CN102719403B

CN102719403B - 一种人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和应用

Info

Publication number: CN102719403B
Application number: CN201110077923.3A
Authority: CN
Inventors: 秦宵然; 李富; 谢付波; 胡刚; 王科; 闻丹忆; 朱明华; 张陆勇; 江振洲
Original assignee: SHANGHAI RUIZHI CHEMICAL STUDY CO Ltd; China Pharmaceutical University; Shanghai Changhai Hospital
Current assignee: SHANGHAI RUIZHI CHEMICAL STUDY CO Ltd; China Pharmaceutical University; Shanghai Changhai Hospital
Priority date: 2011-03-29
Filing date: 2011-03-29
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2031-03-29
Also published as: CN102719403A

Abstract

本发明提供了一种人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和应用。该人胰腺腺鳞癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC201074。该人胰腺腺鳞癌细胞系可用于在哺乳动物中产生人胰腺腺鳞癌，制备人胰腺腺鳞癌模型，可进一步用于筛选治疗人胰腺腺鳞癌的候选药物。本发明的人胰腺腺鳞癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代。体外传代自第20代至第50代性状保持稳定。本发明的人胰腺腺鳞癌细胞系具有临床上人胰腺腺鳞癌的生物学性状，为胰腺腺鳞癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。

Description

一种人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于细胞系领域，特别涉及一种人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

胰腺腺鳞癌(adenosquamouscarcinoma)又称胰腺黏液表皮样癌(mucoepidermoidcarcinoma)、胰腺棘皮癌(adenoacanthoma)，组织学上肿瘤由导管腺癌成分和鳞状细胞癌成分混合构成，是一种非常少见的胰腺恶性肿瘤，胰腺腺鳞癌占胰腺恶性外分泌肿瘤的3％～4％。胰腺腺鳞癌以老年人为常见。常见的临床体征包括腹痛、体重下降、厌食、乏力、黄疸等，无特异性，与胰腺导管腺癌无法区分。临床比较常见的是肿块与周围脏器粘连在一起，有时会难以分辨病变起源于哪个器官。有时，胰腺本身的病灶较小，周围器官的病灶很大，似乎是其他脏器的肿瘤累及胰腺组织。这种早期发生转移的生长特点，常常给诊断带来误导。

1、起源

胰腺最常见的肿瘤是导管腺癌，而胰腺腺鳞癌是少见类型的胰腺恶性肿瘤。胰腺导管腺癌起源于胰腺的外分泌部(胰腺导管)，但胰腺的鳞癌成分来自哪里并不十分清楚。多数学者接受多能干细胞分化理论，认为腺鳞癌细胞起源于多能干细胞，然后分化、增殖而形成。

2、病理学特征

大体及镜下特点：大多数胰腺腺鳞癌位于胰腺的头部，也可位于胰腺体、尾，甚至占据整个胰腺。在病灶中同时存在胰腺导管腺癌和鳞癌的成分，其中鳞癌生长较快，易发生坏死、囊变，腺癌很少发生坏死，常产生黏液。大体病理：病变切除物为淡棕褐色至淡黄色，通常与正常的胰腺实质界限不清。组织病理学通过HE染色标本作为诊断的标准，肿瘤包括腺上皮细胞和鳞状上皮细胞，前者有导管或腺体结构伴有大量细胞内外粘蛋白；后者是以不规则和浸润性的实性瘤巢或带有明显的细胞边界、细胞间桥、不透亮的嗜伊红染色的胞浆、不同程度的角化现象的多形编织状细胞为特征。

免疫组织化学：大多数腺鳞癌中，CA19-9、CK7、CK19、CEA阳性被认为是代表腺癌的，鳞癌中一般有高分子量CK和p63阳性，常规还做p53、Ki-67等辅助了解肿瘤的基因突变和增值活性等信息。因而可以作为鉴别胰腺腺鳞癌的补充方法。

3、治疗及预后

胰腺腺鳞癌由于发病隐匿，很难早期发现和治疗，往往预后不良。手术治疗(包括胰十二指肠切除、胰体尾切除加周围淋巴结清扫)是胰腺腺鳞癌的主要治疗方法。手术后患者总的生存期大概为5、6个月，超过1年者很少。肝功能衰竭、广泛转移、恶病质是最常见的死亡原因。

目前，有关胰腺腺鳞癌的发生、发展的生物学机制尚不十分清楚，也缺少用于胰腺腺鳞癌发生机理及抗胰腺腺鳞癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的实验材料，通过对ATCC，上海细胞库等国际上大型细胞库搜索，没有发现已经建立好的胰腺腺鳞癌细胞系。运用临床肿瘤组织直接建立细胞系的成功率较低，因此，通过运用临床肿瘤标本先建立动物模型，进而通过原代培养建立的人源肿瘤细胞更接近于肿瘤的临床生物学特性，对于研究胰腺腺鳞癌的发生和发展是个很好的研究工具。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有尚没有建立好并可以购买到的人胰腺腺鳞癌细胞系存在，提供一种新的人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和用途。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人胰腺腺鳞癌细胞系，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201074。

本发明还提供如上所述的人胰腺腺鳞癌细胞系的子代细胞系。

本发明还提供如上所述的人胰腺腺鳞癌细胞系的用途，用于在哺乳动物中产生胰腺腺鳞癌。所述的哺乳动物可以是各种哺乳动物，优选裸小鼠。所述的裸小鼠优选BALC/c裸小鼠。所述的胰腺腺鳞癌优选胰低分化或中分化腺癌。

本发明还提供一种上述人胰腺腺鳞癌细胞系的建立方法，包括以下步骤，

1)获得新鲜的临床胰腺腺鳞癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，接种哺乳动物；

2)接种80～100天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。

其中，所述的哺乳动物、所述的胰腺腺鳞癌都如上所述。

所述的新鲜的临床胰腺腺鳞癌手术切除标本较佳的用哺乳动物细胞培养液或生理盐水漂洗后再进行接种，更佳的用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素B)漂洗。

所述的接种的方式可以是皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种。对于胰腺腺鳞癌较佳的是进行皮下穿刺接种。

所述的原代培养方法可以是常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳的包括以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37℃孵箱体积百分比5％CO₂条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入DMEM/F12培养液(含体积百分比5％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，6.7ng/ml亚硒酸钠，5.5μg/ml转铁蛋白，2μg/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)，静置培养；

所述的传代培养方法可以是常规哺乳动物细胞的传代培养方法。较佳的包括以下步骤：吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.05g/100ml胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻刮擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶；当细胞传代到第五代以后，将培养液更换为RPMI1640培养液(含体积百分比10％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)。

本发明还提供一种筛选治疗胰腺腺鳞癌的候选药物的方法，包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胰腺腺鳞癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胰腺腺鳞癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上所述的人胰腺腺鳞癌细胞系或其子代细胞系所导致的胰腺腺鳞癌肿瘤。

具体的，本发明的筛选治疗胰腺腺鳞癌的候选药物的方法包括以下步骤：

(1)将所述的胰腺腺鳞癌细胞系或其子代细胞系制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得人胰腺腺鳞癌动物模型；

(2)将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胰腺腺鳞癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胰腺腺鳞癌的候选化合物。

其中，所述的动物模型优选裸小鼠。所述的裸鼠优选BALB/C裸小鼠。较佳的可采用细胞悬液注射来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于胰腺腺鳞癌荷瘤动物。较佳的使用对照实验，一种优选的方式是：同时还使用不含测试化合物的溶剂施用于胰腺腺鳞癌荷瘤动物作为对照。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明的人胰腺腺鳞癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，为胰腺腺鳞癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。本发明的细胞系具有高度成瘤性，可以成功制备胰腺腺鳞癌动物模型，所制的得动物模型可以用于基础研究及药物筛选。通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的抗胰腺胰腺腺鳞癌药物筛选平台。也可用于研究胰腺腺鳞癌转移的发病机理，进而可以寻找胰腺腺鳞癌转移特征生物标志物，是人胰腺腺鳞癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。

生物材料的保藏

本发明的人胰腺腺鳞癌细胞系，于2010年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，培养物名称为人源胰腺癌细胞PAXC-010，保藏编号为CCTCCNO：C201074。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1.PAXC-010细胞的形态学观察(100×)。

图2.PAXC-010细胞的染色体分析。A.PAXC-010细胞；B.小鼠细胞染色体(参照)。

图3.PAXC-010细胞的短片段重复序列(STR)分析结果。

图4.PAXC-010细胞免疫组化染色(DAB法)：A.细胞角蛋白Cytokeratin(200×)；B.CA19-9(200×)；C.癌胚抗原CEA(200×)。

图5.PAXC-010细胞倍增时间曲线。

图6.PAXC-010细胞周期分析。

图7.体外测试PAXC-010细胞和MIApaca-2细胞对吉西他滨的反应性。

图8.PAXC-010细胞的成瘤性。A.PAXC-010细胞在裸小鼠体内生长曲线(肿瘤体积)；B.实验终点时肿瘤重量。

图9.肿瘤的病理组织切片。A.临床上取得的肿瘤标本(100×)；B.裸小鼠体内亲本肿瘤(100×)；C.PAXC-010细胞在裸小鼠体内成瘤(100×)。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1PAXC-010细胞的制备

裸小鼠：5只裸小鼠，雌性，体重20.0±2.0g，鼠龄5周，饲养于SPF环境。裸小鼠由上海斯莱克实验动物技术有限公司提供。

从上海市长海医院获得新鲜的临床胰腺腺鳞癌切除标本(女，56岁，病理诊断结果为：低分化胰腺腺鳞癌)，立即浸入预冷的无菌HBSS缓冲液中(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素B)。在生物安全柜中，用新鲜的无菌HBSS缓冲液冲洗标本，切成20～50mg的小块，穿刺接种裸小鼠腋背部皮下。动物接种后，健康状态良好，行为正常。接种40天后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结节于接种50天后开始生长明显，至接种后80天时，肿瘤体积超过300mm³。

原代培养：皮下穿刺接种人胰腺腺鳞癌80～100天后，将荷瘤裸小鼠用过量二氧化碳气体麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下：用HBSS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.25μg/ml两性霉素B)漂洗肿瘤组织快3次，去除结缔组织和坏死组织；用无菌手术刀片将肿瘤组织剪切成约1mm³小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱5％CO₂条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入10mlDMEM/F12培养液(含5％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，6.7ng/ml亚硒酸钠，5.5μg/ml转铁蛋白，2μg/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。

传代培养：当由组织块中长出的细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下：吸弃旧培养液，向瓶中加入1ml新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，轻轻润洗贴壁细胞层，吸弃，再加入1ml新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，于37℃孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3ml新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，计数，分别接种于新的培养瓶。当细胞传代到第5代以后，将培养液逐步更换为RPMI1640培养液(含10％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素)，细胞生长良好，形态较为均一。传代至50代以上。

在本发明中，来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞呈上皮样，细胞形态较为均一，无接触抑制，初期生长速度较为缓慢；随着传代次数的增加，生长速度逐步加快；将该细胞系命名为PAXC-010，提交保藏，保藏编号为CCTCCNO：C201074。

实施例2PAXC-010细胞的生物学特性及应用

本发明采用含有胎牛血清和胰岛素的RPMI1640培养液培养PAXC-010细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的PAXC-010细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制，呈恶性生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该PAXC-010细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。该PAXC-010细胞和其来源的临床胰腺腺鳞癌肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可以为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性，以及胰腺腺鳞癌的发生、发展、转移和生物标志物提供新的试验材料。具体如下：

a.形态学观察

将培养PAXC-010细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照。结果见图1(100×)，可见，PAXC-010细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁生长部分呈扁平状，以不规则铺路石样为主，符合上皮样细胞的特点。

b.染色体的鉴定

将培养的PAXC-010细胞置于4℃孵育12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为0.4μg/ml，再于37℃孵箱中继续培养10小时。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图2，可见，PAXC-010细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，表现为多倍体，染色体众数(M)集中在76～84之间，占72％，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体(图2A，1000×)；而小鼠细胞的染色体数2n＝40，且均为顶端着丝粒(图2B，1000×)，据此可与人类染色体相区别。可见该PAXC-010细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。

c.短片段重复序列(STR)鉴定

短片段重复序列(shorttandemrepeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。

收集新鲜培养的PAXC-010细胞，用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(购自Axygen公司的AxyPrep^TMMultisourceGenomicDNAMiniprepKit，货号为AP-MN-MS-GDNA)提取细胞基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，计算各个短片段重复序列的重复数。见图3，结果如下，在美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库中，进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果。

d.组织来源鉴定

将PAXC-010细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％甲醛固定，进行免疫组化染色(DAB显色法)。结果显示，细胞角蛋白(Cytokeratin，图4A，200×)和CA19-9(图4B，200×)为强阳性，癌胚抗原(CEA，图4C，200×)为弱阳性，结合病理诊断，该细胞为胰腺腺鳞癌细胞。

e.细胞动力学

将PAXC-010细胞以2000/孔的密度接种在96孔板中，进行培养，分别在12小时、24小时、36小时、48小时、72小时和96小时固定细胞，并进行PI染色，用高内涵细胞筛选仪Acumen测量每孔细胞数。在12小时、24小时、36小时、48小时、72小时和96小时的读值分别为550240μm³、663003μm³、769146μm³、868387μm³、1253083μm³和1894106μm³。细胞动力学研究结果显示，PAXC-010细胞的群体倍增时间为48.49小时(图5)。

f.细胞周期分布

收集约10⁶细胞于1.5ml离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用1毫升-20℃75％乙醇重悬，室温固定1个小时。离心弃上清，加入500微升PI染色液。混匀，室温孵育-30分钟。用流式细胞仪(BDFACSCELIBUR)检测。检测得到周期分布图(图6)和各周期分布比例(下表)。

周期分布	百分比
		总体	100
M1	68.2
		M2	15.02
M3	15.99

g.体外对吉西他滨的反应性

体外测定胰腺癌一线治疗药物吉西他滨对PAXC-010和胰腺癌细胞系MIApaca-2的生长增值作用。将PAXC-010和MIApaca-2细胞分别以3000/孔和6000/孔的密度(接种密度根据生长曲线确定)接种在96孔板中，给药不同浓度的药物六天后，用Promega公司的CellTiterGlo试剂盒测定各药物浓度下的细胞活力。对PAXC-010细胞，吉西他滨在200μM、40μM、8μM、1.6μM、0.32μM和0.064μM时肿瘤抑制率分别为94.71％、93.73％、90.97％、90.13％、87.86％和61.28％。经XLFit软件计算IC₅₀(半数抑制浓度)，发现PAXC-010和MIApaca-2的IC₅₀均小于0.064μM(图7)。而根据文献报道，吉西他滨在体外对胰腺癌细胞株的IC₅₀一般为2到20nM，和本公司在另一株胰腺癌细胞株PAXC003(已申请专利，申请号201010178581.X)上获得结果类似(PAXC-003细胞接种密度为4000/孔，IC₅₀为14.4nM)。

h.细胞的成瘤性

体外培养和收集PAXC-010细胞，皮下接种BALB/C裸小鼠(每只动物接种5.0×10⁶个细胞，细胞悬液和Matrigel以1∶1混合，共接种7只动物)，每周两次调查动物体重和肿瘤大小。接种约5天后，肿瘤开始形成并生长。绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积＝(长×宽×宽)÷2。在第39天结束实验，这时的肿瘤体积为1826.85±237.39mm³(见图8A)，并且安乐死处死动物，肿瘤重量为1.66g±0.63g(见图8B)。可见该PAXC-010细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

i.肿瘤的病理学鉴定

将实施例1的从上海市长海医院获得新鲜的临床胰腺腺鳞癌切除标本、穿刺接种于裸小鼠背部皮下90天后皮下长出的肿瘤、和上述h步骤中PAXC-010细胞在裸小鼠皮下接种20天后形成的肿瘤，进行石蜡包埋切片和H&E染色，结果见图9。它们的病理诊断结果见下表1。可见临床标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤和PAXC-010细胞在裸小鼠体内所成肿瘤的结构类似，形成对应关系。

表1.各肿瘤标本的病理诊断结果

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种人胰腺腺鳞癌细胞系，其特征在于：其保藏编号为CCTCCNO：C201074。

2.如权利要求1所述的人胰腺腺鳞癌细胞系的子代细胞系。

3.如权利要求1所述的人胰腺腺鳞癌细胞系或如权利要求2所述的人胰腺腺鳞癌细胞系的子代细胞系的用途，其特征在于：其用于在哺乳动物中产生胰腺腺鳞癌。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的哺乳动物是裸小鼠。