CN117004571A - 一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系cbc2t-2及应用 - Google Patents

一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系cbc2t-2及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117004571A
CN117004571A CN202310941999.9A CN202310941999A CN117004571A CN 117004571 A CN117004571 A CN 117004571A CN 202310941999 A CN202310941999 A CN 202310941999A CN 117004571 A CN117004571 A CN 117004571A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell line
human
cell
cbc2t
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310941999.9A
Other languages
English (en)
Inventor
孟文勃
姜宁祖
白明圳
黄崇斐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Hospital of Lanzhou University
Original Assignee
First Hospital of Lanzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Hospital of Lanzhou University filed Critical First Hospital of Lanzhou University
Priority to CN202310941999.9A priority Critical patent/CN117004571A/zh
Publication of CN117004571A publication Critical patent/CN117004571A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T‑2及其子代细胞系的应用，所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T‑2于2022年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022273；该细胞系是人源的，且建系时间较短，生物遗传性状稳定，增殖、愈合、侵袭、迁移能力较强，可以用于研究人肝门部胆管癌肉瘤的发病机制；所述的细胞系能在小鼠体内可形成肿瘤，具有致瘤性，可研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性提供新的试验材料。

Description

一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2及其子代细胞系的应用。
背景技术
胆管癌肉瘤(Cholangiocarcinoma sarcoma)是一种罕见的胆管恶性肿瘤，由癌和肉瘤组成。癌肉瘤多见于老年患者，多发于食管、甲状腺、乳腺、肺、膀胱、胰腺、卵巢，少发与肝与胆囊，发生在胆管的更少，伴有软骨细胞的胆管癌肉瘤临床罕见，肿瘤分化差、侵袭性强，预后极差。癌肉瘤的病理特征是肿瘤组织同时具有上皮和间充质成分，肉瘤成分通常由未分化的梭形细胞和多种异质成分组成，如软骨、骨、平滑肌、横纹肌肉瘤细胞。癌成分通常由腺癌组成，少有鳞癌、小细胞癌和未分化癌等。组织之间界限清晰，没有转化。胆管癌肉瘤发病机制存在多种假说，最多见的理论是“全能干细胞理论”，即单克隆假设，癌肉瘤起源于低分化的全能干细胞。还有“碰撞肿瘤理论”与“化生理论”等理论，即多克隆假设，认为在同一组织中，上皮细胞和间充质细胞恶性增殖或癌化生为肉瘤。最近新假设“上皮-间充质转(EMT)”，认为在EMT发生过程中，癌细胞失去上皮特性和细胞间粘附，转变为间充质细胞，并获得迁移能力。但是，目前尚不清楚胆管癌肉瘤的发病机制，更没有研究清除胆管癌肉瘤的治疗方案。
细胞系是一种有效的体外模型系统，可以用于评估癌细胞的特征，基于它们的特性，使细胞成为原发肿瘤的直接后代。胆管癌的细胞系建立已经比较成熟，例如发明专利CN104560878B建立了人肝内胆管癌细胞系LICCF，为揭示人肝内胆管癌耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物以及筛选人肝内胆管癌相关生物标志物提供了实验基础。发明专利CN115125213A建立了肝内胆管癌细胞系mIC-22，填补目前国内肝内胆管癌研究缺乏稳定小鼠体内外模型的空白，可直接用于体内外小鼠肝内胆管癌模型的构建。但是，目前并没有建立一个合理且有效的胆管癌肉瘤的原代细胞系。
针对上述技术问题，发明人所在的课题组在手术过程中获得了一个胆管癌肉瘤标本，成功分离提取了胆管癌肉瘤的原代细胞系，在胆管癌肉瘤细胞系中实现零的突破，对于研究胆管癌肉瘤提供了很好的实验模型，具有很高的临床价值。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2于2022年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2022273。
本发明的第二目的是提供一种所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2的子代细胞系。
优选的，所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，所述的细胞系具有裸鼠皮下成瘤能力。
本发明的第三目的是提供所述的细胞系的应用，所述的应用选自：
(1)用于研究胆管癌肉瘤发病机制、发展和转移的机理；
(2)用于构建人肝门部胆管癌肉瘤的动物模型；
(3)筛选或评估治疗肝门部胆管癌的药物；
(4)构建耐药细胞模型；
(5)构建肝门部胆管癌动物模型的细胞试剂；
(6)筛选肝门部胆管癌相关生物标志物或鉴定分子靶点；或
(7)研究肝门部胆管癌耐药机制。
本发明的第四目的是提供一种药物的抑制人肝门部胆管癌肉瘤的活性的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将待测药物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的药物为具有抑制胆管癌肉瘤活性的药物，其中所述的细胞模型是所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2。
本发明的第五目的是提供一种用于研究分析人肝门部胆管癌肉瘤细胞系或用于建立人肝门部胆管癌肉瘤细胞系动物模型的试剂盒，所述的试剂盒中包括容器，以及装于容器中的所述的细胞。
本发明的第六目的是提供所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2的制备方法，包括如下步骤：
(1)标本采集及保存：在胆管组织中，取自瘤体增生活跃的表层部分的肿瘤组织；
(2)原代培养：肿瘤组织经PBS洗涤三次，机械剪碎，IV胶原酶消化，离心及洗涤；
(3)采用机械刮除法纯化细胞：原代培养成功后，上皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞多数同时出现和混杂生长，这种混杂生长往往分区呈片，CAF都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上；
(4)扩大培养：待细胞汇合度达80％以上时进行传代培养，加入0.25％胰蛋白酶，使之脱离瓶壁形成细胞悬液，离心重悬接种于用含10％胎牛血清的DMEM培养瓶继续培养。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2022273。
(2)肿瘤组织离体培养的原代细胞，细胞增殖活跃，镜下细胞存在两类细胞形态，一种典型的多边形胆管癌细胞形态，另一种是长梭形肉瘤软骨肉瘤的细胞形态。
(3)所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2已传代至100代左右，生长状态良好，细胞经过冻存复苏后仍具有良好的活力，已能永生化。细胞倍增时间约为47.11h，所述人胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2在临床诊断为肝门部胆管癌肉瘤(低分化腺癌90％，软骨肉瘤10％)，人胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2在临床诊断时同时具有上皮和间质两种成分特性，即表达上皮成分如CK19和间质成分如Vimention、Desmin、CD117和CD56。
(4)该细胞系是中国人来源的，且建系时间较短，生物遗传性状稳定，以该人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2作为研究模型，对于了解人群的人肝门部胆管癌肉瘤的发病机制有很大帮助。
(5)所述人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2在支原体检测试剂盒检测时，PCR结果为阴性，未受到支原体污染；所述细胞系增殖、愈合、侵袭、迁移能力较强，可以用于研究人肝门部胆管癌肉瘤的发病机制。
(6)本发明所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，该细胞能在小鼠体内可形成肿瘤，具有致瘤性，可研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性提供新的试验材料。
附图说明
图1为人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2形态学结果注：A为CBC2T-2细胞在初代、1代、10代、20代和50代的明视野形态(A 100倍)；B为SEM和TEM电子显微镜观察细胞超微结构(500倍，1500倍，3000倍)；C为CBC2T-2细胞的流式细胞术；D-E CBC2T-2细胞的生长曲线。
图2为人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2成球能力、迁移和侵袭结果注：A为第7天和第14天CBC2T-2细胞成球能力的代表性图像；B-C为24小时和48小时后CBC2T-2和TFK-1细胞的划痕愈合结果；D为Transwell实验检测CBC2T-1和TFK-1细胞的迁移和侵袭能力的代表性图像；E-F为CBC2T-1和TFK-1细胞克隆形成的代表性图像。(其中A，B，D，E放大100倍)。
图3为细胞遗传学分析和STR特征注：A为染色体核型分析显示细胞为多倍体，染色体结构和数目存在差异；B为CBC2T-2细胞的短片段重复序列(STR)鉴定结果。
图4为人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2的成瘤实验结果注：A为瘤子标本；B为瘤子体积生长曲线；C为小鼠体重增长曲线；D为病人原发肿瘤组织、小鼠移植瘤和细胞系CBC2T-2的免疫组化(100倍)
图5为体外测试多个一线治疗用药对人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2的抑制作用注：A为紫杉醇(Paclitaxel)的药物抑制曲线；B为吉西他滨(Gecitabine)的药物抑制曲线；C为5-氟尿嘧啶(5-Fu)的药物抑制曲线；D为顺铂(Cis-platinum)的药物抑制曲线；E为奥沙利铂(Oxaliplatin)的药物抑制曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系建立过程
标本采集在病理医师的指导下进行，以免影响病理报告的诊断。用磷酸盐缓冲盐溶液，用无菌刀片切成1～2mm3块，用IV型胶原酶(0.1mg/m)在37℃培养箱中保存10min。然后将沉淀物接种于6孔板中，以一定比例(10％胎牛血清(FBS；1％的青霉素和链霉素(Gibco)，89％的杜尔贝科改良鹰培养基：F-12(DMEM/F-12)。在37℃和5％CO2的湿化培养箱中培养细胞。连续培养时，细胞定期传代，并定期冷冻于液氮中。培养过程中无其他细胞或外来微生物污染。细胞株CBC2T-2建立过程中不添加任何外源性生长因子或刺激性细胞因子。
所述的细胞株CBC2T-2命名为人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，于2022年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:C2022273，电话：027-68752319；E-mail：cctcc@whu.edu.cn。
实施例2、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞镜检
肝门部胆管癌肉瘤(低分化腺癌90％，软骨肉瘤10％)，苏木精和伊红染色显示，镜下上皮异性增生，呈条索状、巢状、腺样排列，细胞体积增大，核大深染，可见病理性核分裂象，局部可见大量粘液及粘液软骨，癌细胞浸润生长，侵及周围脂肪组织，可见神经侵犯及脉管内癌栓，周围淋巴结可见转移癌(1/1)。AJCC-pTNM分期：T2aN2Mx。第7组淋巴结可见转移癌(2/4)。组织学显示出两种明显分离的上皮和间充质成分，即腺癌和梭形细胞组成的软骨肉瘤。
如图1A所示，为肿瘤组织离体培养的原代细胞，细胞增殖活跃，镜下细胞存在两类细胞形态，一种典型的多边形胆管癌细胞形态，另一种是长梭形肉瘤软骨肉瘤的细胞形态见图1B。上述细胞系目前已传代至100代左右，生长状态良好，细胞经过冻存复苏后仍具有良好的活力，已能永生化。图1B透射电子显微镜(TEM)显示细胞中含有许多线粒体、粗面内质网、核糖体和核膜上有深凹痕的不规则细胞核，扫描电子显微镜(SEM)显示细胞表面有微绒毛样突起、紧密连接和细胞间桥。
当细胞传至30代以上，细胞性状逐渐稳定，可以进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。
实施例3人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的细胞周期
取对数生长期的肿瘤细胞(p15)，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12培养基中，制备成单细胞悬液。收集到离心管内1000g左右离心3-5min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液以避免吸走细胞。加入约1m冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5mL离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。细胞固定：加入1mL冰浴预冷的75-80％乙醇，轻轻吹打混匀，对于易成团的细胞，要一边加入乙醇一边震荡混匀。固定1-2h可以进行检测。预冷PBS洗两次，1000rpm离心5min，调整细胞浓度为1×106/mL。加入0.5mL碘化丙啶，4℃避光染色30min。用流式细胞仪在535nm激发波长和615nm发射波长的通道检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析，每份样品检测1×104/ml个细胞。
如图1C所示，人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的细胞周期，细胞增殖活跃，适用于胆管癌肉瘤体外2D模型研究。
实施例4、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的倍增时间与细胞成像
取对数生长期的肿瘤细胞(p15)，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12培养基中，制备成单细胞悬液并血小板计数板进行计数，经浓度调整后获得终浓度为5000个/100μl的细胞悬液；将其接种在96孔板中，每孔100μl，每组设3个复孔，将96孔板放入Cytation5细胞成像工作站中，选择每孔拍摄视野，每2小时拍摄一张照片，连续拍摄120小时。
如图1D所示，为实时活细胞成像生长曲线图。本发明的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，通过活细胞成像计数测得，细胞倍增时间为47h。
实施例5、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的倍增时间
取对数生长期的肿瘤细胞(p15)，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12培养基中，制备成单细胞悬液并血小板计数板进行计数，经浓度调整后获得终浓度为5000个/100μl的细胞悬液；将其接种在96孔板中，每孔100μl，每组设5个复孔，另设只加100μl培养基的5复孔作为空白对照；置于恒温培养箱中，在37℃，5％CO2和饱和湿度下培养。于0、24、48、72、96、120h时间点按1：10的比例加入CCK-8液，37℃细胞培养箱孵育2h，随后于450nm处测定吸光值。
如图1E所示，细胞生长曲线的横轴为时间，纵轴为吸光度。采用倍增时间软件(PDT)(http://www.doubling-time.com)实现的计算细胞倍增时间。CBC2T-2细胞的倍增时间约为47.11h，增殖时间较短，适用于胆管癌肉瘤体外2D模型研究。
实施例6、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2球体形成能力
取对数生长期(p25)的1×105细胞，消化后接种至康宁超低贴壁96孔板。于接种后3、7、10、14d监测细胞成球情况，检测细胞成球能力。
如图2A所示，将人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2接种于超低贴壁96孔板中，观察14d，显示人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2具有成球能力。
实施例7、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞愈合能力
取对数生长期的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2(p15)和团队从公司购买的肝外胆管细胞TFK-1细胞，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12和1640培养基中，制备成单细胞悬液。经自动细胞计数仪计数，经浓度调整后获得终浓度为2×106/ml的细胞悬液，取2ml细胞混悬液接种至六孔板中，培养24h后，用1ml枪头在六孔板中垂直画出十字，并用PBS清洗3次，最后加入含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养基培养，于24h、48h后在光学显微镜下拍照观察。
结果如图2B-C所示，人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞愈合能力明显强于人肝外胆管癌细胞系TFK-1细胞。
实施例8、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的迁移、侵袭能力
取对数生长期的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2(p20)和肝外胆管细胞TFK-1细胞，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12和1640培养基中，制备成单细胞悬液。转移至离心管后离心(1000r/5min)，用无菌PBS重悬并离心三次，最后分别重悬于不含血清的DMEM/F-12培养基和1640培养基中。经自动细胞计数仪计数，经浓度调整后获得终浓度为1×105/ml的细胞悬液；检测细胞的迁移能力时，将200μl细胞悬液铺至未铺基质胶的transwell上层小室中；检测细胞的侵袭能力时，将200μl细胞悬液铺至铺好基质胶的transwell上层小室中(可提前30min铺好胶备用，配置浓度为无血清培养基和胶比例为1:10，每个上室加入约40μl，凝固后吸出多余的液体)。将上层小室分别放入装有含15％胎牛血清DMEM/F-12培养基和1640培养基的24孔板中，置于细胞培养箱。分别培养24h、48h后，取出上层小室，置于4％多聚甲醛中固定20min，然后用棉签擦去小室上层未穿过transwell膜的细胞。用0.1％结晶紫溶液染色20min后，用PBS清洗干净，然后置于倒置显微镜下观察并拍摄。
如图2D所示，人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的迁移、侵袭能力于24h和48h均强于肝外胆管细胞TFK-1细胞系。
实施例9人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的克隆形成能力
取对数生长期的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2(p25)和肝外胆管细胞TFK-1细胞，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12和1640培养基中，制备成单细胞悬液。经自动细胞计数仪计数，浓度调整后获得终浓度为800/2ml的细胞悬液；将以上浓度的细胞悬液接种到6孔板中，每孔2ml，放入培养箱继续培养，毎3天更换一次培养基。2周后，将细胞置于倒置光学显微镜下观察并拍照。后弃去培养基，用PBS洗清洗3次，4％多聚甲醛中固定20min，然后用0.5％结晶紫溶液染色20min，后于清水下清洗干净，然后置于倒置显微镜(ZEISS)下拍摄并计数。
如图2E-F所示，人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的迁移的克隆形成能力明显强于肝外胆管细胞TFK-1。
实施例10、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的染色体核型分析
本发明的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，将处于对数生长期的细胞(p25)在含有10μg/ml秋水仙碱的标准培养基中孵育2小时。弃去培养液后用PBS洗涤并用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后将细胞收集于15ml离心管底部，在37℃水浴中进行，用0.075M氯化钾溶液低张力处理30min。上述低渗液中直接加入lml新鲜配制的固定液(甲醇：冰醋酸，3：l，V/V)，轻轻吹打均匀，固定5min后离心(2000rpm，10min)，弃上清；再次加入6-8ml新鲜配制的固定液，常温固定30min；将以上标本离心后再加5-6滴固定液，试取1滴，滴在4℃蒸馏水玻片上，在酒精灯火焰上迅速烘烤并吹片；将吹好的玻片表面滴加适量Giemsa工作液染色10-15min，自来水冲洗玻片后自然晾干即得到中期染色体标本。
如图3A所示，用标准方法制备染色体，染色体数目大多分布在通过G显带。获得有代表性的染色体集的图像用于核型分析，核型的解释基于国际(人类)细胞遗传学命名系统(ISCN)。图3A为人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞代表性单细胞的核型分析，人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2的染色体数目和结构均出现异常，细胞系染色体属多倍体，染色体数目介于69-73条之间，结构异常包括染色体增加、缺失和易位等。
实施例11、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的STR位点
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10-60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
收集新鲜培养的人胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞，使用Tsingke的动物基因组抽提试剂盒(货号TSP201-200)提取细胞的基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，分析包括AMEL，D19S433，D5S818，D21S11，D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，以及Penta D等21个STR位点的序列重复数。
如图3B所示，本发明的人胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2采用目前最权威的检测方法为ATCC推荐的STR检测法，检测结果确定胆管癌肉瘤细胞系均是人源的，与ATCC、DSMZ和CELLOSAURUS三个全球最著名的培养物保藏机构中的细胞遗传信息进行比对，没有跟其他细胞匹配的序列，证明未受到其他细胞污染。
实施例12、小鼠皮下成瘤实验
取对数生长期的肿瘤细胞(p30)，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12培养基中，制备成单细胞悬液离心(1000rpm，5min)，细胞沉淀用PBS洗涤离心3次，将细胞重新悬浮于DMEM/F-12中，计数调整细胞密度K为1×107/ml；将1ml的以上细胞悬液注射到4周的NOD/SCID小鼠腋窝皮下(n＝3)，小鼠饲养于SPF级的层流动物房；观察7周，每5天测量瘤体直径大小；8周后将小鼠安乐死，取出瘤体测量拍照，取部分瘤体浸泡于10％福尔马林溶液，进行常规石蜡包埋及切片制作，备用。
如图4A-C所示，实验结果发现，所建立的细胞系在裸鼠体内均具有良好的体外成瘤性。中国人来源建立的，建系时间较短，生物遗传性状稳定，以该人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2作为研究模型，对于了解中国人群的癌肉瘤的发病机制有很大帮助。
实施例13、免疫组化实验
细胞的爬片制备：将盖玻片用洗洁剂清洗干净，然后用自来水将洗洁剂冲干净，再用纯水冲洗三遍，泡在75％的酒精中静置10min。用镊子夹起24mm*24mm盖玻片在酒精灯上将酒精烧干，温度不可太高。将烧干的盖玻片放在六孔板中，待冷却后将细胞悬液(约2×104个细胞)滴加在盖玻片上。5h后轻轻补加1ml培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养过夜，细胞贴在玻片上良好生长。
固定：制作好的爬片用PBS溶液洗2遍，六孔板每孔里面加1ml 4％多聚甲醛溶液后，静置10-15分钟。(2)吸掉多余的4％多聚甲醛溶液，然后加入500μl的PBS溶液。
烤片：将小鼠肿瘤组织切片以及人肝门部胆管癌细胞系CBC2T-2和细胞来源病人的原发肿瘤组织切片置于70℃烤片1h。
脱蜡：将片子转移至二甲苯中依次脱蜡处理：二甲苯I10min，二甲苯II 10min，二甲苯Ⅲ10min。
水化：100％乙醇I1min、100％乙醇II 1min、95％乙醇1min、85％乙醇1min、75％乙醇1min，然后用纯净水洗涤3遍。
抗原修复：将高压锅中0.01M枸橼酸缓冲液加热至沸腾，将切片放入，沸腾2分半后冷却至室温；修复结束取出切片，置于PBS中PBS洗涤3次，每次2min。
内源性过氧化物酶阻断：切片滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，将玻片置于PBS中洗涤3次，每次2min。
封闭：山羊血清封闭10min。
孵一抗：封闭液倒掉后放入湿盒加入对应一抗，4℃过夜孵育。
孵二抗：次日将一抗弃掉，PBS洗3次，每次2min，转移至湿盒内，滴加二抗，室温孵育30min。
DAB染色：PBS洗3次，每次2min。滴加DAB反应1-5min，及时终止显色，然后转移到玻片架上，双蒸水洗涤5min。
苏木素染色：苏木素染液中浸泡5min后用净化水冲洗，接着用盐酸酒精分化液分化数秒，分化结束后立即用净化水冲洗，最后将切片置于流水中冲洗反蓝5min。
脱水封片：将切片依次放入75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇各1min，干燥后在切片上滴加中性树胶，盖上盖玻片封片。
如图4D所示，通过H&E和IHC染色观察小鼠移植瘤、CBC2T-2(P30)细胞和患者原发肿瘤组织的成瘤情况。由H&E染色结果证实组织学上具有一致性(图4D，第一行)。IHC染色显示组织和细胞局部表达角蛋白(CK19)，CK19是一种上皮标志物。肉瘤成分标志物如Vimentin、Desmin、CD117和CD68、S-100蛋白表达阳性。我们证明了原发肿瘤组织同时具有上皮成分(癌)和间叶成分(软骨肉瘤)。总之，CBC2T-2细胞系将是体外和体内研究胆管癌肉瘤的有价值的工具。
实施例14、人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞的药物筛选
取对数生长期的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞(p30)，用PBS清洗，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬于含10％FBS的DMEM/F-12培养基中，制备成单细胞悬液并血小板计数板进行计数，经浓度调整后获得终浓度为10000个/100μl的细胞悬液；将其接种在96孔板中，每孔100μl，每组设5个复孔，另设只加100μl培养基的5复孔作为空白对照；待接种细胞培养24h贴壁后对每组分别加入适量的化疗吉西他滨(Gemcitabine)和奥沙利铂(Oxaliplation)，顺铂(Cis-platinum)、紫杉醇(Paclitaxelcis)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，设置不同浓度药物，放入培养箱中继续培养72h。
待细胞加药培养72h后分别对以上每组细胞用CCK-8(1:10稀释，37℃孵化2h)进行活性检测，并记录每组细胞在450nm的吸光度值，利用Graphpad软件绘制曲线并计算IC50值。
使用酶标仪检测450nm波长的吸光度(OD值)按公式计算：
细胞活力(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
注：As：实验组吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)；Ac：对照组吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物)；Ab：空白组吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)。
结果如图5A-E所示，化疗药物中，奥沙利铂(IC50＝77.51μM)、紫杉醇(IC50＝0.002197μM)、5-氟尿嘧啶(IC50＝7.516μM)、顺铂(IC50＝19.24μM)和吉西他滨(IC50＝0.0095μM)均抑制CBC2T-2细胞，其中紫杉醇对于该细胞最为敏感，其次是吉西他滨，本药物筛选为该胆管癌患者提供临床治疗信息，指导临床用药，优先选用吉西他滨联合紫杉醇治疗最为敏感。
综上所述，所述人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞在支原体检测试剂盒检测时，PCR结果为阴性，未受到支原体污染；所述人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2细胞增殖、愈合、侵袭、迁移能力较强，可以用于研究肝门部胆管癌肉瘤的发病机制。本发明所述的人肝门部胆管癌细胞系CBC2T-2可以成功制备胆管癌肉瘤动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选，为临床前研究体内实验，针对临床抗癌药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，其特征在于，所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2于2022年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:C2022273。
2.一种如权利要求1所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2的子代细胞系。
3.如权利要求1或2所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2，其特征在于，所述的细胞系具有裸鼠皮下成瘤能力。
4.如权利要求1或权利要求2所述的细胞系的应用，其特征在于，所述的应用选自：
(1)用于研究胆管癌肉瘤发病机制、发展和转移的机理；
(2)用于构建人肝门部胆管癌肉瘤的动物模型；
(3)筛选或评估治疗肝门部胆管癌的药物；
(4)构建耐药细胞模型；
(5)构建肝门部胆管癌动物模型的细胞试剂；
(6)筛选肝门部胆管癌相关生物标志物或鉴定分子靶点；或
(7)研究肝门部胆管癌耐药机制。
5.一种药物的抑制人肝门部胆管癌肉瘤的活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：将待测药物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的药物为具有抑制胆管癌肉瘤活性的药物，其中所述的细胞模型是如权利要求1所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2。
6.一种用于研究分析人肝门部胆管癌肉瘤细胞系或用于建立人肝门部胆管癌肉瘤细胞系动物模型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括容器，以及装于容器中的权利要求1所述的细胞。
7.如权利要求1所述的人肝门部胆管癌肉瘤细胞系CBC2T-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)标本采集及保存：在胆管组织中，取自瘤体增生活跃的表层部分的肿瘤组织；
(2)原代培养：肿瘤组织经PBS洗涤三次，机械剪碎，IV胶原酶消化，离心及洗涤；
(3)采用机械刮除法纯化细胞：原代培养成功后，上皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞多数同时出现和混杂生长，分区呈片，生长在瓶壁上；
(4)扩大培养：待细胞汇合度达80％以上时进行传代培养，加入0.25％胰蛋白酶，使之脱离瓶壁形成细胞悬液，离心重悬接种于用含10％胎牛血清的DMEM培养瓶继续培养。
CN202310941999.9A 2023-07-29 2023-07-29 一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系cbc2t-2及应用 Pending CN117004571A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310941999.9A CN117004571A (zh) 2023-07-29 2023-07-29 一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系cbc2t-2及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310941999.9A CN117004571A (zh) 2023-07-29 2023-07-29 一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系cbc2t-2及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117004571A true CN117004571A (zh) 2023-11-07

Family

ID=88570405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310941999.9A Pending CN117004571A (zh) 2023-07-29 2023-07-29 一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系cbc2t-2及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117004571A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107541494A (zh) * 2016-06-27 2018-01-05 上海市东方医院 一种人胆管癌细胞系及其应用
CN108048401A (zh) * 2018-01-03 2018-05-18 浙江大学 人胆道癌细胞系及应用
KR20180132298A (ko) * 2017-06-02 2018-12-12 한국과학기술원 Yap/taz를 이용한 간세포 분화 및 간질환 관련 용도
CN115161283A (zh) * 2022-06-24 2022-10-11 中山大学孙逸仙纪念医院 一种用于肝门部胆管癌来源类器官定向分化和培养的组合物及应用
CN115786262A (zh) * 2022-11-29 2023-03-14 兰州大学第一医院 一种人肝门部胆管癌细胞系cbc3t-1及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107541494A (zh) * 2016-06-27 2018-01-05 上海市东方医院 一种人胆管癌细胞系及其应用
KR20180132298A (ko) * 2017-06-02 2018-12-12 한국과학기술원 Yap/taz를 이용한 간세포 분화 및 간질환 관련 용도
CN108048401A (zh) * 2018-01-03 2018-05-18 浙江大学 人胆道癌细胞系及应用
CN115161283A (zh) * 2022-06-24 2022-10-11 中山大学孙逸仙纪念医院 一种用于肝门部胆管癌来源类器官定向分化和培养的组合物及应用
CN115786262A (zh) * 2022-11-29 2023-03-14 兰州大学第一医院 一种人肝门部胆管癌细胞系cbc3t-1及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丛超, 吴小鹏, 孙文娟: "人类肝门部胆管癌裸鼠瘤株的建立及其生物学特性研究", 中华肝胆外科杂志, no. 06, 30 June 2005 (2005-06-30) *
周晋生;吴小鹏;: "人肝门部胆管癌转移动物模型的建立及生物学特性研究", 中国普通外科杂志, no. 03, 30 April 2006 (2006-04-30) *
王曙光，韩本立，段恒春，陈意生，彭志明: "肝外胆管癌细胞系的建立", 中华实验外科杂志, no. 02, 30 March 1997 (1997-03-30) *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021208130A1 (zh) 一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
Paraskeva et al. The isolation and characterization of colorectal epithelial cell lines at different stages in malignant transformation from familial polyposis coli patients
WO2021088119A1 (zh) 原代乳腺上皮细胞培养基、培养方法及其应用
AU2011201605B2 (en) Stem cell fusion model of carcinogenesis
EP4105320A1 (en) Culture medium for primary cells of esophageal squamous carcinoma, and cultivation method therefor
Dexter et al. Establishment and characterization of two human pancreatic cancer cell lines tumorigenic in athymic mice
CN109609460B (zh) 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用
CN102250840B (zh) 一种人胰腺癌细胞系及其应用
CN102719403B (zh) 一种人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和应用
CN111793604B (zh) 一种耐奥希替尼的人非小细胞肺癌细胞株h1975/or及其应用
CN102067828B (zh) 人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测
CN115786262B (zh) 一种人肝门部胆管癌细胞系cbc3t-1及应用
CN102329775B (zh) 一种对吉西他滨耐药的人胰腺癌细胞系及其应用
CN113667645B (zh) 一种犬乳腺癌细胞系、其建立方法及应用
CN107177551B (zh) 一种具有高成瘤能力的人肝内胆管癌细胞系及其应用
CN105255832A (zh) 一种人胆管癌细胞系及其应用
CN116891829B (zh) 一株人肺腺癌hla19细胞系及其应用
CN107541497B (zh) 人垂体腺瘤细胞株及其用途
CN106479981B (zh) 一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法
CN117004571A (zh) 一种人肝门部胆管癌肉瘤细胞系cbc2t-2及应用
CN109355261B (zh) 一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法
CN108048401A (zh) 人胆道癌细胞系及应用
US20220387668A1 (en) Cultivated Autologous Limbal Epithelial Cell (CALEC) Transplantation
CN100408676C (zh) 纯种新西兰白兔口腔颌面部鳞癌细胞系的建立及应用
CN108977410B (zh) 中国人胰腺癌原位癌细胞系

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination