CN110846280A - 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人肠癌原代细胞及其培养方法与应用，该人肠癌原代细胞命名为人肠癌细胞HCOC‑950，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18529。与现有纯化培养过程所培养出的肿瘤原代细胞的细胞状态相比，该人肠癌原代细胞的细胞状态更好。

Description

人肠癌原代细胞及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及人肠癌原代细胞及其培养方法与应用。

背景技术

肿瘤原代细胞培养，是指从肿瘤患者体内手术切除肿瘤组织，获得肿瘤细胞，并在体外进行短期培养的过程。肠癌是常见的消化道疾病，一般原代培养的肿瘤细胞由于组织刚刚离体，其生物学特性未发生很大变化，仍保留原遗传特性，基因保留量在90％以上，适用于生化分子实验和药物敏感性试验及机制探究相关试验，其数据更具有说服力。因此，纯化培养人肠癌原代细胞对于细胞株的建立、药敏检测实验、个性化治疗和肠癌的发病及其治疗机制的研究具有重要意义。

目前，在肿瘤原代细胞的纯化培养过程中，可以单纯的依靠酶消化法来收集肿瘤细胞。但存在细胞状态不好或是死亡的缺点。

发明内容

本发明提供了人肠癌原代细胞及其培养方法与应用，培养出的细胞状态更好。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种人肠癌原代细胞，命名为人肠癌细胞 HCOC-950，已于2019年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCCNO.18529。

本发明提供的人肠癌原代细胞HCOC-950，至少具有以下特点：

特点1：原代分离培养自中国人的肠癌组织，该细胞未导入任何外源基因。

特点2：显微镜下观察人肠癌原代细胞HCOC-950，发现细胞的大小、形态不等，失去极性，排列紊乱，无接触抑制，互相挤压，呈堆叠状或镶嵌状的上皮来源细胞。

特点3：人肠癌原代细胞HCOC-950经免疫荧光鉴定为CK(cytokeratin，细胞角蛋白)强表达，CR(Calretinin，钙视网膜蛋白)不表达。

特点4：人肠癌原代细胞HCOC-950经核型分析鉴定为癌细胞异型核型。经核型分析，显示细胞的染色体数为48条，细胞为超二倍体核型的肿瘤细胞，符合人恶性肿瘤的遗传特性。

特点5：人肠癌原代细胞HCOC-950经STR基因分型鉴定，其为单一人类来源，且无交叉污染的细胞。

特点6：人肠癌原代细胞HCOC-950，可用于人癌症相关疾病的发病机理研究、药物敏感性研究和检测，以及抗肿瘤药物研究。

第二方面，本发明提供了培养人肠癌原代细胞的方法，包括：

取新鲜人肠癌组织，用含10％血清的培养基，进行原代分离培养；

原代分离培养出的细胞汇合度达到70-90％时，移除含10％血清的培养基，作细胞消化处理，并边消化边收集人肠癌细胞，将每次收集的人肠癌细胞均转移至放置有含10％血清的培养基的离心管中；

将收集的人肠癌细胞离心并移除上清，用含无血清培养基重悬，接种于细胞培养瓶中培养，以及在成纤维细胞贴壁后将未贴壁的人肠癌细胞收集起来，将收集的未贴壁的人肠癌细胞转入新的细胞培养瓶继续培养，如此反复贴壁，直至清除全部成纤维细胞，得到已纯化的人肠癌原代细胞。

在本发明一个实施例中，在所述得到已纯化的人肠癌原代细胞之后，进一步包括：

用无血清培养基，培养得到的已纯化的人肠癌原代细胞；

已纯化的人肠癌原代细胞汇合度达到70-90％时，移除无血清培养基，作细胞消化处理，并边消化边收集人肠癌原代细胞，将每次收集的人肠癌原代细胞均转移至放置有含10％血清的培养基的离心管中；

将收集的人肠癌原代细胞离心并移除上清，用无血清培养基重悬，接种于细胞培养瓶中培养，得到传代后的人肠癌原代细胞。

优选地，所述无血清培养基包括：DF培养基，添加物为1-5mM谷氨酰胺、5-30mg/L胰岛素、5-20mg/L转铁蛋白、5-20μg/L亚硒酸钠、5-20μg/L EGF， 10-100nM氢化可的松、1-5mg/ml BSA、0.1-0.5mg/ml青霉素、0.1-0.5mg/ml 硫酸卡那霉素、0.25-0.5μg/ml两性霉素B、1-5μg/ml万古霉素。

优选地，所述无血清培养基包括：3.5-5μg/ml万古霉素。

优选地，含10％血清的培养基包括：含10％FBS的DF培养基。

第三方面，本发明提供了上述人肠癌原代细胞，或利用上述任一所述方法所培养得到的人肠癌原代细胞，在研究癌症相关疾病的发病机理中的应用。

第四方面，本发明提供了上述人肠癌原代细胞，或利用上述任一所述方法所培养得到的人肠癌原代细胞，在药物敏感性研究和检测中的应用。

第五方面，本发明提供了上述人肠癌原代细胞，或利用上述任一所述方法所培养得到的人肠癌原代细胞，在筛选或制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明公开了人肠癌原代细胞及其培养方法与应用，该人肠癌原代细胞命名为人肠癌细胞HCOC-950，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18529。与现有纯化培养过程所培养出的肿瘤原代细胞的细胞状态相比，该人肠癌原代细胞的细胞状态更好。

保藏信息

本发明所涉及的人肠癌原代细胞HCOC-950，已于2019年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center，CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC NO.18529。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的细胞形态图；

图2是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的生长曲线示意图；

图3是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞免疫荧光鉴定照片；

图4是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的染色体核型分析图；

图5是本发明一实施例提供的人肠癌原代细胞的STR基因分型图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例提供了一种人肠癌原代细胞，命名为人肠癌细胞 HCOC-950，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18529。

实施例2

实施例2用于说明人肠癌原代细胞的形态学观察。

通过在倒置显微镜下观察人肠癌原代细胞HCOC-950，可以得到如图1 所示的形态学观察结果。

请参考图1，可以发现，人肠癌原代细胞HCOC-950为上皮样细胞形态，癌细胞团中，细胞大小、形态不等，失去极性，排列紊乱，癌细胞增殖快，无接触抑制，互相挤压，呈堆叠状或镶嵌状。

实施例3

实施例3用于说明人肠癌原代细胞的生长曲线测定。

步骤3.1：人肠癌原代细胞HCOC-950汇合度达70-90％时，移除无血清培养基，用PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞至少两次，以去除旧的无血清培养基和脱落的状态不好的细胞，用1-2ml EDTA-Trypsin消化处理，并用DF10 培养基终止消化。

步骤3.2：细胞以5×10⁴/ml接种至96孔板，200μl/孔。

步骤3.3：24h后开始进行测定，以后每隔24h测定一次，分别进行吸光度测定，计算平均值。

步骤3.4：测定时用终浓度为100μg/ml的中性红染色2h，再用PBS清洗 3次后，加入中性红洗脱液(水：乙醇：乙酸＝49：50：1)震荡混匀10min，于550nm处测吸光光度值，连续测定8天。该步骤中，可以得到表1所示的生长曲线相关数据，进而得到如图2所示的生长曲线示意图。

表1

时间(天)	相对OD值(550nm)	误差
			1	0.05511	0.012506
2	0.09354	0.015263
			3	0.15381	0.012059
4	0.26264	0.02398
			5	0.36207	0.037966
6	0.43485	0.030873
			7	0.71196	0.069172
8	0.69566	0.069788

注，表1中的相对OD值为平均值。

由表1结合图1可知，在此期间，人肠癌原代细胞HCOC-950生长良好，体外培养具有稳定的细胞生长特性。

实施例4

实施例4用于说明人肠癌原代细胞的免疫荧光鉴定。

步骤4.1：人肠癌原代细胞HCOC-950汇合度达到70-90％左右，移除无血清培养基，用PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞至少两次，以去除旧的无血清培养基和脱落的状态不好的细胞，用1-2ml EDTA-Trypsin消化，接种至 48孔板。

步骤4.2：当细胞汇合度达70-90％时，去除无血清培养基，PBS清洗3 次，加入500μl/孔的冰甲醇，固定30min后移除。

步骤4.3：加入200μl/孔2.5％BSA封闭液，室温封闭60min后吸出封闭液。

步骤4.4：加入150μl/孔的一抗(CK18 1:800稀释，CR 1:1000稀释)； 37℃孵育2h后吸出。

步骤4.5：加入150μl/孔的荧光二抗(二抗Anti-Mouse-IgG-FITC 1：100 稀释；Cy3标记山羊抗兔IgG 1：500稀释)，室温避光孵育1h，吸出二抗， PBS洗涤3次。

步骤4.6：加入150μl/孔的PBS，荧光拍照，物镜×目镜(20×10)。

本实施例中，可以得到如图3所示的免疫荧光鉴定结果。

详细地，CK是上皮细胞及其肿瘤的常见标志物，上皮细胞及其来源的肿瘤细胞中只表达CK，而不表达CR。请参考图3，经免疫荧光鉴定发现，人肠癌原代细胞HCOC-950CK强表达，CR不表达，说明人肠癌原代细胞 HCOC-950来源于上皮细胞。

实施例5

实施例5用于说明人肠癌原代细胞的染色体核型分析鉴定。

步骤5.1：细胞培养

当人肠癌原代细胞HCOC-950汇合度达到70-90％时，移除无血清培养基，用PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤细胞至少两次，以去除旧的无血清培养基和脱落的状态不好的细胞，用1-2ml EDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，并将消化下来的肿瘤细胞用DF10培养基终止消化。全部消化下来后，1000rpm离心5min，移除上清。

步骤5.2：秋水仙素处理

加入浓度为300μg/ml的秋水仙素20-25μl，37℃培养箱中处理25min。

步骤5.3：低渗处理

秋水仙素处理完毕后，离心(1300rpm，10min)，弃上清液。然后加入37℃水浴的0.075mol/L的KCL溶液低渗液至10ml，用吸管吹打成细胞悬液，置37℃水浴处理30-35min。

步骤5.4：预固定

低渗处理结束在每个离心管中加入1ml的固定液，继续37℃水浴5min。

步骤5.5：离心

1300rpm离心10min，弃上清液。

步骤5.6：固定

在离心管中加入固定液6-8ml，立即用吸管轻轻吹打成单个细胞悬液，在37℃水浴中固定30min后，1300rpm离心10min，弃上清液。

步骤5.7：第二次固定

在离心管中加入固定液6-8ml，立即用吸管轻轻吹打成单个细胞悬液，在37℃水浴中固定15min后，1300rpm离心10min，弃上清液。

步骤5.8：制片

在离心管中加入新固定液0.2ml左右，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，从冰箱的冷冻室内取出冰片，调到合适悬液，每片滴加悬液1-2滴，75℃烤3h。

步骤5.9：染色

用6％Giemsa染液染色10min，然后用镊子夹出玻片，用自来水轻轻冲洗两面，室温干燥后镜检。

步骤5.10：镜检

待玻片干后，在显微镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。

该步骤中，可以得到如图4所示的染色体核型分析鉴定结果。

请参考图4，可知，人肠癌原代细胞HCOC-950经染色体核型分析鉴定为癌细胞异型核型，不同于人体正常细胞的核型。经核型分析，显示细胞的染色体数为48条，细胞为超二倍体核型的肿瘤细胞，符合人恶性肿瘤的遗传特性。

实施例6

实施例6用于说明人肠癌原代细胞的STR鉴定结果。

步骤6.1：贴壁生长的人肠癌原代细胞HCOC-950(1×10⁶个)，用PBS (0.01M，PH7.4)洗涤细胞两次，用1-2ml EDTA-Trypsin消化5-60min，10ml DF10培养基终止消化反应。

步骤6.2：10000rpm离心1min，弃上清，加200μl缓冲液GA(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮。

步骤6.3：加入20μl Proteinase K溶液，混匀。

步骤6.4：加入200μl缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。

步骤6.5：加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心。

步骤6.6：将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液。

步骤6.7：向吸附柱中加入500μl缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液。

步骤6.8：向吸附柱中加入600μl漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30s，去废液。

步骤6.9：将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50～200μl洗脱缓冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，将提取的DNA溶液收集到离心管中。

步骤6.10：利用ABI 9700PCR扩增仪(ABI公司)进行21个基因座(20 个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增。

步骤6.11：使用ABI 3130XL型遗传分析仪进行扩增片段的检测。

步骤6.12：使用GenoMapper3.2软件分析样本数据，进行自动基因分型。

该步骤中，STR分型结果可以如图5所示，检测21个基因座，以“基因座/等位基因长度”来表示：D19S433/13/14，D5S818/10/14，D21S11/30/30， D18S51/14/14，D6S1043/12/13，AMEL/X/Y，D3S1358/15/16，D13S317/8/12， D7S820/10/11，D16S539/9/10，CSFIPO/10/12，PentaD/9/9，D2S441/11/14， vWA/15/17，D8S1179/10/15，TPOX/8/11，PentaE/18/21，TH01/9/9， D12S391/19/21，D2S1338/19/25，FGA/23/24。

请参考图5，经STR基因分型鉴定，人肠癌原代细胞HCOC-950为单一人类来源，且无交叉污染的细胞。

实施例7

实施例7用于说明人肠癌原代细胞在研究癌症相关疾病的发病机理中的应用。

本实施例中，利用人肠癌原代细胞HCOC-950来研究人肠癌相关疾病的发病机理。

实施例8

实施例8用于说明人肠癌原代细胞在药物敏感性研究和检测中的应用。

本实施例中，采用CD-DST方法，研究人肠癌原代细胞HCOC-950，在药物敏感性研究和检测中的应用。

步骤8.1胶原凝胶滴培养

人肠癌原代细胞HCOC-950与凝胶构成液(Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ＝8:1:1)混合均匀，按照30μl/胶滴，3个胶滴/孔，将细胞悬液接种于6孔板中，同时在另一6孔板中接种3个胶滴，作为0-time对照组。1-2h后待胶滴凝固加入3mL DF10培养基，于37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。

步骤8.2抗癌药物接触与清洗

培养24h后加入抗癌药物，设未用药物的阴性对照孔(Control)，及临床肠癌常用药处理的阳性对照孔，同时将0-time组进行染色固定。培养相应时间后，用DF培养基清洗2次，每次15min，然后用无血清培养基继续培养5天，其中第3天更换一次培养基。

步骤8.3染色固定与扫描

第8天进行染色固定，终浓度为50μg/ml的中性红染色2h，PBS清洗细胞3次，每次5min，中性福尔马林固定45min，蒸馏水清洗15min，通风干燥，获得具有活性的肿瘤细胞。然后，用Primage图像分析系统对胶滴进行扫描分析。

该步骤中，可以得到如表2所示的药敏检测结果。

表2

药物名称	细胞存活率
		奥沙利铂+氟尿嘧啶(FOLFOX)	51.72％
卡培他滨+奥沙利铂(XELOX)	46.99％
		伊立替康+替吉奥胶囊(IRIS)	51.27％
奥沙利铂+替吉奥胶囊(SOX)	51.42％
		伊立替康+氟尿嘧啶(FOLFIRI)	45.60％

实施例9

实施例9用于说明人肠癌原代细胞在筛选或制备抗肿瘤药物中的应用。

本实施例中，利用人肠癌原代细胞HCOC-950，来筛选或制备抗肿瘤药物。

综合上述实施例2至实施例9，可知人肠癌原代细胞HCOC-950至少具有以下特点：

特点1：原代分离培养自中国人的肠癌组织，该细胞未导入任何外源基因。

特点2：显微镜下观察人肠癌原代细胞，发现细胞的大小、形态不等，失去极性，排列紊乱，无接触抑制，互相挤压，呈堆叠状或镶嵌状的上皮来源细胞。

特点3：经免疫荧光鉴定为CK强表达，CR不表达。

特点4：经核型分析鉴定为癌细胞异型核型。经核型分析，显示细胞的染色体数为48条，细胞为超二倍体核型的肿瘤细胞，符合人恶性肿瘤的遗传特性。

特点5：经STR基因分型鉴定，其为单一人类来源，且无交叉污染的细胞。

特点6：可用于人癌症相关疾病的发病机理研究、药物敏感性研究和检测，以及抗肿瘤药物研究。

实施例10

实施例10用于说明培养人肠癌原代细胞的方法。

步骤10.1：取新鲜人肠癌组织，用含10％血清的培养基，进行原代分离培养。

步骤10.2：原代分离培养出的细胞汇合度达到70-90％时，移除含10％血清的培养基，作细胞消化处理，并边消化边收集人肠癌细胞，将每次收集的人肠癌细胞均转移至放置有含10％血清的培养基的离心管中。

步骤10.3：将收集的人肠癌细胞离心并移除上清，用无血清培养基重悬，接种于细胞培养瓶中培养，以及在成纤维细胞贴壁后将未贴壁的人肠癌细胞收集起来，将收集的未贴壁的人肠癌细胞转入新的细胞培养瓶继续培养，如此反复贴壁，直至清除全部成纤维细胞，得到已纯化的人肠癌原代细胞。

本发明实施例中，步骤10.3中，优选用无血清培养基来培养细胞，而不用含10％血清的培养基。

步骤10.3中，可以在成纤维细胞贴壁后，直接吸取未贴壁的人肠癌细胞并转入新的细胞培养瓶，用无血清培养基继续培养，继续培养过程中成纤维细胞会优先贴壁，在成纤维细胞贴壁后，再次直接吸取未贴壁的人肠癌细胞并转入新的细胞培养瓶，如此循环以实现反复贴壁，直至清除全部成纤维细胞。

考虑到已纯化的人肠癌原代细胞通常可进一步作传代培养，且由于人肠癌原代细胞已纯化，故会使用无血清培养基来做传代培养。因此，步骤10.3 中使用无血清培养基来培养细胞时，反复贴壁直至清除全部成纤维细胞时的人肠癌原代细胞无需离心，即可直接转移到新的培养瓶中作传代培养，从而可以避免因离心操作对人肠癌原代细胞的损伤影响。

此外，反复贴壁直至清除全部成纤维细胞时，若人肠癌原代细胞也部分贴壁，为收集贴壁的人肠癌原代细胞，可在去除无血清培养基后，直接用 EDTA-Trypsin消化处理。

而若步骤10.3中使用含血清培养基来培养细胞时，反复贴壁直至清除全部成纤维细胞时的人肠癌原代细胞需要离心以去除含血清培养基，才可转移到新的培养瓶中作传代培养，但离心操作容易对人肠癌原代细胞的损伤影响。

此外，反复贴壁直至清除全部成纤维细胞时，若人肠癌原代细胞也部分贴壁，为收集贴壁的人肠癌原代细胞，除了需要将含血清培养基去除外，还需作清洗处理，之后才可用EDTA-Trypsin消化处理。这是因为在去除含血清培养基后，人肠癌原代细胞的表面通常还会残留含血清培养基，而含血清培养基的存在会影响消化效果。此外，与使用无血清培养基相比，使用含血清培养基时，由于还需执行清洗步骤，使得细胞培养步骤有所增加，从而增加了细胞污染的可能性。

本发明实施例中，通过边消化边收集，可以对消化下来的人肠癌细胞作及时收集并终止消化，避免因过度消化而导致细胞状态不好或是死亡。此外，基于差时贴壁法，通过反复贴壁，可以很好的去除成纤维细胞。因此，基于上述培养方法，能够快速、稳定的对肠癌细胞进行分离和纯化，从而培养得到已纯化的人肠癌原代细胞，细胞纯化清除效率提高，纯化周期缩短，污染物质少，肿瘤细胞的收获量大且纯度高，纯化培养出的细胞状态好，且培养成功率高，从而能够克服现有的人肠癌细胞株分子生物学实验结果与临床个体结果的差异很大的缺陷。

已纯化的人肠癌原代细胞的数量满足生物保藏要求时，对于该已纯化的人肠癌原代细胞，可直接取一部分作生物保藏，剩余部分可作细胞特性分析及细胞应用研究，以及可液氮封存备用。

举例来说，可以将1×10⁶个上述已纯化的人肠癌原代细胞，重悬于1～2ml 的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，然后储存于液氮中备用。其中，DMSO(Dimethylsulfoxide)为二甲基亚砜。

下面，分别说一下原代分离培养和纯化培养的具体实现步骤。

上述培养方法中，首先需要做原代分离培养。本发明实施例中，原代分离培养的具体操作步骤可以如下(a1)～(a6)所述：

(a1)将新鲜肠癌组织以清洗液清洗，去除杂质；

(a2)将步骤(a1)中处理后的肠癌组织剁成泥状；

(a3)将步骤(a2)中切碎的肿瘤组织用细胞分散酶消化，消化结束后终止反应并离心取沉淀；

(a4)将步骤(a3)的细胞沉淀中加入细胞消化液，消化结束后终止反应；

(a5)将步骤(a4)的细胞液以尼龙膜过滤，离心取沉淀；

(a6)将步骤(a5)中的细胞用DF10培养基重悬接种至细胞培养瓶中，至37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。

其中，DF10培养基为含10％FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DF 培养基。

上述培养方法中，完成原代分离培养后，即可作纯化培养。本发明实施例中，纯化培养的具体操作步骤可以如下(b1)～(b3)所述：

(b1)原代分离培养出的细胞汇合度达到70-90％时，移除DF10培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，消化时间为5-60min；

(b2)显微镜下观察，边消化边收集人肠癌细胞，将每次收集的人肠癌细胞均转移至放置有DF10培养基的离心管中；

(b3)1000rpm离心5min去上清，用无血清培养基重悬，37℃、5％CO₂细胞培养箱中放置10min-2h，成纤维细胞贴壁后再将未贴壁的人肠癌细胞收集起来，转入新的细胞培养瓶继续培养，反复贴壁2-5次，以全部清除成纤维细胞，得到已纯化的人肠癌原代细胞。

其中，EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)为乙二胺四乙酸，Trypsin 为胰蛋白酶。

本发明实施例中，优选地，所述无血清培养基包括：DF培养基，添加物为1-5mM谷氨酰胺、5-30mg/L胰岛素、5-20mg/L转铁蛋白、5-20μg/L亚硒酸钠、5-20μg/L EGF，10-100nM氢化可的松、1-5mg/ml BSA、0.1-0.5mg/ml 青霉素、0.1-0.5mg/ml硫酸卡那霉素、0.25-0.5μg/ml两性霉素B、1-5μg/ml 万古霉素。

举例来说，谷氨酰胺的浓度取值可以为1、2、3、4或5；胰岛素的浓度取值可以为5、10、15、20、25或30；转铁蛋白的浓度取值可以为5、10、 15或20；亚硒酸钠的浓度取值可以为5、10、15或20；EGF的浓度取值可以为5、10、15或20；氢化可的松的浓度取值可以为10、30、50、70或100； BSA的浓度取值可以为1、2、3、4或5；青霉素的浓度取值可以为0.1、0.2、 0.3、0.4或0.5；硫酸卡那霉素的浓度取值可以为0.1、0.2、0.3、0.4或0.5；两性霉素B的浓度取值可以为0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5；万古霉素的浓度取值可以为1、2、3、3.5、4、4.5或5。

因此，本发明实施例中，所述无血清培养基可以包括3.5-5μg/ml万古霉素。

详细地，DF培养基可以为本领域常见的DME/F-12 1:1培养基(美国 HyClone)。

详细地，EGF(Epidermal Growth Factor)为表皮细胞生长因子；BSA (Albuminfrom bovine serum)为牛血清白蛋白。

上述无血清培养基能够有效地促进人肠癌原代细胞生长，抑制成纤维细胞等杂质细胞。抗生素用于抑制微生物增殖，避免肿瘤细胞发生污染。

上述已纯化的人肠癌原代细胞的数量不多时，可以对该已纯化的人肠癌原代细胞进行传代培养，以培养出其后一代或多代的人肠癌原代细胞。培养出的任一代人肠癌原代细胞均可取一部分用于生物保藏，剩余部分可作细胞特性分析及细胞应用研究，以及可液氮封存备用。因此，可以存在下述实施例11。

实施例11

实施例11用于说明培养人肠癌原代细胞的方法。

本发明实施例中，培养方法与上述实施例10中提供的培养方法基本相同，不同之处在于：在步骤10.3中的得到已纯化的人肠癌原代细胞之后，进一步包括：

步骤11.1：用无血清培养基，培养得到的已纯化的人肠癌原代细胞。

步骤11.2：已纯化的人肠癌原代细胞汇合度达到70-90％时，移除无血清培养基，作细胞消化处理，并边消化边收集人肠癌原代细胞，将每次收集的人肠癌原代细胞均转移至放置有含10％血清的培养基的离心管中。

步骤11.3：将收集的人肠癌原代细胞离心并移除上清，用无血清培养基重悬，接种于细胞培养瓶中培养，得到传代后的人肠癌原代细胞。

本发明实施例中，由于人肠癌原代细胞已纯化，故作细胞传代培养时，可选用无血清培养基。上述已纯化的人肠癌原代细胞，即可以为初步纯化后得到的人肠癌原代细胞，也可以为对该人肠癌原代细胞传代后的任一代人肠癌原代细胞。

下面，说一下传代培养的具体实现步骤。

本发明实施例中，上述传代培养的具体操作步骤可以如下(c1)～(c4) 所述：

(c1)用无血清培养基，培养已纯化的人肠癌原代细胞；

(c2)人肠癌原代细胞汇合度达到70-90％时，用PBS洗涤细胞，再用 1-2ml EDTA-Trypsin消化，消化时间为5-60min；

(c3)边消化边收集人肠癌原代细胞，将每次收集的人肠癌原代细胞均转移至放置有DF10培养基的离心管中；

(c4)1000rpm离心5min去上清，用无血清培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，至37℃、5％CO₂培养箱中培养，得到传代后的人肠癌原代细胞。

本发明实施例中，优选地，所述人肠癌原代细胞的癌细胞倍增时间为 24-72h。在此期间，细胞生长活跃，体外培养具有稳定的细胞生长特性。

基于上述内容，由于均原代分离培养自同一肠癌组织，故利用上述任一实施例中的细胞培养方法所培养出的人肠癌原代细胞，不同之处通常仅在于细胞代数不同，均可用作生物保藏，其细胞特性与上述实施例中人肠癌原代细胞HCOC-950的细胞特性基本保持一致。

结合上述内容，通过以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

实施例12

实施例12用于说明人肠癌原代细胞的分离培养。

步骤12.1：在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集病人手术时切除的部分肠癌组织。

步骤12.2：将肠癌组织转移至细胞培养皿内，用含0.1-0.5mg/ml青霉素、 0.1-0.5mg/ml硫酸卡那霉素、0.25-0.5μg/ml两性霉素B、1-5μg/ml万古霉素的生理盐水冲洗5-8次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。

该步骤中，通过反复冲洗，可以起到杀菌抑菌、防止污染的效果。

步骤12.3：将步骤12.2中处理后的肠癌组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块处理成碎泥状。

该步骤中，通过处理为碎泥状，可便于后续消化、分离。

步骤12.4：将步骤12.3中碎泥状的肿瘤组织转移至50ml离心管中， 1500rpm离心5min；移除上清，加入9ml DF培养基进行重悬，再加入1ml 细胞分散酶(含1-10mg/ml的胶原酶Ⅰ和0.2-2mg/ml透明质酸酶)，37℃、 5％CO₂培养箱中低速振荡消化30min-2h；酶反应结束后，加20mlDF10培养基终止反应，吹散混匀，1500rpm离心5min，移除上清。

该步骤中，利用无添加物的DF培养基进行重悬，可有益于更好的消化。

步骤12.5：将步骤12.4的细胞沉淀中加入5ml细胞消化液 (EGTA-Trypsin)溶液，混匀；室温静置5min；加入20ml DF10培养基终止反应，吹散混匀。

步骤12.6：将步骤12.5的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50ml离心管中，1500rpm离心5min，移除上清。

该步骤中，过滤操作可去除掉非肿瘤组织，例如脂肪组织。

步骤12.7：将步骤12.6中的细胞用10ml含抗生素的DF10培养基重悬，至37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。这一初期培养可历时24-72h。

实施例13

实施例13用于说明人肠癌原代细胞的纯化。

步骤13.1：当步骤12.7中的细胞汇合度达到70-90％时，移除DF10培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理。

步骤13.2：显微镜下观察，边消化边收集人肠癌细胞，将每次消化下来的人肠癌细胞用DF10培养基终止消化。

步骤13.3：1000rpm离心5min，移除上清，用无血清培养基重悬，37℃、 5％CO₂细胞培养箱中放置10min-2h，成纤维细胞贴壁后再将未贴壁的肠癌原代细胞收集起来，转入新的细胞培养瓶继续培养，反复贴壁2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用，从而得到已纯化的人肠癌原代细胞。

步骤13.4：利用无血清培养基，培养步骤13.3中得到的人肠癌原代细胞。

该步骤中培养的人肠癌原代细胞，可作生物保藏、细胞特性分析、液氮冻存备用等。

步骤13.5：必要时可将1×10⁶个人肠癌原代细胞重悬于1～2ml的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。

实施例14

实施例14用于说明人肠癌原代细胞的传代培养。

步骤14.1：当培养的人肠癌原代细胞汇合度达到70-90％时，用1×PBS (0.01M，PH7.4)洗涤细胞两次，再用1-2mlEDTA-Trypsin消化5～60min。

该步骤首次执行时，该培养的人肠癌原代细胞即可以为步骤13.4中的细胞，该步骤非首次执行时，该培养的人肠癌原代细胞即可以为步骤14.3中的细胞，如此循环，即完成已纯化人肠癌原代细胞的传代培养。

步骤14.2：显微镜下观察，边消化边收集人肠癌原代细胞，将每次消化下来的人肠癌细胞用DF10培养基终止消化，直至人肠癌原代细胞全部消化下来。

步骤14.3：1000rpm离心5min，用无血清培养基重悬，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

针对步骤13.4中培养出的人肠癌原代细胞，该步骤中培养出的人肠癌原代细胞与其相比，不同之处通常仅在于细胞代数不同，细胞特性基本保持一致，故同样可作生物保藏、细胞特性分析、液氮冻存备用等。

步骤14.4：必要时可将1×10⁶个肿瘤细胞重悬于1～2ml的细胞冻存液 (90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。

步骤14.5：基于步骤14.3中培养的人肠癌原代细胞，再次执行步骤14.1～步骤14.3，如此循环，以传代培养人肠癌原代细胞，连续传代培养58天。

试验发现，人肠癌原代细胞连续传代培养至58天时，发现细胞仍能保持增殖状态正常生长。

实施例15

实施例15用于说明人肠癌原代细胞的特性分析。

本发明实施例中，利用步骤13.4中培养出的初步纯化的人肠癌原代细胞，以及利用步骤14.3中培养出的传代培养至任一代的人肠癌原代细胞，分别执行上述实施例2至实施例6中的细胞特性鉴定分析操作。

经实验发现，无论是初步纯化的人肠癌原代细胞，还是传代培养至任一代的人肠癌原代细胞，其细胞特性均与上述人肠癌原代细胞HCOC-950保持一致。

实施例16

实施例16用于说明人肠癌原代细胞的应用。

本发明实施例中，利用步骤13.4中培养出的初步纯化的人肠癌原代细胞，以及利用步骤14.3中培养出的传代培养至任一代的人肠癌原代细胞，用于人癌症相关疾病的发病机理研究、药物敏感性研究和检测，以及抗肿瘤药物研究。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.人肠癌原代细胞，其特征在于，命名为人肠癌细胞HCOC-950，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18529。

2.培养人肠癌原代细胞的方法，其特征在于，包括：

取新鲜人肠癌组织，用含10％血清的培养基，进行原代分离培养；

原代分离培养出的细胞汇合度达到70-90％时，移除含10％血清的培养基，作细胞消化处理，并边消化边收集人肠癌细胞，将每次收集的人肠癌细胞均转移至放置有含10％血清的培养基的离心管中；

将收集的人肠癌细胞离心并移除上清，用无血清培养基重悬，接种于细胞培养瓶中培养，以及在成纤维细胞贴壁后将未贴壁的人肠癌细胞收集起来，将收集的未贴壁的人肠癌细胞转入新的细胞培养瓶继续培养，如此反复贴壁，直至清除全部成纤维细胞，得到已纯化的人肠癌原代细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

在所述得到已纯化的人肠癌原代细胞之后，进一步包括：

用无血清培养基，培养得到的已纯化的人肠癌原代细胞；

已纯化的人肠癌原代细胞汇合度达到70-90％时，移除无血清培养基，作细胞消化处理，并边消化边收集人肠癌原代细胞，将每次收集的人肠癌原代细胞均转移至放置有含10％血清的培养基的离心管中；

将收集的人肠癌原代细胞离心并移除上清，用无血清培养基重悬，接种于细胞培养瓶中培养，得到传代后的人肠癌原代细胞。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，

所述无血清培养基包括：DF培养基，添加物为1-5mM谷氨酰胺、5-30mg/L胰岛素、5-20mg/L转铁蛋白、5-20μg/L亚硒酸钠、5-20μg/L EGF，10-100nM氢化可的松、1-5mg/mlBSA、0.1-0.5mg/ml青霉素、0.1-0.5mg/ml硫酸卡那霉素、0.25-0.5μg/ml两性霉素B、1-5μg/ml万古霉素。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

所述无血清培养基包括：3.5-5μg/ml万古霉素。

6.根据权利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于，

含10％血清的培养基包括：含10％FBS的DF培养基。

7.权利要求1所述的人肠癌原代细胞，或利用权利要求2至6中任一所述方法所培养得到的人肠癌原代细胞，在研究癌症相关疾病的发病机理中的应用。

8.权利要求1所述的人肠癌原代细胞，或利用权利要求2至6中任一所述方法所培养得到的人肠癌原代细胞，在药物敏感性研究和检测中的应用。

9.权利要求1所述的人肠癌原代细胞，或利用权利要求2至6中任一所述方法所培养得到的人肠癌原代细胞，在筛选或制备抗肿瘤药物中的应用。

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