CN107460171A - 人甲状腺未分化癌细胞系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人甲状腺未分化癌细胞系及其应用，其命名为人甲状腺未分化癌细胞ZJB‑ATC1，于2017年03月31日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201753。本发明的人甲状腺未分化癌细胞系，可长期体外传代，大量扩增，具有较强的增殖活性；分化类型为未分化，可作为有效的研究细胞模型，为研究者深入开展人甲状腺未分化癌的病因学、转移机制、耐药机理、新药筛选等提供新的实验模型。

Description

人甲状腺未分化癌细胞系及其应用
技术领域
本发明属于细胞系领域，具体涉及人甲状腺未分化癌细胞系及其应用。
背景技术
甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)是恶性程度(致死率)较高的实体性肿瘤，其发病率不超过甲状腺癌的5％，但死亡率占甲状腺癌的50％(甲状腺未分化癌死亡患者占甲状腺癌死亡患者的一半)。由于甲状腺未分化癌病程发展迅猛，确诊时往往局部已侵犯周围的器官，如气管、食管、血管、肌肉等，且约50％病人已有肺、骨、脑、肝等远处转移，即使给予积极的治疗，也仅极少病人能长期生存，一般从诊断到死亡的中位生存期仅4～8个月。UICC、AJCC将所有ATC都分为Ⅳ期。ATC可采用手术、放疗、化疗、靶向治疗等治疗方式，但各治疗手段往往不能控制疾病的进展，目前仍然缺乏标准治疗模式。
人恶性肿瘤细胞系的建立，为了解肿瘤的生物学特性、研究其癌变、分子遗传以及转移演变机制等提供丰富的实验材料，从而为建立标准治疗模式提供帮助。由于甲状腺未分化癌发病率低、死亡率高，进行大样本的随机对照研究较困难，因此，丰富甲状腺未分化癌细胞株库具有重要作用。目前甲状腺未分化癌细胞系种类较少，甲状腺未分化癌常用永生细胞系主要为CAL-62、8305C、KMH-2、DRO、FRO等。Rebecca E.Schweppe通过STR方法对ATC细胞库中40株甲状腺癌细胞进行DNA分析，研究结果发现仅23株保持独立的基因型，其他株细胞系被污染或为其他细胞系来源，其中，甲状腺未分化癌DRO90-1为黑色素瘤A-375细胞系来源；甲状腺未分化癌ARO81-1为结肠癌细胞系HT-29衍生物，甲状腺未分化癌细胞系库告急。因此，迫切需要科研工作者建立新的人甲状腺未分化癌细胞系，从而建立较为完备的甲状腺未分化癌细胞系库，为研究肿瘤异质性提供合适的体外模型。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种人甲状腺未分化癌细胞系及其应用，该人甲状腺未分化癌细胞系能够大量扩增，且可长期在体外传代培养。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
人甲状腺未分化癌细胞系，命名为人甲状腺未分化癌细胞ZJB-ATC1，于2017年03月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C201753。
本发明还提供如上所述的人甲状腺未分化癌细胞系的子代细胞系。
在本发明的一些实施例中，如上所述人甲状腺未分化癌细胞系或其子代细胞系中，CK表达为阳性(+)，CD68表达为阴性(－)，DES表达阴性(－)，Ki67表达为阳性(+,60％)，Pax-8表达为阴性(－)，SMA表达阴性(－)，TG表达为阴性(－)，TTF1表达为阴性(－)。
本发明还提供如上所述人甲状腺未分化癌细胞系或其子代细胞系在作为人甲状腺未分化癌的细胞模型中的应用。
本发明还提供如上所述人甲状腺未分化癌细胞系或其子代细胞系在研究人甲状腺未分化癌发生、发展、转移机理中的应用。
本发明还提供如上所述人甲状腺未分化癌细胞系或其子代细胞系在研究人甲状腺未分化癌的耐药机理或筛选治疗人甲状腺未分化癌药物中的应用。
本发明中，提供了一种人甲状腺未分化癌细胞系的建立方法：获取甲状腺未分化癌患者的癌组织标本进行酶消化原代培养，原代培养3周进行单细胞悬液克隆纯化，后开始每周传代1次，持续稳定培养至今，已传代数50代以外，活性较强且能稳定传代，命名该甲状腺未分化癌细胞系为ZJB-ATC1。
本发明通过光学形态观察发现该人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1贴壁细胞纤维形，且细胞性状稳定，可稳定多次传代。该人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1的病理学鉴定表明其与标本组织形态相同：细胞呈圆形，核浆比例大，核仁较明显，核膜清晰，核分裂像比较多，确定为癌组织来源细胞，且判定为未分化细胞株。该人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1的CK(光谱细胞角质蛋白)、CD68、DES(结蛋白)、Ki67(Ki67核抗原)、Pax-8(配对盒基因8)、SMA(肌动蛋白)、TG(甲状腺球蛋白)、TTF1(甲状腺转录因子1)免疫组化分析结果为：CK表达为阳性(+)，CD68表达为阴性(－)，DES表达阴性(－)，Ki67表达为阳性(+,60％)，Pax-8表达为阴性(－)，SMA表达阴性(－)，TG表达为阴性(－)，TTF1表达为阴性(－)，同时结合HE染色结果，证实ZJB-ATC1为甲状腺未分化癌株。通过对该人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1进行遗传物质STR分析，并在数据库中进行STR序列检索，未发现与该细胞匹配的位点，鉴定其为新的单一细胞株。同时，本发明研究还表明该人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1大量扩增，具有较强的增殖活性。
综合可见，本发明人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1作为新的单一细胞株，丰富了人甲状腺未分化癌细胞系库；同时，其能够稳定传代，且能大量扩增和长期在体外传代培养，可作为有效的研究细胞模型，为研究者深入开展甲状腺未分化癌的病因学、转移机制、耐药机理、新药筛选等提供新的实验模型。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明的人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1贴壁细胞纤维形，且细胞性状稳定，可稳定多次传代。
(2)本发明的人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1经STR鉴定为新的单一细胞株。
(3)本发明的人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1为未分化细胞株，丰富人甲状腺未分化癌细胞系库。
(4)本发明的人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1，具有较强的增殖活性，能大量扩增和长期在体外传代培养，可作为有效的研究细胞模型，可为研究者深入开展甲状腺未分化癌的病因学、转移机制、耐药机理、新药筛选等提供新的实验模型。
生物材料的保藏
本发明的人甲状腺未分化癌细胞系，命名为人甲状腺未分化癌细胞ZJB-ATC1，于2017年03月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201753。
附图说明
图1A～图1D依次分别为实施例1得到的ZJB-ATC1细胞系P0、P6、P17、P50代细胞的光学形态图片，放大倍数为40倍。
图2为实施例1得到的ZJB-ATC1细胞系的细胞生长曲线图。
图3A和图3B分别为实施例1中ZJB-ATC1细胞系与原组织(临床甲状腺未分化癌细胞组织标本)的HE染色图片，放大倍数为40倍。
图4A1、图4A2为分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的CK检测结果。
图4B1、图4B2分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的CD68表达检测结果。
图4C1、图4C2分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的DES表达检测结果。
图4D1、图4D2分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的Ki67表达检测结果。
图4E1、图4E2分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的Pax-8表达检测结果。
图4F1、图4F2分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的SMA表达检测结果。
图4G1、图4G2分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的TG表达检测结果。
图4H1、图4H2分别为ZJB-ATC1细胞、患者甲状腺未分化癌细胞组织的TTF1表达检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。
下列实施例中未特别说明的各种仪器、原料和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。在下列实施例中列出的所使用的具体材料及其来源，仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
实施例1：ZJB-ATC1细胞系的建立
1.1标本的来源：
2016年04月，取自我院一名72岁甲状腺未分化癌患者手术后标本，患者主诉1月前无明显诱因出现咳嗽，少量痰，无发热，CT检查：双肺多发结节，转移瘤考虑，甲状腺来源可能，升主动脉瘤样扩张，总瘤体：7x 6x 4.5cm，伴简质胶原化，累犯周围纤维组织，术前签署患者知情同意书。
1.2标本处理：
取手术切除的新鲜甲状腺未分化癌标本，生理盐水冲洗3次，剪除出血坏死组织，4℃下PBS(含青霉素500IU/mL，链霉素500μg/mL，两性霉素B 5μg/mL)浸泡10min，生理盐水反复漂洗标本共计3次。
无菌条件下将甲状腺未分化癌组织剪切成1mm×1mm左右大小的组织块，在剪切过程中，需向组织块上滴加1～2滴DMEM/F12培养基(购自Gibco)，以保持湿润；
组织剪切后，将组织置于15mL无菌离心管，加入5mL终浓度0.1％(w/v)胶原酶(购自Sigma，美国)，0.125％(w/v)胰蛋白酶-EDTA(购自Gibco，美国)，37℃振荡消化4h，加5mL含10％(v/v)胎牛血清DMEM/F12+RPIM1640+DMEN/HIGH GLUCOSE(DMEM/F12：RPIM1640：DMEN/HIGH GLUCOSE＝2:2:1)(购自Gibco，货号:12400-024)，混匀静置15min；
采用70μm无菌滤膜过滤，收集过滤液，1000r/min离心5min弃上清；PBS清洗1次，离心收集细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养4周，培养基为DMEM/F12+10％(v/v)FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+5mg/L氢化可的松。
1.3单克隆纯化：
挑取活力较强的细胞区，制为10个细胞/mL的单细胞悬液，各取100μL置于96孔板中培养，制成单细胞增殖孔，进行单克隆纯化；
获得单克隆细胞团，采用0.25％(w/v)胰蛋白酶消化1min后进行扩大培养,培养基为DMEM/F12+RPIM1640+DMEN/HIGH GLUCOSE(DMEM/F12：RPIM1640：DMEN/HIGH GLUCOSE＝2:2:1)+10％(v/v)FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+5mg/L氢化可的松，于37℃、5％CO2培养箱中。每周传代1次，目前细胞生长良好，形态较为均一。传代至50代以上。
将上述株人甲状腺未分化癌细胞系命名为人甲状腺未分化癌细胞ZJB-ATC1。人甲状腺未分化癌细胞ZJB-ATC1已于2017年03月31日保藏在于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201753。
实施例2：ZJB-ATC1细胞系的生物学特性及应用
a.ZJB-ATC1细胞系的形态学观察
取传代培养的ZJB-ATC1细胞，在光学显微镜下(日本Olympus IMT-2倒置显微镜)观察活细胞生长情况(40×)。结果见图1A～图1D，图1A～图1D依次分别为ZJB-ATC1细胞系P0、P6、P17、P50代细胞光学形态图片，由图1A～图1D可见：本细胞系生长旺盛，背景清晰，杂质少见，贴壁生长细胞为纤维状，4-5天可以传代。
b.ZJB-ATC1细胞系的遗传物质STR分析
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
胰酶消化收集P30代ZJB-ATC1细胞，用Axygen的基因组抽提试剂盒(购自Axygen公司的AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取细胞基因组DNA，采用20-STR扩增方案扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。
STR位点及Amelogenin位点包括：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、VWA、TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、D12S391、FGA、D2S1338、D21S11、D18S51、D8S1179、D3S1358、D6S1043、PENTAE、D19S433、PENTAD。ZJB-ATC1细胞系遗传物质STR分析如表1所示。
在德国微生物菌种保藏中心DSMZ数据库(Deutsche SammlungvonMikroorganismen und Zellkulturen)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库，进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果。即，在数据库未找到与该细胞匹配的位点，表明此为新细胞株；未发现多等位点，表明此细胞株为单一细胞，无其他细胞污染。
表1：ZJB-ATC1细胞系的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果
c.ZJB-ATC1细胞系的生长动力学研究
取传代对数生长细胞制成1×104细胞/mL细胞悬液，按每孔100μL体积接种于96孔板中，依次采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法检测0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天孔板细胞增殖情况。CCK-8检测方法参照试剂盒说明书，配置体积比为1：9(CCK-8原液：培养基)CCK-8工作液，每孔加入100μL，37℃，5％CO2培养箱孵育2小时，450nm处获得OD值。绘制的ZJB-ATC1细胞系生长曲线如图2所示。
由图2可知，ZJB-ATC1细胞系第1、2、3、4、5、6天进入倍增状态，第7天进入平台期稳定期，具有较强增殖能力。
d.ZJB-ATC1细胞系的病理学鉴定
(ⅰ)将实施例1的ZJB-ATC1细胞和临床甲状腺未分化癌手术组织标本按以下步骤进行石蜡包埋切片和HE染色：
ZJB-ATC1细胞系蜡块处理程序
0.25％(w/v)胰蛋白酶消化P30代ZJB-ATC1细胞培养标本，用低速自动平衡离心机(LD-Z5-2北京)3000转/分，离心5分钟以每分钟3000转离心10分钟；弃除上清，滴加1ml10％中性缓冲福尔马林固定5h后，将底部沉淀标本以茶叶滤纸包裹；采用75％、80％、95％、95％、100％、100％乙醇依次脱水2h；采用二甲苯透明30min，操作2次；入60℃石蜡，浸蜡2h；采用德国徕卡JUNG包埋机包埋；采用德国徕卡2135石蜡切片机切片，厚度4μm；60℃烤箱，烤片1小时；采用德国徕卡ST5020染色机染色；采用德国徕卡CV5030封片机封片。
临床甲状腺未分化癌标本组织蜡块处理程序
将组织切为约1cm×1cm×0.3cm大小，置于组织包埋盒中，采用10％中性缓冲福尔马林固定；采用75％、80％、95％、95％、100％、100％乙醇依次脱水2h；采用二甲苯透明30min，操作2次；入60℃石蜡，浸蜡2h；采用德国徕卡JUNG包埋机包埋；采用德国徕卡2135石蜡切片机切片，厚度4μm；60℃烤箱，烤片1小时；采用德国徕卡ST5020染色机染色；采用德国徕卡CV5030封片机封片。
(ⅱ)在光学显微镜下(日本Olympus IMT-2正置显微镜)进行显微拍照，对比观察ZJB-ATC1细胞与临床甲状腺未分化癌组织标本的HE染色图片(40×)，结果分别如图3A和图3B所示。由病理科三位诊断医生分别判读，对它们的病理诊断结果为：ZJB-ATC1细胞系形态与临床甲状腺未分化癌组织标本形态相同，细胞呈圆形，核浆比例大，核仁较明显，核膜清晰，核分裂像较多，确定为患者癌组织来源细胞，且判定为未分化细胞株。
e.ZJB-ATC1细胞系和患者组织的免疫组化分析
按照上述步骤d中(ⅰ)的方法制作ZJB-ATC1细胞系细胞蜡块和临床患者甲状腺未分化癌标本组织蜡块，4μm切片60℃烤片1小时后，采用二甲苯进行脱蜡处理，3％(质量百分含量)H2O2孵育10分钟后；采用小鼠PV两步免疫组化试剂盒测定(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-6002)；分别滴加小鼠来源一抗(CK、CD68、DES、Ki67、Pax-8、SMA、TG、TTF1)，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，2分钟3次；滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育20分钟，PBS冲洗，2分钟3次；用DAB显色1分钟后，自来水充分冲洗；采用德国徕卡CV5030封片机封片。
ZJB-ATC1细胞系和临床患者甲状腺未分化癌标本组织的CK(光谱细胞角质蛋白)、CD68、DES(结蛋白)、Ki67(Ki67核抗原)、Pax-8(配对盒基因8)、SMA(肌动蛋白)、TG(甲状腺球蛋白)、TTF1(甲状腺转录因子1)免疫组化分析结果如图4A1～图4H2所示。其中，图4A1为ZJB-ATC1细胞系的CK检测，表达为阳性(+)；图4A2为患者甲状腺未分化癌标本组织的CK检测，表达为阳性(+)；图4B1、图4B2分别为ZJB-ATC1细胞、患者组织的CD68表达检测，表达均为阴性(－)；图4C1、图4C2分别为ZJB-ATC1细胞、患者组织的DES表达检测，表达均为阴性(－)；图4D1、图4D2分别为ZJB-ATC1细胞、患者组织的Ki67表达检测，表达均为阳性(+,60％)；图4E1、图4E2分别为ZJB-ATC1细胞、患者组织的Pax-8表达检测，表达均为阴性(－)；图4F1、图4F2分别为ZJB-ATC1细胞、患者组织的SMA表达检测，表达均为阴性(－)；图4G1、图4G2分别为ZJB-ATC1细胞、患者组织的TG表达检测，表达均为阴性(－)；图4H1、图4H2分别为ZJB-ATC1细胞、患者组织的TTF1表达检测，表达均为阴性(－)。
由病理科三位诊断医生分别判读，CK表达为阳性，符合甲状腺未分化癌细胞蛋白表达特征；CD68可区分单核/巨噬细胞，表达为阴性，表明无巨噬细胞污染；Des为细胞中间丝蛋白，广泛存在于骨骼肌、平滑肌来源的肿瘤，该细胞表达为阴性，排除梭型肌细胞及肉瘤细胞等；Ki67为细胞增殖指数，与许多肿瘤的分化、浸润、转移以及预后密切相关，ZJB-ATC1组织及细胞系Ki67表达量高，细胞增殖活性强；Pax-8表达为阴性；SMA为肌动蛋白，主要梭形细胞、纤维肌细胞或肉瘤等，表达为阴性，则无杂细胞污染。综上，结合HE染色及免疫组化结果，证实ZJB-ATC1为甲状腺未分化癌细胞株，且无其他细胞污染。
综合以上实验观察与验证，上述人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1贴壁细胞纤维形，细胞性状稳定，可稳定多次传代。免疫组化分析和病理学鉴定表明其与标本组织形态相同，为甲状腺未分化癌细胞株，没有其他细胞(如纤维细胞及平滑肌细胞等)污染。遗传物质STR鉴定该细胞为新的单一细胞株。该人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1能大量扩增，具有较强的增殖活性。该人甲状腺未分化癌细胞系ZJB-ATC1可作为有效的研究细胞模型，为研究者深入开展甲状腺未分化癌的病因学、转移机制、耐药机理、新药筛选等提供新的实验模型。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (5)

1.人甲状腺未分化癌细胞系，其特征在于，命名为人甲状腺未分化癌细胞ZJB-ATC1，保藏编号为CCTCC NO：C201753。
2.如权利要求1所述人甲状腺未分化癌细胞系的子代细胞系。
3.如权利要求1所述人甲状腺未分化癌细胞系或如权利要求2所述子代细胞系在作为人甲状腺未分化癌的细胞模型中的应用。
4.如权利要求1所述人甲状腺未分化癌细胞系或如权利要求2所述的子代细胞系在研究人甲状腺未分化癌发生、发展、转移机理中的应用。
5.如权利要求1所述人甲状腺未分化癌细胞系或如权利要求2所述的子代细胞系在研究人甲状腺未分化癌的耐药机理或筛选治疗人甲状腺未分化癌药物中的应用。
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