CN115322967B - 一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115322967B
CN115322967B CN202210664169.1A CN202210664169A CN115322967B CN 115322967 B CN115322967 B CN 115322967B CN 202210664169 A CN202210664169 A CN 202210664169A CN 115322967 B CN115322967 B CN 115322967B
Authority
CN
China
Prior art keywords
papillary thyroid
thyroid carcinoma
immortalized
papillary
fibroblast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210664169.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115322967A (zh
Inventor
葛明华
胡啸天
孟可馨
郑国湾
忻莹
多哥·赛杜
周政
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Provincial Peoples Hospital
Original Assignee
Zhejiang Provincial Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Provincial Peoples Hospital filed Critical Zhejiang Provincial Peoples Hospital
Priority to CN202210664169.1A priority Critical patent/CN115322967B/zh
Publication of CN115322967A publication Critical patent/CN115322967A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115322967B publication Critical patent/CN115322967B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞永生化构建技术领域，具体涉及一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用。一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株，命名为人甲状腺乳头状癌成纤维细胞G‑CAF，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为C2022119。本申请人团队收集甲状腺乳头状癌患者手术标本，对肿瘤组织中的CAF进行分离、培养、纯化和鉴定，之后使用猿猴病毒（SV40）感染原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞，从而构建一株永生化的甲状腺乳头状癌成纤维细胞系，为进一步探索甲状腺乳头状癌肿瘤微环境提供稳定的体外细胞模型。

Description

一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及细胞永生化构建技术领域，具体涉及一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
申请人所在团队在甲状腺乳头状癌肿瘤-间质相互作用方向上做了许多探索，在研究过程中成功分离纯化并培养出了甲状腺乳头状癌成纤维细胞，并用于实验。但是目前关于肿瘤相关成纤维细胞(CAF)研究过程中的一个最大的可变因素就是细胞的稳定性，原代细胞往往只有特定的几代能够稳定增长，无法保证持续传代，不利于后续实验进行[1]。
通常原代细胞在离体培养一段时间后，衰老和凋亡的概率将会大大增加，促肿瘤进展的能力显著削弱，而永生化细胞可以使细胞不断分裂增殖可以多次传代，克服原代细胞增殖速度慢和传代次数短的缺点，同时保留成纤维细胞的性状。目前，国内永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞系还处于缺乏状态。
发明内容
为解决上述问题，本申请人团队收集甲状腺乳头状癌患者手术标本，对肿瘤组织中的CAF 进行分离、培养、纯化和鉴定，之后使用猿猴病毒(SV40)感染原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞[2]，从而构建一株永生化的甲状腺乳头状癌成纤维细胞系，为进一步探索甲状腺乳头状癌肿瘤微环境提供稳定的体外细胞模型。
为了实现上述的发明目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株，命名为人甲状腺乳头状癌成纤维细胞 G-CAF，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO: C2022119，保藏日期是2022年3月23日，保藏地址是中国武汉。
作为优选，所述永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株是通过使用猿猴病毒SV40感染原代人甲状腺乳头状癌成纤维细胞构建而成的。
进一步，本申请提供了一种所述的永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株的构建方法，该方法包括如下步骤：
(1)分离培养原代CAF；
(2)铺板：对原代CAF进行24孔板铺板；
(3)转染：铺板24小时后使用专用培养基常规换液；猿猴病毒SV40加入后继续培养，
12-24小时后进行换液，此时培养基换为10％FBS和DMEM/F12，继续培养；
(4)嘌呤霉素筛选：培养若干天，待细胞状态稳定后，加培养基和嘌呤霉素进行药物筛选，每天更换1次培养基，连续3-4日，将成功转染后的细胞筛出后，胰酶消化进行传代培养。
作为优选，所述步骤(2)中原代CAF铺板密度为每孔铺3x104细胞。
作为优选，所述步骤(3)中猿猴病毒SV40的病毒滴度为108TU/ml，MOI 23，加入量为每孔6.9ul。
作为优选，所述步骤(3)中专用培养基用量为每孔1ml。
作为优选，所述步骤(4)中培养基和嘌呤霉素用量为每孔1ml+2ug/L。
作为优选，所述步骤(1)中原代CAF的分离培养方法包括如下具体步骤：
(1)细胞分离：①将新鲜甲状腺乳头状癌标本转移至装有D-Hanks的15ml离心管中，冲洗肿瘤组织2-4次；②在D-Hanks溶液中剪除标本的出血坏死组织及被膜，之后将组织剪切成1mm×1mm×1mm大小的组织块，继续使用D-Hanks溶液浸泡冲洗2-4次，每次4-6min，后浸泡组织块以保持湿润；③T-25培养瓶预先以少量FBS浸润瓶底，将组织块均匀铺放于培养瓶底部，置入37℃，5％CO2的培养箱进行预贴壁3-4小时；
(2)专用培养基配制：其组分包含：FBS、DMEM/F12培养基、青霉素、链霉素、胰岛素、氢化可的松和表皮生长因子；
(3)细胞培养：①预贴壁3-4小时后，轻轻加入步骤(2)的专用培养基2-4ml浸润组织块(切忌将组织块全部浸没，以防组织块浮起)，培养前3日需每日换液，之后每隔3-4 日进行换液，连续培养26-30日；②弃去培养基，吸去组织块，加入PBS洗涤2-4次后加入2ml胰酶，37℃消化2-3分钟，再加入2ml专用培养基中和消化，200xg，3min离心，弃上清，加入1ml专用培养基重悬细胞沉淀后，于T-25培养瓶中进行传代培养。
作为优选，所述专用培养基由以下含量的组分构成：5％FBS 5ml，DMEM/F12培养基100ml， 100单位/ml青霉素+100ug/ml链霉素1ml，5ug/ml胰岛素50ul，1ug/ml氢化可的松0.1ul， 5ng/ml表皮生长因子10ul。
进一步，本申请提供了所述的细胞株和所述的构建方法在建立甲状腺乳头状癌肿瘤的体外细胞模型中的应用。
采用本技术方案的有益效果是：本发明填补了国内永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞株的空白，获得的细胞株具有和体内最接近的性状，且能够稳定提供后续实验的细胞来源，为甲状腺肿瘤生长侵袭和发展提供了极为重要的实验材料，也为建立稳定的甲状腺乳头状癌肿瘤组织细胞体外模型和进一步探索其相关功能奠定了较好的研究基础，对研究甲状腺乳头状癌的形成机理及其治疗方法具有重大意义。
附图说明
图1永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞(图1A永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞(40倍)，
图1B永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞(100倍))；
图2永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞标志物α-SMA与FAP免疫荧光(永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞为免疫荧光染色阳性，分别为α-SMA(图2A)和FAP(图2B)，细胞核用DAPI进行了反向染色)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清查、完整的描述，进而进一步解释发明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。给予本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
标本获取：
标本的来源：
2021年09月，取自我院一名36岁女性甲状腺乳头状癌患者手术后标本，患者无明显不适主诉，B超检查提示甲状腺右叶近峡部结节，ACR TI-RADS 5类，甲状腺左叶结节，ACRTI-RADS 4类，右颈部IV区淋巴结，考虑转移。增强CT检查：甲状腺右侧近峡部、甲状腺左叶结节，颈部多发淋巴结显示，右IV区强化淋巴结。总瘤体：1.2x0.8x1.4 cm，术前签署浙江省人民医院生物样本资源中心患者知情同意书。
标本获取与处理：
手术台上切除标本后，直接于无菌条件下置入无血清DMEM/F12培养基(Hyclone，美国，货号：SH30023.01)中带回实验室中，于生物安全柜中进行操作。
原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞分离纯化培养：
①将新鲜甲状腺乳头状癌标本，转移至装有D-Hanks的15ml离心管中，冲洗肿瘤组织2-4次。
②在D-Hanks溶液中剪除标本的出血坏死组织及被膜，之后将组织剪切成1mm×1mm×1mm 左右大小的组织块，继续使用D-Hanks溶液浸泡冲洗2-4次，每次4-6min，后浸泡组织块以保持湿润。
③T-25培养瓶预先以少量FBS(Biological Industries BI，lsrael，货号：04-001-1ACS)浸润瓶底，将1mm×1mm×1mm组织块以0.4cm-0.6cm间距均匀铺放于培养瓶底部。置入37℃， 5％CO2的培养箱进行预贴壁3-4小时。
原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞专用培养基配制：
①5％FBS(Biological Industries BI，lsrael，货号：04-001-1ACS)5ml；
②DMEM/F12(Hyclone，美国，货号：SH30023.01)培养基100ml；
③100单位/ml青霉素+100ug/ml链霉素1ml；
④5ug/ml胰岛素50ul；
⑤1ug/ml氢化可的松0.1ul；
⑥5ng/ml表皮生长因子10ul。
原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞的培养过程：
①预贴壁3-4小时后，轻轻加入专用培养基2-4ml浸润组织块(切忌将组织块全部浸没，以防组织块浮起)，培养前3日需每日换液，目的是将细胞碎屑进行洗脱以及提供充分营养，有利于细胞从组织块爬出，3日后，每隔3-4日进行换液，连续培养26-30日。
②连续培养26-30日后，弃去培养基，吸去组织块，加入PBS洗涤2-4次后加入2ml胰酶，37℃消化2-3分钟，再加入2ml专用培养基中和消化，200xg，3min离心，弃上清，加入1ml专用培养基重悬细胞沉淀后，于T-25培养瓶中进行传代培养。
实施例1原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞永生化过程
①铺板：对分离纯化后得到的原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞进行24孔板铺板，每孔铺3x104细胞。
②转染：铺板24小时后使用CAF专用培养基常规换液，每孔1ml。猿猴病毒SV40(病毒滴度：108TU/ml，MOI 23)6.9ul/孔加入后继续培养，12-24小时后进行换液，此时培养基换为 10％FBS((Biological Industries BI，lsrael，货号：04-001-1ACS))+DMEM/F12(Hyclone，美国，货号：SH30023.01)，继续培养。
③嘌呤霉素筛选：培养3-5天，待细胞状态稳定后，每孔1ml培养基+2ug/L嘌呤霉素进行药物筛选，每天更换1次培养基，连续3-4日，将成功转染后的细胞筛出后，胰酶消化进行传代培养。
实施例2永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞的鉴定
永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞的形态学观察：
取传代培养的永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞，在光学显微镜下观察活细胞生长情况 (4X&10X)。结果见图1A&图1B，由图1A&图1B可见：本细胞系生长旺盛，背景清晰，杂质少见，贴壁生长细胞为纤维状，4-5天可以传代。
永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞STR鉴定：
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～ 60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
胰酶消化收集P15代原代甲状腺乳头状癌成纤维细胞，用Axygen的基因组抽提试剂盒 (购自Axygen公司的AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取细胞基因组 DNA，采用21-STR扩增方案扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因 Amelogenin进行检测。
STR位点及Amelogenin位点包括：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、VWA、 TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、D12S391、FGA、D2S1338、D21S11、D18S51、 D8S1179、D3S1358、D6S1043、PENTAE、D19S433、PENTAD、D1S1656。细胞系遗传物质STR分析如表1所示。
在德国微生物菌种保藏中心DSMZ数据库(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)、美国典型培养物保藏中心(ATCC数据库)，日本JCRB细胞保藏中心，日本理化学研究所(RIKEN)进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果。即在数据库未找到与该细胞匹配的位点，表明此为新细胞株；未发现多等位点，表明此细胞株为单一细胞，无其他细胞污染。
表1永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞和Amelogenin位点的基因分型结果
永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞特异性蛋白免疫荧光染色鉴定：
胰酶消化原代永生化甲状腺乳头状癌成纤维细胞，并用专用培养基与10％FBS(BI) +DMEM/F12(HyClone)培养基对细胞进行重悬，在共聚焦小室，每孔加入100ul细胞悬液，培养24h后，多聚甲醛固定15min，吸去多聚甲醛，PBS冲洗3次，每次5min，使用一抗稀释液封闭30min，吸去后，4℃孵育一抗过夜，一抗分别为兔抗人α-SMA单克隆抗体(ab124964，Abcam，英国)，兔抗人FAP单克隆抗体(ab53066，Abcam，英国)，PBS洗去一抗，室温避光孵育荧光二抗1小时，FAP对应的荧光二抗为Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG(H+L)(YEASEN，中国，货号：34206ES60)；α-SMA对应的荧光二抗为Alexa Fluor 594标记驴抗兔IgG(H+L)(YEASEN，中国，货号：34212ES60)。PBS洗去二抗，加入DAPI(YEASEN，中国，货号：40728ES03)细胞核染色15min，PBS洗去DAPI后，共聚焦荧光显微镜观察、拍照。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
参考文献
[1]Cza B,Ip C,Pea D,et al.Cancer-associated fibroblasts indesmoplastic tumors:emerging role of integrins[J].Seminars in Cancer Biology,2020,62:166-181.
[2]Ozer H L,Banga S S,Dasgupta T,et al.SV40-mediated immortalizationof human fibroblasts[J].Experimental Gerontology,1996,31(1-2):303-310.

Claims (3)

1.一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株，命名为人甲状腺乳头状癌成纤维细胞G-CAF，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为C2022119。
2.根据权利要求1所述的一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株，其特征在于，所述永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株是通过使用猿猴病毒SV40感染原代人甲状腺乳头状癌成纤维细胞构建而成的。
3.权利要求1或2所述的细胞株在建立甲状腺乳头状癌肿瘤的体外细胞模型中的应用。
CN202210664169.1A 2022-06-13 2022-06-13 一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用 Active CN115322967B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210664169.1A CN115322967B (zh) 2022-06-13 2022-06-13 一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210664169.1A CN115322967B (zh) 2022-06-13 2022-06-13 一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115322967A CN115322967A (zh) 2022-11-11
CN115322967B true CN115322967B (zh) 2023-08-08

Family

ID=83915806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210664169.1A Active CN115322967B (zh) 2022-06-13 2022-06-13 一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115322967B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117165534B (zh) * 2023-10-31 2024-01-16 山东大学齐鲁医院 一种永生化人胃癌成纤维细胞株及其构建和增殖强化方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997018296A1 (en) * 1995-11-15 1997-05-22 University Of Utah Novel method of culturing human epithelial cells for the identification of cancer therapeutics and diagnostics
CN103361312A (zh) * 2013-06-24 2013-10-23 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法
CN107460171A (zh) * 2017-08-22 2017-12-12 浙江省肿瘤医院 人甲状腺未分化癌细胞系及其应用
CN107988160A (zh) * 2018-01-11 2018-05-04 武汉大学深圳研究院 人乳腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途
CN108795851A (zh) * 2017-04-27 2018-11-13 大连医科大学 一种人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的建立方法及其应用
CN112574946A (zh) * 2020-12-28 2021-03-30 中国科学院昆明动物研究所 一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101189329A (zh) * 2005-02-23 2008-05-28 新加坡科技研究局 无限繁殖化饲养细胞
US20110318769A1 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 National Tsing Hua University Method and composition for targeting vicious cycles of stresses and inflammatory responses
CA3221001A1 (en) * 2015-07-06 2017-01-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against esophageal cancer and other cancers

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997018296A1 (en) * 1995-11-15 1997-05-22 University Of Utah Novel method of culturing human epithelial cells for the identification of cancer therapeutics and diagnostics
CN103361312A (zh) * 2013-06-24 2013-10-23 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种甲状腺乳头状癌组织中巨噬细胞的分离方法
CN108795851A (zh) * 2017-04-27 2018-11-13 大连医科大学 一种人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的建立方法及其应用
CN107460171A (zh) * 2017-08-22 2017-12-12 浙江省肿瘤医院 人甲状腺未分化癌细胞系及其应用
CN107988160A (zh) * 2018-01-11 2018-05-04 武汉大学深圳研究院 人乳腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途
CN112574946A (zh) * 2020-12-28 2021-03-30 中国科学院昆明动物研究所 一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人甲状腺乳头状癌原代细胞的体外长期培养;边学海;赵吉生;张秀英;张纯海;付言涛;赵丽娜;孙辉;郑泽霖;;中国普外基础与临床杂志(08);62-65 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115322967A (zh) 2022-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115322967B (zh) 一种永生化人甲状腺乳头状癌成纤维细胞株及其构建方法和应用
CN109486765B (zh) 一种nf2-/-前庭神经鞘瘤施旺细胞系的建立方法及其细胞系
CN111718995A (zh) 一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记
CN110846280B (zh) 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用
CN107541494B (zh) 一种人胆管癌细胞系及其应用
CN111925985B (zh) 间充质干细胞的驯化培养方法
CN107460171B (zh) 人甲状腺未分化癌细胞系及其应用
CN111004782B (zh) 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用
CN116694570A (zh) 一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用
CN115651887A (zh) 一种人正常角膜上皮细胞的应用
CN117165534B (zh) 一种永生化人胃癌成纤维细胞株及其构建和增殖强化方法
CN113444679B (zh) 一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用
CN110904043B (zh) 人肠癌原代细胞、应用和培养方法
CN113817683A (zh) 一种肺癌类器官的培养基及其应用
CN1810957A (zh) 一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法
CN112695015A (zh) 一种永生化脐带间充质干细胞的制备方法及其外泌体制备方法和应用
CN113817684A (zh) 一种具有高淋巴结转移潜力的中国人肺腺癌细胞系及应用
CN113430170B (zh) 人肠癌原代细胞及其培养方法、应用
CN113278589A (zh) 人肠癌原代细胞及其培养方法、应用
CN112831472B (zh) 人胸腺瘤原代细胞及其培养方法、应用和无血清培养基
CN114134118B (zh) 一种永生化人喉环后区细胞及其构建方法
CN118240883B (zh) 一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法
CN114015655B (zh) 一种hbrca-959细胞系及其培养方法和应用
CN108285887B (zh) 人正常结膜上皮细胞及其用途
CN117327656A (zh) 人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm及构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant