CN116694570A - 一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用。具体来说，本发明方法利用自体肿瘤细胞和用肿瘤细胞培养出的肿瘤类器官的上清液来分三次对患者自体肿瘤浸润淋巴细胞进行3次扩增，分别是初级扩增、二级扩增和三级扩增，在较短时间内获得数量较多的肿瘤浸润淋巴细胞，且活性好。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用。
背景技术
肿瘤类器官是通过对患者的肿瘤组织进行三维培养得到的保留部分原始肿瘤特征的细胞团，其在基因组、转录组及免疫组化染色特点上浓缩了原始肿瘤的部分特征，多代培养后也能够较稳定地保持形态和遗传特征，因此成为了精准医疗研究中的新兴方向。然而类器官也有一定的局限，主要是不具备原始肿瘤中肿瘤细胞与免疫细胞在体内相互作用的肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)，因此类器官不能等同于含有多种细胞类型的真实组织系统。
借助肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)去辅助了解肿瘤免疫微环境从而协助免疫治疗研究已成为当下肿瘤研究的热点。TILs是指一组从血液中迁移到肿瘤中起作用的淋巴细胞，其对肿瘤细胞具有特定的功能，可用于研究对肿瘤的杀伤作用。
然而，原始肿瘤组织来源的TILs数量极少，体外快速扩增很困难。即使通过人工培养的方式扩增出一定的数量，也很难保持体外的杀伤活性和维持其在体外的长期活性。目前体外培养TILs的主流方法包括两种：在培养基中添加白细胞介素家族的细胞因子(包括IL-2、IL-9、IL-21等)和不添加白细胞介素家族的细胞因子。其中，又以在培养基中添加IL-2为主流，因其可以促进TILs在体外的快速扩增。例如，CN2016106323937、CN2020106469704、CN2021102926160。然而研究证明，高浓度IL-2的加入会导致TILs中Treg细胞数量增多，从而造成免疫抑制，这样培养出的TILs并不适合用于类器官的后续相关研究。因此，目前也有在培养基中不添加IL-2来培养TILs的研究和报道。例如，CN2021104689545公开了一种TIL细胞扩增培养基，该培养基中不含IL-2，但包含了白细胞介素家族的其他细胞因子(IL-5、IL-9、IL-21)和单克隆抗体、灵芝多糖、谷胱甘肽等添加剂。该专利公布的培养基成分复杂，其中用IL-5、IL-9和IL-21的组合来刺激TIL细胞增殖，以替代IL-2的作用，然而该专利培养出数量较多的TILs需要的时间较长。
综上所述，有必要提出一种快速扩增TILs的新策略。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用，具体技术方案如下。
一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，所述方法利用自体肿瘤细胞和用肿瘤细胞培养出的肿瘤类器官上清液来协同扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞，具体步骤如下：
步骤1：取患者来源的肿瘤组织剪碎，加入消化液消化为单细胞混合物，所述单细胞混合物包括肿瘤细胞、(微量的)肿瘤浸润淋巴细胞和其他细胞；
步骤2：将步骤1中所述的肿瘤细胞培养为肿瘤类器官；
步骤3：收集步骤2中所述的肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液；
步骤4：将步骤1中所述的单细胞混合物进行离心，离心后弃掉上清，随后加入步骤3所述的类器官上清液并接种于细胞培养孔板中，所述类器官上清液与离心后的所述单细胞混合物的体积比为2：1(v/v)，所述类器官上清液对所述单细胞混合物里的肿瘤浸润淋巴细胞进行初级扩增；
步骤5：显微镜下观察到步骤4中的细胞培养孔板里每孔中的肿瘤浸润淋巴细胞开始形成聚集体并占据细胞培养孔板面积的至少60％时，将孔内的混合物转移至干净离心管中进行过滤，收集肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞；
步骤6：向步骤5收集得到的所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞中再次加入所述类器官上清液，所述类器官上清液与所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞混合物(肿瘤细胞+TILs混合物)的体积比为2:1(v/v)，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行二级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体。
由于自体肿瘤细胞上有可以刺激TILs生长的抗原，因此再结合该自体肿瘤细胞培养出的类器官所产生的上清液共同作用，进而实现对自体TILs的快速扩增培养。
可以理解的是，本发明所述的类器官上清液包括类器官细胞的分泌物。
进一步，向步骤6中的肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体中加入2倍体积的所述类器官上清液，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行三级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第2聚集体。
进一步，所述步骤1中的其他细胞包括成纤维细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。
进一步，所述步骤1中的肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌或胃癌。
进一步，所述步骤2中培养肿瘤类器官的具体操作如下：
步骤1：将肿瘤细胞与基质胶按1:1的比例混匀并接种于细胞培养孔板中，于37℃、5％ CO2条件下放置；
步骤2：待步骤1中的培养物凝固后，加入无血清培养基和促进类器官生长的细胞因子或小分子培养3-5天成为肿瘤类器官；所述促进类器官生长的细胞因子或小分子包括Heregulinβ-1(重组人Heregulinβ-1)、R-Spondin(经典Wnt信号通路的激活因子)、Noggin(BMP骨形态发生蛋白的内源性抑制剂)、EGF(表皮生长因子)、FGF-10(成纤维细胞生长因子10)、Wnt-3a(Wnt3a重组蛋白)、Y27632(ROCK抑制剂)。
进一步，所述步骤3中收集肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液的操作为用移液器移取，移取完类器官上清液以后将新的无血清培养基加入类器官继续培养。
进一步，所述步骤1中加入消化液在水浴锅中消化10-40min至肿瘤组织完全消化为单细胞混合物；或者加入I型和II型胶原酶消化为肿瘤细胞。
一种自体肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液在制备自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品中的应用。
进一步，所述自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品中还可以包括自体肿瘤细胞。
进一步，所述自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品可以是培养液或培养基。
有益技术效果
本发明创新性地提出了一种利用自体肿瘤细胞和用自体肿瘤细胞培养出的肿瘤类器官上清液来协同扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法。本发明方法无需额外配制成分复杂的培养基，且不添加白细胞介素家族的任何细胞因子，实现了在相同时间内培养出的TILs聚集体细胞数更多、活性更大，肿瘤杀伤效力更强，即实现了快速扩增TILs的目的。
本发明方法对原代组织中的肿瘤浸润淋巴细胞进行了3次扩增，第1次是在将肿瘤组织消化为单细胞混合物后，加入肿瘤类器官上清液对单细胞混合物中极少量的TILs进行初级扩增，该操作避免了将极少量的TILs从单细胞混合物中分离出来，使原本量就极少的TILs进一步损失，并且还减少了实验操作的难度。第2次是在TILs在肿瘤类器官上清液环境中开始逐渐聚集时，采用过滤的方法将此时已有较多数量的TILs细胞和肿瘤细胞一起过滤出来(此时过滤的操作难度已经大为降低)，再加入肿瘤类器官上清液，使肿瘤细胞和肿瘤类器官上清液对此时的TILs协同作用进行二级扩增，时间为4-7天，得到TILs第1聚集体。而此时得到的TILs第1聚集体中的TILs细胞数量已经远超现有技术方法加入含有IL-2培养基培养出的TILs数量。最后，本发明方法根据科学研究的需要，再选择性地对TILs聚集体1进行了三级扩增，得到了数量更多、杀伤活力更强的TILs第2聚集体。
总体来讲，本发明方法操作简单，技术思路新颖，不仅实现了快速扩增TILs的目的，且培养出的TILs活性好，本发明方法具有独创性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明快速扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法技术路线图；
图2为本发明实验组和对照组培养的TILs聚集体中的细胞计数图；
图3为本发明实验组和对照组培养的TILs聚集体对肿瘤类器官的杀伤效果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
实施例1
本实施例提供一种利用自体肿瘤组织培养类器官过程中产生的上清液来促进肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增的技术示例，如图1所示。
步骤1：取患者来源的肿瘤组织剪碎，加入消化液消在水浴锅中消化10-40min至肿瘤组织完全消化为单细胞混合物，所述单细胞混合物包括肿瘤细胞、(微量的)肿瘤浸润淋巴细胞和其他细胞。或者取肿瘤组织剪碎，加10mL胶原酶混合液(I型和II型胶原酶，均以200U/mL终浓度)，37℃水浴消化30min左右，消化为肿瘤细胞团块。
步骤2：将步骤1中所述的肿瘤细胞培养为肿瘤类器官。
步骤3：收集步骤2中所述的肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液。具体操作为使用1mL移液枪，从靠近胶滴边缘的地方吸取上清，并收集至15mL离心管中，移取完上清后，再将新的无血清培养基加入类器官的培养板中，继续培养。
步骤4：取步骤1中所述的单细胞混合物进行离心，离心后弃掉上清，随后加入步骤3所述的类器官上清液并接种于细胞培养孔板中，所述类器官上清液与离心后的所述单细胞混合物的体积比为2：1，所述类器官上清液对所述单细胞混合物里的肿瘤浸润淋巴细胞进行初级扩增。
步骤5：显微镜下观察到步骤4中的细胞培养孔板中每孔里的肿瘤浸润淋巴细胞开始形成聚集体并占据细胞培养孔板面积的至少60％时，将孔内的混合物转移至干净离心管中进行过滤，收集肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。
步骤6：向步骤5收集得到的所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞中再次加入所述类器官上清液，所述类器官上清液与所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞混合物的体积比为2：1，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行二级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体。所述肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体中的TILs细胞量约为1×109～4×109个。
步骤7：向所述步骤6中的肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体中按体积比2：1再加入所述类器官上清液，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行三级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第2聚集体。所述肿瘤浸润淋巴细胞第2集体中的TILs细胞量约为20×109个。
实施例2
本实施例提供可用于促进肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增的肿瘤类器官上清液的制备方法
1)将肿瘤组织用含双抗的PBS清洗三遍，剪碎至1mm3左右大小。
2)加10mL胶原酶混合液(I型和II型胶原酶，均以200U/mL终浓度)，37℃水浴消化30min左右。
3)取上清至镜下观察，出现较多细胞团时，加2mL终止终止液。
4)沉淀10-20s，将上清转移至15mL离心管中，4℃，离心，600g，5min。
5)弃上清，将沉淀与基质胶1:1混匀，并铺在48孔板中，在37℃，5％ CO2条件下放置，待凝固后，加入含有各种细胞因子和小分子：50nM Heregulinβ-1、1ug/mL R-Spondin、100ng/mL Noggin、50ng/mL EGF、200ng/mL FGF-10、60ng/mL Wnt-3a、10uM Y27632的无血清培养基中培养3-5天(3天、4天或5天)即得肿瘤类器官。
6)收集肿瘤类器官培养上清得到一种用于促进肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增的培养基PO。
实施例3
本实施例提供一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离和扩增方法
1)将患者来源膀胱癌组织剪碎至1mm3，然后用10-20mL的消化液，在37℃水浴锅中，消化10min-40min。
2)完全消化后，在4℃、离心600g，5min。
3)弃上清，加入1-2mL红细胞裂解液充分混匀后，在冰上裂解1min，在4℃、离心600g，5min。
4)弃上清，随后加入4mL实施例2备的培养基，以每孔1mL肿瘤组织碎片接种至24孔板中培养。
5)显微镜下观察到孔内TILs数量占比约60％时即可过筛处理，即将孔内细胞及组织吸取至离心管中。
6)随后过70μm滤网收集肿瘤细胞及TILs，使用含FBS的PBS将滤网下的细胞收集起来。
7)将收集的肿瘤细胞和TILs在4℃、离心600g，5min，然后加入培养基PO共培养4-7天，得到TILs第1聚集体，所述TILs第1聚集体中的TILs细胞量约为1×109～4×109个。
8)用2mL培养基PO将上述TILs第1聚集体接种至24孔板中培养，每孔1mL，培养3-5天可得到TILs第2聚集体，所述TILs第2集体中的TILs细胞量约为20×109个。
实施例4
对比试验例1：提供一种含有高浓度IL-2的培养基
配制培养基：将25mM HEPES、1％的青霉素-链霉素、2mM谷氨酰胺、10％ AB(人血清)、6000IU/mL IL-2加入至1640培养基中，即得TILs培养基PO-D1。
对比试验例2：提供一种含有低浓度IL-2的培养基
配制培养基：DC培养基、5％人血清、1％人血小板裂解物、1％P/S(青霉素/链霉素)、2mM L-glutamine(L-谷氨酰胺)、1×MEM-Eagle(MEM Eagle培养基)、1mM Sodiumpyruvate(丙酮酸钠)、10mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、1×β-mercaptoethanol(2-巯基乙醇)、500U/mL IL-2、50U/mL IL-15、50U/mL IL-21，即得TILs培养基PO-D2。
实施例5
对比试验例3：提供用对比试验例1的培养基培养的TILs
1)将患者来源膀胱癌组织剪碎至1mm3，然后用10-20mL的消化液，在37℃水浴锅中，消化10min-40min。
2)完全消化后，在4℃、离心600g，5min。
3)弃上清，加入1-2mL红细胞裂解液充分混匀后，在冰上裂解1min，在4℃、离心600g，5min。
4)弃上清，随后加入4mL P0-D1培养基，以每孔1mL肿瘤组织悬液接种至24孔板中培养。
5)显微镜下观察到孔内TILs数量占比约60％时即可过筛处理，即将孔内细胞及组织吸取至离心管中。
6)随后过70μm滤网收集肿瘤细胞及TILs，使用含FBS的PBS将滤网下的细胞收集起来。
7)在4℃、离心600g，5min，即得原代TILs，一般需4-7天。
8)用2mL P0-D1培养基将上述原代TILs接种至24孔板中培养，每孔1mL，3-5天可成球形TILs聚集体-D1。
对比试验例4：提供用对比试验例2的培养基培养的TILs
1)将患者来源膀胱癌组织剪碎至1mm3，然后用10-20mL的消化液，在37℃水浴锅中，消化10min-40min。
2)完全消化后，在4℃、离心600g，5min。
3)弃上清，加入1-2mL红细胞裂解液充分混匀后，在冰上裂解1min，在4℃、离心600g，5min。
4)弃上清，随后加入4mL P0-D2培养基，以每孔1mL肿瘤组织碎片接种至24孔板中培养。
5)显微镜下观察到孔内TILs数量占比约60％时即可过筛处理，即将孔内细胞及组织吸取至离心管中。
6)随后过70μm滤网收集肿瘤细胞及TILs，使用含FBS的PBS将滤网下的细胞收集起来。
7)在4℃、离心600g，5min，即得原代TILs，需14天。
8)用2mL P0-D2培养基将上述原代TILs接种至24孔板中培养，每孔1mL，6-8天可成球形TILs聚集体-D2。
实施例6
验证1
1)将实施例3和实施例5获得的TILs聚集体吹打成单细胞，并用血细胞计数板计数。
2)每孔100uL，铺于96孔板中，每组3个复孔，见表1。
3)将0天培养组中，加入ATP检测试剂100uL/孔，常温孵育10min，利用酶标仪进行检测。
4)将孵育7天后的细胞，加入ATP检测试剂100uL/孔，常温孵育10min，利用酶标仪进行检测。
5)将孵育14天后的细胞，加入ATP检测试剂100uL/孔，常温孵育10min，利用酶标仪进行检测酶标仪进行检测。
6)绘制其增值曲线，见图2。
表1细胞计数
实验结论：在相同时间内，本发明所述培养基中的TILs数量增殖更多，且随着培养时间的延长，TILs细胞数增长的趋势更快。
验证2
TILs对肿瘤类器官杀伤能力的检测
1)将实施例3和实施例5中用两种对照培养基扩增的TILs与实施例2中培养的类器官分别取出并计数；
2)将类器官铺于96孔板中，每孔1000个类器官/100uL，分别设置PDOM组(肿瘤类器官+裂解液)、PDO+本发明制备的TILs(第2聚集体)组、PDO+TILs聚集体-D1、PDO+TILs聚集体-D2，每组三个复孔，孵育24h；
3)分别向PDO+本发明制备的TILs组、PDO+TILs聚集体-D1组、PDO+TILs聚集体-D2组中加入10倍TILs；
4)孵育72h，提前20min加入细胞裂解液将PDOM组中的肿瘤类器官(PDO)全部裂解，即作为细胞全部被杀伤的基准线，然后再利用LDH试剂盒及酶标仪检测上清中LDH含量，以对比用不同方法培养出的TILs对肿瘤类器官的杀伤效力，见图3。
实验结论：本发明方法培养得到的TILs对肿瘤细胞的细胞毒性最大，杀伤效力最好，体外活性最高。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (10)
1.一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法利用自体肿瘤细胞和用肿瘤细胞培养出的肿瘤类器官上清液来协同扩增培养肿瘤浸润淋巴细胞，具体步骤如下：
步骤1：取患者来源的肿瘤组织剪碎，加入消化液消化为单细胞混合物，所述单细胞混合物包括肿瘤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和其他细胞；
步骤2：将步骤1中所述的肿瘤细胞培养为肿瘤类器官；
步骤3：收集步骤2中所述的肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液；
步骤4：将步骤1中所述的单细胞混合物进行离心，离心后弃掉上清，随后加入步骤3所述的类器官上清液并接种于细胞培养孔板中，所述类器官上清液与离心后的所述单细胞混合物的体积比为2：1，所述类器官上清液对所述单细胞混合物里的肿瘤浸润淋巴细胞进行初级扩增；
步骤5：显微镜下观察到步骤4中的细胞培养孔板里每孔中的肿瘤浸润淋巴细胞开始形成聚集体并占据细胞培养孔板面积的至少60％时，将孔内的混合物转移至干净离心管中进行过滤，收集过滤后的肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞；
步骤6：向步骤5收集得到的所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞中再次加入所述类器官上清液，所述类器官上清液与所述肿瘤细胞和所述肿瘤浸润淋巴细胞混合物的体积比为2:1，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行二级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向步骤6中的肿瘤浸润淋巴细胞第1聚集体中加入2倍体积的所述类器官上清液，所述肿瘤类器官上清液和所述肿瘤细胞共同作用对所述肿瘤浸润淋巴细胞进行三级扩增得到肿瘤浸润淋巴细胞第2聚集体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的其他细胞包括成纤维细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌或胃癌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中培养肿瘤类器官的具体操作如是下：
步骤1：将肿瘤细胞与基质胶按1:1的比例混匀并接种于细胞培养孔板中，于37℃、5％CO2条件下放置；
步骤2：待步骤1中的培养物凝固后，加入无血清培养基和促进类器官生长的细胞因子或小分子培养3-5天成为肿瘤类器官；所述促进类器官生长的细胞因子或小分子包括Heregulinβ-1、R-Spondin、Noggin、EGF、FGF-10、Wnt-3a或Y27632。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中收集肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液的操作为用移液器移取，移取完类器官上清液后将新的无血清培养基加入类器官中继续培养。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中加入消化液在水浴锅中消化10-40min至肿瘤组织完全消化为单细胞混合物；
或者加入I型和II型胶原酶消化为肿瘤细胞。
8.一种自体肿瘤类器官培养过程中产生的类器官上清液在制备自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品中还可以包括自体肿瘤细胞。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述自体肿瘤浸润淋巴细胞快速扩增产品可以是培养液或培养基。
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