501细胞的生物学特性及应用
本发明采用RPMI1640培养并用差速贴壁法纯化LIXC-501细胞,使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上,细胞性状逐渐稳定,进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定,直至第30-50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证,体外生长的LIXC-501具有典型的上皮样形态,主体为扁平不规则多角形,中有圆形核,呈覆层生长,细胞贴壁且彼此紧密相连,生长时呈膜状移动。遗传学研究证实该细胞异倍体比例约50%,染色体数目和结构畸变严重,符合恶性肿瘤的遗传学特征。该细胞和其来源的临床肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系,可为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性的相关性提供新的试验材料。具体如下:
a.形态学观察
将培养LIXC-501细胞的培养瓶置于倒置显微镜下,在明视野下进行观察,结果见图2。图2可见LIXC-501细胞主体呈扁平不规则多角形,中有圆形核,呈克隆性生长覆层生长,细胞贴壁且彼此紧密相连,生长时呈膜状移动。
b.染色体的鉴定
将培养的LIXC-501细胞37℃细胞培养箱培养12小时后,加入秋水仙 素,使其终浓度为0.2μg/mL,再于37℃孵箱中继续培养过夜。采集分裂中期的细胞,用固定液进行固定,然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上,用Giemsa染色液染色,于显微镜下计数染色体数,结果见图3。图3可见,LIXC-501细胞连续传代后,染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征,染色体众数(M)集中在54~63(图3A,1000×)与107~118(图3B,1000×)之间,分别占28%和26%,存在多数中央及亚中央着丝粒染色体;而裸小鼠的染色体数2n=40,且均为顶端着丝粒(图3C,1000×),据此可与人类染色体相区别。可见该LIXC-501细胞为异倍体,染色体数目和结构畸变十分严重,符合恶性肿瘤的遗传学特征。
c.短片段重复序列(STR)鉴定
短串联重复序列(short tandem repeat,STR)又称为微卫星DNA,是指染色体上,由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对),串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10~60多次,基因片段在400碱基对以下);每个核心单位重复的次数会出现个体差异,从而形成片段长度不同的等位基因。因此,一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的,是个体的基因身份特征,也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
收集新鲜培养的LIXC-501细胞,用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(购自Axygen公司的AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit,货号为AP-MN-MS-GDNA)提取细胞基因组DNA,用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增,对所得产物进行测序,分析包括Amelogenin、THO1、TPOX、D13S317、vWA、D16S539、D5S818、CSF1PO以及D7S820等各个STR位点的序列重复数,其中STR位点的引物序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1~18所示)及拷贝数如表2~4和图4A~4I所示。将上述序列和ATCC,DSMZ等细胞保存库的数据库进行查询对比,未返回相同的遗传图谱,在美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库中,进行STR序列检索,也未发现相同STR检测结果,且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染,由此可以证明其独一无二性。
表2 STR位点的引物序列
表3 STR位点的引物序列及拷贝数
表4 STR位点的数据结果
d.组织来源鉴定
将LIXC-501细胞接种在盖玻片上培养,待细胞伸展后,用4%(v/v) 甲醛固定,进行免疫组化染色(DAB显色法)。
结果参见图5。结果显示,癌胚抗原(CEA)为强阳性,提示其具有很高的恶性程度;甲胎蛋白(AFP)为弱阳性;角蛋白(CK)为强阳性;肝细胞特异性标记物(HEP)为弱阳性。结合来源组织的临床信息和病理诊断结果,判断LIXC-501细胞的组织来源为肝细胞癌。
e.细胞倍增时间
将LIXC-501细胞以2000/孔的密度接种在96孔板中,于37℃培养箱5%(v/v)CO2条件下培养,分别在12小时、24小时、36小时、48小时、72小时和96小时使用CellTiter Glo试剂盒测定(测定方法参见试剂盒说明书)每孔中的活细胞数。其中,倍增时间的计算公式为:倍增时间=Log2/曲线斜率。
结果为图6所示。图6中倍增时间(X)与Log荧光信号(Y)的曲线方程为:Y=0.0096X+4.9604;其中R2=0.9474。由图6所得的公式可知,LIXC-501细胞的群体倍增时间为31.4小时。
f.细胞生长曲线
将LIXC-501细胞以1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔的密度接种在96孔板中,于37℃培养箱5%(v/v)CO2条件下培养,分别在0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天使用MTT法测定每孔的细胞活力。结果如图7所示,图7说明,当细胞接种密度为1000个/孔,第6天到达平台期;当细胞接种密度为2000个/孔,第5天到达平台期;当细胞接种密度为3000、4000个/孔,第4天到达平台期;当细胞接种密度为5000、6000、7000、8000、9000或10000个/孔,第3天到达平台期。
g.细胞周期分布
收集约106个LIXC-501细胞于1.5mL离心管内,离心弃上清。细胞沉淀用1mL保存于-20℃的75%(v/v)乙醇重悬,室温固定1个小时。离心弃上清,加入500μL PI染色液。混匀,室温孵育30分钟。用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测每孔细胞数和每个细胞的总DNA含量(每个细胞的总DNA含量和该细胞的总PI荧光强度呈正比);并根据不同细胞周期时,细胞总DNA含量的变化,计算各个细胞周期的细胞总数。检测得到周期分布图如图8所示,各周期分布比例如表5所示。根据细胞增殖指数(PI)公式PI=(G2/M+S)÷(G0/G1+S+G2/M+8N)×100%,计算结果:LIXC-501细胞PI=65.47%%。
表5 LIXC-501细胞周期分布比例
周期 | 比例(%) |
G0/G1 | 34.54% |
S | 15.52% |
G2/M | 49.95% |
h.体外细胞毒实验
体外测定肝细胞癌临床常用化疗药物:索拉非尼、多西紫杉醇、阿霉素、长春花碱、5-氟尿嘧啶或厄洛替尼(其中索拉非尼购自LC LABORATORIES、多西紫杉醇购自Fluka、阿霉素购自Sigma、长春花碱购自Sigma、5-氟尿嘧啶购自Sigma、厄洛替尼购自LCLABORATORIES)的抗增殖作用。将LIXC-501细胞以3000个/孔的密度接种在96孔板中,给不同浓度的药物三天后,用Promega公司的CellTiter Glo试剂盒测定各药物浓度下的细胞活力,经XLFit软件计算IC50(半数抑制浓度)。测定细胞活力的步骤按照试剂盒的说明书进行。其结果如图9和表6~7所示。表6的结果说明索拉非尼、多西紫杉醇、阿霉素、长春花碱对LIXC-501细胞均有较好的抑制效果。表7的结果说明索拉非尼、多西紫杉醇、阿霉素、长春花碱对于LIX-C501细胞的IC50均小于10μM,其中多西紫杉醇、长春花碱对于细胞LIX-C501细胞的IC50均小于0.032μM,抑制效果最好。
表6 体外测试多个抗癌药物对LIXC-501细胞增殖的抑制作用
表7 各种药物对LIXC-501的半数抑制浓度(IC50)
药物名称 | 索拉非尼 | 多西紫杉醇 | 阿霉素 | 长春花碱 | 5-氟尿嘧啶 | 厄洛替尼 |
IC50 | 6.343 | <0.032 | 0.201 | <0.032 | >200 | >200 |
i.细胞的成瘤性
体外培养和收集LIXC-501细胞,皮下接种NU/NU裸小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),以细胞悬液和Matrigel基质胶以体积比1:1混合,每只动物接种2.0×106个细胞,接种5只动物,双侧接种,N=10,每周调查动物体重和肿瘤大小。接种约1周后,肿瘤开始形成并生长,成瘤率高达90%以上。绘制肿瘤生长曲线,其中公式肿瘤体积(mm3)=长径(mm)×宽径(mm)2×0.5(见图10和表8)。可见LIXC-501细胞能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤并生长均一快速,具有高致瘤性。
表8 接种LIXC-501细胞后的肿瘤体积
接种后天数 | 22 | 29 | 34 | 41 | 48 | 22 |
肿瘤体积(mm3) | 69.52 | 95.02 | 204.82 | 353.63 | 494.89 | 69.52 |
j.肿瘤的病理学鉴定
将正常的肝组织(来源于上海东方医院)、实施例1制得的肝细胞癌人源小鼠模型LIXC-501中形成的肿瘤和上述i步骤中LIXC-501细胞在裸小鼠皮下接种25天后形成的肿瘤,分别固定后石蜡包埋,制备切片并进行H&E染色。结果如图11和表9所示,其病理诊断结果为肝:低中分化肝细胞癌。
表9 各标本的病理诊断结果
k.LIXC-501移植瘤体内药效学实验
体外培养和收集LIXC-501细胞,皮下接种NU/NU裸小鼠(细胞悬液和Matrigel以1:1混合,每只动物接种5.0×106个细胞。每周调查动物体重和肿瘤大小。当肿瘤体积达到100-150mm3时进行随机分组,30只动物随机分为3组:组A给予60mg/kg的索拉非尼,给药量为0.1mL/10g体重,灌胃给药,每天给药一次;组B给予300mg/kg体重的BLU-9931(购自MedChemExpress),给药量0.1mL/10g体重,灌胃给药,每天给药二次;组C设为对照,给予生理盐水,给药量0.1mL/10g体重,灌胃给药,每天一次。
根据公式肿瘤体积(mm3)=长径(mm)×宽径(mm)2×0.5,计算肿瘤体积(结果见图12A和表10)。结果说明,对照组(组C)的肿瘤生长最快,而索拉非尼和BLU-9931分别对组A和组B的肿瘤生长有显著的抑制作用。
表10 肿瘤生长情况
用公式TGI%评价药物治疗效果:TGI%=[1-(T-T0)/(C-C0)]×100%。其中,T为给药组肿瘤体积,T0为D0天给药组肿瘤体积;C为对照组肿瘤体积,C0为D0天对照组肿瘤体积(结果见图12B和表11)。结果表明经过二十八天给药后,体内用索拉非尼、BLU-9931进行治疗,能够显著抑制LIXC-501肿瘤的体内生长,可见LIXC-501细胞在体内表现出显著对FGF19 通路特异药物的敏感性。
表11 肿瘤生长抑制率情况
应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种FGF19过表达的人肝癌细胞,其特征在于,其保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C201663。
2.如权利要求1所述的人肝癌细胞的子代细胞。
3.如权利要求1或2所述的人肝癌细胞的用途,其特征在于,用于制备在非人类的哺乳动物中产生肝癌肿瘤并过表达FGF19的试剂。
4.如权利要求3所述的人肝癌细胞的用途,其特征在于,所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠。
5.如权利要求4所述的人肝癌细胞的用途,其特征在于,所述的免疫缺陷小鼠为免疫功能重建的免疫缺陷小鼠。
6.如权利要求4所述的人肝癌细胞的用途,其特征在于,所述的免疫缺陷小鼠包括裸小鼠或SCID鼠。
7.一种如权利要求1或2所述的人肝癌细胞的建立方法,其特征在于,包括以下步骤,
1)获得新鲜的临床肝癌手术切除标本,切成20~50mg的小块,皮下穿刺接种哺乳动物;
2)穿刺接种70~90天后,将荷瘤动物处死,取出肿瘤组织,进行癌细胞的原代培养和传代培养。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,进行所述皮下穿刺接种前,所述的新鲜的临床人肝癌切除标本用HBSS缓冲液漂洗,所述的HBSS缓冲液包括500U/ml的青霉素G、500μg/ml的硫酸链霉素和1.25μg/ml的两性霉素B。
9.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的原代培养方法包括以下步骤:将肿瘤组织剪切成小块,置入培养瓶中,于37℃孵箱下培养;次日,将培养瓶慢慢翻转平放,向瓶内加入RPMI-1640培养液,所述RPMI-1640培养液包含10%胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B,静置培养;待细胞铺展到占培养瓶表面70%满时进行传代培养和纯化;
所述传代培养包括以下步骤:吸弃旧培养液,向瓶中加入新鲜的0.25%胰蛋白酶溶液,待细胞脱落后,加入新鲜的RPMI-1640培养液,所述RPMI-1640培养液包含10%胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B,所述百分比为质量百分比;所述纯化的方法为差速贴壁。
10.一种筛选治疗肝癌的候选药物的方法,其特征在于,其包括以下步骤:将测试化合物施用于动物模型,施用后导致肝癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肝癌的候选化合物,其中所述的动物模型具有权利要求1或2所述的人肝癌细胞所导致的肝癌肿瘤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610487846.1A CN107541495B (zh) | 2016-06-28 | 2016-06-28 | 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610487846.1A CN107541495B (zh) | 2016-06-28 | 2016-06-28 | 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107541495A true CN107541495A (zh) | 2018-01-05 |
CN107541495B CN107541495B (zh) | 2022-04-26 |
Family
ID=60962448
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610487846.1A Active CN107541495B (zh) | 2016-06-28 | 2016-06-28 | 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107541495B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109722480A (zh) * | 2018-05-17 | 2019-05-07 | 上海交通大学 | 一种非小细胞肺癌检测试剂盒及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105492009A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-04-13 | 安斯泰来制药株式会社 | 以嘧啶化合物为有效成分的医药组合物 |
-
2016
- 2016-06-28 CN CN201610487846.1A patent/CN107541495B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105492009A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-04-13 | 安斯泰来制药株式会社 | 以嘧啶化合物为有效成分的医药组合物 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109722480A (zh) * | 2018-05-17 | 2019-05-07 | 上海交通大学 | 一种非小细胞肺癌检测试剂盒及其应用 |
CN109722480B (zh) * | 2018-05-17 | 2022-04-26 | 上海交通大学 | 一种非小细胞肺癌检测试剂盒及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107541495B (zh) | 2022-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103627673B (zh) | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
CN112080472B (zh) | 一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3d模型的方法 | |
CN102465113B (zh) | 一种人肝癌细胞系及其应用 | |
CN109609460B (zh) | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
CN108504625B (zh) | 一种小鼠成纤维细胞及其用途 | |
CN102250840B (zh) | 一种人胰腺癌细胞系及其应用 | |
CN107988160A (zh) | 人乳腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途 | |
CN107217039A (zh) | 肿瘤组织3d培养方法及培养液 | |
CN102719403B (zh) | 一种人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和应用 | |
CN106367393B (zh) | 小鼠前列腺癌循环肿瘤细胞系及前列腺癌循环肿瘤细胞分离和培养方法 | |
Drewinko et al. | Further biologic characteristics of a human carcinoembryonic antigen-producing colon carcinoma cell line | |
CN107541494A (zh) | 一种人胆管癌细胞系及其应用 | |
CN114908039A (zh) | 胃癌类器官的培养基及其无支架培养方法 | |
CN102329775B (zh) | 一种对吉西他滨耐药的人胰腺癌细胞系及其应用 | |
CN110106150A (zh) | 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用 | |
CN109825587B (zh) | 一种胶质瘤预后标志物cpvl及其应用 | |
CN104745530A (zh) | 一种人肝细胞癌细胞系及其建立方法和应用 | |
CN102067828A (zh) | 人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测 | |
CN105255832A (zh) | 一种人胆管癌细胞系及其应用 | |
CN102732484B (zh) | 一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系建立方法 | |
CN107541495A (zh) | 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用 | |
CN105062973B (zh) | 一株携带tp53突变的hpv阴性阴茎鳞癌细胞系及其用途 | |
CN110438081B (zh) | 人套细胞淋巴瘤恶性克隆细胞株及其建立方法和应用 | |
CN104403996B (zh) | 一种具有5-氟尿嘧啶耐药性的人胃癌细胞系及其建立方法和应用 | |
CN110172448A (zh) | 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R及其子代细胞系 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |