CN113416704B - 一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用 - Google Patents

一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113416704B
CN113416704B CN202110132896.9A CN202110132896A CN113416704B CN 113416704 B CN113416704 B CN 113416704B CN 202110132896 A CN202110132896 A CN 202110132896A CN 113416704 B CN113416704 B CN 113416704B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
smooth muscle
vascular smooth
cell
renal vascular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110132896.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113416704A (zh
Inventor
刘红亚
章小平
肖文
王前进
刘霞
李继新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Saier Langling Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Saier Langling Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Saier Langling Technology Co ltd filed Critical Wuhan Saier Langling Technology Co ltd
Priority to CN202110132896.9A priority Critical patent/CN113416704B/zh
Publication of CN113416704A publication Critical patent/CN113416704A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113416704B publication Critical patent/CN113416704B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用。该细胞命名为人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞XHRAML‑06，保藏编号为C202082。所述原代细胞的供体为临床肾血管平滑肌脂肪瘤患者。该原代细胞具有体外软琼脂成瘤能力、裸鼠皮下成瘤能力，对雷帕霉素、洛铂和卡铂呈现不同的药物毒性反应。该发明涉及细胞可在体外、体内分析人肾血管平滑肌脂肪瘤的发病机制，体外检测药物敏感性等相关特性，为人肾血管平滑肌脂肪瘤的研究提供更接近于临床肿瘤生物学特性的实验素材。

Description

一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用
技术领域
本发明属细胞生物学技术领域，具体涉及一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原 代细胞、子代细胞及其应用。
背景技术
根据2016版WHO肾脏肿瘤分类，肾血管平滑肌脂肪瘤(Renal angiomyolipoma,RAML)归属于主要发生于成人的间叶肿瘤。在组织学上， RAML分型有两种，一种为经典型RAML，一种为上皮样RAML。经典型 RAML是一种良性间叶性肿瘤，构成于脂肪组织，梭形和上皮样平滑肌细胞 以及厚壁血管。上皮样RAML的特征是在经典型RAML结构基础上以上皮 样细胞增生为主，呈浸润性破坏性生长，具有恶性潜能的间叶性肿瘤。RAML 占肾脏肿瘤的8.7％-29.4％。由于其可导致常见的自发性破裂出血的并发症， 可造成患者失血休克，严重的可危及患者生命。
在临床上，肾血管平滑肌脂肪瘤容易被错诊为肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)，CT检查结合肾脏血管造影可以有效的识别RAML和RCC。 临床上的RAML病例并不常见，上皮样RAML于1994年由Martignoni等首 次报道，至今该类肿瘤国内外报道均较少，相关文献多为个案报道。该类肿 瘤临床表现缺乏特异性，误诊率高，目前尚没有标准的治疗方案。当前对于 RAML的治疗目的在于最大限度保留肾功能，预防肿瘤破裂及解除或减轻肿 瘤引起的症状。上皮样RAML临床上首选外科手术治疗，术后仍有可能出 现复发及转移。
尽管目前在肿瘤领域的一系列研究已经广泛开展，研究领域涉及到肿瘤 诊断、发病机制及药物治疗等多方面，目前人肾血管平滑肌脂肪瘤的发病机 制依然尚未明确。其主要原因在于当今市场上尚未有合适的可用于该疾病研 究的模型。现阶段肿瘤领域研究的主要模型多采用肿瘤细胞系 (patient-derived cancer cell lines,PDC)。然而，目前全球范围内用于基础研 究及药敏检测的肿瘤细胞系屈指可数且肿瘤细胞系具有严重的缺陷，即体外 培养的过程中易丢失肿瘤细胞的异质性和肿瘤细胞在体内的特征，而原代培养的肿瘤细胞因其保留原来的遗传特性，与临床保持良好的相关性，能更真 实的反应机体内部的特性，成为了研究人员理想的体外实验模型。目前尚无 人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞可供研究人员使用。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原 代细胞、子代细胞及其应用，能够有效解决目前人肾血管平滑肌脂肪瘤实验 研究缺乏原代细胞的难题。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
本发明保护一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，所述原代细胞的保藏 号为C202082，分类命名为人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞XHRAML-06。
在上述技术方案的基础上，本发明还能够有如下改进。
进一步，所述的原代细胞为临床人源细胞。
进一步，所述细胞具备软琼脂成瘤能力。
进一步，所述细胞具备裸鼠成瘤能力。
进一步，所述细胞对雷帕霉素、卡铂和顺铂呈现出不同的药物敏感性。
进一步，所述细胞的STR数据如下：
AMEL-X、D3S1358-15/17、D13S317-8/13、D7S820-9/11、D16S539-9/10、 Penta E-17/22、TPOX-8、TH01-6、D2S1338-19/24、CSF1P0-10/11、Penta D-9、D2S441-11/14、D19S433-13/15.2、vWA-14/17、D21S11-30/31.2、D18S51-14/15、 D6S1043-12/20、D8S1179-10/11、D5S818-11/12、D12S391-15/19、FGA-23/25， 涵盖国际通用检测19个位点。
本发明还保护上述人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的子代细胞，所述子 代细胞具备与原代细胞相同的特性。
进一步，所述子代细胞的STR数据如下：
AMEL-X、D3S1358-15/17、D13S317-8/13、D7S820-9/11、D16S539-9/10、 Penta E-17/22、TPOX-8、TH01-6、D2S1338-19/24、CSF1P0-10/11、Penta D-9、 D2S441-11/14、D19S433-13/15.2、vWA-14/17、D21S11-30/31.2、D18S51-14/15、 D6S1043-12/20、D8S1179-10/11、D5S818-11/12、D12S391-15/19、FGA-23/25， 涵盖国际通用检测19个位点。
本发明还保护上述人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞及其子代细胞在体 外、体内分析人肾血管平滑肌脂肪瘤的发病机制，该疾病诊断及治疗方法的 研究，以及治疗该疾病药物的体外药物敏感性等相关研究的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供人血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，经 STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册的人血管平滑肌脂肪瘤原代细 胞，细胞核型分析鉴定显示染色体为40-45，异常比例为100％。细胞性状稳 定，为人肾血管平滑肌脂肪瘤的研究提供了更接近于临床肿瘤生物学特性的 实验材料和模型。本发明所得的原代细胞可以直接作为研究人肾血管平滑肌 脂肪瘤发病机制研究的基础研究模型，也可以直接作为体外临床前肾血管平 滑肌脂肪瘤最佳用药方案的筛选模型。
附图说明
图1：人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞光镜下的细胞形态图，放大倍数： 400x；
图2：人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的生长曲线图；
图3.人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞标记物组化结果；
图4：人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的染色体核型分析图；
图5：人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的STR基因分型图；
图6：人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的软琼脂克隆形成实验结果图；
图7：人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的DNA损伤应答结果；
图8：人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的药敏检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不受其限制。下 列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件进行，或按 照制造厂商所建议的条件，室温为26℃。本发明提供的人肾血管平滑肌脂肪 瘤原代细胞XHRAML-06，以下简写为XHRAML-06。
本发明保护一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，所述原代细胞的保藏 号为C202082，分类命名为人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞XHRAML-06。
该细胞分离培养分别取自中国人肾血管平滑肌脂肪瘤术后切除组织，保 藏号为CCTCC NO：C202082，于2020年12月25日保藏于中国典型培养 物保藏中心，地质：中国武汉，武汉大学。基因STR分型鉴定为国内外从 未登记注册过的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，细胞核型分析鉴定为：分 析15个中期分裂相细胞，均为亚二倍体核型，涉及到包括性染色体及常规 染色体的所有染色体的数目及结构异常，为非克隆性的遗传变异，染色体数量为40～45，异常比例为100％。
本发明的原代细胞STR(短串联重复序列)基因型以21个“STR基因 座/等位基因长度”来表示：AMEL-X、D3S1358-15/17、D13S317-8/13、 D7S820-9/11、D16S539-9/10、PentaE-17/22、TPOX-8、TH01-6、 D2S1338-19/24、CSF1P0-10/11、Penta D-9、D2S441-11/14、D19S433-13/15.2、vWA-14/17、D21S11-30/31.2、D18S51-14/15、D6S1043-12/20、D8S1179-10/11、 D5S818-11/12、D12S391-15/19、FGA-23/25，检测结果涵盖国际通用检测19 个位点。
本发明的原代细胞的细胞性状稳定，具有稳定的体外软琼脂成瘤能力、 裸鼠皮下稳定成瘤能力，对雷帕霉素(Rap)、卡铂(CBP)和顺铂(DDP) 有不同的药物敏感性。
本发明的原代细胞能够在体外稳定传代培养，本发明还保护传代培养后 的子代细胞，其具备与原代细胞相同的特性。
本发明的子代细胞STR(短串联重复序列)基因型以21个“STR基因 座/等位基因长度”来表示：AMEL-X、D3S1358-15/17、D13S317-8/13、 D7S820-9/11、D16S539-9/10、PentaE-17/22、TPOX-8、TH01-6、 D2S1338-19/24、CSF1P0-10/11、Penta D-9、D2S441-11/14、D19S433-13/15.2、 vWA-14/17、D21S11-30/31.2、D18S51-14/15、D6S1043-12/20、D8S1179-10/11、 D5S818-11/12、D12S391-15/19、FGA-23/25，检测结果涵盖国际通用检测19 个位点。检测结果与原代细胞一致。
本发明还保护上述人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞及子代细胞的用途。 其中所述较佳用途包括一种筛选治疗肾血管平滑肌脂肪瘤最佳敏感药物的 方法，其中较佳操作步骤如下：将测试药物添加至细胞模型中，根据药物作 用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的程度，筛选最佳敏感性测试药物为治疗 人肾血管平滑肌脂肪瘤的候选药物，其中所述细胞模型为本发明所述的人肾 血管平滑肌脂肪瘤原代细胞。
其中所述筛选方法为常规筛选方法，所述筛选方法较佳的包括以下步 骤：
1)将1000个/孔的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞或其子代细胞接种 于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；
2)将测试药物稀释成不同浓度作用于细胞，药物作用72小时后测定细 胞活力，计算不同浓度药物对细胞增殖抑制能力，用以评估测试药物的抗肿 瘤能力。
其中步骤(2)所述检测途径，用以评估测试药物的抗肿瘤能力的方法 为本领域常规检测及计算方法。其中所述检测方法较佳的包括MTT发或 CCK-8法，本发明所述检测方法优选的为采用Celigo仪器检测。优选的Celigo 全称为Celigo Image Cytomete，全视野细胞扫描分析仪。Celigo是一款基于 多荧光通道细胞成像的快速全孔&整板扫描分析仪，因此基于细胞成像能够 检测全孔细胞的增殖生长情况。在检测细胞增殖生长过程中无需消化细胞， 无需取样，无需对细胞进行任何处理即可在任何时间点随时成像，随时分析 并获取统计学数据进行结果处理。整板的全孔图像预览和曲线分析带来一目 了然的细胞分析结果，完成整个过程只需要约8分钟，从而简单实现多时间 点的整板细胞生长分析快速追踪。针对3D肿瘤球，Celigo也已开发全自动 拍照和分析方案应用于药物评估中。优选的Celigo仪器检测法为传统CCK-8 及MTT法的替代法，其特征为药物处理后无需对细胞进行任何处理，无需 额外加入任何实验试剂，可在8分钟内快速、无毒的完成所有检测，灵敏度高及重复性佳。
以下为本发明的具体实施例和应用例，揭示了本发明分离获取原代细 胞、体外培养、传代培养和药筛应用等全过程。
实施例1 XHRAML-06的原代分离培养
(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意 书后，从武汉协和医院获得新鲜的人肾血管平滑肌脂肪瘤术后切除临床标 本。
(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000U/ml青霉素、 1000ug/ml硫酸链霉素、2.5ug/ml两性霉素和50ug/ml的庆大霉素)的收集管 中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离。
(3)原代分离培养：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1 次，用1xPBS(pH7.2～7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、 脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状。加入20mL含1xI型胶 原酶和0.25％胰酶-0.2％EDTA的消化液消化肿瘤组织，消化时间为1.5小时， 并用100um滤膜过滤收集细胞沉淀，低速离心后收集细胞沉淀。向细胞沉淀 中加入10ml红细胞裂解液(Solarbio，R1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入5ml的1xPBS(pH7.2～7.4)，低速离心收集 细胞沉淀。用CORT培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％CO2 条件下进行培养。CORT培养基组成为：DMEM低糖培养基与F12培养基 以3：1体积比例混合，添加1xN2、1x非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、500ng/ml R-Spondin1、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子、 10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、5ng/ml孕酮及100U/mL青霉素、100ug/ml 链霉素、0.25ug/mL两性霉素B。
按照上述方法分离培养成功的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞即为本 发明的原代细胞，显微镜下观察细胞形态如图1，初期分离获得的早代细胞 形态较为多样，细胞随传代次数增加，细胞形态逐渐趋于上皮样。
实施例2人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的传代培养
(1)培养于T25培养瓶的细胞丰度达到80％时，用1xPBS(pH7.2～7.4) 漂洗细胞2次，加入1ml0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2-3min。
(2)加入2ml含有10％FBS的PBS终止消化。
(3)1000rpm离心4min，去上清，收集细胞沉淀，用1ml CORT培养 基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入T25培养瓶中进行培养。
按照上述方法传代培养的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，培养获取的 细胞生长曲线如图2，连续传代43天，细胞增值倍数达34，本发明的人肾 血管平滑肌脂肪瘤原代细胞仍能保持增殖状态正常生长。
实施例3人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的标记物表达鉴定
上述获得的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞XHRAML-06培养后，鉴定 细胞的特异性标记物表达，具体步骤如下：
(1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
(2)用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
(3)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗 原省略此步骤)；
(4)PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加 正常山羊血清，室温封闭30min；
(5)吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足量的已稀释好的一抗 并放入湿盒，4℃孵育过夜；
(6)第二天用PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多 余液体后，滴加已稀释好的二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3 次，每次3min；
(7)DAB显色3-5min，自来水充分涮洗；
(8)苏木素复染5min，自来水充分涮洗；
(9)盐酸酒精分化10s，自来水冲洗2min后，再用氨水反蓝2min，自 来水充分冲洗；
(10)依次通过梯度酒精，再过2遍的二甲苯，流水冲洗2min；
(11)中性树脂封片观察。
染色结果见图3。A为α-SMA表达情况，该标记物为肌源性特异性标 记物，细胞α-SMA表达阳性。B为HMB-45表达情况，该标记物是一种黑 色素瘤前体相关的糖蛋白发生反应的单克隆抗体，该蛋白在其他肾脏肿瘤中 无表达，我们获取的这例细胞该蛋白表达呈阳性。C为CK的表达情况，该 标记物为上皮源性标记物，我们获取该例细胞此标记物基本无表达。D为 Ki-67表达情况，该标记物为细胞恶行增殖性标记物，该例细胞此蛋白表达 为阳性。
实施例4人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的核型分析鉴定
1.细胞培养
按照上述培养条件实施例2获取足够数量的原代细胞。
2.收获细胞
2.1接种次日早晨打开水浴箱调至37℃，将低渗液放入水浴箱中。待水 温恒定后，用温度计测量低渗液的温度，当低渗液温度也达到37℃时方可使 用。
2.2向每一个培养基中加入秋水仙素80ul，来回混匀3次后放入培养箱 中继续培养30分钟。该步骤需要在超净工作台中进行。
2.3将培养物缓缓倒入离心管中，以1500转离心5分钟，离心完成后小 心取出离心管，用真空泵吸取上清液。
2.4将预热好的低渗液缓缓加入到离心管中，用一次性吸管轻轻吹打混 匀。再放入水浴箱中低渗30min。
2.5低渗时间将要完成时，在通风橱中以甲醇:乙酸＝3:1的比例配制适量 的固定液，充分混匀后方可使用。固定液的用量算法：平均一支离心管用20ml 固定液。
2.6将离心管从水浴箱中取出，在通风橱中每支离心管加固定液1ml， 用一次吸管轻轻吹打混匀后，以1500转离心5分钟。
2.7将离心完的样本轻轻取出，用真空泵吸取上清液，再在每支离心管 中加入固定液8ml，轻轻吹打混匀，静置30min。
2.8将离心管放入离心机中，以1500转离心5分钟后，轻轻移入通风橱 中，用真空泵吸取上清液后，再加入固定液8ml静置10min。
2.9将固定好的悬液再次以1500转离心5分钟，弃去上清液，加入1ml 固定液(视沉淀物多少可适量加减固定液)混匀。
以上步骤必须在通风橱中进行。
2.10将混匀好的细胞悬液保存在4℃冰箱中。
3制片
3.1将保存的细胞悬液再用上述固定液固定10min，以1500转离心5分 钟，弃上清，加入适量的固定液混匀制成细胞悬液。滴片后在低倍显微镜下 观察，细胞密度刚好，细胞间距在2个细胞到3个细胞之间且没有重叠，分 裂相较多时可见分裂相分散良好即为合格，则该浓度的细胞悬液最佳。
3.2使用HANABI Ver.2.0b染色体中期分散仪滴片：每张片上滴2滴， 每滴用移液枪吸取12ul细胞悬液滴加。
3.3将滴好的玻片放入75℃烤箱中烘烤过夜。
4染片
4.1准备工作：在37℃水浴箱中放入3个玻璃缸，第一个缸内加入40ml 的生理盐水、0.5％胰酶1ml和10％NaHCO3溶液10滴，混匀，第二个缸内 加入40ml生理盐水，第三缸内加入40ml磷酸盐缓冲液和2.5ml的吉姆萨染 液，混匀。待每个缸内的溶液温度达到37℃时，即可开始染片。
4.2胰酶消化：每张玻片消化10-12秒，然后在第二只缸内用生理盐水 涮洗一下。
4.3染色：将涮洗后的玻片放入染色缸内染色2min 30s，然后在低倍镜 下观察颜色，紫红色为标准，颜色合适后在水龙头下冲洗玻片，玻片上的残 渣冲洗干净为宜。
4.4保存：玻片染色完毕，将玻片放进玻片架传送到阅片室经观察。
染色体分析结果为：分析15个中期分裂相细胞，均为亚二倍体核型， 涉及到包括性染色体及常规染色体的所有染色体的数目及结构异常，为非克 隆性的遗传变异。代表性的核型分析结果见图4，人肾血管平滑肌脂肪瘤原 代细胞的核型异常，染色体数量为40～45，异常比例为100％。
实施例5人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的STR基因分型鉴定
短串联重复序列(short tandem repeat,STR)又称为微卫星DNA，是指 染色体上由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一 类DNA序列(重复次数为10-60次，基因片段在400碱基对以下)；每个 核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。 因此，不同个体中具有唯一的一组STR序列重复次数，为个体的“基因身 份证”，为细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。具体操作如 下：
(1)收集新鲜培养的对数期贴壁XHRAML-06原代细胞，数量控制在 106数量级；
(2)根据AxyPrep基因组DNA小剂量试剂盒(AP-MN-MS-GDNA) 说明书提取细胞基因组DNA，用5‘端荧光标记的引物进行PCR扩增，对 所得产物进行测序，计算各个短判断重复序列的重复数。STR检测结果见图 4.检测21个STR位点，以“STR基因组/等位基因长度”来表示：
AMEL-X、D3S1358-15/17、D13S317-8/13、D7S820-9/11、D16S539-9/10、 Penta E-17/22、TPOX-8、TH01-6、D2S1338-19/24、CSF1P0-10/11、Penta D-9、 D2S441-11/14、D19S433-13/15.2、vWA-14/17、D21S11-30/31.2、 D18S51-14/15、D6S1043-12/20、D8S1179-10/11、D5S818-11/12、 D12S391-15/19、FGA-23/25，检测结果涵盖国际通用检测19个位点。该STR 检测图谱详见图5。将该细胞STR数据提交至ATCC数据库进行比对，没有 匹配的细胞系或原代细胞，说明本发明分离获取的该例原代细胞为新一例的 人肾血管平滑肌原代细胞。
实施例6人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的软琼脂克隆形成实验结果
(1)不同浓度低熔点琼脂糖溶液准备：用超纯水分别配制1.4％和0.7％ 两个浓度的琼脂糖溶液，高压灭菌后维持在40℃水浴中保持其溶液状态。
(2)以1：1比例分别混合1.2％琼脂糖和2xCORT或2xDMEM培养基， 迅速混匀后倒入6孔板，每孔倒入2ml，室温冷却30min使其凝固后备用， 每株细胞做三个复孔。
(3)以1：1比例分别混合0.7％琼脂糖和2xCORT或2xDMEM培养基， 迅速混匀后加入适量原代细胞或EJ细胞系悬液，保持每孔1000细胞量，充 分混匀后铺入含有1.2％琼脂糖底层平皿中，室温放置使其凝固后置入37℃， 5％CO2培养箱培养2周。
(4)于显微镜下观察平皿中克隆形态以判断细胞的致瘤性。
结果见图6，如图所示，人肾癌细胞系786-O和XHRAML-06在软琼脂 上培养2周时间，均能在软琼脂形成明显且较大的细胞克隆，XHRAML-06 细胞克隆形成率与人肾癌细胞系786-O细胞几乎保持一致，说明人血管平滑 肌脂肪瘤原代细胞在体外具有强致瘤性。
实施例7人血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的DNA损伤应答
(1)将人血管平滑肌脂肪瘤原代细胞XHRAML-06和正常人肾小管原 代RN-01分别接种到直径10mm的细胞培养皿中，接种量为5x105。
(2)细胞放置37℃，5％CO2培养箱中24h后，加入0.5nM的放线菌 素D(Act D)，继续培养24h，同时以未加药物的细胞作为阴性对照。
(3)药物作用24h后收集细胞沉淀，加入RIPA裂解液收集蛋白质做 蛋白免疫印记(WB)，步骤如下：
①蛋白收集：放线菌素D作用细胞24h后，弃去培养基，用预冷的PBS 漂洗细胞3次，加入RIPA裂解液，冰上裂解15min，反复吹打后将含有细 胞碎片的裂解液转移至1.5mL离心管中，置于4℃，12000rpm离心20min， 收集上清弃沉淀。
②BCA法测定蛋白浓度，根据BCA检测试剂盒操作说明，以BSA为 标准品制作标准曲线，计算各蛋白样品的总蛋白量。
③根据总蛋白浓度计算蛋白上样量(总上样量为40ug)，将蛋白样品和 5x上样缓冲液置于沸水中煮5min，使蛋白完全变性，瞬时离心后收集上清。
④SDS-PAGE凝胶电泳：制备12％的分离胶和5％的浓缩胶，将处理后 的样品加入凝胶微孔，放于4℃冰箱中恒压80v电泳30min，此时溴酚蓝指 示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，再调电压至120V约1.5h后，溴酚蓝 移动到凝胶底部，停止电泳。
⑤转膜：将PVDF膜放置甲醇中激活30s，转移液中浸泡5-10min。取 下凝胶，根据Marker切下目的条带，按照正→负(海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶 -滤纸-海绵)的顺序放入电转槽，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对 照黑色负极。在转膜槽中加满电转液开始转膜。4℃条件下稳流转膜 (200mA)，不同蛋白所用时间不同，p21转膜70min，p53转膜120min，β-actin转膜90min。
⑥封闭：5％BSA TBST溶液，室温摇床封闭2h。
⑦孵育一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液 中，4℃孵育过夜。抗体稀释浓度如下：β-actin为1：2000，p21为1:1000， p53为1:1000。
⑧孵育二抗：用封闭液稀释相应的HRP标记二抗---1:50000稀释，使 PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h。
⑨显影：将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1:1比例混匀 制成工作液，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟，待荧光带明显后，用 滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、 定影液定影，冲洗胶片。
细胞DNA损伤应答反应实验结果，见图7，在XHRAML-06细胞中，p53和p21蛋白的表达量在Act D处理前后均无显著变化，而人正常肾小管 原代细胞RN-01经过Act D处理后，相比对照组细胞，其p53蛋白的表达量 上调，下游信号分子p21蛋白的表达量也同时上调，说明人正常肾小管原代 细胞XHRN-01对DNA损伤有正常的应答能力，而人肾血管平滑肌脂肪瘤 细胞XHRAML-06细胞可能存在p53信号通路功的蛋白能性变异。
应用例人肾血管平滑肌脂肪瘤细胞的药敏检测
(1)0.05％胰酶消化常规培养人血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，制备细胞 悬液，以每孔1000个细胞接种于96孔板，每孔加100ul悬液，放于37℃、 5％CO2培养箱培养72h。
(2)每孔加入10uL不同浓度药物，药物浓度(uM)分别设置为雷帕 霉素(Rap)0.01、0.02、0.1、1.0、10、50、100，顺铂(DDP)0.01、0.1、 1、10、100，卡铂(CBP)0.01、0.1、1、10、100。每种药物浓度设置3个 复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不含药物)、空白对照孔(只含培养 基)，每组设置3个复孔。
(3)药物加入后放入37℃，5％CO2培养箱继续培养72h后用Celigo检 测记录细胞增殖情况。
(4)计算每种药物作用于细胞的抑制率(IR％)。
实验结果见图8。A为不同药物浓度的雷帕霉素处理XHRAML-06细胞 的抑制率，B为不同浓度的顺铂处理XHRAML-06细胞的抑制率，C为不同 浓度的卡铂处理XHRAML-06细胞的抑制率，D为同一浓度梯度下三种不同 药物对XHRAML-06细胞的抑制率。本发明的细胞对所测试的3种药物呈现 出了不同的药物敏感性反应，对Rap药物的反应性优于DDP和CBP。临床上对肾血管平滑肌脂肪瘤的治疗可采用mTOR抑制剂，Rap为一种有效的 mTOR抑制剂，在我们分离获取的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞 XHRAML-06中体现出了该药物的优越性，与临床应用保持一致。该细胞可 作为人肾血管平滑肌脂肪瘤疾病的治疗药物及方法的优秀体外筛选模型。
本发明所用的原料或试剂除特别说明外，均市售可得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，其特征在于，所述原代细胞的保藏号为CCTCCNO：C202082，分类命名为人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞XHRAML-06。
2.根据权利要求1所述的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，其特征在于，所述细胞的STR数据如下：
AMEL-X、D3S1358-15/17、D13S317-8/13、D7S820-9/11、D16S539-9/10、Penta E-17/22、TPOX-8、TH01-6、D2S1338-19/24、CSF1P0-10/11、Penta D-9、D2S441-11/14、D19S433-13/15.2、vWA-14/17、D21S11-30/31.2、D18S51-14/15、D6S1043-12/20、D8S1179-10/11、D5S818-11/12、D12S391-15/19、FGA-23/25，涵盖国际通用检测19个位点。
3.一种权利要求1所述的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的子代细胞，其特征在于，所述子代细胞具备与原代细胞相同的特性。
4.根据权利要求3所述的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的子代细胞，其特征在于，所述细胞的STR数据如下：
AMEL-X、D3S1358-15/17、D13S317-8/13、D7S820-9/11、D16S539-9/10、Penta E-17/22、TPOX-8、TH01-6、D2S1338-19/24、CSF1P0-10/11、Penta D-9、D2S441-11/14、D19S433-13/15.2、vWA-14/17、D21S11-30/31.2、D18S51-14/15、D6S1043-12/20、D8S1179-10/11、D5S818-11/12、D12S391-15/19、FGA-23/25，涵盖国际通用检测19个位点。
5.权利要求1-2任一项所述的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞，或权利要求3-4任一项所述的人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞的子代细胞在体外、体内分析人肾血管平滑肌脂肪瘤的发病机制，以及治疗该疾病药物的体外药物敏感性相关研究的应用。
CN202110132896.9A 2021-01-29 2021-01-29 一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用 Active CN113416704B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110132896.9A CN113416704B (zh) 2021-01-29 2021-01-29 一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110132896.9A CN113416704B (zh) 2021-01-29 2021-01-29 一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113416704A CN113416704A (zh) 2021-09-21
CN113416704B true CN113416704B (zh) 2022-02-01

Family

ID=77711734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110132896.9A Active CN113416704B (zh) 2021-01-29 2021-01-29 一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113416704B (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762787A (zh) * 2017-11-09 2019-05-17 江苏齐氏生物科技有限公司 一种原代人肾癌细胞的分离及培养方法
CN110241071B (zh) * 2019-06-28 2021-02-23 武汉赛尔朗灵科技有限公司 一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113416704A (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110241071B (zh) 一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用
CN113528444A (zh) 一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
CN106367393B (zh) 小鼠前列腺癌循环肿瘤细胞系及前列腺癌循环肿瘤细胞分离和培养方法
CN101726602A (zh) 一种检测Legumain蛋白判断卵巢癌预后的方法
CN109694852B (zh) 一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用
CN110079501B (zh) 小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法
CN109355261B (zh) 一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法
CN115786262B (zh) 一种人肝门部胆管癌细胞系cbc3t-1及应用
CN113416704B (zh) 一种人肾血管平滑肌脂肪瘤原代细胞、子代细胞及其应用
CN110499290B (zh) 一株人尤文肉瘤细胞系
CN116426480A (zh) 一种人胶质母细胞瘤细胞系y1203及其应用
CN111575385B (zh) Sb290157在卵巢上皮性癌疾病中的应用
CN102435734A (zh) 卵巢癌原发化疗敏感性测评试剂盒及其应用
CN110846280A (zh) 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用
CN114085909A (zh) Top1作为宫颈癌标志物和/或治疗靶点的应用
CN110904043B (zh) 人肠癌原代细胞、应用和培养方法
CN115354078A (zh) 骨肉瘤检测标记物及其应用
CN113917160A (zh) 采用her2抗体免疫荧光法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法
CN111004782B (zh) 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用
RU2104526C1 (ru) Способ диагностики т-клеточных лимфом кожи
CN106011069A (zh) 一种食管癌细胞系及其应用
CN114276994B (zh) 人卵巢鳞癌细胞系及其应用
CN113604568B (zh) Hpv16整合靶点联合铁死亡调控基因在制备宫颈癌早期治疗试剂盒中的应用
KR20090097730A (ko) 인시츄 배양방법을 이용한 고형종양의 핵형분석방법
CN114015655B (zh) 一种hbrca-959细胞系及其培养方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A primary cell and progeny cell of human renal angiomyolipoma and its application

Effective date of registration: 20220721

Granted publication date: 20220201

Pledgee: China Construction Bank Corporation Wuhan Gangcheng sub branch

Pledgor: WUHAN SAIER LANGLING TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2022980010978

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right