CN115786262B - 一种人肝门部胆管癌细胞系cbc3t-1及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及人肝门部胆管癌细胞系CBC3T‑1及应用，所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T‑1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2022169，其性状稳定，可稳定多次传代，在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了胆管癌细胞库，可以成功制备胆管癌动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内实验，针对临床抗癌药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料。

Description

一种人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1及应用

技术领域

本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1及应用。

背景技术

胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性程度极高的肿瘤，仅次于肝细胞癌的常见肝脏恶性肿瘤，由于肿瘤的解剖位置不同，可分为肝内胆管癌和肝外胆管癌，肝外胆管癌又可进一步分为肝门部胆管癌以及远端胆管癌。肝门部胆管癌约占所有胆管癌的50％～70％，发生于肝左、肝右胆管交界处，仅20％～30％可获得根治性切除的机会。但是即使根治性切除后，术后复发率仍高达50％～70％，5年生存率为10％～40％。究其原因，一方面是胆管癌起病隐匿，早期诊断困难，大部分患者明确诊断时往往处于疾病的中晚期，失去外科根治性切除的时机；另一方面是胆管癌对目前化疗药物不敏感，疗效较差，导致胆管癌复发率较高。

细胞系是一种有效的体外模型系统，可以用于评估癌细胞的特征，基于它们的特性，使细胞成为原发肿瘤的直接后代。在适当的条件下，癌细胞系保留了原发肿瘤的大部分表型和基因型特性。近50年来，胆管癌细胞系已被用于(i)更好地了解胆管癌特性，(ii)研究治疗方案，(iii)在体外建立疾病模型，以及(iv)建立体内异种移植模型。通过检索发现目前全球共有胆管癌细胞系112株，其中肝内胆管癌细胞系92株，肝外胆管癌细胞系30株，地域主要分布在美国、日本、泰国。国内的研究也主要集中在肝内胆管癌，例如发明专利CN114606194A公开了一株人肝内胆管癌细胞株ICC-X1及其应用，发明专利CN107177551B公开了一种具有高成瘤能力的人肝内胆管癌细胞系及其应用；针对肝门部胆管癌细胞系的专利申请较少，仅有发明专利CN108048401A公开的人胆道癌细胞系及应用，包括：分别命名为人胆囊癌细胞系ZJU-0430、人肝门部胆管癌ZJU-0826和人肝门部胆管癌ZJU-1125，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CCTCC NO:C2017174、CCTCC NO:C2017175和CCTCCNO:C2017176的人胆道癌细胞系。但是，随着癌症的不断变异，细胞系也是需要不断的更新，以便更清楚的研究肝门部胆管癌的发病机制，用药机理等，故本发明提供了一种人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1，分离自肝门部胆管中低分化腺癌，细胞折射性好，细胞生长状态良好，背景清晰，细胞多近圆形或椭圆形，群体倍增时间约为52h。所述人胆管癌细胞系在临床诊断为胆管中低分化腺癌，特征鉴定表型为CK19，Ki67阳性。所述人胆管癌细胞系在支原体检测试剂盒检测时，PCR结果为阴性，未受到支原体污染；所述细胞系增殖、愈合、侵袭、迁移能力较强，可以用于研究肝门部胆管癌的发病机制等。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的人胆管癌细胞系生物多样性低，尤其是细胞系建立成功率低，同时现有细胞系与临床胆管癌的生物学性状相差较大等不足，提供一种新的来源于中国人群的胆管癌细胞系。

本发明提供一种人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1，其于2022年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022169，地址为中国武汉武汉大学，电话为027-68752319。

优选的，所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1分离自肝门部胆管中低分化腺癌。

本发明的第二目的是提供一种所述人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的子代细胞系。

本发明的第三目的是提供所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的应用，所述应用选自：

a)用于研究肝门部胆管癌发生、发展和转移的机理；

b)构建肝门部胆管癌动物模型；

c)筛选或评估治疗肝门部胆管癌的药物；

d)构建耐药细胞模型；

e)构建肝门部胆管癌动物模型的细胞试剂；

f)筛选肝门部胆管癌相关生物标志物或鉴定分子靶点；或

g)研究肝门部胆管癌耐药机制。

本发明的第四目的是提供一种药物的抑制肝门部胆管癌的活性的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将待测药物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的药物为具有抑制胆管癌活性的药物，其中所述的细胞模型是所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1。

本发明的第五目的是提供一种用于研究分析人肝门部胆管癌或用于建立人肝门部胆管癌动物模型的试剂盒，所述的试剂盒中包括容器，以及装于容器中的所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞。

优选的，所述的试剂盒中还包括：细胞培养基。

本发明的第六目的是提供所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的制备方法，包括以下步骤：

(1)标本采集及运输：手术标本离体后半小时内取材，确定肿瘤部位，肿瘤组织取自瘤体增生活跃部分，保存于4℃的DMEM/F-12中，冰上运输至实验室；

(2)标本切割及酶解：通过手术刀及组织剪处理标本为1mm3大小，并加入消化酶消化为单细胞；

(3)原代培养：300g离心5分钟后弃去上清，沉淀组织用PBS重悬并离心，重复三次，然后用含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬细胞，并接种于6孔板中培养；

(4)细胞纯化：对于贴壁细胞通过无菌条件下显微镜直视下刮除杂细胞，PBS洗涤三次，加入新培养基继续培养至长出肉眼可见的细胞团，通过不同细胞对胰酶的反应时间不同来清理杂细胞；

(5)扩大培养：胰酶消化细胞团，离心收集细胞后接种至6孔板，随后依次接种至T25瓶和10cm培养皿中进行正常的传代培养，即得。

本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022169，细胞折射性好，细胞生长状态良好，背景清晰，细胞多近圆形或椭圆形，群体倍增时间约为52h，所述人胆管癌细胞系在临床诊断为胆管中低分化腺癌，特征鉴定表型为CK19，Ki67阳性，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了胆管癌细胞库。

(2)所述人胆管癌细胞系在支原体检测试剂盒检测时，PCR结果为阴性，未受到支原体污染；

(3)所述细胞系增殖、愈合、侵袭、迁移能力较强，可以用于研究肝门部胆管癌的发病机制。

(4)本发明所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1可以成功制备胆管癌动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内实验，针对临床抗癌药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料。

附图说明

图1为人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1显微形态学结果注：A为不同代数的CBC3T-1光学显微镜下的形态学观察，B为CCK-8实验增殖结果，C为活细胞成像增殖曲线，D为活细胞成像图。

图2为人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的鉴定及支原体检测注：表1为短串联重复序列(STR)鉴定结果，A为球体形成的形态学观察以及球体形成HE染色结果，B为代表性单细胞的核型分析，C为CBC3T-1及TFK-1细胞支原体检测结果

图3为人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1功能试验的结果注：A为划痕愈合能力；B为迁移能力检测；C为侵袭能力检测；D为克隆形成的测定其中肝外胆管癌细胞系TFK-1为对照组

图4为体外测试多个胆管癌一线治疗用药对人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的抑制作用注：A为顺铂(Cisplatin)的药物抑制曲线；B为吉西他滨(Gecitabine)的药物抑制曲线；C为奥沙利铂(Oxaliplatin)的药物抑制曲线；D为紫杉醇(Paclitaxel)的药物抑制曲线；E为5-氟尿嘧啶(5-Fu)的药物抑制曲线

图5为人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的成瘤实验结果注：A为瘤子标本；B为；瘤子体积生长曲线；C为小鼠标本；D为小鼠体重增长曲线；E为该细胞系来源的组织与移植瘤的HE和免疫组化结果

具体实施方式

下面参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

实施例1、细胞系的建立

从一例71岁男性患者肝门部胆管中低分化腺癌的组织切除标本中取样，剔除纤维结缔组织和脂肪等组织，用含1％双抗的磷酸缓冲盐溶液清洗3次。

将组织置入无菌培养皿中，用无菌眼科剪充分剪碎至体积约1mm³大小；将剪碎组织块转移至含有胶原酶Ⅳ和中性蛋白酶的混合液中，37℃消化10-30min。待组织块消化为小细胞团时终止消化，将液体收集后置于15ml离心管中，离心(300×g，5min)后弃去上清，用生理盐水洗涤离心(300×g，5min)三次。用含10％FBS+1％双抗的DMEM/F-12重悬沉淀，接种于6孔板中，置入37℃的CO²培养箱培养，至少2天内不要移动六孔板，利于原代肿瘤细胞贴壁；待细胞在皿中长至70-80％时进行传代培养。每日镜下观察，待观察到镜下细胞为卵圆形、片状分布细胞团时，显微镜下无菌刮除周围成纤维细胞，并用生理盐水洗涤3次，加入新的培养基继续培养；不便于刮出成纤维细胞时，通过胰酶消化肿瘤细胞和成纤维细胞待细胞的时间差异进行消化分离，反复清除成纤维细胞后可得到纯净的肿瘤细胞，待团块长至肉眼可见时，胰酶消化液消化细胞传至T25培养瓶中进行扩增。

建系成功后，命名为人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1，于2022年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022169，地址为中国武汉武汉大学，电话为027-68752319。

实施例2、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞镜检

取传代培养的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞，在光学显微镜下观察细胞生长情况。

镜检：如图1A所示，分别为第5代、30代、60代细胞学形态图片，细胞折射性好，细胞生长状态良好，背景清晰，细胞多近圆形或椭圆形，符合胆管癌细胞形态学。

实施例3、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的倍增时间

将培养的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞胰酶消化后，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12培养基中并进行计数，经浓度调整后获得终浓度为6000个/200μl的细胞悬液；将其接种在96孔板中，每孔200μl，每组设4个复孔，另设只加200μl培养基的4复孔作为空白对照；将培养板放入37℃培养箱中培养，于0、24、48、72、96、120h时间点按1：10的比例加入CCK-8液，37℃细胞培养箱孵育2h，随后于450nm处测定吸光值。

结果如图1B所示，其群体倍增时间约为52h，增殖时间较短，适用于胆管癌体外2D模型研究。

实施例4、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞成像

将培养的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞经胰蛋白酶-EDTA消化后，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12培养基中并进行计数，经浓度调整后获得终浓度为4000/200μl的细胞悬液；将其接种在96孔板中，每孔200μl，设3个复孔，将96孔板放入Cytation5细胞成像工作站中，选择每孔拍摄视野，每2小时拍摄一张照片，连续拍摄120小时。

图1C为所绘制的生长曲线，图1C为实时活细胞成像生长曲线图，图1D为选取活细胞实时监测中0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120h的细胞照片，肿瘤细胞出现明显迁移抱团生长趋势，是其作为细胞模型的优势之一。

实施例5、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1HE染色结果

使用胰蛋白酶-EDTA溶液分离贴壁生长人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞。细胞融合度应为80-90％，且状态良好。以800r/5min离心并吸出上清液。将细胞重悬后计数，1X10⁵个/100ul，将细胞以1X10⁵/100ul的浓度接种于Corning超低吸附96孔板，孵育培养物14天。每3-4天添加一半培养体积的新鲜培养基。2周后将细胞和培养基转移到15mL锥形管，采集肿瘤球状体，离心后沉淀用4％多聚甲醛固定。

图2A为选取的第3、7、14天的成球图片以及球体HE染色结果，随着时间推移，圆形球体逐渐增大，显示肿瘤干性特征，适合2D肿瘤模型研究。

实施例6、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的染色体核型分析

向处于指数生长期的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞培养液中加入秋水仙素(终浓度为10ug/ml)作用2h；弃去培养液后用PBS洗涤并用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后将细胞收集于15ml离心管底部；加入已于37℃水浴锅中充分预热的低渗KCl溶液(0.075M)4-5ml，于37℃水浴中孵育30min，以充分膨胀细胞于上述低渗液中直接加入lml新鲜配制的固定液(甲醇：冰醋酸，3：l，V/V)，轻轻吹打均匀，固定5min后离心(2000rpm，10min)，弃上清；再次加入6-8ml新鲜配制的固定液，常温固定30min；将以上标本离心后再加5-6滴固定液，试取1滴，滴在4℃蒸馏水玻片上，在酒精灯火焰上迅速烘烤并吹片；将吹好的玻片表面滴加适量Giemsa工作液染色10-15min，自来水冲洗玻片后自然晾干即得到中期染色体标本。

图2B为人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞代表性单细胞的核型分析，通过G显带，染色体核型分析，细胞系染色体属超3倍体，染色体数目介于69-73条之间，表现为核型异常，基因的突变导致肿瘤的进展，有利于新药的开发。

实施例7、支原体感染情况的检测

对分离出的癌细胞需要同时进行支原体感染情况的检测，本研究采用的是PCR法，利用赛贝生物公司的支原体MycoEasy快速支原体检测试剂盒，步骤如下：

(1)试剂盒组成：

①支原体检测试剂(18μl，3x8联排)

②阳性对照(24μl/次，1支)

③使用说明书1份

(2)样本收集及处理：

收集细胞培养液：将细胞接种后培养2～3天，然后收集500μl培养上清液至1.5ml微量离心管中；13000rpm离心10min；吸取480μl上清弃掉，直接重悬沉淀，瞬时离心后，分别吸取2μl阳性对照和上述待检测上清加入支原体检测试剂中，瞬时离心，支原体试剂即为阴性对照。

(3)第一次PCR反应：

将上述样本、支原体阳性对照样本、支原体阴性样本放入PCR仪，按照如下设置进行PCR实验：

PCR反应及参数设置：将PCR反应管放入PCR仪，按一下参数进行PCR反应：

PCR结束前半小时配置好1％琼脂糖凝胶，配置方法如下(以配100mL液体为例)：1g琼脂糖粉末加入到100mL TAE(1X)中。

溶解混匀后(混悬液)，放入微波炉中加热至沸腾，待琼脂糖粉末完全溶解后，将其拿出，室温放置至50～60℃左右，加入10μL GelRed(EB替代物)，摇匀，倒入插好梳子的胶槽中，静置30min。

完成PCR后，将样品取出，瞬时离心。

上样：按照顺序上述得到的样本加入配好胶的孔中，120V恒压，25min。

取出胶块，使用凝胶成像系统拍照，得出实验结果。

实验结果如图2C所示，出现与阳性对照相同的条带即为支原体阳性样本，所建立的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1以及肝外胆管癌细胞系TFK-1未受支原体污染。

实施例8、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞的STR位点

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)，也称微卫星DNA，是由2-6个碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类DNA序列，由于核心单位重复数目在个体间呈高度变异性并且数量丰富，构成了STR基因座的遗传多态性。它分布于人类整个基因组，平均每15kb就存在一个STR基因座。分布广泛，易于检测，信息量大，是继限制性片段长度多态性(RFLP)之后的第二代遗传记。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。

收集新鲜培养的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞，使用Tsingke的动物基因组抽提试剂盒(货号TSP201-200)提取细胞的基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，分析包括D19S433，THO1，TPOX，D13S317，vWA，D16S539，D5S818，AMEL以及FGA等各个STR位点的序列重复数。

其中STR位点的引物序列如表1所示。上述序列和ATCC，DSMZ和CELLOSAURUS保存库的数据库进行查询对比，未返回相同的遗传图谱，在美国典型培养物保藏中心(CATCC)数据库中进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果。由此可以证明其独一无二性，且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染。

表1 STR位点

实施例9、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞愈合能力

将培养的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1和人肝外胆管癌细胞系TFK-1细胞经胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基中和，转移至离心管后离心(800r/5min)，后重悬于不含血清的DMEM/F-12培养基中。经自动细胞计数仪计数，经浓度调整后获得终浓度为1×10⁶/ml的细胞悬液，取2ml细胞混悬液接种至六孔板中，培养24h后，用200μl枪头在六孔板中垂直画出十字，并用PBS清洗3次，最后加入含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基培养，于12h、24h后在光学显微镜下拍照观察。

结果如图3A所示，人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞愈合能力明显强于人肝外胆管癌细胞系TFK-1细胞，在24小时几乎完全愈合，在胆管癌体外研究中具有明显优势。

实施例10、人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞的迁移、侵袭能力

将培养的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞和TFK-1细胞经胰酶消化后，分别用含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基和1640培养基中和，转移至离心管后离心(800r/5min)，用无菌PBS重悬并离心三次，最后分别重悬于不含血清的DMEM/F-12培养基和1640培养基中。经自动细胞计数仪计数，经浓度调整后获得终浓度为5×10⁵/ml的细胞悬液；检测细胞的迁移能力时，将200ul细胞悬液铺至未铺基质胶的transwell上层小室中；检测细胞的侵袭能力时，将200ul细胞悬液铺至铺好基质胶的transwell上层小室中。将上层小室分别放入装有含15％胎牛血清DMEM/F-12培养基和1640培养基的24孔板中，置于细胞培养箱。分别培养24h、48h后，取出上层小室，置于4％多聚甲醛中固定20min，然后用棉签擦去小室上层未穿过transwell膜的细胞。用0.1％结晶紫溶液染色20min后，用PBS清洗干净，然后置于倒置显微镜下观察并拍摄。

如图3B、C所示，人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞的迁移、侵袭能力于24h和48h均强于TFK-1细胞系，恶性程度更高，说明该细胞系在胆管癌体外研究中具有明显优势。

实施例11人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的增殖能力

将培养的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1和人肝外胆管癌细胞系TFK-1细胞经胰酶消化后悬浮于DMEM/F-12培养液中并计数，经浓度调整后获得终浓度为700/2ml的细胞悬液；将以上浓度的细胞悬液接种到6孔板中，每孔2ml，放入培养箱继续培养，毎3天更换一次培养基。2周后，将细胞置于倒置光学显微镜下观察并拍照。后弃去培养基，用PBS洗清洗3次，4％多聚甲醛中固定20min，然后用0.5％结晶紫溶液染色20min，后于清水下清洗干净，然后置于倒置显微镜(ZEISS)下拍摄并计数。

如图3D所示，人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞的克隆形成能力明显强于TFK-1，有利于胆管癌增殖相关研究。

实施例12、胆管癌细胞药物筛选

(1)细胞准备：将培养人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞用胰酶消化后悬浮于DMEM/F-12中培养液中并计数，经浓度调整后获得终浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液；

(2)细胞接种：将以上浓度的细胞悬液分别接种到96孔板中，每孔0.1ml(含10000个细胞)，每组4个复孔，只加培养液不含细胞的孔作为空白对照；待接种细胞培养24h贴壁后对每组分别加入适量的化疗吉西他滨(Gecitabine)、紫杉醇(Paclitaxel)、顺铂(Cisplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)，设置不同浓度药物，放入培养箱中继续培养72h。

(3)CCK-8检测：待细胞加药培养72h后分别对以上每组细胞用CCK-8(1:10稀释，37℃孵化2h)进行活性检测，并记录每组细胞在450nm的吸光度值，利用Graphpad软件绘制曲线并计算IC50值。

结果如图4A-E所示，化疗药物中，奥沙利铂(IC50＝18.84μM)、紫杉醇(IC50＝0.034μM)、5-氟尿嘧啶(IC50＝13.79μM)、顺铂(IC50＝32.86μM)和吉西他滨(IC50＝1.48μM)滨均抑制CBC3T-1细胞，其中紫杉醇对于该细胞最为敏感，其次是吉西他滨，本药物筛选为该胆管癌患者提供临床治疗信息，优先选用吉西他滨联合紫杉醇治疗最为敏感。

实施例13、小鼠皮下成瘤实验

(1)细胞准备：将指数生长期的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞经胰酶消化后离心(800rpm，5min)，细胞沉淀用PBS洗涤离心3次；

(2)将细胞重新悬浮于DMEM/F-12中，计数调整细胞密度为1×10⁷/ml；

(3)将0.2ml的以上细胞悬液(含约2×10⁶个细胞)注射到4周的NOD/SCID小鼠腹股沟部皮下(n＝4)，小鼠饲养于SPF级的层流间内；

(4)观察7周，每5天测量瘤体直径大小；

(5)7周后将小鼠安乐死，取出瘤体测量拍照，取部分瘤体浸泡于10％福尔马林溶液，进行常规石蜡包埋及切片制作，备用。

图5A-D为人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞在无胸腺的小鼠皮下所成瘤体、瘤体生长曲线小鼠大体标本以及小鼠体重曲线，随着时间推移，肿瘤体积逐渐增大，在成瘤20天后体积进入快速生长期，总体的小鼠体重变大不大，该体内模型可作为胆管癌相关研究的动物模型。

实施例14、免疫组化实验

(1)烤片：将小鼠肿瘤组织切片以及人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1细胞来源病人的原发肿瘤组织切片置于70℃烤片1h。

(2)脱蜡：将片子转移至二甲苯中依次脱蜡处理：二甲苯I10min，二甲苯II 10min，二甲苯Ⅲ10min。

(3)水化:100％乙醇I1min、100％乙醇II 1min、95％乙醇1min、85％乙醇1min、75％乙醇1min，然后用纯净水洗涤3遍。

(4)抗原修复：将高压锅中0.01M枸橼酸缓冲液加热至沸腾，将切片放入，沸腾2分半后冷却至室温；

(5)修复结束取出切片，置于PBS中PBS洗涤3次，每次2min。

(6)内源性过氧化物酶阻断：切片滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，将玻片置于PBS中洗涤3次，每次2min。

(7)封闭：山羊血清封闭10min。

(8)孵一抗：封闭液倒掉后放入湿盒加入对应一抗，4℃过夜孵育。

(9)孵二抗：次日将一抗弃掉，PBS洗3次，每次2min，转移至湿盒内，滴加二抗，室温孵育30min。

(10)DAB染色：PBS洗3次，每次2min。滴加DAB反应1-5min，及时终止显色，然后转移到玻片架上，双蒸水洗涤5min。

(11)苏木素染色：苏木素染液中浸泡5min后用净化水冲洗，接着用盐酸酒精分化液分化数秒，分化结束后立即用净化水冲洗，最后将切片置于流水中冲洗反蓝5min。

(12)脱水封片：将切片依次放入75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇各1min，干燥后在切片上滴加中性树胶，盖上盖玻片封片。

图5E为手术切除的肿瘤标本与小鼠瘤体HE染色，以及Ki67、CK19的免疫组化结果，HE说明肿瘤为胆管中低分化腺癌，Ki67、CK19均为强阳性，说明肿瘤为腺上皮来源，增殖强，进一步说明了该细胞系形成的皮下移植瘤模型的可靠性。因此，本发明提供的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1属于全新的人胆管癌细胞系。

综上所述，本发明提供了一种人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022169，细胞折射性好，细胞生长状态良好，背景清晰，细胞多近圆形或椭圆形，群体倍增时间约为52h，所述人胆管癌细胞系在临床诊断为胆管中低分化腺癌，特征鉴定表型为CK19，Ki67阳性，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了胆管癌细胞库。所述人胆管癌细胞系在支原体检测试剂盒检测时，PCR结果为阴性，未受到支原体污染；所述细胞系增殖、愈合、侵袭、迁移能力较强，可以用于研究肝门部胆管癌的发病机制。本发明所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1可以成功制备胆管癌动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内实验，针对临床抗癌药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022169。

2.如权利要求1所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1，其特征在于，所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1分离自肝门部胆管中低分化腺癌。

3.一种如权利要求1所述人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的子代细胞系。

4.权利要求1～2中任意一项所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1的应用，其特征在于，所述应用选自：

a)用于研究肝门部胆管癌发生、发展和转移的机理；

b)构建肝门部胆管癌动物模型；

c)筛选或评估治疗肝门部胆管癌的药物；

d)构建耐药细胞模型；

e)构建肝门部胆管癌动物模型的细胞试剂；

f)筛选肝门部胆管癌相关生物标志物或鉴定分子靶点；或

g)研究肝门部胆管癌耐药机制。

5.一种药物的抑制肝门部胆管癌的活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：将待测药物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的药物为具有抑制胆管癌活性的药物，其中所述的细胞模型是如权利要求1所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1。

6.一种用于研究分析人肝门部胆管癌或用于建立人肝门部胆管癌动物模型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括容器，以及装于容器中的权利要求1所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC3T-1。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：细胞培养基。