CN111996169B - 一株转移潜能高的胃癌细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

一株转移潜能高的胃癌细胞系及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株转移潜能高的胃癌细胞系及其建立方法和应用，该胃癌细胞系由胃癌临床肿瘤标本移植裸鼠成瘤后，将瘤组织体外培养传代建系。该肿瘤细胞系皮下移植裸鼠后，发生肝和肺转移。该肿瘤细胞核型为超二倍体，与正常细胞二倍体不同，染色体众数集中在50‑57之间。细胞群体倍增时间为48小时。细胞迁移实验显示该肿瘤细胞随着时间增加细胞迁移能力增强。细胞侵袭实验显示该肿瘤细胞具有明显的侵袭力。因此，本发明建立的胃癌细胞系为胃癌的治疗和转移机制研究提供例如良好的实验工具。

Description

一株转移潜能高的胃癌细胞系及其建立方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一株转移潜能高的胃癌细胞系及其建立方法和应用。
背景技术
胃癌(GC)是最常见的恶性肿瘤之一，虽然通过手术和化疗有所改善，但晚期胃癌的预后仍然很差，5年生存率接近20％。侵袭和转移是该病致死的主要原因，并极大影响治疗效果。由于胃癌转移的发生与诸多肿瘤相关基因密切相关，不同病人应存在各自的特征。因此，急需建立与临床生物学和行为特征更为接近的个体化转移模型，确定胃癌转移的关键基因并了解其预后和治疗的分子机制，而建立相应的肿瘤细胞系是制备胃癌转移模型的重要基础。
目前建立胃癌细胞系较常用的方法是将病人组织块(或腹水)直接培养，由于受手术切除标本大小的限制，肿瘤细胞和正常细胞交替存在，很难获到大量的瘤细胞，同时人体单细胞体外生长需要严格的培养条件，大部分肿瘤细胞无法在体外稳定、持续传代。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株转移潜能高的胃癌细胞系及其建立方法和应用，该胃癌细胞系具有良好的侵袭能力和迁移能力，能够有效提升肿瘤细胞的建系效能，稳定传代。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一株胃癌细胞系，该胃癌细胞系由胃癌临床肿瘤标本移植裸鼠成瘤后，将瘤组织体外培养传代建立，命名为C61262，该胃癌细胞系于2019年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202001。
优选地，该胃癌细胞系皮下移植裸鼠后能够发生肝和肺转移。
优选地，该胃癌细胞系的细胞核型为超二倍体，与正常细胞二倍体不同，染色体众数集中在50-57之间。
优选地，STR分型显示该胃癌细胞系为人源性细胞。
优选地，肿瘤特异性标志物CEA和CA19-9在该胃癌细胞系中表达均呈阳性；胃癌特异性标志物MGb2和MGb7在该胃癌细胞系中表达均为阳性。
进一步优选地，肿瘤标志物CEA在该胃癌细胞系的细胞膜和细胞质表达，呈强阳性(+++)；肿瘤标志物CA199在该胃癌细胞系的细胞膜表达，呈弱阳性(+)；胃癌特异性标志物MGb2和MGb7在该胃癌细胞系的细胞膜表达，均呈强阳性(+++)。
优选地，该胃癌细胞系的肿瘤细胞随着时间增加细胞迁移能力增强。
本发明还公开了上述的胃癌细胞系的建立方法，取离体的新鲜胃癌细胞组织，移植于免疫缺陷小鼠的皮下，待形成肿瘤后，取肿瘤组织在免疫缺陷小鼠的体内连续传代；取第三代肿瘤组织进行体外培养，获得目标胃癌细胞系C61262。
本发明还公开了上述的胃癌细胞系在研究胃癌发生机理、筛选防治胃癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次公开了一株转移潜能高的胃癌细胞系，将该胃癌细胞系命名C61262，并将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202001。本发明建立的胃癌细胞系模型，较好的保持了原发瘤的异质性，利用该模型获得肿瘤组织较好的适应了机体内环境，再经过体外培养，可有效提升肿瘤细胞的建系效能，稳定传代。
进一步地，该肿瘤细胞核型为超二倍体，与正常细胞二倍体不同，染色体众数集中在50-57之间。细胞群体倍增时间为48小时。肿瘤标志物CEA主要在细胞膜和细胞质表达，呈强阳性(+++)；CA199主要在细胞膜表达，呈弱阳性(+)；MGb2和MGb7主要在细胞膜表达，均呈强阳性(+++)。细胞迁移实验显示该肿瘤细胞随着时间增加细胞迁移能力增强。细胞侵袭实验显示该肿瘤细胞具有明显的侵袭力。
本发明公开的胃癌细胞系C61262的建立方法是将临床离体的新鲜肿瘤标本首先移植免疫缺陷小鼠建立异种移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX模型)进行筛选，进一步取荷瘤鼠肿瘤组织进行体外培养，建立细胞系，该方法可有效提升肿瘤细胞的建系效能，稳定传代。
本发明公布的胃癌细胞系C61262与已有的胃癌细胞系相比，移植免疫缺陷裸鼠后可模拟胃癌病人的临床特征，发生肝转移和肺转移，具有良好的转移潜能，因此，该胃癌细胞模型可有效应用于胃癌的转移机制研究和相关药物筛选。
菌株保藏
胃癌细胞系命名为C61262，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址是中国武汉武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC NO：C202001，保藏日期为为2019年12月17日。
附图说明
图1为本发明制备的PDX模型组织结构；其中，(a)为Human(人)(×400)；(b)为Mouse(鼠)(×400)。
图2为本发明建立的胃癌细胞C61262形态；其中，(a)为(×100)；(b)为(×200)。
图3为C61262细胞HE染色结果；其中，(a)为(×100)；(b)为(×200)。
图4为C61262细胞生长曲线。
图5为C61262细胞生长周期。
图6为C61262细胞STR分型结果；其中，(a)为原发肿瘤；(b)为转移瘤。
图7为C61262细胞染色体特征；其中，(a)为随机选取的视野1；(b)为随机选取的视野2。
图8为免疫组织化学检测C61262肿瘤标志物的表达；其中，(a)为CEA；(b)为CA199；(c)为MGb7；(d)为MGb2。
图9为C61262细胞组织划痕实验；其中，(a)为0h；(b)为24h。；(c)为48h。
图10为C61262细胞侵袭实验；其中，(a)为(×100)；(b)为(×400)。
图11为C61262细胞异种移植肿瘤生长曲线。
图12为C61262细胞异种移植发生转移后脏器组织结构(HE染色)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1.胃癌PDX模型的建立
将临床获得新鲜的胃癌手术标(编号为61262)本剪碎为3mm3，混合适量的基质胶，利用穿刺针移植到裸鼠背部皮下，成瘤后当体积生长至800mm3～1000mm3时(命名为P1代)，异氟烷麻醉小鼠，手术获取肿瘤组织在另一只裸鼠皮下进行传代，命名为P2代，以此类推。每代冻存肿瘤组织(冻存液成分为：10％DMSO+90％胎牛血清)。取P3代瘤组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行HE染色，光学显微镜下观察。瘤组织HE染色后，结果见图1，其中，(a)为Human(人)(×400)；(b)为Mouse(鼠)(×400)，从图中可以看出，肿瘤组织腺体生长丰富，肿瘤细胞处于增值旺盛阶段，符合胃腺癌的特征，小鼠移植瘤与原发瘤基本保持相同的形态结构。
2.胃癌细胞系C61262的建立
取P3代瘤组织，用手术剪将组织剪成小块(约1mm3)，用无菌镊子将小块在培养瓶底部均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，25ml培养瓶20-30小块为宜，组织块放好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝天，向瓶内注射2ml含20％胎牛血清(FBS)的1640培养基盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置于CO2培养箱37℃，2-4小时后小块附壁，将培养瓶慢慢转平放置培养。
结果显示接种组织块2-4周后，在倒置显微镜下，可见多边形上皮样细胞和长梭形成纤维细胞从组织边沿移出生长。长期传代约50代后，在相差显微镜下，可见癌细胞呈多边形上皮样细胞，多核，异型性明显。癌细胞失去正常细胞间接触性抑制，呈现重叠生长，可见细胞重叠层上有折光度强的圆形细胞，符合癌细胞形态特点，如图2所示，其中，(a)为(×100)；(b)为(×200)，细胞命名为C61262。
3.C61262细胞HE染色
将生长状态良好的C61262胃癌细胞用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养24小时后，取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。用4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤3次，进行HE染色，光学显微镜观察。染色结果如图3所示，其中，(a)为(×100)；(b)为(×200)：癌细胞呈多边形，排列不规则，细胞核大，核浆比例增大，深染突出，符合肿瘤细胞结构特征。
4.C61262细胞生长曲线
取对数期生长的细胞于前一天换液，用0.25％胰酶消化细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度1×104/ml接种于24孔板，置于37℃CO2孵箱中培养24小时后，每日取3个孔用胰酶消化，将细胞悬液用细胞计数器计数活细胞，计算活细胞平均数，连续7天。以细胞数为纵坐标，培养天数为横坐标，绘制细胞生长曲线。结果参见图4，生长曲线显示癌细胞潜伏期长，对数期生长明显，符合癌细胞生长特点，细胞群体倍增时间为48小时。
5.C61262细胞周期测定
将生长状态良好的细胞用0.25％胰酶消化，离心弃上清。用PBS将细胞洗2次，收集并调整细胞浓度为1×106/ml，取1ml单细胞悬液，离心去除上清，在细胞中加入体积分数为70％冷乙醇500ul固定(2小时或过夜)，4℃保存。染色前用PBS洗去固定液，加入500ul PI/RNase A染色工作液，室温避光30-60分钟，上机检测。检测结果如图5所示，流式细胞仪测得细胞周期符合肿瘤细胞特点。
6.STR分型确定肿瘤的同源性
收集培养的肿瘤细胞，利用试剂盒提取肿瘤组织基因组DNA，进行STR(Shorttandem repeat)基因分型检测。该方法是肿瘤组织溯源性重要的评价指标。检测结果显示如图6所示，其中，(a)为原发肿瘤STR分析结果，(b)为转移瘤STR分析结果，表明所选择的十六个基因座均检测到信号，肿瘤细胞与患者术肿瘤组织同源性为99.99％，确认该肿瘤细胞为人源性。
7.染色体分析
取对数期生长的C61262细胞，加入终浓度为0.1ug/ml的秋水仙素，37℃孵育4h后，0.25％的胰酶消化并收集细胞，加入5ml 0.075mol/L KCL溶液(37℃预热)吹打至均匀，37℃水浴20分钟，1000rpm/10min离心弃上清，沿管壁缓慢加入固定液甲醇-冰醋酸(3：1)1ml预固定。10分钟后离心去上清，再加入3ml新固定液，室温静置30分钟，离心去上清，反复固定3次后，加入0.5ml固定液，取一滴细胞悬液高空滴到冰冷玻片上，酒精灯过火几次，干燥后Giemsa染色10分钟后，中性树脂封片，油镜下观察。结果如图7所示，图中(a)为随机选取的视野1，(b)为随机选取的视野2，结果显示癌细胞染色体保持人类肿瘤染色体的特点，核型主要为超二倍体，与正常细胞二倍体不同，染色体众数集中在50-57之间，占70％，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体。
8.肿瘤标志物的检测
将对数期生长的C61262细胞用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养24小时后，取出细胞爬片，PBS洗涤3次。用4％多聚甲醛固定30分钟，PBS充分淋洗，然后封闭非特异性蛋白并消除内源性过氧化物酶活性，一抗CEA、CA199、MGb2 4℃孵育过夜，加入二抗(羊抗鼠)室温孵育20分钟，DAB显色后苏木素复染，酒精脱水，甲醛透明并中性树脂封片，光学显微镜下观察。结果如图(图8)所示，C61262细胞中肿瘤标志物CEA主要在细胞膜和细胞质表达，呈强阳性(+++)；CA199主要在细胞膜表达，呈弱阳性(+)；MGb2和MGb7主要在细胞膜表达，呈强阳性(+++)
9.C61262细胞迁移实验
用胰酶消化细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度5×105/ml接种于6孔板，置于37℃CO2孵箱中培养，待细胞铺满后，用200ul枪头垂直于孔板制造划痕。吸掉旧培养基，用PBS洗涤细胞3次，去除划下的细胞后，加入无血清培养基，放入37℃CO2孵箱中培养。按0h、24h、48h拍照，倒置显微镜观察。结果参见图9，结果显示随着时间增加细胞迁移能力增强,。
10.细胞侵袭实验
将包被基质胶的小鼠室放入24孔板中，在上室加入300ul预热的无血清培养基，使基质胶水化，室温下静置30分钟后，吸去剩余培养液。对数期生长的C61262细胞用0.25％的胰酶消化并计数，用含1％胎牛血清的1640培养基重悬，调整细胞密度为1×105，取100ul细胞悬液培养在24孔板transwell小室的上室，下室加入500ul含10％血清的1640培养基。37℃5％CO2培养箱培养48小时后，取出小室弃掉培养基，轻轻擦掉上室的细胞，4％多聚甲醛固定30分钟，0.2％结晶紫染色30分钟后，用PBS清洗3次，置于显微镜下拍照观察，取五个视野计数穿膜细胞数，计算平均值。结果如图10所示，48h后穿膜细胞数量显著升高，表明细胞有明显的侵袭力。
11.C61262细胞异种移植
将对数生长期的C61262细胞用0.25％的胰酶消化后制备成细胞悬液，用PBS把细胞稀释成1×107/ml接种到6-8周龄的免疫缺陷裸鼠皮下，用游标卡尺每5天测量皮下肿瘤的长度(l)和宽度(w)，肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×(w2×l)肿瘤体积，连续测定肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(如图11)。
12.C61262细胞异种移植转移潜能
将对数生长期的C61262细胞用0.25％的胰酶消化后制备成细胞悬液，按照1×107/ml接种到6-8周龄的裸鼠皮下，肿瘤生长后2个月处死动物，解剖观察各脏器的转移情况，取部分肿瘤和转移灶4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。光学显微镜下观察，结果如图12所示，结果显示，移植瘤与C61262组织形态学相似。虽然细胞经体外培养后，细胞形态有所变化，但经动物体内组织再建，可出现原肿瘤的组织细胞学特征，并且肺和肝组织中出现明显的肿瘤侵入形态结构，提示该肿瘤具有良好地转移潜能。
13.C61262细胞的传代稳定性
将C61262细胞持续培养20代和40代后，进行形态观察，HE染色，计算细胞倍增时间，STR分析测定细胞的遗传特征。结果显示均未发生变化，保持稳定。
综上所述，本发明取临床新鲜的胃癌瘤组织移植于免疫缺陷小鼠(裸鼠)皮下，待形成肉眼可见肿瘤后，取瘤组织在裸鼠体内连续传代，取第三代(F3)瘤组织体外培养。经过连续体外培养传代获得胃癌细胞系C61262。该肿瘤细胞核型为超二倍体，与正常细胞二倍体不同，染色体众数集中在50-57之间。细胞群体倍增时间为48小时。
本发明建立的胃癌细胞系，HE染色结果、细胞生长特征和细胞周期分析均符合肿瘤细胞的特点；STR分型显示其为人源性细胞；染色体分析显示其为肿瘤细胞。肿瘤特异性标志物CEA和CA19-9表达均呈阳性，胃癌特异性标志物MGb2和MGb7表达均为阳性。肿瘤标志物CEA主要在细胞膜和细胞质表达，呈强阳性(+++)；CA199主要在细胞膜表达，呈弱阳性(+)；MGb2和MGb7主要在细胞膜表达，均呈强阳性(+++)。
本发明建立的胃癌细胞进行划痕实验和侵袭实验，结果均显示其具有转移潜能，进一步将胃癌细胞移植裸鼠皮下，发生了肺转移和肝转移。细胞迁移实验显示该肿瘤细胞随着时间增加细胞迁移能力增强。细胞侵袭实验显示该肿瘤细胞具有明显的侵袭力。因此，本发明建立的胃癌细胞系为胃癌的治疗和转移机制研究提供例如良好的实验工具。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (2)

1.一株胃癌细胞系，其特征在于，该胃癌细胞系由胃癌临床肿瘤标本移植裸鼠成瘤后，将瘤组织体外培养传代建立，命名为C61262，该胃癌细胞系于2019年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202001。
2.权利要求1所述的胃癌细胞系在筛选防治胃癌药物中的应用。
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